新生期投予Dexamethasone 對大白鼠成年期杏仁核功能之影響

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 新生期投予新生期投予 Dexamethasone 對大白鼠大白鼠成年期杏仁核功能之影響成年期杏仁核功能之影響 The effects of neonatal dexamethasone treatment on amygdala function in adult rats. 研究生：洪于惠 Yu-Hui Hung. 指導教授：呂國棟博士 Kwok-Tung Lu, Ph.D.. 中華民國九十八年六月.

(2) 目錄中文摘要 (Abstract in Chinese) ........................................................... - 4 英文摘要 (Abstract in English) ............................................................ - 7 第一章. 緒論 (Introduction) ............................................................ - 10 -. 一、研究背景............................................................................... - 11 二、研究目的............................................................................... - 24 第二章. 研究材料與方法 (Materials and Methods) ...................... - 25 -. 一、實驗動物（Animals） ......................................................... - 26 二、實驗藥品 (Drugs) ................................................................ - 26 三、藥物投予方式 (Drug administration) ................................. - 26 四、電生理學紀錄法（Electrophysiological recording)............ - 28 A. 杏仁核腦薄片製備 (Amygdala slice preparation )....... - 28 五、行為測試 (Behavioral experiment) ..................................... - 31 A. 高台曝露 (Exposed of flat-top) ...................................... - 31 B. 自發性運動行為 (Locomotor activity) ......................... - 31 C. 平衡桿測試 (Rota-rod test) ........................................... - 32 D. 強迫游泳 (Forced swimming test；FST)...................... - 32 E. 恐懼促進之驚跳反應 (Fear potentiated startle；FPS) .. - 33 六、統計方法 (Statistics)............................................................ - 36 -. -2-.

(3) 第三章. 實驗結果 (Results) ............................................................ - 37 -. 第四章. 討論 (Discussion) .............................................................. - 55 -. 第五章. 參考文獻 (References) ...................................................... - 62 -. 第六章. 圖表 (Figures and Tables) ................................................. - 71 -. -3-.

(4) 中文摘要 (Abstract in Chinese). -4-.

(5) 中文摘要中文摘要人類於新生期所面對的心理或生理壓力，會對成年期的情緒表達或生理狀況產生深遠的影響。Dexamethasone（DEX）為一種人工合成的醣皮質激素，常用於早產兒的治療，它可有效的降低早產兒因肺部發育不良所引發的慢性呼吸系統疾病 (chronic lung disease)。近期研究顯示在大白鼠新生期投予 DEX 可能導致青少年期空間記憶產生障礙，亦會干擾海馬迴 (hippocampus) 中長期增益現象 (long-term potentiation；LTP) 的形成。而這些不良影響在成年期可獲得改善。新近的研究結果指出，新生期投予 DEX 亦可能使下視丘-腦下垂體腎上腺機制(hypothalamo–pituitary–adrenal；HPA axis) 失調導致情緒或恐懼記憶造成影響。因此，本研究利用 Wistar 大白鼠，於出生後第一至第三天，以皮下注射的方式遞減式的投予 DEX。結果顯示新生期投予 DEX，體重增幅明顯趨緩，但在六週後此現象逐漸消失。新生期投予 DEX 之大白鼠在八週仍會抑制杏仁核長期增益現象。自發性運動行為及平衡桿測試的表現並沒有顯著差異，故藥物之投予並不影響動物的活動力或基本的運動功能。強迫游泳測試 (forced swimming test；FST) 發現，新生期投予 DEX 的大白鼠在短時間內即放棄掙扎，在水中靜止與漂浮的時間較長，且經曝露高台 (exposed of flat-top) 的刺激後，實驗組大白鼠漂浮時間顯著增長，並達顯著差. -5-.

(6) 異。因此在壓力刺激下，可能會增加其憂鬱行為表現。動物由恐懼所促進之驚跳反應 (fear potentiated startle；FPS) 的行為模式結果顯示，動物在新生期接受 DEX 確實影響大白鼠成年後條件化恐懼記憶 (fear condition) 的建立，使之無法形成。由結果可推論，新生期接受 DEX 注射會影響成鼠杏仁核形成長期增益現象。新生期 DEX 投予雖不影響動物活動力與運動功能，但曝露於壓力情境下，會較易顯現出憂鬱之傾向，並且干擾動物對外界線索的連結，影響條件化恐懼記憶的形成。綜合此等結果，我們認為新生期投予 DEX 對於動物杏仁核神經傳導活性之神經可塑性、壓力引起的情緒反應以及條件化恐懼記憶的形成皆會造成顯著影響，且可延續至成年期。. 關鍵字：Dexamethasone （DEX）、長期增益現象、高台曝露、強迫游泳、恐懼驚嚇反應、杏仁核。. -6-.

(7) 英文摘要 (Abstract in English). -7-.

(8) 英文摘要 Synthetic glucocorticoid dexamethasone (DEX) is frequently used as a therapeutic agent to lessen the morbidity of chronic lung disease in premature infants. Previous studies suggest neonatal DEX treatment altered hippocampal synaptic plasticity and associative memory in rats. It has been recognized that the amygdala is highly involved in emotional processes. In fact, considerable evidence suggests that the amygdala may be a critical site of neuronal plasticity for fear learning. The present study was aimed to evaluate the possible effects of neonatal DEX treatment on the synaptic function of amygdala in adult rats. To achieve this goal, we were subcutaneous injection (sc) of tapering doses of DEX from postnatal day. 1. to. 3,. PN1~PN3.. Animals. were. then. subjected. for. electrophysiological recording, forced swimming test (FST) and fear potentiated startle (FPS) at the age of 8 weeks. Results showed that neonatal DEX treatment temporary decrease body weight in the young rats, but not affected in the later life when compared with the control group. Neonatal DEX treatment blocked LTP formation in basolateral nucleus of amygdala. Locomotor activity and rota-rod results showed that neonatal DEX treatment did not affect animal’s motor function. Neonatal DEX treatment also increased depression-like behavior in adulthood which had been determined by using FST. The percentage of time spent in free floating is significant increased via exposed of flat-top in the DEX treated group compared with the control animals. Furthermore, fear potentiated startle evidence that neonatal DEX treatment to hold back formation of fear condition in adulthood. Our results suggest that -8-.

(9) neonatal DEX treatment may have adverse consequence in the later life. The resulted gathered from this study not only expand our knowledge on the neural basis of fear learning, but also help us to know how neonatal stress may alter the neuroplasticity in amygdala . The conclusion that enhancement of the susceptibility for depression disorder and wrong to connect with fear condition in later life.. Key word：Dexamethasone（DEX）、long-term potentiation (LTP)、 exposed of flat-top、forced swimming test (FST)、fear potentiated startle (FPS)、amygdala。. -9-.

(10) 第一章緒論 (Introduction). - 10 -.

(11) 一、研究背景母體懷孕若於 20~37 週內發生的分娩稱之為早產 (premature) 其發生率約佔所有懷孕的 5~10%，卻佔新生兒主要的死亡原因 80% 。另外可依出生體重分為：出生體重低於 2500 公克稱為低體重 (low birth weight； LBW)，出生體重低於 1500 公克者稱為極低體重 (very low birth weight；VLBW) 出生體重低於 1000 公克者稱為超極低體重 (extremely low birth weight；ELBW) (Smith et al., 1994)。早產兒 (premature infants) 出生時，所有的生理狀況，幾乎都可歸因於身體組織的發育不成熟，像是皮膚發育不成熟、防禦病菌的能力差、呼吸系統無法維持足夠的呼吸與氣體交換，因腦組織的血管也尚未成熟，易併發腦室內出血 (intraventricular hemorrhage) 及週腦室白質軟化症 (periventricular leukomalacia) (Crowley, 2006)，家屬及社會需負擔龐大的醫療支出，來照顧這些脆弱的新生命。文獻亦指出少於 32 週的早產兒高達 40-50% 會罹患慢性呼吸系統疾病 (chronic lung disease；CLD) (Liggins and Howie, 1972; Chiswick, 1995)，其主要原因為早產兒肺部第二型肺泡細胞 (alveolar type II pneumocyte) 發育尚未成熟，無法分泌足夠的表面張力 (surfactant)，使得肺泡壁張力不佳而導致肺泡塌陷，造成呼吸窘迫症候群 (respiratory distress syndrome；RDS)。若能於出生後前三天給予治療，則是一個重要的. - 11 -.

