行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
山藥及其他食物材料中具雌激素活性化合物或區分物之篩
選與功能性研究(1/3)
計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC92-2321-B-002-011- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學生化科技學系 計畫主持人： 黃青真 共同主持人： 陳曉鈴，郭悅雄 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 93 年 5 月 11 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫第二次期中進度報告
針對停經後婦女保健之功能性食品成份開發-山藥及其他食物材料中具
雌激素活性化合物或區分物之篩選與功能性研究(1/3)
計畫類別：□ 個別型計畫 x 整合型計畫
計畫編號：NSC 92－ 2321－B002 － 011 － －
執行期間： 92 年 8 月 1 日至 93 年 7 月 31 日
計畫主持人：黃青真
共同主持人：郭悅雄, 陳曉玲
計畫參與人員： 鄭瑋宜
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：X 精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管
計畫及下列情形者外，得立即公開查詢
□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢
執行單位：
國立臺灣大學生化科技學系
中 華 民 國 93 年 04 月 05 日
2 (一)摘要： 婦女停經後因體內不再分泌雌激素，而 產生更年期症狀、骨質疏鬆且心血管疾病危險 率大大提高。此外，雌激素之作用會促進雌激 素依賴性癌細胞增生，而與乳癌、子宮內膜癌 (男性攝護腺癌)等有密切關係。流行病學調 查、介入性人體實驗以及細胞、動物之實驗研 究指出有些食物含『植物性雌激素』成分，對 上述與雌激素作用有關之症狀或疾病具有預 防效果。含植物雌激素之食材，乃具有開發為 保健食品之潛力。 國內推動山藥研究已有相當成果。其中 吳文惠教授(師大)之停經後婦女人體試驗、應 靜雯教授(東吳)之乳癌細胞實驗，以及翁祖輝 教授之乳癌細胞結合實驗，提供了山藥具『植 物雌激素』活性之證據。本三年計畫擬建立細 胞與分子層次之『植物雌激素』活性分析方法 並配合動物實驗，以詳細探討山藥『植物雌激 素』之活性成分與區分物，提供山藥發展為停 經後婦女保健食品之基礎。此外，所建立之細 胞與分子層次之篩選模式，一方面不但可提供 給其他子計畫，自黑豆、發酵黑豆與其他豆 類、榖、豆與其他種子苗或芽等研發具植物雌 激素活性之保健食品，另一方面亦可選擇其他 本土性食物材料廣泛篩選，期能找出更多具植 物雌激素活性潛力之材料。 第一年計畫擬建立分子與細胞層次之雌 激 素 活 性 篩 選 模 式 。 執 行 頭 四 個 月 (92/8/1~92/11/1 ， 第 一 次 期 中 報 告 ) 已 建 立 MCF-7 細 胞 培 養 及 其 對 雌 二 醇 (17beta-Estradiol，E2)之反應，發現其生長狀 況對 E2之反應敏感度不佳，不適合成為雌激 素 活 性 之 指 標 。 接 著 乃 自 行 選 殖 出 hERαcDNA，並自瑞典 Dr. Gustafson 之實驗室 取 得 hERβcDNA ， 用 以 製 備 pBKCMV GAL4-ERαLBD 質體，並建立將該等 chimeric receptor 與 (UAS)4-Alkaline phosphatase
reporter 共同短暫轉染 CHOK1 細胞，以測試 具雌激素活性化合物藉 hERα transactivate 基 因 表現 之活 性 。至第 二 次期 中報 告 期 間 (92/12/5-93/4/5)，我們以已知植物雌激素，三 種黃豆異黃酮標準化合物，測試我們所建立之 ERα與 ERβ transactivation assay 之有效性。結 果如下表，E2對 ERα 之活化大於ERβ，但三 種異黃酮，則對 ERβ之活化大於ERα。與文 獻所述相符。 EC50 ERα ERβ 17-β estradio 8.79×10-6nM 2×10-5nM Genistein 298.49 nM 3.41 nM Daizein 874.86 nM 31.81 nM Genistin 726.03 nM 13.41nM 因此，我們所建構之 transactivation assay 確可應用於雌激素活性篩選，將陸續篩選由農 試所劉新裕博士所提供之山藥樣品，以及其他 子計畫所得發酵黑豆樣品。 (二)報告內容： 前言: 國內推動山藥研究已有相當成果。尤其 在品系篩選、栽培及推廣方面，目前幾乎所有 市場均可買到各式各樣山藥。國人的接受程度 也相當高。而山藥之保健功效方面，由於被列 入『跨部會保健食品推動計畫』重點食材之 一，也有一些不錯之成果。例如:抗氧化、調 節腸道功能等。其中最值得注意的是：吳文惠 教授(師大)之停經後婦女人體試驗、應靜雯教 授(東吳)之乳癌細胞實驗，以及翁祖輝教授之 乳癌細胞結合實驗，提供了山藥具『植物雌激 素』活性之證據。