1 8-16 17-25
第二章 結果與討論
第一節 化學合成
壹﹒2-Substituted benzyloxy benzonitriles (17-25)之合成 此類化合物之合成方法如 Scheme 2 50所示：
No. R2? R3? R4?
8, 17 50 H H H
9, 18 Cl H H
10, 19 H Cl H
11, 20 H H Cl
12, 21 F H H
13, 22 H F H
14, 23 H H F
15, 24 H OCH3 H
16, 25 H H OCH3
將 2-cyanophenol (1)分別與 substituted benzyl chloride (8-16)溶於乙醇 中，在無水碘化鉀及無水碳酸鉀存在下進行反應，即可得到相對應之 2-substituted benzyloxy benzonitrile (17-25)
此類產物之構造決定，以 2-[(3-methoxybenzyl)oxy]benzonitrile (24)為代 表說明如下：
OH
CN + ClCH2
R2' R3' R4'
K2CO3, KI CN
O CH2
R2' R3' R4' Ethanol
Scheme 2
化合物 24 為透明片狀結晶；熔點為 71.2-72.6 ℃
質 譜 (EIMS) (圖 24-1)：
由其分子離子峰 (m/z 239, M+)，及元素分析結果得知此化合物分子式 為 C15H13NO2，與預期相符。
IR 圖 譜 (圖 24-2)：
在 3016 ㎝-1處有不飽和碳氫(=C-H)之吸收，在 2955 ㎝-1處有飽和碳氫 (-C-H)之吸收，2222 ㎝-1為 C≡N 的吸收，1597, 1491, 1466 ㎝-1為芳香環的 吸收帶。
UV：在 283.4 nm 處有最大吸收。
1
H-NMR 圖 譜 (圖 24-3)：
其積分值顯示此化合物有 13 個質子訊號。而由其化學位移、偶合情形 及氫-氫相關譜(圖 24-4)，將各個質子訊號歸屬如下：在最高磁場的δ3.75 (3H, s)歸屬為-OCH3，δ5.24 (2H, s)為-OCH2-之訊號，由上資料，再配合 IR 上 C≡N 之吸收，足以表示 2-cyanophenol (1)與 3-methoxybenzyl chloride (8) 有結合起來。其次，因受 C≡N 的影響，H-6 的位移往較低磁場移動，出現 在δ7.72 (1H, dd, J= 7.6, 1.6 Hz)，再依據氫-氫相關譜，進一步將δ7.03- 7.11, δ7.63 (1H, ddd, J= 8.0, 8.0, 1.7 Hz), δ7.29 (1H, d, J= 8.0 Hz)分別歸屬於 H-5, H-4, H-3 之訊號(Fig. 24-a )。
d7.72 d7.03- 7.11
d7.63
d7.29
d3.75 d5.24
1 6 5 4
3 2
CN
OCH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
Fig. 24-a 質子訊號之歸屬
1 6 5 4
3 2
CN
OCH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 d55.20 d70.07
d113.72
d121.50 d133.90
d135.18
Fig. 24-b 碳訊號之歸屬
Fig. 24-c -OCH2-與 C-2, C-2?, C-6? 及 C-1?之偶合關係
13
C-NMR 圖 譜 (圖 24-5)：
顯示有 15 支訊號，由分子式得知有 15 個碳，推測並無重疊的碳訊號，
每個訊號皆代表一個碳。
HMQC 圖 譜 (圖 24-6a, 24-6b)：
依據碳與氫之相關性，可將δ55.20, δ70.07, δ113.72, δ121.50, δ 133.90, δ135.18 分別歸屬於-OCH3, -OCH2-, C-3, C-5, C-6, C-4 之訊號(Fig.