(12) 關鍵期 (Dobbing and Sands, 1979; Bakker et al., 2000)。前人研究文獻指出人工合成的醣皮質激素之 dexamethasone (DEX)，它可藉由增加表面張力素之分泌，促進肺部之成熟 (Lee et al., 2000; Lemons et al., 2001)，進而提升早產兒的存活率，降低死亡風險以及早產兒常見的併發症。過去的研究中，通常是利用動物模式建立評估新生期投予 DEX 對於神經方面之影響，根據 Dobbing (1981) 所提出的理論，大白鼠在出生後第一天 (postnatal day；P1) 其腦部發育相當於人類胎兒約懷孕期 22-24 週，出生後第二天相當於人類胎兒約懷孕期 24-28 週，出生後第三天相當於人類胎兒約懷孕期 29 週，直到出生後第七天，大白鼠的腦部發育趨近於成熟，相當足月出生 (38-40 週) 的胎兒大腦。大白鼠在出生後七天是腦部發育重要階段，在這段時間投予 DEX 正好可當作神經發育影響之動物模式。然而，新生期投予 DEX 對於整體生長、神經發育、學習與記憶，對於外界壓力的耐受性皆具有影響，尤其對於壓力的反應性更被認為與學習及神經可塑性的調控有著密切關係 (Lin et al., 2006)。. - 12 -.

(13) (1). 醣皮質激素 (Glucocorticoids) 腎上腺皮質分泌的醣皮質激素，無論是體內分泌，或是臨床上研發的各種腎上腺皮質素類似衍生物，皆統稱為類固醇類激素。人體產生的醣皮質激素，和其他相似的衍生物之化學相關性，可利用 cortisone 的化學結構來加以說明 (圖一，A)，而本篇論文使用的 DEX，僅在碳 16 上多了 α- CH3 ，碳 9 上多了 α- F (圖一，B)，為具有強力抗炎效果及極弱鈉鹽滯留作用之長效型腎上腺皮質激素，吸收效率高，由腸胃道即可吸收，故可經由口服投藥 (口服 1 小時候血中濃度達最高值，藥效持續 2.75 天 ) ，另外亦可藉由靜脈 (intravenous)、皮下 (subcutaneous)、肌肉 (intramuscular) 注射 (注射 8 小時後血中濃度達最高值，藥效持續 6 小時)，吸收後可藉由循環系統分佈於全身，可通過胎盤作用於胎兒，亦可經由乳腺分泌。DEX 藥效持久，半衰期 3~4.5 小時，並可抑制下視丘-腦下垂體-腎上腺機制長達 35 至 54 小時。醣皮質激素的主要作用機制，為控制蛋白質的合成速率，可直接進入細胞，與細胞質中之醣皮質激素接受器 (glucocorticoid receptor；GR) 結合後，會形成複合體，隨後複合體轉移進入細胞核中，調控特定蛋白質的生合成，再經由新合成的蛋白質，影響體內的生化反應。又因醣皮質激素具有脂溶性，可直接通過神經細胞膜，與. - 13 -.

(14) 位於胞內的接受器結合產生作用。其作用形態可依照作用速度的快慢，分為兩類，作用快的一種主要透過調節細胞膜上的離子通道而產生，較慢的一種則是透過改變特定基因的轉錄作用，進而調節神經細胞內的接受器、神經傳遞物質、酵素的數量及活性。當面臨緊急狀況時，人體會產生快速的動作反應，主要透過活化腎上腺髓質，使得大量腎上腺素和正腎上腺素被釋放進入循環系統，進而改變體內的能量代謝，使得個體產生足夠的能量，進行「戰或逃」的反應。隨後體內產生的種種壓力反應，主要是透過活化人體內的邊緣系統 (limbic system) 所投射的下視丘-腦下垂體-腎上腺機制 (圖二)，當危險狀況解決後，亦需透過醣皮質激素的作用，重建體內的恆定狀態 (Korte et al., 1995)。. - 14 -.

(15) (2). 下視丘-腦下垂體下視丘腦下垂體-腎上腺腦下垂體腎上腺機制腎上腺機制 (hypothalamo–pituitary–adrenal；；HPA axis) Hans Selye 在發表於Nature 的文獻指出，當壓力 (stress) 或有害物質(noxious agents) 存在下，身體會得到警訊開始產生反應時，可泛指為「一般適應症候群 (general adaptation syndrome)」(Selye, 1998; Bao et al., 2008)。雖然壓力反應是為了維持身體內部環境的恆定 (homeostasis)，但壓力系統處於過度刺激活化下視丘-腦下垂體-腎上腺機制時，容易增加肥胖、心血管疾病、憂鬱以及提高伺機性感染等疾病的發生率。當我們面臨壓力時，下視丘-腦下垂體-腎上腺機制會促使下視丘室旁核 (paraventricular nucleus) 釋放促腎上腺皮質激素釋放因子 (corticotropin – releasing hormone；CRH) ，引發腦下垂體 (pituitary gland) 作用，釋放促醣皮質激素 (adrenocorticotropic hormone ； ACTH) ，使腎上腺皮質 (adrenal cortex) 分泌 cortisone，進一步應付外來的環境壓力，此調節對動物生命的維持不可或缺 (Nagano et al., 2008)，也是扮演胎兒生長和器官發育的重要角色 (Dallman et al., 1987)。在許多的器官和腦區中 cortisone 是扮演主要的壓力激素，可分為兩大類接受器，礦物性皮質激素接受器 (mineralocorticoid receptor；MR) 和醣皮質激素接受器 (Reul and de Kloet, 1985)。醣皮. - 15 -.

(16) 質激素接受器位於情緒認知之腦區，像是海馬迴、杏仁核 (amygdala) 和前額葉皮質區 ( prefrontal cortex；PFC) 等，參與下視丘-腦下垂體 -腎上腺機制之調控。然而，研究也顯示在情緒認知腦區中，如杏仁核、前額葉皮質區和腦幹之藍斑核 (locus coeruleus) 若受到固醇類 (corticosteroids) 刺激，會干擾下視丘-腦下垂體-腎上腺機制活化失調，亦影響情緒壓力反應的應對 (Quirarte et al., 1997; Roozendaal, 2002; Fuchs et al., 2004)。近年來的研究，利用新生兒隔離 (neonatal isolation) 或與母子分離 (maternal separation) 之動物模式，都證實這些幼鼠往後於青春期 (adolescence) 和成年期 (adulthood) 面臨壓力時，會有別於一般正常的大白鼠，產生異常的行為表現及生理反應 (Vanderschuren et al., 1997; Kamphuis et al., 2004)。前人研究也指出，當下視丘-腦下垂體腎上腺機制尚未發育完全時，投予 DEX 藥物，相較於控制組幼鼠，於成長後會影響其心理和生理之功能如認知 (cognitive) 及運動 (motor) 功能的缺損 (Barrington, 2001; Halliday et al., 2003; Jones, 2005)、增加心血管疾病 (cardiovascular system) 之罹患率、神經內分泌系統 (neuroendocrine system) 失調、免疫反應不良 (Meaney et al., 1996; Weaver et al., 2004; Lin et al., 2006; Noorlander et al., 2006) 並降低下視丘 - 腦下垂體 - 腎上腺機制調控 (Kamphuis et al., 2002;. - 16 -.

(17) Kamphuis et al., 2004; Karemaker et al., 2008)，更有學者指出在女性的發生比例會比男性高 (Karemaker et al., 2006; Karemaker et al., 2008)，此等論述都可推測下視丘-腦下垂體-腎上腺機制可能成為情緒性疾病的主要成因，像是外在環境或內在基因的危險因素促使過度活化下視丘-腦下垂體-腎上腺機制，進而導致情緒性疾病產生，並牽涉著壓力系統反應。. - 17 -.