印證幾年前婦產科醫師報導 一 位 更年 期婦 女 因為連 續 數週 以山 藥 為 主 食，而出現如停經前之生理現象，而懷疑山藥 具有類似雌激素之功能。植物雌激素為近年非 常熱門的研究主題，例如黃豆異黃酮在預防乳 癌、更年期症狀及骨質疏鬆症方面受到相當的 重視。在保健食品市場具有相當潛力。 本計畫之目的在探討山藥『植物雌激素』 之活性成分與區分物，以提供山藥發展為停經 後婦女保健食品之基礎，並協助其他子計畫自 黑豆、發酵黑豆與其他豆類、榖、豆與其他種 子苗或芽等研發具植物雌激素活性之保健食 品，同時亦自其他可能具『植物雌激素活性』 之食材或豆科植物中藥材粗萃物篩選更多具 植物雌激素活性潛力之食品材料。 (二)報告內容： 前言: 本三年研究計畫之內容依實驗性質大致 分為二部分：一為分子、細胞層次之活體外實
驗(第一、二年)；二為以鼠類為模式之活體動 物實驗(第二、三年) 。本年度(第一年)研究 重點在第一部份 :『以細胞及分子之雌激素活 性分析法篩選高雌激素活性山藥品系及其中 活性成分之區分與化學鑑定』當中之 第一年 建立分子與細胞層次之植物雌激素 活性分析法 (92/12/5~93/4/5) 材料與方法： 1. 細胞增生試驗： 此部分所用的細胞株為 MCF-7 細胞株 (ATCC, HTB-22) 購自 ATCC。MCF-7，為 人 類 乳 癌 細 胞 株 （ human breast adenocarcinoma），含有高量 estrogen receptor 的表現，組織來源為：mammary gland; breast; metastatic site: pleural effusion; adenocarcinoma。其培養採用之培養基為含 10%胎牛血清（FBS）及 Minimum essential medium (Eagle) 培養液，約每二至三天長滿 需繼代培養。實驗進行時，分別以細胞計數 法、MTT 法及 BrdU 標定方法觀察細胞數 目 。 實 驗 中 所 用 的 positive control 為 17β-estradiol（購自 Sigma 公司，產品編號 為 E2758）。 2. Transactivation Assay (1) 細胞株： 此部分所用的細胞株為 CHO-K1 細胞 株 (ATCC, CCL 61) 購自食品工業研究所 菌種中心/國家衛生研究院細胞庫，菌種中 心編號：CCRC60006，組織來源：ovary, Chinese hamster, Cricetulus grise。其培養採 用之培養基為含 10%胎牛血清（FBS）及 Ham’s F12 nutrient mixture (GIBCOBRL® 11765-054) 培養液，約每二至三天長滿需 繼代培養。
(2) 試劑：
實 驗 中 所 用 的 positive control 為 17β-estradiol（購自 Sigma 公司，產品編號 為 E2758）。Genistein、Daidzein 及 Genistin 購自 Sigma 公司。
(3) 構 築 含 GAL4-ERβ LBD Chimeric
receptors 之 cDNA：
人類 ERβ的引子是依據 NCBI 中人類之 ERβ cDNA 序 列 （ accession number 為 NM_001437 ） 設 計 而 成 ， 由 Maggiolini Marcello 等人（2002）研究指出，ERβ的
ligand binding domain（LBD）位於 c-terminal 287 amino acids，即為 732-1593 bp，長度為 861 bp。所以本實驗設計的 primer 由 cDNA 之 721 bp 開始到 1593 bp，長度為 872 bp； 並在 5’端及 3’端分別加上 Hind III 及 Xba I 限制酶切位。以 Dr. Gustaffson 實驗室所提 供之 pSG5-hERβ plasmid 為模板，利用上述 引子進行 PCR 實驗。之後先將此片段以 T&A cloning 方 式 接 入 pGEMT cloning vector 中，再利用 Hind III 及 Xba I 將此片 段切下，與含有 Gal4 DNA binding domain 之 pBKCMV vector 進 行 ligation 及 transformation 。 得 到 含 GAL4-ERβ LBD Chimeric receptors 之 Expression vector，最 後進行定序，確認序列的正確性。
(4) 以 CHO-K1 細 胞 進 行 transactivation
assay：
a. 含 receptor 與 reporter 之質體製備： 含 GAL4-ERα（ 或β） LBD Chimeric receptors cDNA 之 pBKCMV(mammalian cell Expression vector)質體，由上述實驗得之；含 (UAS)4-Alkaline phosphatase Reporter