24-b)，其餘的碳與氫之訊號需參照 HMBC 來做進一步的確認。
HMBC 圖 譜 (圖 24-7a, 24-7b)：
由於-OCH2- (δ5.24)和 C-2, C-2?, C-6?有 3J correlation，並且和 C-1?有 2J correlation(Fig. 24-c)，故可將δ113.22, δ119.67, δ137.84, δ160.05 分別 歸屬於 C-2?, C-6?, C-1?, C-2 之訊號(Fig. 24-d)。
1 6 5 4
3 2
CN
OCH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
Fig. 24-d 碳訊號之歸屬
5 4
3 2 1
6 CN
O 1'
2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 d113.22
d119.67
d137.84 d160.05
Fig. 24-g 碳訊號之歸屬
其他碳氫間的 3J correlation 則以 Fig. 24-e 及下表表示：
3J correlation 3J correlation
13C 1H 13C
4 6
2
6 4, CN
1? 5? 3?
2? 4?, 6?
6? 2?, 4?
其中 C-2?和 C-6?同時與 H-4?有3J correlation，故可將δ6.87-6.92 歸屬於 H-4?
的訊號，而δ7.07 和δ7.02-7.05 則分別為 H-2?及 H-6?的訊號；另外，δ7.31 (1H, t, J =8.1 Hz), 歸屬於 H-5?，δ7.63 (1H, ddd, J= 8.0, 8.0, 1.7 Hz)和δ7.72 (1H, dd, J= 7.6, 1.6 Hz)確定為 H-4 及 H-6 之訊號(Fig. 24-f)，最後分別將δ 116.64, δ159.62 歸屬於 C≡N, C-3?之訊號，而δ133.90, δ135.18 則可確 定為 C-6, C-4 之訊號，另外由 H-3, 5 之遠程偶合關係，可將δ101.16 歸屬 為 C-1 之訊號(Fig. 24-g)。
綜合上述光譜數據分析，足以判定化合物 24 之結構為 2-[(3-methoxy benzyl)oxy]benzonitrile。
5 4
3 2 1
6 CN
O 1'
2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
d6.87-6.92 d7.07
d7.02-7.05 d7.31
Fig. 24-f 質子訊號之歸屬
5 4
3 2 1
6 CN
O 1'
2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 d116.64
d159.62 d101.16
5 4
3 2 1
6 CN
O 1'
2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 H
H
H H
H H
Fig. 24-e 碳氫間之遠程偶合關係
圖 24-1 MS spectrum of compound 24
圖 24-2 IR (KBr) spectrum of compound 24
CN
OCH2
OCH3
CN
OCH2
OCH3
圖 24-4 1H-1H COSY (DMSO-d6, 200 MHz) spectrum of compound 24 圖 24-3 1H-NMR (DMSO-d6, 200 MHz) spectrum of compound 24
1 6 5 4
3 2
CN
OCH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
1 6 5 4
3 2
CN
OCH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
圖 24-5 13C-NMR (DMSO-d6, 50 MHz) spectrum of compound 24
1 6 5 4
3 2
CN
OCH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
圖 24-6a HMQC (DMSO-d6) spectrum of compound 24
圖 24-6b HMQC (DMSO-d6) spectrum of compound 24
1 6 5 4
3 2
CN
OCH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
1 6 5 4
3 2
CN
OCH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
圖 24-7a HMBC (DMSO-d6) spectrum of compound 24
圖 24-7b HMBC (DMSO-d6) spectrum of compound 24
1 6 5 4
3 2
CN
OCH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
5
4 3
2 1
6 CN
O 1'
2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 H
H
H H
H H
貳. 化合物 26-44 之合成
此類化合物可細分為下列四大類，其合成方法如 Scheme 3 50所示：
A. 2-Substituted benzyloxy methylbenzenes (26-29) B. 2-Substituted benzyloxy phenyl methanols (30-33) C. 2-Substituted benzyloxy benzoates (34-41)
D. 2-Substituted benzyloxy benzamides (42-44)
No. R1 No. R2? R3? R4?
2 CH3 8 H H H
3 CH2OH 9 Cl H H
4 COOCH3 10 H Cl H
5 CONH2 11 H H Cl
12 F H H
13 H F H
14 H H F
15 H OCH3 H
16 H H OCH3
compound R1 R2? R3? R4?