(18) (3). 情緒性疾病 (emotional illness) 動物在生理上或精神上受到外來刺激時，所引起種種心理上的反應，即是所謂的情緒。由於具有體驗及表現情緒能力，使的動物從刻板行為中解放出來，也因為情緒的起伏，得以感受喜、怒、哀、樂，乃至於威脅、恐懼等。因而在自然環境下，隨時會面臨到生存的壓力及危險情緒反應對於生物的生存具有莫大的重要性。當我們的情緒讓體內的調節無法獲得平衡，此時身體就會外顯表徵在異常的行為上，然而，影響情緒壓力所導致的精神疾病，亦可統稱為情緒性疾病。而所謂壓力是指：任何情況下會傷害到身體或引起細胞死亡的情形，都可泛稱為壓力，而壓力可來自於不良環境、高低氣溫、繁重工作、負面情緒、藥物副作用、營養素缺乏、醫療行為、疾病等。此外，心理分析學家 (psychoanalyst) 研究亦指出幼年期身體受虐 (physical abuse) 或遭受不當對待 (maltreatment) ，以及母子關係或養育的環境不良，對於後期人格上的不健全發展有直接的關連性 (Bifulco et al., 1991; McCauley et al., 1997; Young et al., 1997; Widom, 1999; Imanaka et al., 2006) 。個體是經過重度壓力事件例如暴力攻擊、施虐、監禁、受虐兒童、嚴重的意外後，出現持續性或延遲發生之壓力疾病，臨床上稱為創傷後壓力症候群 (post-traumatic stress disorder；PTSD) (Gorman et al.,. - 18 -.

(19) 2000)，學者亦指出創傷後壓力症候群的病患中，女性比例明顯高於男性 (Louvart et al., 2009)，其原因可能長期牽涉下視丘-腦下垂體-腎上腺機制異常活化 (hyperactivity)，導致此行為表徵常伴隨憂鬱和多項焦慮及恐懼症發生 (Tarullo and Gunnar, 2006)。近年來的文獻指出，動物曝露在急性壓力 (acute stress) 的環境中，令使其動物處於驚嚇 (freezing) 狀態，可能會造成工作性記憶 (working memory) 受到干擾 (Murphy et al., 1996)。另外，目前在動物實驗上，已發展出許多評斷情緒壓力導致行為異常的實驗模式。 Porsolt. (1977 ) 提出強迫游泳運動 (forced. swimming test) 之動物行為實驗，可在行為上判斷實驗動物是否憂鬱。在實驗動物放入水裡開始游泳後，以開始產生靜止不動的時間 (immobility time) 作基準，靜止不動的時間發生得越早或越長，均可視作憂鬱反應的指標 (Porsolt et al., 1977; Huang and Lin, 2006)。另一項恐懼促進之驚跳反應 (fear potentiated startle；FPS) 也是目前研究恐懼情緒記憶的主要動物模式。透過給予一個條件化刺激 (conditioned stimulus, CS) ，例如聲音或燈光，再配合嫌惡性的非條件化刺激 (unconditioned stimulus, US) ，通常給予一個足部電擊。經過連續配對訓練後，當再次給予條件化刺激時，實驗動物會產生害怕的生理反應，行為上也會因為害怕而產生恐懼驚嚇反應的表現 (Lu et. - 19 -.

(20) al., 2001)。而導致動物引發憂鬱或恐懼表現的成因，源自於影響邊緣系統所投射的下視丘-腦下垂體-腎上腺機制 (Welberg et al., 2001; Nestler et al., 2002)。在邊緣系統中，海馬迴和杏仁核為兩個與學習記憶有關之腦區，而海馬迴主要掌控動物對空間記憶的學習，杏仁核則是負責情緒性記憶的學習，參與恐懼記憶 (fear memory) 的形成，即恐懼記憶的獲得 (acquisition) 、表現 (expression) 與消減 (extinction) (Fendt, 2001)。兩者都是情緒學習記憶重要腦區。. - 20 -.

(21) (4). 杏仁核，；LTP) 杏仁核，長期增益現象長期增益現象 (long-term potentiation；與記憶的關聯性記憶是對過去的經驗喚回和重現 (Tully et al., 2003)，神經系統在學習與記憶的過程中，分別透過獲得 (acquisition)、固化 (consolidation)、保留 (retention) 與提取 (retrieval) 四個階段來處理訊息。並依據被提取的方式來分類，可將記憶分為外顯性 (explicit) 與內隱性 (implicit)，即陳述性 (declarative) 與非陳述性(non-declarative) 記憶。陳述性記憶為有意識地回憶過去所發生的事，屬於事實、念頭及事件的記憶，例如今早與朋友的對話內容；非陳述性記憶則為自動化與反射的反應，無法清楚地以言語陳述，而是利用行為表現來顯示該記憶，例如運動技能、習慣、情緒學習以及反射 (Thompson and Kim, 1996)。另外，美國心理學家 James W (1980) 將記憶簡單區分為：1. 短期記憶 (short term memory) 只能持續幾秒鐘或幾分鐘。2.長期記憶 (long term memory) 可以持續幾小時、幾天、幾年，甚至終生 (Castellucci et al., 1986)。當我們經由感官刺激接收新訊息，進入短期記憶，透過編碼 (encoding) 的過程，將記憶固化後，便進入中期記憶型態；若經由不斷再學習獲得或提取，使記憶型態再次固化 (reconsolidation)，轉換成長期記憶 (Castellucci et al., 1986)。然而被認為跟學習記憶相關的神經模式，由 Bliss (1973) 學者提. - 21 -.

(22) 出的長期增益現象，利用電生理實驗方式，以高頻的電刺激 (high-frequency stimulus；HFS)，藉由突觸可塑性形成聯結，而這些突觸的連結具有雙向調節作用，當神經元突觸聯結及傳導性變強的時候，將會接收到的新訊息，儲存在特定的腦區 (Bliss and Gardner-Medwin, 1973) 。當突觸前 (presynapse) 神經元釋放興奮性神經傳遞物質 (excitatory neurotransmitter)，特別是麩胺酸（glutamate）的釋放，會使 alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor (AMPA) 型受體打開，讓鈉離子流入突觸後 (postsynapse) 神經元，引發膜電位上升，產生去極化 (depolarization)，並活化 N- methyl D-aspartate receptor (NMDA) 型受體，鈣離子和鈉離子向內流入突觸後細胞，這時鈣離子會接合調鈣素 (calmodulin) 形成複合物，以 Ca2+-calmodulin complex 的型式與下游分子機制作用，例如 Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaM kinaseII)、 Mitogen-activated protein kinases (MAPK) (Impey et al., 1999)、cyclic AMP- dependent protein kinase (PKA)、cAMP response element-binding protein (CREB) (Wikstrom et al., 2003) 等…(圖三)。先前的研究顯示 1. 杏仁核 NMDA 接受體參與條件化恐懼之消減作用。 2. NMDA 接受體刺激活化 MAPK。 3. 杏仁核之 MAPK 活化，連結了條件化恐懼的建立和長期增益現象的形成 (English and Sweatt, 1996; Xia et al.,. - 22 -.

(23) 1996)。許多證據顯示，在恐懼記憶的獲取及形成長期記憶的過程，均與杏仁核中長期增益現象的形成，有着密切的相關性 (Rogan et al., 1997; Maren, 1999)。. 由於 DEX 的投予牽涉著下視丘-腦下垂體-腎上腺反應機制的平衡，影響動物面臨壓力時的生理反應及情緒性記憶之形成，故本研究主要目的在探討新生期投予 DEX 是否會影響成年期杏仁核調控之行為表現，並試圖釐清給予大白鼠急性壓力後，是否會影響行為及對恐懼記憶之學習，另一方面，先前的研究指出，新生期投予 DEX 會改變海馬迴的突觸可塑性，進而影響青春期空間記憶的形成，但不持續至成年期。然而在其它腦區的影響是否會延續至成年期？此現象是否源自於藥物對杏仁核神經連結之影響，亦是值得探討的問題。本實驗希望藉由新生期投予 DEX 的模式，使我們對於下視丘-腦下垂體腎上腺機制和學習與記憶之相關機轉有所瞭解，並提供 DEX 在用藥安全及臨床治療上之参考。. - 23 -.

(24) 二、研究目的本研究之主軸在於完成下列目標，以釐清人工合成之醣皮質激素 DEX 對於大白鼠成年期面臨急性壓力時，杏仁核調控之行為影響。. 1. 探討新生期投予 DEX，是否對大白鼠成年期杏仁核的神經可塑性功能造成不良的影響。. 2. 探討新生期投予 DEX，正常環境下 (不給予高台曝露)，是否對大白鼠成年期情緒表現造成不良影響。. 3. 探討新生期投予 DEX，面臨急性壓力時 (給予高台曝露)，是否對大白鼠成年期情緒表現造成不良影響。. 4. 探討新生期投予 DEX，是否對大白鼠成年期條件化恐懼的建立造成不良影響。. - 24 -.