genecDNA 之 pBKCMV，自 Dr. Gustaffson 之 實驗室取得。用以轉型大腸菌 XL1blue，經篩 選後，挑出有表現之菌株，大量培養並抽取質 體 DNA.。 b. 細胞培養： CHOK1 細 胞 購 自 新 竹 食 工 所 細 胞 庫 取 得，以含 10%牛血清之 HAM-12 培養液培養。 MCF-7 細胞購自 ATCC，以含 10%牛血清之 MEM 培養液培養，並添加 bovine insulin（Final 0.01mg/mL）。 c. 轉染實驗： 進行轉染實驗前一天將長至 confluence 之細胞植入 96 孔培養盤，當天將含血清之培 養基洗除乾淨。將兩種質體 DNA 定量加入 lipofectamineTM 2000 轉染劑及轉染專用培養 基使形成 DNA-liposome complex 再加入上述 洗淨之細胞中，轉染 5 小時.。 d. 活化實驗： 吸除含轉染劑之轉染培養基，加入已知 的 ER activators，培養 2 天後後，吸取定量培 養基測定 Alkaline phosphatase(AP)活性。AP 活性係以會產生冷光 luminescence 之 CSPD 基 質於 96 孔微盤中測定。已知之 ER 活化劑以 17β-estradiol 為正對照。
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結果與討論：
1.
細胞增生實驗： MTT standard curve 如圖一所示，可 發現隨細胞數的增加，OD540 nm 吸光值 亦 隨 之 增 加 ， 但 到 細 胞 數 為 約 40000 cells/well 時，漸趨平緩。於是取其直線區 域作為 MTT standard curve。 不 同 細 胞 數 於 不 同 時 間 點 測 得 之 MTT 結果如圖二所示。若以時間與 log of cell number 做圖，可計算出其 Doubling Time 約為 46.3 ~ 53.76 小時，與 paper 所 查到的 52.8 小時差不多，但 ATCC 所測 出的為 29 小時，相差甚遠。 圖三顯示以數細胞法測量細胞增生 的結果，在六組的處理中，發現以活性碳 處理血清【CS-FBS】取代原本使用隻胎 牛血清【FBS】會些微的降低細胞生長速 率；另外，以 100 nM Estradiol 組會增加 MCF-7 細胞數目，而添加 10µM E2組則 抑制細胞生長，兩者之間的差距在第六天 時達到最大，約相差 13.64 倍。由此可知， 低濃度 E2對於 MCF-7 細胞有促進此細胞 增生的效果。但若將 10%CS-FBS 與 100 nME2 組第六天的數據比較，只有相差 1.47 倍，不甚理想。 若以 MTT 法測量細胞數目，可發現 在有胰島素的存在下，添加不同濃度的 E2會些微的促進細胞生長，如圖四所示， 在 E2濃度為 100nM 時達最大值，但也只 有 control 的 1.8 倍。 之後採用靈敏度較高的 BrdU 法標定 細胞中的 DNA，以偵測細胞數目。結果 如圖五所示，發現在起始濃度為 5000 cells / well 的條件下，添加不同濃度 E2 培養 46 小時後可些微增加細胞數目，到 10-2 nM 有最大值，約為控制組的 1.81 倍。 綜上所述，發現無論用最基本的細胞 計數，或是靈敏度較高的 BrdU 法，皆無 法有效的看出 Estradiol 對 MCF-7 細胞增 生的影響，可能是因為在培養液中有其餘 無法排除的生長因子影響所致，故認為用 細 胞 增 生 法 看 雌 激 素 或 植 物 雌 激 素 效 應，並非為一良好判定方法。之後希望能 建立偵測下游基因的表現量的方法，來評 估所篩選出之樣品雌激素活性！ 2. Transactivation Assay (1) 構 築 含 GAL4-ERβ LBD Chimeric receptors 之 cDNA： 所 構 築 出 來 的 GAL4-ERβ LBD pBKCMV 表現質體經由定序。與基因庫比 對結果，有 99.54%的相似性。仔細比對發現 只有二個 base 不同，進一步比對氨基酸序 列，發現只有一個氨基酸不同，為 a.a. 236 （IleÆThr）。經由參考文獻中 LBD 作用位 置，皆非此兩個氨基酸，故可用此建構之質 體，進行以下轉染實驗。 (2) pBKCMV-ERα（ 或β） Transactivation assay 之條件尋找： 以不同 receptor 與 reporter 比例找出最大 活化倍數，結果如圖一所示。在 CHO-K1 細 胞 轉 染 pBKCMV-ERα 中 ， 以 receptor/reporter=5/1，加入 1nM E2後活化倍 數達最大（5.14 倍）；而在 ERβ方面則用 receptor/reporter=4/1 加入 1nM E2後活化倍 數達最大（5.82 倍），故兩種 receptor 分別以 其最適當之 receptor 與 reporter 比例進行後 續實驗。 (3) 17β-estradiol 對 ERα與 ERβ之活化效果： CHO-K1 細胞經共同短暫轉染 pBKCMV GAL4-ERα與 pBKCMV (UAS)4-AP 後 對17-β estradiol（E2）之劑量反應曲線如圖二 所示，可看出隨 E2濃度增加，AP 活性亦隨 之增加，到 10-3 nM E2達最大值，活化倍數 為 4.7 倍，EC50為 8.79×10-6nM。 在 ERβ方面，17-β estradiol（E2）之劑量 反應曲線如圖三所示，可看出隨 E2 濃度增 加，AP 活性亦隨之增加，到 10-1 nM E2達最 大值，活化倍數為 6.97 倍，EC50為 2×10-5nM。 