26 CH3 H H H
27 CH3 Cl H H
28 CH3 H Cl H
29 CH3 H H Cl
30 50 CH2OH H H H
31 CH2OH Cl H H
OH
R1 + ClCH2
R2' R3' R4'
K2CO3, KI
R1
O CH2
R2' R3' R4' Ethanol or Methanol
2-5 8-16 26-44
Scheme 3
compound R1 R2? R3? R4?
32 CH2OH H Cl H
33 CH2OH H H Cl
34 50 COOCH3 H H H
35 COOCH3 Cl H H
36 COOCH3 H Cl H
37 COOCH3 H H Cl
38 COOC2H5 H H H
39 COOC2H5 Cl H H
40 COOC2H5 H Cl H
41 COOC2H5 H H Cl
42 CONH2 Cl H H
43 CONH2 H Cl H
44 CONH2 H H Cl
此類化合物之合成方法與 2-substituted benzyloxy benzonitrile 類(17-25, scheme 2)相似，當合成具有甲酯結構的化合物 34-37 時以甲醇為反應溶媒，
以維持 methyl salicylate (4)甲酯的結構，相較於化合物 38-41 則是以乙醇為 反應溶媒，因此會進行轉酯反應，將 methyl salicylate (4)的甲酯轉變為乙酯，
因而得到乙酯的結構。
參. 2-Substituted benzylamino benzoates (45-55)之合成
此類化合物之合成方法如 Scheme 4 50所示
No. R1 R4 R5 No. R2? R3? R4?
6 COOC2H5 H H 8 H H H
7 COOCH3 OCH3 OCH3 9 Cl H H
10 H Cl H
11 H H Cl
12 F H H
13 H F H
14 H H F
15 H OCH3 H
16 H H OCH3
compound R1 R4 R5 R2? R3? R4?
45 COOC2H5 H H H H H
46 COOC2H5 H H Cl H H
47 COOC2H5 H H H Cl H
48 COOC2H5 H H H H Cl
49 COOC2H5 H H F H H
50 COOC2H5 H H H F H
51 COOC2H5 H H H H F
52 COOC2H5 H H H OCH3 H
53 COOC2H5 H H H H OCH3
54 COOCH3 OCH3 OCH3 H OCH3 H
55 COOCH3 OCH3 OCH3 H H OCH3
6-7 8-16 45-55
Scheme 4
NH2 R1 R5
R4 + ClCH2
R2' R3' R4'
K2CO3, KI
R1
HN R5
R4
CH2
R2' R3' R4' Ethanol or Methanol
此類化合物之合成方法與 2-substituted benzyloxy benzonitrile 類 (17-25, Scheme 2)相似，其中化合物 54, 55 以甲醇為反應溶媒，以維持 methyl 2-amino-4, 5-dimethoxybenzoate (7)甲酯的結構。
肆. 2-Substituted benzyloxy benzoic acids (56-64)及 2-substituted benzylamino benzoic acids (65-75)之合成
此類化合物之合成方法如 Scheme 5 51, 52所示，取化合物 34, 36-37, 39,
45-55 為起始原料，以 10 %的 NaOH 進行水解反應，或以 21-25 為起始原
料，以 3M 的 NaOH 進行水解反應，隨後以冰醋酸酸化即可得到相對應的 化合物 56-75。Scheme 5
COOR
HN R5
R4
CH2
R2' R3' R4'
CN
O CH2
R2' R3' R4' 34, 36, 37, 39, 45-55
21-25
1. 10 % NaOH 2. AcOH
1. 3M NaOH 2. AcOH
COOH
X R5
R4
CH2
R2' R3' R4'
56-75
compound R4 R5 R2? R3? R4? X
56 H H H H H O
57 H H Cl H H O
58 H H H Cl H O
59 H H H H Cl O
60 H H F H H O
61 H H H F H O
62 H H H H F O
63 H H H OCH3 H O
64 H H H H OCH3 O
65 H H H H H NH
66 H H Cl H H NH
67 H H H Cl H NH
68 H H H H Cl NH
69 H H F H H NH
70 H H H F H NH
71 H H H H F NH
72 H H H OCH3 H NH
73 H H H H OCH3 NH
