聚乙烯醇─海藻酸鈉包埋固定納豆菌生產菌果聚醣之研究 李俊緯、施英隆
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摘 要
本研究以聚乙烯醇及海藻酸鈉進行固定化Bacillus subtilis natto，並以回應曲面實驗設計法探討固定化之最佳條件，所得之 固定化菌體可用於以批次式及連續式發酵生產菌果聚醣(Levan)。 在固定化條件探討，本研究以回應曲面實驗設計因子，探 討不同攪拌時間、不同聚乙烯醇濃度及不同海藻酸鈉濃度對固定化菌體顆粒強硬度及Levan產量之影響。結果顯示當顆粒 製作條件為攪拌時間2.45 hr，聚乙烯醇(PVA)濃度9.05 g/100 mL，海藻酸鈉(SA)濃度0.91 g/100 mL時，所得菌體顆粒在SM 生產培養基培養30小時後，可以生產最高之Levan產量79.14 g/L且固定化菌在培養期間顆粒依舊保持完整無破碎。 在所有 測試氮源(尿素、peptone、yeast extract、硫酸銨)，除硫酸銨外其餘氮源在膠體滲透層析(Gel Permeation Chromatogramphy, GPC)分析後，圖譜中之波峰皆與Levan之波峰相疊，因此選擇硫酸銨作為氮源以進行後續之實驗探討。 以一次一因子方式 批次探討生產條件時，發現當硫酸銨濃度為2%、蔗糖濃度為250 g/L、溫度為37℃、pH值為6.5時，Levan產量高達80.63 g/L。經過五個批次生產Levan後，固定化菌仍依舊完整無破碎，但Levan產量已降低至5.49 g/L。 以連續式發酵探討Levan 生產時，發現當硫酸銨濃度為2%、蔗糖濃度為250 g/L、曝氣量為300 mL/hr、pH值為6.5時， Levan產量在第30小時高 達63.81 g/L，且於第 30~76小時可連續獲得較高之Levan產量，同時發現在208小時連續式培養生產Levan後，固定化菌皆 依舊完整無破碎。 連續式生產Levan之產量雖不及批次式之產量，但於節約能源、減少人力成本，且機器連續之方式更利 於自動化控制等方面均對於批次式生產Levan有利。本研究可提供工業化大量生產Levan之參考依據，對生物高分子方面之 研究具有學術及應用上之價值。
關鍵詞 : 聚乙烯醇、海藻酸鈉、固定化
目錄
頁次 封面內頁 簽名頁 中文摘要 iii ABSTRACT v 致謝 vii 目錄 viii 圖目錄 xiii 表目錄 xvi 第一章 前言 1 第二章 文獻回顧 4 2.1 Levan的介紹、化學結構特性與合成機制 4 2.1.1 Levan之介紹 4 2.1.1.2 Levan之化學結構特性...5 2.1.1.3 Levan之合成機制 8 2.1.2 Levan之應用 11 2.1.2.1 Levan於農業領域上之應用 11 2.1.2.2 Levan於醫藥領域上之應用 11 2.1.2.3 Levan於食品領域上之應用 12 2.1.2.4其它 13 2.2固定化技術 14 2.2.1固定化技術之介紹 14 2.2.2固定化技術之應用研 究 15 2.2.2.1固定化技術於食品工業之應用 15 2.2.2.2固定化技術於廢水處理中之應用 15 2.2.2.3固定化技術於酒精發酵中之 應用 16 2.2.3固定化方法之分類 17 2.2.4固定化包埋法之優點 19 2.3聚乙烯醇-海藻酸鈉之複合材料 21 2.3.1固定化材料之特 性 21 2.3.2聚乙烯醇(PVA，Poly vinyl alcohol) 22 2.3.3海藻酸鈉(Sodium Alginate，SA) 23 2.3.4海藻酸鈉結合聚乙烯醇 24 2.4回 應曲面法 RSM 25 2.4.1 RSM簡介 25 2.4.2實驗設計原理 28 2.4.3二水準因子設計( two-level factorial design ) 28 2.4.4陡升路徑 法( Method of path of Steepest Ascent ) 30 2.4.5中心混成設計( Central Composite Design ) 30 2.4.6數據統計分析( Regression