行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 █ 成 果 報 告
□期中進度報告
以台灣本土之海洋異營性微細藻類生產 n-3 多元不飽和脂肪酸 (II) Production of n-3 polyunsaturated fatty acids using Taiwan indigenous
marine heterotrophic microalgae (II)
計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫 計畫編號：NSC 97-2313-B-006-004-MY3
執行期間：97 年 8 月 1 日至 100 年 7 月 31 日
計畫主持人：陳逸民 共同主持人：盧重光 計畫參與人員：陳佩津
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、
列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢
■涉及專利或其他智慧財產權，□一年 ■二年後可公開查詢
執行單位：國立成功大學
中 華 民 國 99 年 5 月 25 日
(一) 計畫中文摘要。（五百字以內）
本年度的工作，主要為配合與味丹公司的技物移轉，針對在前一年度篩選到的藻株 BL10，進行急毒性試驗、分類鑑定、以及培養條件的最適化。
研究結果顯示，BL10 的乾藻粉在 8 g/kg rat 的口服劑量下，並不會使大鼠出現任何毒 性的反應。型態鑑定的結果顯示 BL10 屬於 Aurantiochytrium limacinum (舊名 Schizochytrium limacinum)。培養條件的分析結果顯示 BL10 的最適培養鹽度為 10-15 ppt，可以利用 Na2SO4
取代掉 80%的海鹽，此有利於工業級發酵槽的操作。最佳的氮源為味精/酵母萃出物＝2/1，
其相較於原本的蛋白胴/酵母萃出物 = 1/2 配方可減少五成的培養成本。相關研究成果已移 轉給味丹生技公司，權利金 2,510 萬元，為台灣有史以來最大的藻類技術移轉案。
(二) 計畫英文摘要。（五百字以內）
In this year we focused on the strain BL10, the best candidate for DHA production. We checked the acute toxicity of the algal powder, identified the strain based on its morphological
characteristics, and further optimized its growth conditions.
Our results showed that BL10 have no acute toxicity effects after oral delivery at the dosage of 8 g/kg to rats. The strain was identified as Aurantiochytrium limacinum (formerly Schizochytrium limacinum) based on its morphological characteristics and fatty acid profile. The optimal salinity for cultivating BL10 was determined as 10 ppt. The use of 0.8% sodium sulfate plus 2 ppt natural seawater was an alternative method which can decrease the corrosion of the medium using diluted seawater to fermenter made by stainless steel. The replacement of yeast extract in medium by using monosodium glutamate can decrease 50% cost for growing BL10.
The cultivation methods for BL10 have been transferred to We-Dan Biotech Company and won a 25,100,000 NTD contract for National Cheng Kung University.
一、工作項目 (1) BL10 的鑑定
(2) BL10 的急毒性分析 (3) BL10 的量產條件分析 二、方法
BL10 的鑑定是依據其在特定培養條件下的形態外觀以及脂肪酸組成來進行。
型態鑑定部分，是將 BL10 培養在以純海水配製的 H medium (monosodium glutamate/yeast extract/glucose = 0.5/0.2/2.0 gL-1)(Takao et al. 2005) 或 H3 medium