(25) 第二章研究材料與方法 (Materials and Methods). - 25 -.

(26) 研究材料一、實驗動物（）實驗動物（Animals）實臉中所使用之 Wistar 品系的母鼠，(購自台灣大學實驗動物研究中心)，實驗期間將動物飼養於國立台灣師範大學生命科學系之動物房，自行進行配種，供給充足之食物及飲水，其溫度維持約 23 至 25 度，晝夜循環設定為 12 / 12小時（早上 6 點至下午 6 點定為白晝期問）。懷孕期大約為 21 至 23 天後可產幼鼠，幼鼠離乳期為 21 天，離乳後飼養至 8 週齡時再進行實臉，所有行為實驗均於動物之光週期進行，動物房清潔之維護由動物房工作人員負責，本研究之動物實驗均經由國立台灣師範大學實驗動物管理委員會之審查及監督。. 二、實驗藥品 (Drugs) Dexamethasone (DEX) 購自於南光化學製藥股份有限公司。. 三、藥物投予方式 (Drug administration) 每批幼鼠大致上分為兩組，即saline組 (控制組）和DEX組（實驗組。幼鼠出生後 1-3 天 (P1-P3) 利用皮下注射 (subcutaneous injection；SC) 方式投藥，兩組動物各別給予生理食鹽水或 DEX 注射，並每週測量其體重，以驗證是否給藥成功。本投藥方式則採用過去文獻所使用的藥物劑量，DEX 的劑量是按照 Pl (0.5 mg/kg)、P2 - 26 -.

(27) (0.3 mg/kg)、P3 (0.1 mg/kg )的方式投藥 (Lin et al., 2006)，對照組則給予相等體積的生理食鹽水。於 8 週齡時，再進行以下實驗。. - 27 -.

(28) 研究方法四、離體胞外電離體胞外電生理學紀錄法（In vitro extracellular electrophysiological recording) 實驗主要探討投予DEX後，是否會影響大白鼠成年期杏仁核之神經功能。. A. 杏仁核腦薄片製備 (Amygdala slice preparation ) 先將 8 週年紀的大白鼠利用不銹鋼動物斷頭台 (guillotine) 將其斷頭犧牲。以剪刀剪開頭皮，再利用小骨剪將腦上之頭蓋骨剪除，之後以小鑷子將腦膜 (dura) 挑開，並以取腦扁平器將神經與腦殼分離，大腦放入裝有 4oC 人工腦脊髓液 ( artificial cerebrospinal fluid , ACSF) (參考，溶液配製一) 的燒杯中，實驗過程中腦組織皆放置於持續供給 95 % O2 和 5 % C02 混合氣體之腦脊髓液中。之後將大腦倒入鋪有濾紙的培養皿中，並使大腦持續浸潤於充有混合氣體的 ACSF 中。接著用解剖刀將整個小腦切除，大腦對切分為左右半腦，並以快乾膠固定於載物台上，再置於震動切片機 (vibrotome) 的水槽中。以刀片進行水平切法 (horizontal section) 的方式將大腦切成厚度約 400 µm 的腦薄片 (brain slice) 。取含有杏仁核的腦薄片，於室溫下靜置於混合氣體之腦脊髓液中，至少 1 小時再進行實臉。. - 28 -.

(29) 使用胞外電生理學紀錄法 (extracellular recording)，將杏仁核腦薄片移至紀錄槽 (recording chamber ) 中，以黏有尼龍細線的不鏽鋼環固定杏仁核腦薄片，並使 ACSF 覆蓋。灌流的速率為每分鐘維持 2-3 滴的流速(視情況而調整)，並利用循環式加熱器使紀錄槽內溶液的溫度維持在 32℃左右。準備好之後，將雙極型刺激電極擺放在側杏仁核 (basolateral amygdala；BLA) 區域，紀錄電極擺放於杏仁中央核 (amygdaloid central ； CeA) 區域，以誘發突觸後的反應 (field excitatory postsynaptic potential; fEPSP)。呈穩定狀態後，開始記錄突觸的基礎訊號 (baseline)，約 20 分鐘後，誘發長期增益現象。其誘發長期增益現象的方法為：給予三次持續一秒鐘 100Hz 的高頻電刺激，每次間隔 20 秒，再持續紀錄至少一小時，觀察其變化。. - 29 -.

(30) 【溶液配製一】 ACSF 10 X Stock （1L，保存於4℃，一週內使用完畢）藥品名稱（分子量）濃度（mM）. 重量（g）. NaCl（58.5）. 1170. 68.45. KCl（74.5）. 47. 3.50. CaCl2（111）. 25. 2.78. MgCl2．6H2O（203.3） 12. 2.44. NaH2PO4．H2O（138） 12. 1.66. Powder（1L，以密封袋保存於乾燥箱中）藥品名稱（分子量）濃度（mM）. 重量（g）. NaHCO3（84）. 25. 2.1. Glucose（180）. 11. 1.98. - 30 -.

(31) 五、行為測試 (Behavioral experiment). A. 高台曝高台曝露 (Exposed of flat-top) 此實驗目的主要探討給予實驗動物急性壓力後，是否會造成壓力後創傷之行為變化。操作方法如下：進行每項行為測試之前，將實驗動物置於離地面一公尺的一個平台，平台面積約 14 X 14 公分，讓大白鼠待其 15 分鐘後，間隔一小時，進行下一個行為實驗。. B. 自發性運動行為 (Locomotor activity) 此行為測試主要目的是為了排除藥物的投予後，是否影響實驗動物之活動能力及自發性探索行為，進而改變大白鼠的運動能力。實驗器材與操作方法如下：將大白鼠置於 42 x 42 x 36 cm3 的壓克力箱中，透過其正上方之小型直立式攝影機可拍攝紀錄大白鼠在壓克力箱中的活動，經由 EthoVision video tracking system 設備 (EthoVision ; Noldus , NED) 以每秒鐘拍攝六次記錄動物的中心點位置變化，再將整個活動軌跡傳送到電腦螢幕上直接觀察到大白鼠水平移動情形 (distance of horizontal movement)，並利用此軟體進行累計運算，每五分鐘紀錄統計一次實驗鼠活動情形，連續紀錄 15 分鐘。. - 31 -.

(32) C. 平衡桿測試 (Rota-rod test) 平衡桿測試主要在探討動物平衡感與運動功能的協調性，此實驗目的藉由此行為測試排除藥物的投予後，是否影響實驗動物之平衡感及運動功能協調能力的變化。平衡桿測試 (Ugo Basile, Varese, ltaly) 操作方法如下：將大白鼠置於離地面高 30 公分，可控制轉速的橫桿上。進行測試之前先給予實驗動物 600 秒的低轉速 (約 4 rpm) 跑步訓練，使大白鼠習得基本跑步能力，之後間隔一小時，開啟加速開關增加轉速，並同時啟動計時踏板及觀察儀器上的加速格。待大白鼠自橫桿上掉落後，紀錄計時踏板時間以及掉落時儀器加速格格數。依此程序測試三次後求其平均停留時間，再進行數據分析。. D. 強迫游泳 (Forced swimming test；；FST) 此行為測試主要源自老鼠怕水的習性，正常情況下老鼠放入水中都會奮力掙扎，然而有憂鬱傾向的老鼠，投入水中其掙扎情況會明顯下降，即所謂不動時間 (immobility time) 會增加 (Porsolt et al., 1977)。實驗步驟如下：利用使用直徑 18 cm，高 38 cm 的透明圓柱壓克力桶，實驗進行前於桶內裝盛高約 30 cm，溫度約 25 度的自來水，將大白鼠放入桶內，使其漂浮於水面上，尾部無法碰觸壓克力桶底部。實驗第一天先讓大白鼠漂浮於水中 15 分鐘，並於結束後將大. - 32 -.