74 OCH3 OCH3 H OCH3 H NH
75 OCH3 OCH3 H H OCH3 NH
此類化合物之構造決定，以 2-[(3-methoxybenzyl)oxy]benzoic acid (63) 為代表說明如下：
COOH
X R5
R4
CH2
R2' R3' R4'
56-75
化合物 63 為白色棉絮狀結晶；熔點為 100.0-101.9 ℃
質 譜 (EIMS) (圖 63-1)：
由其分子離子峰 (m/z 258, M+)，及元素分析結果得知此化合物分子式 為 C15H14O4，與預期相符。
IR 圖 譜 (圖 63-2)：
在 3084 cm-1處有不飽和碳氫(=C-H)之吸收，在 2974, 2920 cm-1處有飽 和碳氫(-C-H)之吸收，而在 3000 cm-1附近的吸收峰底部一直延伸到 2300 cm-1附近，這說明羥基(-OH)的締合極為牢固，這是典型的羧酸羥基的吸 收峰形。另外，1701 cm-1處為羧基之 C=O 的吸收，1599, 1493, 1441 cm-1 為芳香環的吸收帶，與原料(化合物 24)比較，多了羧酸羥基及 C=O 之吸 收，而 C≡N 的吸收消失，表示 C≡N 已成功反應為-COOH。
UV：在 243.3 nm 處有最大吸收。
1
H-NMR 圖 譜 (圖 63-3)：
其積分值顯示此化合物有 14 個氫。初步判斷δ3.74 (3H, s)為-OCH3
之訊號，δ5.16 (2H, s)為-OCH2-之訊號，而δ12-14 (1H, br)應為-COOH 之 訊號。另外，與原料(化合物 24)比較(表 63-1)，由於其結構相近，化學位 移及訊號之形態亦相近，故可直接將δ6.85 (1H, dd, J=8.1, 2.4 Hz), δ7.47 (1H, ddd, J=7.9, 7.9, 1.7 Hz), δ7.68 (1H, dd, J=7.6, 1.7 Hz)分別歸屬為 H-4?, H-4 及 H-6 之訊號(Fig. 63-a)。
化合物 24 化合物 63
-OCH3 δ3.75 (3H, s) δ3.74 (3H, s) -OCH2- δ5.24 (2H, s) δ5.16 (2H, s)
H-4? δ6.87-6.92 δ6.85 (1H, dd, J=8.1, 2.4 Hz) H-4 δ7.63 (1H, ddd, J= 8.0, 8.0, 1.7 Hz) δ7.47 (1H, ddd, J=7.9, 7.9, 1.7 Hz) H-6 δ7.72 (1H, dd, J= 7.6, 1.6 Hz) δ7.68 (1H, dd, J=7.6, 1.7 Hz)
至此，可確定化合物 63 結構無誤，以下主要是進行其他碳氫訊號之 歸屬。
由其偶合情形及氫-氫相關譜，可進一步將δ6.96-7.05 (2H, m)歸屬為 H-5 及 H-6?之訊號，δ7.28 (1H, t, J=7.9 Hz)歸屬為 H-5?之訊號，另外，δ 7.14-7.18 (2H, m)則為 H-3 之訊號，尚有 H-2?未定義，推測應與 H-3 在同 一範圍內(Fig. 63-b)。
13
C-NMR 圖 譜 (圖 63-5)：
顯示有 15 支訊號，由分子式得知有 15 個碳，推測並無重疊的碳訊號，
每個訊號皆代表一個碳。初步推斷位於最低磁場的δ167.73 應為-COOH 之訊號。
HMQC 圖 譜 (圖 63-6a, 63-6b)：
依據碳與氫之相關性，可將碳原子訊號(四級碳除外)歸屬如 Fig. 63-c
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 d3.74 d5.16
d12-14
d6.85 d7.47
d7.68
Fig. 63-a 質子訊號之歸屬
d6.96-7.05
d6.96-7.05 5
4 3
2 1
6 COOH
O 1'
2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 d7.28
d7.14-7.18 d7.14-7.18
Fig. 63-b 質子訊號之歸屬
剩下四個四級碳，可由 HMBC 圖譜來做進一步的確認。
HMBC 圖 譜 (圖 63-7a, 63-7b)：
由於 H-5?與 C-1?, C-3?有遠程偶合關係(Fig. 63-d)，因此可將δ138.90, δ159.58 歸屬為 C-1?及 C-3?之訊號(Fig. 63-e)，另外，-OCH2- (δ5.24)和 C-2, C-2?, C-6?有 3J correlation，並且和 C-1?有 2J correlation，故可將δ 157.18 歸屬為 C-2之訊號, 同時將δ112.59, δ119.16, δ138.90 分別確定 為 C-2?, C-6?及 C-1?之訊號，最後由於 H-3, H-5 同時與 C-1 有遠程偶合關 係，因此將δ122.04 歸屬於 C-1 之訊號。
綜合上述光譜數據分析，足以判定化合物 63 之結構為 2-[(3-methoxy benzyl)oxy]benzoic acid。