(peptone/yeast extract/glucose = 1.0/2.0/4.0 gL-1) (Yang et al., 2010) 的液態或固態培養基 (添 加 0.8%的 agar) 內，觀察細胞及群聚型態，並以 ATCC28209 (Schizochytrium aggregatum) 以 及 TN6 (Oblongichytrium sp.) (Yang et al., 2010) 做為比對用的參考藻株。脂肪酸組成分析的 方法則參考 Yang et al. (2010)。
急毒性實驗方面，是將 BL10 冷凍乾燥的藻粉 (以 peptone/yeast extract/glucose = 3/6/90 gL-1培養至對數生長末期後採收) 和少量去離子水調和成 0.5 g/mL，以每公斤大鼠灌食 16 mL 劑量的方式進行灌食，公鼠與母鼠各六隻；控制組灌食相同劑量的飼料。於灌食後兩週 觀察這些大鼠是否出現死亡、體重減輕、腹瀉、脫毛、以及其他異常的現象。
BL10 的培養實驗中採用 50 mL 的有蓋試管，內裝有 4.5 mL 新鮮的培養基。在接種 0.5 mL 的藻液後，以 150 rpm 進行搖晃，並於 27 oC 的溫度下培養 3 天，隨後以離心或過濾的 法採收藻細胞，凍乾後進行秤重。培養基的組成將於結果部分描述。
三、結果
在agar plate上，BL10的細胞外觀以球型為主，直徑介於10-20 µm間。絕大多數的細胞 以2分裂法進行複製，產生2或4分體。少數細胞會形成孢子囊，一次能釋放出16個遊走孢子。
少數孢子囊會先轉變成具有爬行能力的 amoeboid cell後，分裂成16個不具移動能力的細 胞。此外在以agar plate進行培養時，BL10的群聚外常可觀察到具有類似菌絲狀結構的 ectoplasmic net，然其不若 Schizochytrium aggregatum (ATCC28209) 以及 Oblongichytrium sp. (TN6) 來得明顯。
在以液態培養基進行培養時，可以看到截然不同的細胞型態及生活史。以 H medium 培養基的使用為例，可以在培養皿底部觀察到一些由球狀細胞轉變而成的 amoeboid cells 這 些 amoeboid cells 會再度變成球狀細胞，隨後進行 4 或 8 分裂，並再次形成 amoeboid cells，
或是分裂成 8 或 16 個遊走孢子，游離底層。遊走孢子在 1-2 小時後將逐漸失去游動能力，
沉回底部，並且由腎形變成球形。和 agar plate 培養不同的地方，在於絕大多數的遊走孢子 是由 amoeboid cells，而非球狀的孢子囊所產生。
在液態培養時，細胞聚集成團的情形並不顯著。偶然可以看到 15-30 個球狀細胞聚集 而成的群聚，然而結構十分鬆散，同時也看不到 ectoplasmic net 的存在。
AC
BL10 的脂肪酸組成分析結果如圖一所示。飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例約為 3/7。DHA 為主要的不飽和脂肪酸，佔總脂肪酸的近 50%，不飽和脂肪酸的近 80%。C22:5 n-6 (n-6 DPA) 為次要的不飽和脂肪酸，佔總脂肪酸的近 10%，n-3 DPA 及 C20:4 (AA) 的 含量則很少，僅佔總脂肪酸的 2-3%。BL10 的脂肪酸組成，與 TN-3 (Aurantiochytrium sp., 自 有藻株) 以及 AlgaMac-3050 (Schizochytrium sp., Bio-Marina, CA, USA) 十分近似，然與 ATCC28209 (S. aggegatum) 以及 TN-6 (Oblongichytrium sp.) 有明顯差異。基本上這兩個藻 株的 DHA 含量偏低，僅佔總脂肪酸的 10%不到，同時前者的 AA 含量佔總脂肪酸的近 10%，
高於其他藻株，後者的 n-3 DPA 的含量佔 5%，是所有藻株中唯一一個 n-3 DPA 含量高於 n-6 DPA 的品系。
圖一、脂肪酸組成分析結果
0% 20% 40% 60% 80% 100%
TN6 ATCC28209 BL10 TN3 Algamac-3050
Fatty acid composition
Unknown Saturated FA C16:2 C18:1 C20:3 C20:4 EPA n-3 DPA n-6 DPA DHA
Porter 於 1989 年的報告，是將破囊弧菌科 (Thraustochytriidae or Thraustochytriaceae) 分成裂殖壺菌屬 (Schizochytrium)、破囊弧菌屬 (Thraustochytrium)、吾肯氏壺菌屬
(Ulkenia)、類網黏菌屬 (Labyrinthuloides)、不動壺菌屬 (Aplanochytrium)、日本壺菌屬 (Japonochytrium) 以及節壺菌屬 (Althornia) 等 7 個屬 (中文名稱參考蔡，1999)。
Schizochytrium 的特徵，在於細胞會持續以二分裂法複製，產生二分體、四分體或群聚。文 獻中又將 Schizochytrium 分成：1. 會形成較大群聚的 S. aggregatum；2. 單一孢子囊釋放出 兩個游動孢子的 S. minutum；3.單一孢子囊釋出 8 個游動孢子的 S. octosporum；4. 游動孢 子由營養細胞 (vegetative cell) 直接形成，不經過形成孢子囊步驟的 S. mangvovei；以及 5.