(33) 白鼠撈起，置於壓克力箱中，以 60W 燈泡將毛髮烘乾後，再放回飼養箱中。第二天以同樣方式將大白鼠置入已盛水之壓克力桶內，以攝影機紀錄大白鼠 5 分鐘內掙扎的狀況，以大白鼠口鼻部沒入水面下，且四肢沒有明顯划水之動作定義為不掙扎，累計大白鼠不掙扎的總時間，進行跨組的比較。. E. 恐懼所促進之；FPS) 恐懼所促進之驚所促進之驚跳反應 (Fear potentiated startle； 1. 行為實驗儀器（behavioral apparatus）由恐懼所促進之動物驚跳反應測定，利用動物行為箱進行實驗 (San Diego Instrument, USA, CA92126)，此行為箱內部附有電擊桿及燈光顯示，於儀器底部有一震動感應器（accelerometer），當動物因聲音刺激或電擊而產生驚跳反應時，所造成之震動變化，可經由壓力感應器接受，透過儀器整合，轉換成電子訊號，傳送至控制儀器之電腦中，原廠所附之程式將記錄動物驚跳反應之大小，驚跳反應強度被定義為刺激呈現後 280 毫秒內所產生最大震動。 2. 行為實驗程序（general behavioral procedures）所有實驗將進行以下之實驗程序，包括馴化階段、條件化恐懼訓練前驚跳測試、條件化恐懼訓練、消減作用訓練前測試。主要分組依據有二：第一、於條件化恐懼訓練前驚跳測試，無明顯驚跳反應之動物將. - 33 -.

(34) 排除於實驗外，其原因為排除可能具有運動功能或知覺障礙之動物；第二、採用消減作用訓練前測試，使每組動物於消減作用訓練前均具有相似程度之驚跳反應。茲分述各階段實驗動物處理如下：(Lu et al., 2001; Walker et al., 2002) a. 馴化階段 (acclimation) 於實驗開始之前三天，每天將動物置放於行為箱中 10 分鐘，其目的為使大白鼠熟悉背景音所籠罩的環境，讓大白鼠對此未曾接觸過之環境能漸漸熟悉，進而降低其探索行為，以免在日後的實驗記錄中，受到自發行為活動量的干擾。所有行為實驗程序中，每個階段的背景音量皆設定為 70 分貝，稍微高於行為箱外的室內音量，如此一來可以隔絕外部噪音之干擾，以確保所有的刺激皆來自於儀器。馴化階段結束後將動物放回原飼養之吊籠內。 b. 條件化恐懼訓練前驚跳測試 (match) 連續兩天將動物置放於行為箱內，給予 30 次 95 分貝之聲音刺激，並記錄由聲音所引發之大白鼠驚跳反應，無明顯驚跳反應之動物將排除於實驗外，因為這些動物可能具有聽覺或運動功能障礙，因此不適合用於研究。 c. 條件化恐懼訓練 (fear conditioning) 於前述測試結束 24 小時後，動物被放置於行為箱中接受 10 次. - 34 -.

(35) 光—足部電擊之配對訓練（light-shock pairing），足部電擊（非條件化刺激, US）將於燈光（條件化刺激, CS）呈現 3.2 秒時給予，電擊強度為 0.6 毫安培持續一秒鐘，每次訓練之平均間隔為 4 分鐘，訓練動物時同時記錄其由電擊所引發之驚跳反應。 d. 消減作用訓練前測試 (pre-extinction training test) 於前述測試結束 24 小時後，動物重回行為箱中靜待五分鐘，接著給予十次燈光合併聲音刺激（light-noise, LN）（95 分貝），以及十次單獨聲音刺激（noise alone, NA）（95 分貝），並記錄其驚跳反應，由恐懼所促進之驚跳反應（FPS），其計算方法為利用燈光合併聲音刺激時之平均反應，減去單獨由聲音刺激所引發之平均反應，兩者之差即為 FPS。為便於計算及減少個體差異對實驗數據之影響，驚跳反應將採以百分比方式計算稱為驚跳反應的百分比（ percent potentiated startle），舉例說明如下。某動物於測試時其 light-noise pairing 及 noise-alone 之反應分則為 100 及 50， FPS 等於兩者之差即 50（100-50 = 50），FPS 再除以 Noise alone 之數值（FPS/noise alone = 50/50 = 1），即 percent potentiated startle，等於 100% 。利用此測試之數值將動物予以分組，使得每一組動物於消減作用訓練前，均具有相似程度之驚跳反應。. - 35 -.

(36) FPS = activity of light-shock pairing 減去 activity of noise alone percent potentiated startle = FPS / activity of noise alone. 六、統計方法 (Statistics) 所有結果數值以 Mean ± S.E.M 之方法表示，所有之條件化恐懼行為實驗結果均採用 percent potentiated startle 方式表示，比較條件化恐懼記憶的影響，不同組間動物驚跳反應之差異，將進行 one-way ANOVA 比較，再以 modified t-test 進行組間分析，以probability value (p ≤ 0.05) 被認定具有統計上的顯著差異。. - 36 -.

(37) 第三章實驗結果 (Results). - 37 -.

(38) 實驗結果體重測量結果：(圖四) 分別比較各組出生後前三天以及第四、六、八週後的體重。數據顯示，新生期投予 DEX 後，P3、P28、P42天大白鼠在體重上，均較 control 組或是 naïve 組的體重輕，呈現生長趨緩的現象，且達統計上顯著差異 [ F(2,27)=15.967, p<0.01 ]、[F(2,27)=48.239, p <0.01 ]、 [F(2,27)=8.731, p<0.05]，而此差距於八週齡時獲得改善，統計上無顯著差異 [ F(2,27)=0.787, p=0.466 ]。由於醣皮質激素能夠刺激肝臟內蛋白質的合成及醣質新生作用 (gluconeogenesis)。然而，在周邊組織卻具有抑制蛋白質合成的功能。此外，醣皮質激素也能影響脂質生成 (lipogenesis)，使周邊的脂肪重新分佈至軀幹。因此，在新生期投予 DEX 會使大白鼠生長遲緩，平均體重低於正常大白鼠，對於未成年期的生長有重大的影響。此狀況在動物成年後，因體內醣皮質激素的分泌功能逐漸發育完成，得以逐步改善。由此圖四可發現新生期接受藥物投予的實驗組動物發育確實受到影響，亦可證實藥物投予成功，故進行下階段實驗，以釐清新生期投予 DEX 對於杏仁核神經可塑性、條件化恐懼行為、憂鬱行為測試之影響。. - 38 -.

(39) 實驗一實驗目的：探討新生期之 DEX 投予，對成年期杏仁核長期增益現象之影響。實驗流程：將實驗動物分為下列兩組： Group-1 為 control group，投予生理食鹽水。 Group-2 為 DEX treated group，給予老鼠皮下注射 DEX。新生鼠於出生後第一至第三天 (P1~P3)，每天接受單次 DEX 皮下注射，其劑量分別為 (P1: 0.5 mg/kg；P2: 0.3 mg/kg；P3: 0.1 mg/kg)。並於出生後的每週秤重一次，以觀察實驗動物的生長狀況，以及判斷投予藥物成功與否。於滿八週齡時，開始接受電生理實驗測試。電生理實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。實驗一流程圖：. Saline or DEX. 8 weeks. Electrophysiological recording 1day 2days 3days. - 39 -.

(40) 實驗結果：實驗結果： 1. 電生理學紀錄法：(圖五) 以八週齡大白鼠之腦薄片，給予三次間隔 20 秒的 100 Hz 的電刺激可以成功地在杏仁核區域成功誘發長期增益現象的表現，結果顯示， control 組，給予高頻電刺激後的一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號的 190 ± 4.1 %。然而在投予 DEX 的大白鼠其長期增益現象的表現明顯小於 control 組，其 fEPSP 的斜率為 106 ± 4.5 %。. - 40 -.

(41) 實驗二實驗目的：探討新生期之 DEX 投予，正常環境下對成年期自發性運動行為之影響。實驗流程：將實驗動物分為下列三組： Group-1 為 naïve group，不給予老鼠任何藥物處理。 Group-2 為 control group，投予生理食鹽水。 Group-3 為 DEX treated group，給予老鼠皮下注射 DEX。新生鼠於出生後第一至第三天 (P1~P3)，每天接受單次的 DEX 皮下注射，其劑量分別為 (P1: 0.5 mg/kg；P2: 0.3 mg/kg；P3: 0.1 mg/kg)。於滿八週齡時，開始接受自發性運動行為實驗測試。行為實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。實驗二流程圖：. Saline or DEX. 8 weeks. Locomotor activity. 1day 2day 3day. Testing. - 41 -.