model analysis ) 31 2.5批次式生物反應器 32 2.5.1批次式生物反應器之研究 32 2.5.1.1停滯期(lag phase) 32 2.5.1.2對數生長 期(logarithmic phase) 33 2.5.1.3穩定期(stationary) 33 2.6連續式生物反應器 34 2.6.1連續式生物反應器之介紹 34 第三章 材料 與方法 35 3.1 實驗材料及儀器設備 35 3.1.1 實驗藥品 35 3.1.2 實驗儀器 36 3.2固定化菌株培養 37 3.2.1菌株來源 37 3.2.2菌株 活化 37 3.2.3固定化顆粒製作方法 38 3.2.4 Levan生產培養 40 3.3以回應曲面法探討固定化菌體顆粒最佳製作條件 41 3.3.1回 應曲面法因子設定 41 3.3.2陡升實驗設計( Method of path of Steepest Ascent ) 43 3.3.3中心混成實驗設計( Central Composite Design ) 45 3.3.4二次回歸分析( Regression model analysis ) 48 3.3.5固定化菌體顆粒強硬度之測定 48 3.4.分析方法 50 3.4.1醣類 分析 50 3.4.2 Levan之分析 52 3.5批次式生產Levan 54 3.5.1添加不同氮源於SM培養基以生產Levan之探討 54 3.5.2氮源濃度 對固定化菌體在SM生產Levan之影響 55 3.5.3蔗糖濃度對固定化菌體在SM-N生產Levan之影響 55 3.5.4溫度對固定化菌體 在SM-N生產Levan之影響 56 3.5.5 pH值對固定化菌體在SM-N生產Levan之影響 56 3.6連續式生產Levan 57 3.6.1固定化菌體 在SM生產培養基連續式培養生產Levan之情形 59 3.6.2氮源濃度對固定化菌體生產Levan之影響 60 3.6.3曝氣對固定化菌體 生產Levan之影響 60 3.6.4 pH值對固定化菌體在SM-N生產培養基生產Levan之影響 61 3.6.5蔗糖濃度對固定化菌體在SM-N 生產Levan之影響 61 第四章結果與討論 62 4.1回應曲面法(Response surface method，RSM ) 62 4.1.1一階回歸分析結果 62 4.1.2陡升實驗之結果 65 4.1.3中心混成之實驗結果 67 4.1.4中心混成實驗二階回歸分析結果討論 69 4.2聚乙烯醇-海藻酸鈉固 定化菌體顆粒強硬度實驗 74 4.3固定化菌在SM培養基中生產Levan之情形 76 4.4在批次發酵中添加氮源對Levan生產之影響 78 4.4.1添加不同氮源對Levan生產之影響 78 4.4.2硫酸銨濃度對固定化菌在SM生產培養基生產Levan之影響 …..80 4.4.3蔗糖 濃度對固定化菌在SM-N生產培養基Levan產量之影響 85 4.4.4 溫度對固定化菌體在SM-N生產Levan之影響 88 4.4.5 pH值對 固定化菌體在SM-N生產Levan之影響 91 4.5連續式發酵生產Levan之探討 94 4.5.1硫酸銨濃度對固定化菌體生產Levan之影響
94 4.5.2蔗糖濃度對固定化菌體在SM-N生產Levan之影響 97 4.5.3曝氣量對固定化菌體在SM-N生產Levan之影響...100 4.5.4 pH值對固定化菌體在SM-N生產Levan之影響 103 第五章 結論 106 參考文獻 108 圖目錄 頁次 圖 1 實驗流程
圖...3 圖 2-1 Levan 和 inulin化學結構圖圖...7 圖 2-2 Levansucrase之酵素合成機制...10 圖 2-3 「一次實驗決定一個因子最適值」之結
果...26 圖 3-1 固定化顆粒製作方法...39 圖 3-2 製備完成之聚乙烯醇-海藻酸 鈉固定化菌體顆粒...49 圖 3-3 固定化顆粒強度的測定方法...49 圖 3-4 Levan 標準溶液檢量 線...51 圖 3-5 各種醣類之HPLC圖...51 圖 3-6 Levan 分子 量檢量線...53 圖 3-7 連續式生物反應器運作模式設計圖...58 圖 3-8 連續式生物反應器運作模式實際圖...58 圖 3-9 生物反應器玻璃槽體管柱設計圖及實際