可觀察到含 16-32 個細胞的群聚，同時具有產生 amoeboid cell 能力的 S. limacinum 等五種。
有鑑於具有 Schizochytrium 特徵的藻種在以 18S rDNA 繪製演化樹時，會出現數個親緣 關係偏遠的獨立區塊 (Honda et al., 1999)，因此 Yokoyama & Honda 於 2007 年的報告中，
按照親緣關係及外觀特徵，將 Schizochytrium 分成 Schizochytrium、Aurantiochytrium 以及 Oblongichytrium 等 3 屬，其中 S. aggregatum 歸類於 Schizochytrium，S. limacinum 及 S.
mangrovei 歸類於 Aurantiochytrium，同時被重新命名為 A. limacinum 及 A. mangrovie，S.
octosporum 及 S. minutum 則被歸類為 Oblongichytrium，並被重新命名為 O. octosporum 及 O. minutum。這 3 個屬在外觀上的最大差異，在於群聚的大小，以及群聚外是否有明顯的 ectoplasmic net。Aurantiochytrium 不易形成明顯的群聚，同時群聚外沒有明顯的 ectoplasmic net；Schizochytrium 及 Oblongichytrium 則容易形成群聚，同時其外側具有明顯的 ectoplasmic net。此外這三個屬的脂肪酸的組成也不盡相同，其中 Aurantiochytrium 的 DHA 含量佔總不 飽和脂肪酸的 80%以上，而 AA 則不到 5%；Schizochytrium 的 AA 佔總不飽和脂肪酸的 20%
左右，為三個屬中最高者。Oblongichytirum 則會有較高的 n-3 DPA 比例。因此，理論上很 容易可利用上述的型態及脂肪酸組成來進行 Schizochytrium 類藻種的鑑定。
BL10 無論在型態及脂肪酸組成方面，均符合 Aurantiochytrium 的特徵；會形成 amoeboid cell 的特性與 A. limacinum 及 A. mangvovei (在 Yokoyama & Honda 於 2007 年的報告中曾提 到部分 A. mangvovei 的品系也會產生 amoeboid cell) 相符，然而形成孢子囊，以及其釋放游 動孢子的數目明顯和 A. mangrovei 不符。BL10 偶而出現 16 或 32 個細胞聚集成團的現象，
則與 A. limacinum 的特徵符合。因此 A. limacinum 確實是所有已知藻類中，與 BL10 最近似 的品種，然而尚有疑點有待釐清。在進行親緣關係分析時，BL10 的親緣關係反而和 A.
mangrovei 較接近，而和已知的 A. limacinum 較偏遠，因此對於 BL10 是否確實屬於 A.
limacinum，仍有待進一部的研究確認。
在我們及前人的研究中，證實原有的”Schizochytrium”藻種中，僅有後來被歸類為 Aurantiochytrium 的物種具有高含量的 DHA，因此推測目前美國市面上的所有
Schizochytrium 產品，其實均是 Aurantiochytrium 這一類的藻種。這一點可以由 AlgaMac-3050 的脂肪酸組成符合 Aurantiochytrium 屬的特徵看出端倪。在美國，富含 DHA 的”Schiochytrium sp.”產品 (DHA 含量占乾藻重 20-25%) 已通過美國 FDA 的許可，廣泛製成人類的健康食品 以及水產飼料等產品。後續我們將收集這些”Schiochytrium sp.”的產品，了解可歸類為 Aurantiochytrium sp.。
綜合以上的分析與比對，我們將BL10鑑定為Aurantiochytrium limacinum (Basionym:
Schizochytrium limacinum)。由脂肪酸組成分析結果，我們推測美國市售的Schizochytrium sp.