(42) 實驗結果： 1. 自發性運動行為：(圖六) 由於行為測試表現可能受到實驗動物的活動能力及自發性探索行為之影響，因此，可利用自發性運動行為來評估新生期投予 DEX 是否對於動物處於無高台曝露的正常環境下，產生活動能力及自發性探索行為之影響。由實驗結果可以證實，出生後接受皮下注射 DEX 與 naïve 組和 control 組相較並沒有顯著差異 [ F(2,21)=0.572, p =0.573 ]。因此早年投予 DEX 不會影響大白鼠的自發性探索行為，可排除藥物對於活動力的干擾，而影響其他行為測試結果。. - 42 -.

(43) 實驗三實驗目的：探討新生期之 DEX 投予，正常環境下對成年期平衡桿測試之影響。實驗流程：將實驗動物分為下列三組： Group-1 為 naïve group，不給予老鼠任何藥物處理。 Group-2 為 control group，投予生理食鹽水。 Group-3 為 DEX treated group，給予老鼠皮下注射 DEX。新生鼠於出生後第一至第三天 (P1~P3)，每天接受單次的 DEX 皮下注射，其劑量分別為 (P1: 0.5 mg/kg；P2: 0.3 mg/kg；P3: 0.1 mg/kg)。於滿八週齡時，開始接受平衡桿測試行為實驗測試。行為實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。實驗三流程圖：. Saline or DEX. 8 weeks. Rota-rod. 1day 2day 3day. Testing. - 43 -.

(44) 實驗結果： 1. 平衡桿測試：(圖七) 由於行為測試表現可能受到實驗動物平衡感與運動功能的協調性之影響，因此，利用平衡桿測試行為來評估新生期投予 DEX 是否對於動物處於無高台曝露的正常環境下，產生平衡感與運動功能的協調性之影響。由實驗結果可以證實，出生後接受皮下注射 DEX 與 naïve 組和 control 組相較並沒有顯著差異 [ F(2,21)=0.173, p=0.842 ]。因此早年投予 DEX 不會影響大白鼠的平衡感及運動功能協調能力的變化，可排除因運動功能受損，而影響其他行為測試結果。. - 44 -.

(45) 實驗四實驗目的：探討新生期之 DEX 投予，正常環境下對成年期強迫游泳測試之影響。實驗流程：將實驗動物分為下列三組： Group-1 為 naïve group，不給予老鼠任何藥物處理。 Group-2 為 control group，投予生理食鹽水。 Group-3 為 DEX treated group，給予老鼠皮下注射 DEX。新生鼠於出生後第一至第三天 (P1~P3)，每天接受單次的 DEX 皮下注射，其劑量分別為 (P1: 0.5 mg/kg；P2: 0.3 mg/kg；P3: 0.1 mg/kg)。於滿八週齡時，開始接受強迫游泳測試行為實驗測試。行為實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。實驗四流程圖：. Saline or DEX. 8 weeks. FST. 1day 2day 3day. Testing. - 45 -.

(46) 實驗結果： 1. 強迫游泳測試：(圖八) 利用攝影機記錄，並累計動物在水中不掙扎的時間。由結果可發現，動物處於無高台曝露的正常環境下，投予生理食鹽水和未經過任何處理的大白鼠在水中不掙扎的時間沒有明顯的差異。新生期投予 DEX 的大白鼠在水中有較快放棄掙扎的趨勢，但未達統計上之顯著差別。 Naïve 組與 control 組大白鼠不掙扎的時間約佔總時間的 50％，而投予 DEX 的大白鼠靜止不掙扎的時間佔總時間的 56％，雖有時間較長的趨勢，但統計後亦無顯著差異 [ F(2,21)=2.125, p=0.144 ]。. - 46 -.

(47) 實驗五實驗五實驗目的：探討新生期之 DEX 投予，面對高台曝露的環境，對成年期自發性運動行為之影響。實驗流程：將實驗動物分為下列三組： Group-1 為 Naïve group，不給予老鼠任何藥物處理。 Group-2 為 Control group，投予生理食鹽水。 Group-3 為 DEX treated group，給予老鼠皮下注射 DEX。新生鼠於出生後第一至第三天 (P1~P3)，每天接受單次的 DEX 皮下注射，其劑量分別為 (P1: 0.5 mg/kg；P2: 0.3 mg/kg；P3: 0.1 mg/kg)。於滿八週齡時，開始接受自發性運動行為實驗測試。行為實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。實驗五流程圖：. Saline or DEX. 8 weeks Locomotor activity 15 mines. 1day 2day 3day. Exposed of flat-top. 1hour. Testing. - 47 -.

(48) 實驗結果： 1. 自發性運動行為：(圖九) 由於行為測試表現可能受到實驗動物之活動能力及自發性的探索行為之影響，因此，可利用自發性運動行為來評估新生期投予 DEX 是否對於動物處於高台曝露面臨急性壓力下，產生活動能力及自發性探索行為之影響。由實驗結果可以證實，出生後接受皮下注射 DEX 與 naïve 組和 control 組相較並沒有顯著差異 [ F(2,18)=0.257, p=0.776 ]。因此早年投予 DEX 不會影響大白鼠的自發性探索行為，可排除藥物對於活動力的干擾，而影響其他行為測試結果。. - 48 -.

(49) 實驗六實驗目的：探討新生期之 DEX 投予，面對高台曝露環境，對成年期平衡桿測試之影響。實驗流程：將實驗動物分為下列三組： Group-1 為 naïve group，不給予老鼠任何藥物處理。 Group-2 為 control group，投予生理食鹽水。 Group-3 為 DEX treated group，給予老鼠皮下注射 DEX。新生鼠於出生後第一至第三天 (P1~P3)，每天接受單次的 DEX 皮下注射，其劑量分別為 (P1: 0.5 mg/kg；P2: 0.3 mg/kg；P3: 0.1 mg/kg)。於滿八週齡時，開始接受平衡桿測試行為實驗測試。行為實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。實驗六流程圖：. Saline or DEX. 8 weeks Rota-rod 15 mines. 1day 2day 3day. Exposed of flat-top. 1hour. Testing. - 49 -.

(50) 實驗結果： 1. 平衡桿測試：(圖十) 由於行為測試表現可能受到實驗動物平衡感與運動功能的協調性之影響，因此，利用平衡桿測試行為來評估新生期投予 DEX 是否對於動物處於高台曝露面臨急性壓力下，產生平衡感與運動功能的協調性之影響。由實驗結果可以證實，出生後接受皮下注射 DEX 與 naïve 組和 control 組相較並沒有顯著差異 [ F(2,23)=0.879, p=0.429 ]。因此早年投予 DEX 不會影響大白鼠的平衡感及運動功能協調能力的變化，可排除因運動功能受損，而影響其他行為測試結果。. - 50 -.

(51) 實驗七實驗七實驗目的：探討新生期之 DEX 投予，面對高台曝露環境，對成年期強迫游泳測試之影響。實驗流程：將實驗動物分為下列三組： Group-1 為 naïve group，不給予老鼠任何藥物處理。 Group-2 為 control group，投予生理食鹽水。 Group-3 為 DEX treated group，給予老鼠皮下注射 DEX。新生鼠於出生後第一至第三天 (P1~P3)，每天接受單次的 DEX 皮下注射，其劑量分別為 (P1: 0.5 mg/kg；P2:0.3 mg/kg；P3:0.1 mg/kg)。於滿八週齡時，開始接受強迫游泳測試行為實驗測試。行為實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。實驗七流程圖：. Saline or DEX. 8 weeks FST 15 mines. 1day 2day 3day. Exposed of flat-top. 1hour. Testing. - 51 -.