由此結果可知，在此系統中，E2對於 ERα 與 ERβ的活化 EC50以 ERα優於 ERβ，即需 要較低的濃度就可達到活化 ERα 的效果。 (4) 驗證各種不同 Phytoestrogen 對 ERα與 ERβ之活化效果： 本 實 驗 採 用 已 知 有 雌 激 素 活 性 之 isoflavone Genistein, Daidzein 及 Genistin 進 行實驗，以驗證我們所建立 transactivation 之有效性(validation)。 在 ERα方面，所得之結果如圖四所示。 結果顯示，隨著此三種 phytoestrogen 濃度增 加，AP 活性亦隨之增加，其 EC50 分別為 Genistein ~ 298.49 nM、Daidzein ~ 874.86 nM
及 Genistin ~ 726.03nM。由此可看出，以 Genistein 的活化效果較佳，至 500 nM 即達 最大值，並有統計差異。而在 Genistin 因有 糖基的存在，故效果比 free form 的 Genitein
差，需要 10µM 才有活化最大值。 在 ERβ方面，所得之結果如圖五所 示。結果顯示，隨著此三種 phytoestrogen 濃度增加，AP 活性亦隨之增加，其 EC50 分別為 Genistein ~ 3.41 nM、Daidzein ~ 31.81 nM 及 Genistin ~ 13.41nM。 綜合比較三種 phytoestrogen 對 ERα 與 ERβ的活化效果，發現對 ERβ的活性 優於 ERα。若由 Genistein 的 EC50來比 較，發現兩者相差 87.6 倍，此與許多文 獻上所證明的：phytoestrogen 對 ERβ有較 好的結合與活化效果相符。 EC50 ERα ERβ 17-β estradiol 8.79×10-6nM 2×10-5nM Genistein 298.49 nM 3.41 nM Daizein 874.86 nM 31.81 nM Genistin 726.03 nM 13.41nM 以 上 結 果 顯 示 ， 我 們 所 建 立 之 transactivation assay ， 確 可 應 用 於 SERM (Selective Estrogen Receptor Modulator) 之篩 選。 自評: 第一次期中報告之前實驗結果顯示，無論 以何種檢測方式，由不同管道取得之 MCF-7 人類乳癌細胞株隻生長對培養液中雌二醇含 量均不敏感。乃積極建立 ER transactivation assay, 以人類子宮組織萃取 RNA 反轉錄出 cDNA 為模板，設計引子以 PCR 放大 ER 之 cDNA。結果順利得到 ERα，但得不到 ERβ。 只好向瑞典 Dr. Gustaffson 要來全長 ERβ cDNA 為模板，終於得到正確之 ERβ。並精剪
接，將兩者之 LBD(Ligand Binding Dmain)取 代我們原用之 PPARα，得到 chimeric receptor construct。經序列分析，知為正確後，利用已 知之黃豆異黃酮標準化合物，驗證其對植物雌 激素反應之正確性。結果與文獻報告吻合，確 認我們建立之 transactivation assay 確可用於植 物雌激素活性之篩選。 我們已自農試所劉新裕博士取得 6 個特性 明顯不同之山藥樣品，進行粗萃。目前正進行 兩種 ER 活化能力分析。此外，也將另一子計 畫所得黑豆發酵樣品萃取物進行分析。 計畫進度符合預期。本年度應可找到可能 具 SERM 特質之食物材料，供第二年進行活 性化合物分離及動物實驗。
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圖一、MCF-7 細胞株 MTT standard curve
圖二、不同細胞數於不同時間點測得之 MTT 結果
圖三、以數細胞方法探討不同血清及不同 Estradiol 濃度對 MCF-7 細胞增生之影響
MCF7 cell MTT standard curve
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 0 20 40 60 80 100 120 140 Cell number (*103) A 540
MCF7 cell MTT standard curve
y = 0.023x - 0.0032 R2 = 0.9995 0.0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0 5 10 15 20 Cell number (*103) A 54 0 MCF7 cell不 同 處 理 組 於 不 同 時 間 點 之 細 胞 數 0 50000 100000 150000 200000 250000 第 0 天 第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天 第 5 天 第 6 天 細胞數 10% FBS 10% C S-FBS 5% FBS 5% C S-FBS 100 nM E2 10 mM E2 Figure. Time V.S . A540 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 0 20 40 60 80 100 Time (hours) A540 0.246 0.492 0.985 1.969 3.938 7.875 15.75 32 63 126