5 4
3 2 1
6 COOH
O 1'
2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 d130.98
d120.59 d133.16
d113.99
d119.16 d129.62 d113.33 d112.59
Fig. 63-c 碳訊號之歸屬
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 H
H H
Fig. 63-d H-5?, -OCH2-, H-3, H-5 與 碳原子之偶合關係。
5 4
3 2 1
6 COOH
O 1'
2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 d138.90
d159.58 d122.04
d157.18
Fig. 63-e 碳訊號之歸屬
圖 63-1 MS spectrum of compound 63
圖 63-2 IR (KBr) spectrum of compound 63
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
圖 63-4 1H-1H COSY (DMSO-d6, 200 MHz) spectrum of compound 63 圖 63-3 1H-NMR (DMSO-d6, 200 MHz) spectrum of compound 63
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
圖 63-5 13C-NMR (DMSO-d6, 50 MHz) spectrum of compound 63
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
圖 63-6a HMQC (DMSO-d6) spectrum of compound 63
圖 63-6b HMQC (DMSO-d6) spectrum of compound 63
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
圖 63-7a HMBC (DMSO-d6) spectrum of compound 63
圖 63-7b HMBC (DMSO-d6) spectrum of compound 63
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3
4
3 2
1 6 5
COOH
O CH2 1' 2' 3'
4' 5' 6'
OCH3 H
H H
第二節 藥理活性試驗結果
壹 、 抗 細 菌 性 下 痢 之 活 性
壹-1. 抑制 LTB 與 GM1-receptor 結合之活性
為了瞭解對於細菌性下痢是否有抑制效果，著者將所合成之化合物
17-44, 56-75 委託本校中國醫學研究所侯庭鏞教授測試其對大腸桿菌忌熱型
腸毒素 B 次單元(LTB)與 GM1-receptor 結合之抑制活性。由於 LTB 會結合 腸上皮的 GM1-receptor，因此利用 competitive GM1 ELISA，測定化合物對 於 LTB 與 GM1-receptor 結合的抑制程度。
結果如 Fig. 5 所示，顯示 lead compound (A)並不具抗下痢活性；而在 2.5μg/ml 的濃度下，本研究所合成的標的化合物中，有部分化合物具有明 顯的抑制活性，進而以抑制率來表示化合物的抑制活性，結果如 Table 1 所 示。
抑制率 (%) =LTBOD405－化合物 OD405/ LTBOD405－PBSOD405
Fig. 5 以 OD405 表現化合物 17-44, 56-75 對 LTB 結合到 GM1-receptor 的抑制效果：
0 0.5 1 1.5
A 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 LT PBS
化 合 物
OD405
化合物濃度：2.5μg/ml LTB 量：0.016μg/well
PBS: phosphate buffered saline 作為 mock 組。
Table 1. Inhibition of toxin binding to GM1-coated microtiter plates by compound 17-44, 56-75 (in vitro)
No. R1 R4 R5 R2' R3' R4' X OD405 Inhibition %
A CHO H H H H H O 1.566
17 C≡N H H H H H O 1.21
18 C≡N H H Cl H H O 1.31
19 C≡N H H H Cl H O 1.344
20 C≡N H H H H Cl O 1.406
21 C≡N H H F H H O 1.3945
22 C≡N H H H F H O 1.086