(52) 實驗結果： 2. 強迫游泳測試：(圖十一) 利用攝影機記錄，並累計動物在水中不掙扎的時間。由結果可發現，在動物處於高台曝露面臨急性壓力下，投予生理食鹽水和未經過任何處理的大白鼠在水中不掙扎的時間沒有明顯的差異。不過，新生期投予 DEX 的大白鼠在水中較快放棄掙扎，並達顯著差異。Naïve 組與 control 組大白鼠不掙扎的時間約佔總時間的 50％，然而，投予 DEX 的大白鼠靜止不掙扎的時間佔總時間的 75％，明顯較長，且達顯著差異 [F(2,21)=6.466, p<0.01]。因此，新生期接受 DEX 的大白鼠呈現類憂鬱的行為表現，顯示藥物投予確實影響動物面臨急性壓力事件後的情緒反應。. - 52 -.

(53) 實驗八實驗八實驗目的：探討新生期之 DEX 投予，對成年期條件化恐懼記憶形成之影響。實驗流程：將實驗動物分為下列三組： Group-1 為 naïve group，不給予老鼠任何藥物處理。 Group-2 為 control group，投予生理食鹽水。 Group-3 為 DEX treated group，給予老鼠皮下注射 DEX。新生鼠於出生後第一至第三天 (P1~P3)，每天接受單次的 DEX 皮下注射，其劑量分別為 (P1: 0.5 mg/kg；P2:0.3 mg/kg；P3:0.1 mg/kg)。於滿八週齡時，開始接受行條件化恐懼之訓練及測試。行為實驗方法：參閱實驗方法中相關之說明。實驗八流程圖：. Saline or. 8 weeks 3days. 2days. 1days. 1da 2da 3da. Acclimation. Match. Fear Condition. Testing. - 53 -.

(54) 實驗結果： 1. 恐懼驚跳反應：. 為排除動物跳躍能力造成之誤差，先以 shock activity 值 (圖十四) 進行評估，確定各組動物的 shock activity 值無顯著差異 [F(2,23)=1.143, p=0.336]，並排除極端數據後分組比較條件化恐懼驚跳反應的數值。新生期投予生理食鹽水的 control 組與 naïve 組大白鼠比較，其條件化恐懼的建立並不受影響。而投予 DEX 的動物卻無法形成條件化恐懼的長期記憶，且在統計上達顯著差異 [F(2.23)=6.310, p<0.01]。顯示新生期 DEX 的注射確實會影響大白鼠在條件化恐懼的學習成果 (圖十二，十三) ，此作用為長期性的影響至八週大的成年大白鼠。. - 54 -.

(55) 第四章討論 (Discussion). - 55 -.

(56) 討論早期面臨的壓力事件經驗導致往後生理機能與情緒反應的不良影響是目前研究的熱門議題之一。近來動物實驗也指出幼年期不良經驗，會造成日後行為異常的影響。在大白鼠自出生後每日將幼鼠與母鼠分隔一個小時，持續兩週的母子分離 (neonatal isolation) 實驗模式中發現幼年期經歷隔離的大白鼠，成年後在強迫游泳測試行為實驗中，漂浮不動的時間明顯高於正常大白鼠（Huang & Lin 2006; Porsolt et al 1977）。顯示幼年期分離經驗，對於行為表現與情緒相關的腦部核區會有長期性影響。臨床統計也發現，幼年期曾經遭遇家庭暴力威脅或遭受遺棄與被迫和親人分離等經驗的兒童，未來罹患憂鬱症的機率也高於正常人 (Bifulco et al., 1991; McCauley et al., 1997; Young et al., 1997; Widom, 1999; Imanaka et al., 2006)。可見幼年期經驗，對於情緒反應具有長期性且持續性的影響。除了幼年期壓力事件的曝露會造成上述影響外，相關實驗報告也發現在新生期接受醣皮質激素藥物注射後，動物可能會導致認知功能以及參與記憶之特定腦區的發育與調控異常。其中 DEX 是我們熟知人工合成的醣皮質激素藥物，臨床上廣泛的應用於治療早產兒經常罹患的新生兒呼吸窘迫症。用以促進肺泡表面張力素的分泌，並且降低慢性呼吸系統疾病 (Cummings et al., 1989; Lee et al., 2000; Lemons et. - 56 -.

(57) al., 2001)。然而，近來有許多的證據指出新生期投予 DEX 的治療，會影響腦部結構和功能的發育。文獻亦指出，曾接受 DEX 治療的新生兒，在青少年時期的肢體協調性與認知功能的發展較同齡學童遲緩。動物實驗中亦證實，在大白鼠新生期投予 DEX 可能導致空間記憶產生障礙且干擾海馬迴中長期增益現象的形成，除此之外，分子機制路徑進一步證實此路徑牽涉 CaMKII 磷酸化增加，影響 AMPA 接受體通道傳導性活化 (Derkach et al., 1999; Poncer et al., 2002)，改變 AMPA 接受體突觸神經傳遞物質的釋放。由於長期增益現象的形成牽涉麩胺酸的 AMPA 接受體和 NMDA 接受體之活化，DEX 的作用可能進一步導致海馬迴突觸可變性 (modifiability) 之閾值增加 (Lin et al., 2006)，影響海馬迴的功能，但此等造成的不良影響在成年期逐漸獲得改善 (Huang et al., 2007)，並不會造成終身性的傷害。本實驗發現新生期投予 DEX，在大白鼠杏仁核腦區調控該行為實驗表現中，同樣看到不良影響，實驗初期我們利用新生期投予 DEX，注射後六週大的大白鼠進行電生理記錄、行為表現測試，結果發現動物無法利用高頻電刺激誘發出長期增益現象，也無法習得條件化恐懼反應，而強迫游泳亦發現動物明顯具有憂鬱之傾向，與前人在大白鼠空間記憶行為測試及海馬迴功能異常的相關研究結果相似。然而，在滿八週大的成年期大白鼠實驗中，電生理記錄結果指向. - 57 -.

(58) 腦區杏仁核之長期增益現象仍無法誘發成功 (圖五)，推測八週大白鼠，在恐懼情境的記憶仍未獲得改善，進一步的行為測試結果也發現動物無法建立條件化恐懼與正常組大白鼠相較明顯無法習得 CS-US 之連結 (圖十二)，由於本研究使用的條件化恐懼模式是一種燈光配對電擊的方式，會讓動物受到痛覺刺激，為了排除投予藥物造成動物痛覺的感受度不依，進而影響實驗結果，因此把實驗的原始 NA、LN 和 shock activity 的數據也一併呈現(圖十三、十四)，這樣可以更清楚說明早期投予 DEX 無法習得 CS-US 之連結，不是源自 DEX 造成痛覺或其他感官方面的影響，並且也證明 DEX 對於腦部掌控情緒性記憶之核區的影響程度與持續時間並不相同。另外，我們進一步想釐清的是當動物在面臨不同壓力危機時，是否會有不同於平常的行為表現，於是我們利用高台曝露當作一種急性壓力﹝即所謂無法逃脫的行為壓力﹞，來觀察動物在面臨壓力危機 ﹝高台曝露﹞ 和正常環境下 ﹝無高台曝露﹞，大白鼠會否有不同行為表現。從本實驗中發現在新生期投予 DEX 對於成年期大白鼠面對正常的環境和急性壓力環境比較，我們利用強迫游泳測試動物的憂鬱反應，發現面對急性壓力之實驗組被迫游泳後，較長時間停滯不游，明顯具有類憂鬱的行為表現 (圖十一)，而面對正常環境之實驗組被迫游泳後，雖然也表現出不掙扎的現象，但相較於對照組統計後並無顯. - 58 -.

(59) 著差異 (圖八)。而自發性探索及平衡桿測試行為與實驗組大白鼠相較並無差異 (圖六~七，九~十)，我們可排除是由於新生期投予 DEX ，而導致動物運動功能障礙，因而影響結果判讀。綜合此等結果我們可推論當下視丘-腦下垂體-腎上腺機制尚未發育完全時，投予 DEX 藥物，可能破壞下視丘-腦下垂體-腎上腺機制的功能，降低下視丘-腦下垂體-腎上腺機制的回饋作用 (Rademaker et al., 2007)，影響其心理和生理之功能 (Kamphuis et al., 2004)，並造成學習與記憶之腦區發育的缺損 (Barrington, 2001; Halliday et al., 2003; Jones, 2005)。又臨床研究指出，新生期投予 DEX 的孩童，結果發現可能導致青少年期干擾下視丘-腦下垂體-腎上腺機制的活性和細胞激素 (cytokine) 生成且降低可體松 (cortisol) 的分泌量，使壓力耐受性下降 (Karemaker et al., 2008)。因此，當動物面臨壓力時，為了因應突如其來的變化，常會活化下視丘-腦下垂體-腎上腺機制。近來研究發現動物處於長期壓力的環境中，會改變下視丘-腦下垂體-腎上腺機制的正常功能，造成海馬迴神經細胞大量死亡，使海馬迴萎縮，造成動物空間記憶形成的障礙 (Bakker et al., 2000; de Vries et al., 2002; Karemaker et al., 2006)。然而，情緒性疾病也在許多文獻中指出，下視丘-腦下垂體-腎上腺機制的調控有可能為主要的關鍵，典型的憂鬱症狀，像是心情低落、缺乏食慾、體重降低等…病症，起因可能為壓力導致下視丘-腦下垂體-腎. - 59 -.