圖四、以 MTT 法探討不同 Estradiol 濃度對 MCF-7 細胞增生之影響 圖五、以 BrdU 法探討不同 Estradiol 濃度對 MCF-7 細胞增生之影響 以 不 同 濃 度 之 Estradiol處 理 MCF-7 ce ll之 MTT結 果 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3
17β-Estradiol conc. (Log µM)
A540 + insulin -insulin 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 10% C SF MEM -3 -2 -1 0 1 17b-estradiol (log nM) A 450nm
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圖 六 、 CHO-K1 細 胞 經 共 同 短 暫 轉 染 不 同 比 例 之 （ A ） pBKCMV GAL4-ERα與
pBKCMV(UAS)4-AP；（B）pBKCMV GAL4-ERβ與 pBKCMV(UAS)4-AP 後對
17β-estradiol 之反應效果 0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 1+1n M E2 2+0. 01nM E2 3 3+1n M E2 4+0.0 1nM E2 5 5+1n M E2 6+0.0 1nM E2 ALP ac ti vi ty (RLU*10 5 )
CHO-K1 cell (ERα)
1: receptor/reporter= 0/0 2: receptor/reporter= 0/0.3 3: receptor/reporter= 2/1 4: receptor/reporter= 3/1 5: receptor/reporter= 4/1 6: receptor/reporter= 5/1 A B 0 10 20 30 40 50 60 1 1+1n M E2 2+0 .01nM E2 3 3+1n M E2 4+0 .01nM E2 5 5+1 nM E 2 6+0. 01nM E2 ALP ac ti vi ty (RLU*10 5 )
CHO-K1 cell (ERβ)
1: receptor/reporter= 0/0 2: receptor/reporter= 0/0.3 3: receptor/reporter= 2/1 4: receptor/reporter= 3/1 5: receptor/reporter= 4/1 6: receptor/reporter= 5/1
圖七、CHO-K1 細胞經共同短暫轉染 pBKCMV GAL4-ERα與 pBKCMV(UAS)4-AP 後對
17β-estradiol 之劑量反應曲線
圖八、CHO-K1 細胞經共同短暫轉染 pBKCMV GAL4-ERβ與 pBKCMV(UAS)4-AP 後對
17β-estradiol 之劑量反應曲線 0 5 10 15 20 25 30 CON -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 17-β estradiol (log nM) AL P ac ti vi ty (RL U *10 5 ) d c e a a a a b 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 CON -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 17-β estradiol (log nM) ALP ac tivity (RLU*10 5 ) d c c b b b a b
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圖九、CHO-K1 細胞經共同短暫轉染 pBKCMV GAL4-ERα與 pBKCMV(UAS)4-AP 後對 不同 phytoestrogen 之劑量反應曲線
圖十、CHO-K1 細胞經共同短暫轉染 pBKCMV GAL4-ERβ與 pBKCMV(UAS)4-AP 後對 不同 phytoestrogen 之劑量反應曲線 0 5 10 15 20 25 30 0 10 50 100 250 500 1000 2000 5000 1000 Isoflavone濃度 (nM) A L P acti vi ty (R LU *10 5 ) Genistein Daidzein Genistin 0. 0 5. 0 10. 0 15. 0 20. 0 25. 0 30. 0 35. 0 40. 0 45. 0 C O N 1 3.162 10 31.62 100 316.2 500 1000 Isoflavone濃度 (nM) AL P ac ti vit y ( R L U *10 5 ) Genistein Daidzein Geinstin