產品同屬於Aurantiochytrium的物種。
(2) 毒性分析結果
大白鼠在灌食 BL10 或飼料的體重變化如圖二所示。實驗組的大白鼠相對於控制組的 體重並無任何顯著差異存在。此外，也並未觀察實驗或控制組的鼠隻出現腹瀉、脫毛、抽 搐、焦躁等異常現象。
由實驗結果，認定 8 g/kg 劑量的 BL10，對於大白鼠並不具任何的急毒性。
圖二、實驗組及控制組大鼠在灌食前 (day 1) 及灌食後 (day 15) 的體重變化情形。
0 100 200 300 400 500
1 15
Study day
Mean body weight (g) .
♀, control
♀, treated
♂, control
♂, treated
(3) BL10 的量產條件分析
首先我們比較不同碳源 (glucose, fructose, glycerol) 對於 BL10 培養密度的影響，實驗 中我們將鹽度固定為 10 ppt，並統一以 peptone & yeast 為氮源，濃度分別為 1 & 2 gL-1。實 驗結果如圖三所示，以葡萄糖的效果最佳、果糖其次，甘油最差。
接著在固定碳源種類及濃度 (glucose, 10 gL-1) 的條件下進行氮源種類的調整，比較在 其為 3 gL-1的濃度條件下，各種氮源的差別。實驗結果如圖四 (a) 所示，純的 yeast extract (Y) 的效果最好，而以 peptone (P)、monosodium glutamate (M) 以及 ammonium sulfate (A) 部 分取代 yeast extract 時均會導致 biomass 量的降低。
考量 monosodium glutamate 及 ammonium sulfate 和 yeast extract 的含氮比例不同，因此 我們另外設計一組實驗，將其中 2g 的 yeast extract 以相同含氮量的其他兩種成分 (M: 2.83 g, A: 1.11 g) 進行取代，結果如圖四 (b) 所示。雖然還是以純的 yeast extract 的結果為最佳，
然而相較於固定重量取代的實驗結果來說，有較佳的生長速率。由於 monosodium glutamate 的成本僅為 yeast extract 的 1/20，同時培養基的成本大多來自 yeast extract，因此在實際量 產時可以考量以其取代 2/3 的 yeast extract。
圖三、不同碳源對於 BL10 生長的影響。
圖四、不同氮源對於 BL10 生長的影響。
0 2 4 6 8 10 12
G F Gly
Carbon source
Biomass (gL-1)
0 2 4 6 8 10 12 14
Y3 PY12 PY21 P3 MY12 MY21 M3 AY12 AY21 A3
Nitrogen source Biomass (gL-1)
* 0
2 4 6 8 10 12 14
Y3 M eq A eq Nitrogen source Biomass (gL-1 )
(a) (b)
圖五、不同 yeast extract (YE) 及 glucose (Glc) 濃度下，BL10 的培養密度。
接著考量不同比例及濃度的 yeast extract 及 glucose 對於 BL10 生長的影響，研究結果 如圖五所示。Yeast extract 的濃度在到達 15 gL-1時，會造成生長的抑制。相對而言，在 yeast extract/glucose 的比例固定為 1/10 時，glucose 的濃度越高，BL10 的生長速度越快。
鹽度方面，我們分別研究在較低的碳/氮源濃度 (yeast extract/glucose = 3/10 gL-1) 以及 較高的碳、氮源濃度 (yeast extract/glucose = 12/120 gL-1) 下，鹽度的改變對於 BL10 生長的 影響。此外我們另行評估以 Na2SO4，一種不含氯離子的鹽來取代部分海鹽的可行性。實驗 結果如圖六所示，在較低的碳氮源濃度下，最佳的鹽度為 10-15 ppt。在較高的碳、氮源濃 度下，當鹽度低於 10 ppt 時，BL10 的生長狀況會隨鹽度的降低而變差，然而在加入 Na2SO4
替代海鹽時，能回復其的成長速率，其中在以 0.8%的 Na2SO4取代 8 ppt 海水時的效果最佳。