圖...59 圖 4-1 PVA濃度與攪拌時間對菌果聚醣生成量之回應曲面圖...71 圖 4-2 PVA濃度與攪拌時間對菌果聚 醣生成量之回應曲面圖...71 圖 4-3 SA濃度與攪拌時間對菌果聚醣生成量之回應曲面圖...72 圖 4-4 SA濃度與攪拌時間對 菌果聚醣生成量之回應曲面圖...72 圖 4-5 PVA濃度與SA濃度對菌果聚醣生成量之回應曲面圖…....73 圖 4-6 PVA濃度 與SA濃度對菌果聚醣生成量之回應曲面圖...73 圖 4-7 固定化菌於 SM培養基中生產Levan之情形...77 圖 4-8 各 種醣類及硫酸銨之GPC圖譜...79 圖 4-9 硫酸銨濃度對Levan產量之影響...82 圖 4-10 不同硫酸銨濃度在第一批次對Levan產量之影響...82 圖 4-11 不同硫酸銨濃度在第三批次對Levan產量之影 響...83 圖 4-12 以批次式探討不同硫酸銨濃度對固定化菌於第30小時之SM-N生產培養基中Levan產物之分子量分 析...84 圖 4-13 蔗糖濃度對Levan產量之影響...86 圖 4-14 不同蔗糖濃度在第一批次對Levan產 量之影響...86 圖 4-15以批次式探討不同蔗糖濃度對固定化菌於第30小時之 SM-N生產培養基中Levan產物之分子量 分析...87 圖 4-16 溫度對Levan產量之影響...89 圖 4-17 不同溫度在第一批次 對Levan產量之影響...89 圖 4-18 以批次式探討不同溫度對固定化菌於第30小時之SM-N生產培養基中Levan產物 之分子量分析...90 圖 4-19 pH值對Levan產量之影響...92 圖 4-20 不同pH值在第一 批次對Levan產量之影響...92 圖 4-21 以批次式探討不同pH值對固定化菌於第30小時之SM-N生產培養基中Levan 產物之分子量分析...93 圖 4-22 進行208小時連續式生產Levan之顆粒...95 圖 4-23 氮源濃度對固 定化菌生產Levan之影響...95 圖 4-24 以連續式探討不同硫酸銨濃度對固定化菌於第30小時之SM生產培養基 中Levan產物分子量分析...96 圖 4-25 蔗糖濃度對固定化菌體生產Levan之影響...98 圖 4-26 以連續 式探討不同蔗糖濃度對固定化菌於第30小時之SM-N生產培養基中Levan產物分子量分析...99 圖 4-27 不同曝氣量 對Levan產量之影響...101 圖 4-28 以連續式探討不同曝氣量對固定化菌於第30小時之SM-N生產培養基 中Levan產物分子量分析...102 圖 4-29 不同pH值對Levan產量之影響...104 圖 4-30 以連 續式探討不同pH值對固定化菌於第30小時之SM-N生產培養基中Levan產物分子量分析...105 表目錄 頁次 表2.1 比較不同的固定化方法之原理、材料及特色...18 表2.2 各固定化方法之比
較...19 表3-1 培養基組成 (NB)...40 表3-2 Levan生產 培養基之組成(SM蔗糖培養基)...40 表3-3 23因子設計表...42 表3-4 23 因子設計層階表...43 表3-5 陡升路徑之實驗設計結果...45 表3-6 中心混成實驗設計表...46 表3-7 中心混成實驗層階
表...47 表4-1 23因子設計層階表...64 表4-2 23因子設 計法之回歸分析表...64 表4-3 23因子設計一階回歸ANOVA分析表...65 表4-4 陡 升路徑之實驗設計結果...66 表4-5 中心混成實驗...68 表4-6 中心混成實驗結果之ANOVA分析表...70 表4-7 不同聚乙烯醇-海藻酸鈉固定化菌體顆粒強硬 度...75
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