23 C≡N H H H H F O 1.404
24 C≡N H H H OCH3 H O 1.208
25 C≡N H H H H OCH3 O 1.2935
26 CH3 H H H H H O 1.26
27 CH3 H H Cl H H O 1.264
28 CH3 H H H Cl H O 1.3835
29 CH3 H H H H Cl O 1.2675
30 CH2OH H H H H H O 1.4225 31 CH2OH H H Cl H H O 1.147 32 CH2OH H H H Cl H O 1.306 33 CH2OH H H H H Cl O 1.2095
34 COOCH3 H H H H H O 1.2505
35 COOCH3 H H Cl H H O 1.3415
36 COOCH3 H H H Cl H O 1.2995
37 COOCH3 H H H H Cl O 1.484
38 COOC2H5 H H H H H O 1.4785 39 COOC2H5 H H Cl H H O 1.1575
40 COOC2H5 H H H Cl H O 1.113 41 COOC2H5 H H H H Cl O 1.138
R1
X CH2 R5
R4
R2' R3' R4'
18.2 10 7.3 2.2 3.1
28.3 2.4
18.4 11.4
14.1 13.8 4
13.5
23.4 10.4
18.3 14.9 7.5
22.5 26.1 24.5 -3.7 -4.2
10.9 -3.5
0.9 A 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
16.2 13.4 13.5 11.7
26.1 43.8 39 35.7 31.8 24.5 15.4
39.9 50.9
60.4 76.6 44.7
50 66 45
56.7 22.25
20.54
100 99.3 42
43 44 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75
No. R1 R4 R5 R2' R3' R4' X OD405 Inhibition %
42 CONH2 H H Cl H H O 1.2345
43 CONH2 H H H Cl H O 1.2695
44 CONH2 H H H H Cl O 1.268
56 COOH H H H H H O 1.29
57 COOH H H Cl H H O 1.1135
58 COOH H H H Cl H O 0.897
59 COOH H H H H Cl O 0.9555
60 COOH H H F H H O 0.9955
61 COOH H H H F H O 1.0436
62 COOH H H H H F O 1.1325
63 COOH H H H OCH3 H O 1.245
64 COOH H H H H OCH3 O 0.217
65 COOH H H H H H NH 0.944
66 COOH H H Cl H H NH 0.8097
67 COOH H H H Cl H NH 0.693
68 COOH H H H H Cl NH 0.495
69 COOH H H F H H NH 0.8856
70 COOH H H H F H NH 0.8208
71 COOH H H H H F NH 0.6248
72 COOH H H H OCH3 H NH 0.882 73 COOH H H H H OCH3 NH 0.7387 74 COOH OCH3 OCH3 H OCH3 H NH 1.1605 75 COOH OCH3 OCH3 H H OCH3 NH 1.1815 MNPG
LTB 1.433
PBS 0.2085
MNPG : m-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside 化合物濃度為 2.5 µg/ml；MNPG 為 20 mM。
PBS: phosphate buffered saline 作為 mock 組。
抑制率愈高表示抑制效果愈好，若為負值則表示誘發 LTB 結合 GM1。
茲將各類化合物之抗下痢活性試驗結果分別討論如下：
A. 2-Substituted benzyloxy benzonitriles (17-25)
由 Table 1-1 可知，nitriles 類化合物之活性並不明顯，但是 R3?為 F 取 代之化合物 22，具有較明顯之抑制活性，其抑制率為 28.3 %。
compound R1 R2' R3' R4' Conc. (µg/ml) inh. %
17 C≡N H H H 2.5 18.2
18 C≡N Cl H H 2.5 10
19 C≡N H Cl H 2.5 7.3
20 C≡N H H Cl 2.5 2.2
21 C≡N F H H 2.5 3.1
