嘉南藥

嘉南藥理科技大學 97 年度教師專題研究計畫成果報告 一、 基本資料

計畫類型 □重點研究 ■一般個人型研究 計畫主持人 劉坤湘 單位 生物科技系 職級 助理教授

計畫名稱 樟芝漆氧化酶基因之分離與光誘導表現之研究

執行期限 民國 97 年 1 月 1 日起至民國 97 年 12 月 31 日止

※計畫編號： CN9720

中華民國 98 年 2 月 26 日

研究計畫內容

以褐腐菌類、屬於台灣特有種真菌的樟芝 (Taiwanofungus camphoratus) 為實驗材料，由於在 先前實驗中無意間發現其中具有漆氧化酶 (laccase) 的活性，並可經由適當之光照誘導而增加漆氧 化酶的活性，因而針對此一已知可用於分解木質素 (lignin) 等多項生理功能的酵素－漆氧化酶，計 畫以反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)，放大出樟芝 漆氧化酶基因 cDNA(s)，以進行漆氧化酶基因的分離與光誘導表現之研究。

由於樟芝在先前的研究中，所含多項成分已為醫療上或抗老化等功能所肯定，針對真菌漆氧化 酶的存在與相關研究，相信亦是一個値得探討的領域。因此計畫以樟芝為實驗材料，進行漆氧化酶 基因的分離，並且能夠進一步研究其基因表現，對於樟芝價值的再提升、以及漆氧化酶的研究與利 用，都將是具有挑戰性與應用性的研究。

(二) 結果與討論

1. 光誘導固態培養之樟芝菌絲產生漆氧化酶活性

Reaction time

0 min 30 min 60 min

圖 1. 樟芝菌株 BCRC35398 經光照後，以 ABTS 初步進行酵素活性測試之檢測結果。

如圖 1 所示，於加入 ABTS 後 30 分鐘至 60 分鐘，藍色呈色顯示菌絲具有漆氧化酶活性。

證明樟芝漆氧化酶活性可經光照誘導。

2. 聚合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 引子設計

圖 2. 經比對相近物種漆氧化酶基因序列，所設計引子在基因上的相對位置。其中 I、

II、III、IV 表示為銅離子結合位置

3. 樟芝漆氧化酶基因 cDNA 之分離

經由比對多條已發表之真菌漆氧化酶基因，參考保守區域設計引子，於 PCR 放大後，得到 樟芝漆氧化酶基因 cDNA 的部分序列。圖 3 為 RT-PCR 反應後之膠體電泳圖，箭頭所示為預期長度 約 999 bp 之漆氧化酶基因 cDNA。

圖 3. 樟芝菌株 BCRC35398 經光照後萃取 RNA，經由 RT-PCR 反應後進行膠體電泳的結果。Lane 2 為 PCR 反應時所使用的 annealing temperature 為 52.7℃，可得較佳的實驗結果，預期長度約為 999 bp。

4. 漆氧化酶基因序列比對

經過 RT-PCR 產物接合至 pGEM-T Easy Vector、轉殖大腸桿菌、少量繁殖後進行質體純化，

將此重組質體進行定序分析後，利用生物資訊網站 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 中的 BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 功能，與資料庫現有之漆氧化酶基因序

列進行比對，結果如圖 4。紅色區塊顯示與資料庫內現有之漆氧化酶基因序列具有及高相似度，確 認所分離出之 cDNA 序列為漆氧化酶基因。

圖 4. 將所分離出之 cDNA 片段經與 NCBI 資料庫比對後的結果。由紅色區塊顯示與資料庫內現存 基因序列有極高相似度。

5. 未來展望

目前初步結果顯示，樟芝固態培養下經光照可誘導漆氧化酶基因表現；此計畫未來可朝以下 方向進行：繼續延長光照時程/照光後避光/避光後照光等處理，以了解在不同光照處理下，漆氧化 酶基因表現情形，期能對該基因有更多了解。

(三) 參考文獻

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