由於 Na2SO4的加入，可以有效降低培養基內的氯離子含量，進而減緩其對不鏽鋼發酵槽體 的腐蝕，對於工業級的量產十分有利。
0 5 10 15 20 25 30
3/30 9/90 15/90 12/120
YE/Glc (gL-1) Biomass (gL-1 )
圖六、在使用低濃度碳氮源 (a) 及高濃度碳氮源 (b) 的條件下，鹽度對於 BL10 培養密度 的影響。
六、具體成果 1. Paper
H.-L Yang, C.-K. Lu, S.-F. Chen, Y.-M. Chen and Y.-M. Chen*, 2010. Isolation and characterization of Taiwanese heterotrophic microalgae: screening of strains for docosahexaenoic acid (DHA) production. Marine Biotechnology, 12: 173 -185. (SCI) 獲選為該期的封面期刊。
2. 技轉
陳逸民，楊惠郎，盧重光，「BL10 藻株生產技術」。國立成功大學授權味丹生技，權利金 2,510 萬。簽約日期 2009 年 7 月 1 日。
0 2 4 6 8 10 12
32.5 ‰ 14.5 ‰ 10.0 ‰ 5.5 ‰ 2.8 ‰ 1.0 ‰
Salinity (ppt) Biomass (gL-1 )
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
10ppt 5ppt 2ppt 2ppt+0.8%SS 1ppt+0.9%SS 1%SS
Salt Biomass (gL-1 )
(a)
(b)
3. 研討會發表
(1) 陳逸民，DHA 微藻的量產與商品化。藻類生質應用研討會。
(2) 陳逸民，藻類多元不飽和脂肪酸 DHA 的開發研究。2009 Microalgae Technology Conference。
(3) 陳逸民，楊惠郎。藻類 DHA 量產技術。「2009 年台灣生技月」。
4. 競賽
「以微細藻類量產多元不飽和脂肪酸」。2009 Crazy Idea 應用王－生物技術研發成果創 意應用競賽，銅牌獎。
七、成果自評
本計畫無論在技轉、競賽、發表等均有豐碩成果，未來商品化的機會也很大，因此本 人對於計畫的成果十分滿意，也非常感謝國科會予以支持，使的本人有機會創造如此豐碩 的成果。
原本本年度預定的進度為：
1. BL-10 的量產條件分析(二) 2. BL-10 的急性與亞急性毒分析 3. BL-10 的營養成分分析
4. BL-10 internal transcribed spacer 2 (ITS2) rDNA 片段的定序
亞急毒性分析及營養成分分析將由味丹公司委託專職、具有公信力的單位進行，因此 不再由本計畫執行。至於ITS的片段對於專利申請或是分類而言均無用處，加上將委託明欣 公司進行BL10的基因體定序，屆時可獲得相關訊息，因此便不再本年度內執行完畢。
七、參考文獻：
蔡喬筑，1999。台灣北部沿海地區破囊壺菌科型態、分類學之研究。國立台灣師範大學生 物學系碩士論文。
Grzebyk D, Sako Y, Berland B (1998) Phylogenetic analysis of nine species of Prorocentrum (Dinophyceae) inferred from 18S ribosomal DNA sequences, morphological comparisons, and description of Prorocentrum panamensis, sp. nov. J Phycol 34:1055–1068.
docosahexaenoic acid (DHA) production. Mar Biothecnol, 12: 173-185.
Yokoyama R, Honda D (2007) Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny
(Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. nov. Mycoscience 48:199–211.