22 C≡N H F H 2.5 28.3
23 C≡N H H F 2.5 2.4
24 C≡N H OCH3 H 2.5 18.4
25 C≡N H H OCH3 2.5 11.4
Table 1-1. Inhibition of toxin binding to GM1-coated microtiter plates by compound 17-25 (in vitro)
B. 2-Substituted benzyloxy methylbenzenes (26-29)
由 Table 1-2 可看出，toluenes 類化合物之活性不明顯，其中在 R3?有 氯原子取代的化合物 28 活性最低。
compound R1 R2' R3' R4' Conc. (µg/ml) inh. %
26 CH3 H H H 2.5 14.1
27 CH3 Cl H H 2.5 13.8
28 CH3 H Cl H 2.5 4
29 CH3 H H Cl 2.5 13.5
Table 1-2. Inhibition of toxin binding to GM1-coated microtiter plates by compound 26-29 (in vitro)
R1
O CH2
R2' R3' R4'
R1
O CH2
R2' R3' R4'
C. 2-Substituted benzyloxy phenyl methanols (30-33)
由 Table 1-3 可看出，alcohols 類化合物之活性均偏低，活性較明顯的 為化合物 31。
compound R1 R2' R3' R4' Conc. (µg/ml) inh. %
30 CH2OH H H H 2.5 0.9
31 CH2OH Cl H H 2.5 23.4
32 CH2OH H Cl H 2.5 10.4
33 CH2OH H H Cl 2.5 18.3
Table 1-3. Inhibition of toxin binding to GM1-coated microtiter plates by compound 30-33 (in vitro)
D. 2-Substituted benzyloxy benzoates (34-41)
由 Table 1-4 可看出，esters 類化合物之活性均偏低，大體上可明顯看 出，若將 R1上的甲酯取代置換成乙酯取代，除化合物 38 外，活性略為提 高，如：化合物 39-41。
compound R1 R2' R3' R4' Conc. (µg/ml) inh. %
34 COOCH3 H H H 2.5 14.9
35 COOCH3 Cl H H 2.5 7.5
36 COOCH3 H Cl H 2.5 10.9
37 COOCH3 H H Cl 2.5 -4.2
38 COOC2H5 H H H 2.5 -3.7
39 COOC2H5 Cl H H 2.5 22.5
40 COOC2H5 H Cl H 2.5 26.1
41 COOC2H5 H H Cl 2.5 24.5 Table 1-4. Inhibition of toxin binding to GM1-coated microtiter plates by compound 34-41
(in vitro)
R1
O CH2
R2' R3' R4'
R1
O CH2
R2' R3' R4'
E. 2-Substituted benzyloxy benzamides (42-44)
由 Table 1-5 可看出，amides 類化合物之活性亦不明顯，。
compound R1 R2' R3' R4' Conc. (µg/ml) inh. %
42 CONH2 Cl H H 2.5 16.2
43 CONH2 H Cl H 2.5 13.4
44 CONH2 H H Cl 2.5 13.5
Table 1-5. Inhibition of toxin binding to GM1-coated microtiter plates by compound 42-44 (in vitro)
F. 2-Substituted benzyloxy benzoic acids (56-64)
由 Table 1-6 可知，此類化合物 R1為-COOH 取代，與上述各類化合物 在其他取代均相同的條件下做比較，如：化合物 58 與其他類化合物在 R3? 位置上同為氯原子取代的化合物 19, 28, 32, 36, 40, 43 相較，可發現化合物
58 之抑制活性明顯提高，大致上都有兩倍以上的活性成長，由此可知，
R1上的羧酸基團對於抑制 LTB 與 GM1-receptor 結合之活性而言，是一個 關鍵性的基團。
另外，化合物 64 展現了明顯的抑制活性，在濃度為 9.7 mM (2.5 µg/ml) 的條件下有高達 99.3 %的抑制率，文獻 1中記載 m-nitrophenyl-α