(60) 上腺機制無法適度的調節，過度活化促腎上腺皮質激素釋放因子之神經元，引發礦物性皮質激素接受器和醣皮質激素接受器失調 (Gold and Chrousos, 2002; Young et al., 2003; Bao et al., 2008)，但其中機制尚未釐清，目前文獻研究指出，受到醣皮質激素接受器調控的蛋白複合體包括 FKBP51 和 FKBP52，當醣皮質激素進入細胞質後，FKBP51 會離開醣皮質激素接受器蛋白複合體，而與 FKBP52 結合，送入細胞核內進行轉錄作用 (Tatro et al., 2009)，是否源自於邊緣系統掌控的情緒性記憶之核團投射至下視丘-腦下垂體-腎上腺機制功能異常的影響，而造成體內醣皮質激素無法達到恆定，以及牽涉神經系統之分子機制都是值得進一步探討的問題。在神經系統調控學習記憶的過程中，需要神經傳遞物質傳遞，其中麩胺酸是中樞神經系統中最主要的興奮性胺基酸作為參與學習與記憶過程的媒介 (Collingridge and Lester, 1989)，先前的研究指出，恐懼記憶的形成第一級訊息是經由神經元釋放麩胺酸，使 AMPA 接受體打開，產生去極化，並活化 NMDA 接受體，進入第二級訊息活化下游分子機制，其中包含 MAPK。許多文獻亦指出，神經系統面臨壓力時，特別是條件化恐懼的獲取和消減作用，針對杏仁核之 MAPK 路徑扮演了重要的角色 (Lu et al., 2001; Lin et al., 2003)。另外，學習與記憶的研究也證實，在記憶形成的因子中包含了 PKA、protein. - 60 -.

(61) kinase C (PKC)、MAPK、CREB 和 brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (Roberson et al., 1999; Waltereit and Weller, 2003; Czeh and Simon, 2005)，然而這些路徑亦牽涉情緒性疾病，例如憂鬱，因此， MAPK 不僅在動物實驗扮演調節憂鬱行為的角色，也是同時牽連著神經可塑性和憂鬱之相關性 (Huang and Lin, 2006)。藉由本研究之電生理實驗結果顯示新生期投予 DEX 會干擾動物杏仁核長期增益現象，且無法建立條件化恐懼，更在強迫游泳測試中，大白鼠表現出憂鬱的傾向，即使至成年期仍無法獲得改善。因此，對於一些重大疾病，例如創傷壓力後症候群、受虐兒童等，情緒控制或面臨壓力時，下視丘-腦下垂體-腎上腺反應機制之恆定或學習與記憶活化之相關路徑的調控，可能會有更長遠的影響，針對這部分值得作更深入的研究與用藥評估。. - 61 -.

(62) 第五章參考文獻 (References). - 62 -.

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(71) 第六章圖表 (Figures and Tables). - 71 -.

(72) 圖表. (A). (B). 圖一：(A)：cortisone 化學結構式。 (B)：DEX 化學結構式。 - 72 -.

(73) 圖二：邊緣系統-下視丘-腦下垂體-腎上腺機制。 Nestler EJ, Barrot M, DiLeone RJ, Eisch AJ, Gold SJ, Monteggia LM (2002) Neurobiology of depression. Neuron 34:13-25.. - 73 -.

(74) 圖三：長期增益現象之分子機制。 (Kandel, ER, JH Schwartz and TM Jessell (2000) Principles of Neural Science. New York: McGraw-Hill.). - 74 -.

(75) 圖四：動物體重測量紀錄表。出生後前三天投予生理食鹽水的 control 組與 naïve 組相較其動物體重變化並沒有顯著差異。而新生期投予 DEX 在出生後第三天開始，體重明顯低於 control 組與 naïve 組，此差異持續至六週仍可見，而八週後各組大白鼠體重沒有顯著差異。實驗數據以 Mean±SEM 之方式表示，各組 n 值為 8。與 control 組比較，* p＜0.05, ** p＜0.01 ，與 naïve 組比較，# p＜0.05, ## p＜0.01 (one-way ANOVA)。. - 75 -.

(76) 圖五：電生理學紀錄法測試結果。Control 組，給予高頻電刺激後的一小時，其 fEPSP 的斜率為刺激前基礎訊號的 190 ± 4.1 %。然而在新生期投予 DEX 的大白鼠其長期增益現象的表現明顯小於 control 組，其 fEPSP 的斜率為 106 ± 4.5 %。實驗數據以 Mean±SEM 之方式表示，各組 n 值為 6。. - 76 -.

(77) 圖六：自發性運動行為測試結果。動物處於正常環境中，以十五分鐘累計動物水平移動的距離計算新生期投予 DEX 與各組間的比較，結果並無顯著的差異。實驗數據以 Mean±SEM 之方式表示，各組 n 值為 8，(one-way ANOVA)。. 。. - 77 -.

(78) 圖七：平衡桿測試行為測試結果。動物處於正常環境中，以平衡桿加速的條件，累計動物停留在平衡桿上的時間，最大值以 600 秒計算，進行新生期投予 DEX 與各組間的比較，結果並無顯著的差異。實驗數據以 Mean±SEM 之方式表示，各組 n 值為 8 ， (one-way ANOVA)。. - 78 -.

(79) 圖八：強迫游泳實驗測試結果。處於正常環境中，以動物置入水中五分鐘，累計動物不掙扎的時間，進行新生期投予 DEX 與各組間的比較，結果並無顯著的差異。實驗數據以 Mean±SEM 之方式表示，各組 n 值為 8，(one-way ANOVA)。. - 79 -.

(80) 圖九：自發性運動行為測試結果。動物處於高台曝露之急性壓力，以十五分鐘累計動物水平移動的距離計算新生期投予 DEX 與各組間的比較，結果並無顯著的差異。實驗數據以 Mean±SEM 之方式表示，各組 n 值為 8，( one-way ANOVA)。. - 80 -.

(81) 圖十：平衡桿測試行為測試結果。動物處在高台曝露之急性壓力，以平衡桿加速的條件，累計動物停留在平衡桿上的時間，最大值以 600 秒計算，進行新生期投予 DEX 與各組間的比較，結果並無顯著的差異。實驗數據以 Mean±SEM 之方式表示，各組 n 值為 8，(one-way ANOVA)。. - 81 -.

(82) 圖十一：強迫游泳實驗測試結果。處於高台曝露之急性壓力，以動物置入水中五分鐘，累計動物不掙扎的時間，進行新生期投予 DEX 與各組間的比較， naïve 與 control 組的動物在水中不掙扎的時間沒有顯著差異。而 DEX 與 control 組相較，DEX 組大白鼠在水中靜止不掙扎的時間明顯較長。實驗數據以 Mean±SEM 之方式表示，各組 n 值為 8。與 control 組比較，** p＜0.01 ，與 naïve組比較，. ##. p. ＜0.01 (one-way ANOVA)。. - 82 -.

(83) 圖十二：恐懼驚跳反應結果。條件化恐懼訓練結束 24 小時後進行新生期投予 DEX 與各組間驚跳反應的比較。結果顯示 naïve 組與 control 組的大白鼠已建立條件化恐懼記憶，但新生期投予 DEX 的大白鼠無法順利形成條件化恐懼記憶的連結。實驗數據以 Mean±SEM 之方式表示，各組 n 值為 8。與 control 組比較，** p ＜0.01 (one-way ANOVA)。. - 83 -.