-D-galactopyranoside (MNPG)在 20 mM (6 µg/ml)的濃度下有 100 %的抑制 率，值得討論的是，本實驗所用的濃度只有文獻值的一半，但卻能達到相 當的抑制率，可以肯定的，化合物 64 有與 MNPG 相當，甚至高於 MNPG 的抑制活性。
R1
O CH2
R2' R3' R4'
Table 1-6. Inhibition of toxin binding to GM1-coated microtiter plates by compound 56-64, 19, 28, 32, 36, 40, 43 (in vitro)
compound R1 R2' R3' R4' Conc. (µg/ml) inh. %
A CHO H H H 2.5 -3.5
56 COOH H H H 2.5 11.7
57 COOH Cl H H 2.5 26.1
58 COOH H Cl H 2.5 43.8
59 COOH H H Cl 2.5 39
60 COOH F H H 2.5 35.7
61 COOH H F H 2.5 31.8
62 COOH H H F 2.5 24.5
63 COOH H OCH3 H 2.5 15.4
64 COOH H H OCH3 2.5 99.3
19 C≡N H Cl H 2.5 7.3
28 CH3 H Cl H 2.5 4
32 CH2OH H Cl H 2.5 10.4
36 COOCH3 H Cl H 2.5 10.9
40 COOC2H5 H Cl H 2.5 26.1
43 CONH2 H Cl H 2.5 13.4
MNPG 6 100
G. 2-Substituted benzylamino benzoic acids (65-75)
由 Table 1-7 可知此類 benzylamino derivatives 普遍具有活性，但若在 R4, R5有甲氧基取代，則活性明顯下降。
另外，當此類化合物與 2-substituted benzyloxy benzoic acid (56-64)類 相對應的化合物做比較時(如：化合物 65 與化合物 56 比較)，可發現此類 化合物更具抑制活性(但化合物 73 例外)，由此可知此類化合物結構中仲胺 (-NH-)的部分對於抑制 LTB 與 GM1-receptor 結合之活性而言，亦具有相
R1
O CH2
R2' R3' R4'
當程度的影響力。
其次，由 R2?, R3?, R4?位置上不同的取代情形可發現以下兩個規則：
(1)不同取代基所造成的抑制活性：
Cl ＞ F ＞ OCH3 ＞ H
(2)不同取代位置所造成的抑制活性：
R4? ＞ R3? ＞ R2?
Table 1-7. Inhibition of toxin binding to GM1-coated microtiter plates by compound 65-75, (in vitro)
compound R1 R4 R5 R2' R3' R4' Conc. (µg/ml) inh. %
A CHO H H H H H 2.5 -3.5
65 COOH H H H H H 2.5 39.9
66 COOH H H Cl H H 2.5 50.9
67 COOH H H H Cl H 2.5 60.4
68 COOH H H H H Cl 2.5 76.6
69 COOH H H F H H 2.5 44.7
70 COOH H H H F H 2.5 50
71 COOH H H H H F 2.5 66
72 COOH H H H OCH3 H 2.5 45
73 COOH H H H H OCH3 2.5 56.7
74 COOH OCH3 OCH3 H OCH3 H 2.5 22.3
75 COOH OCH3 OCH3 H H OCH3 2.5 20.5
綜合上述，可歸納出以下幾個要點：
1. lead compound (A)不具抗下痢活性。
2. R1上的羧基取代是一個增強活性的官能基。
3. 針對化合物 64 而言，若將其苯環上對位取代的甲氧基改為間位取代，
或置換為其他原子取代(氟原子或氯原子)，則活明顯降低，這說明此結
R1
HN CH2 R5
R4
R2' R3' R4'
構在苯環上有對位甲氧基取代的重要性。
4. 結構中有羧基取代，若再配合上仲胺(-NH-)的結構，會形成普遍具有活 性的化合物，如：化合物 65-73，但無法形成最具活性的化合物，也就 是說當 R1具有-COOH 取代，而 R4?為-OCH3時，若再以-NH- 將-O-取 代，並不會再提升其活性，如：化合物 73 活性小於化合物 64。
5. 可將化合物 64 作為一個 core structure，並進一步合成對於抑制 LTB 與 GM1-receptor 結合更具活性的化合物。
壹-2. 大腸桿菌忌熱性腸毒素誘發腸液堆積之抑制活性
經由抗下痢活性快速篩選平台 GM1-ELISA，挑選出具有較高抗下痢活 性的化合物 64 及化合物 68，再進一步進到動物試驗，測試化合物在動物體 內是否依然具有活性，此部分實驗尚在進行中，無法提供參考數據。
