嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

計畫編號：CNPH94-06

計畫名稱：比較不同逆相分析管柱靜相對 LC/MS 之蛋白質胺基酸定 序偵測分析結果的影響性

執行期間：94 年 1 月 1 日至 94 年 12 月 31 日

□整合型計畫 □個別型計畫

計畫總主持人： 計畫主持人：方嘉德副教授

子計畫主持人：

已發表於：第十一屆分析化學技術交流研討會, 2005/5/14, 第 D-32 號

比較不同逆相分析管柱靜相對 LC/MS 之蛋白質胺基酸定序偵測分 析結果的影響性

The influence effect of the different types of reverse phase column stationary on the results of the protein sequence analysis of

LC/ESI-MS

第一章 摘要

在本研究工作中探討了，不同管柱靜相類型對未配備有 nanospray 之

LC/ESI-MS 儀器的蛋白質胺基酸定序分析結果的影響，在其中，包括有使 用不同碳鏈長度以及不同碳鏈交聯情況等各種層析靜相來加以比較。在實 驗工作中，使用 BSA 作為標的蛋白質，而將含有 BSA 的電泳膠片斑點先行

in-gel 消化處理之後，再將消化後的胜肽產物(724 fmol)，進行 LC/ESI-MS 的蛋白質胺基酸定序偵測操作。在實驗中分別使用了 C4、C8、C18 等三種 碳鏈長度類型，同時也比較了靜相碳鏈是分佈在單一平層(monomeric)和多 平層(polymeric)等兩種交聯情況，所獲得的定序分析結果。因為消化後的胜 肽鏈多在十個胺基酸以上，所以由層析分離與胜肽之資料庫搜尋比對結果 發現到，當靜相碳鏈越短時，所辨識出的長胜肽鏈數目就越少，而和一般 預期的結果相符合，亦即長靜相碳鏈者(C8 以上)較適合使用來分離長鏈型 胜肽。而在同樣都是 C18 碳鏈長度，但是採用不同交聯情況的比較上卻也 發現到，雖然單一平層式的確有著稍微較快的平均滯留時間（34min vs.

37min），但是它的 Protein coverage 卻明顯低於多平層式所獲得的結果，平 均為(8.0 ± 2.64)% vs.(12.3 ± 0.424)％。因此顯然對於未配備有 nanospray 之 LC/ESI-MS 儀器而言，使用多平層式靜相所帶來的分析結果之高 Protein coverage 值，足以弭補因為峰線之輕微遲滯現象，所帶來之操作時間的不便 利性。

第二章 緒論

人類基因體計劃（Human Genome Project）因大規模、自動化基因定序 技術的產生，而比原先預期的時間一再提前的完成，後基因體時代

（Post-Genome Era）的大門也隨之開啟。在對 DNA 有了較完整的瞭解之 後，接下來即是對生物體內各種組織或細胞中整體的蛋白質表現進行探 討。一切的遺傳訊息皆隠藏在基因中。但是真正執行所有生理功能的卻是 蛋白質。蛋白質體學──這由基因體學（Genomics）所延續而來的學問，

也隨之發展起來。

蛋白質體學是一門研究蛋白質的科學。主要是在討論蛋白質的胺基酸 排列順序，與蛋白質的立體結構；由於蛋白質的胺基酸排列是被基因所決 定，目前科學家對蛋白質的瞭解尚未足夠，利用已知或是已有理論基礎的 蛋白質結構資料，進一步去分析和推測未知的蛋白質結構，這就是蛋白質 體學興起的主要原因。蛋白質體學的研究囊括了各種學科，例如：結構生

物學 （Structure Biology）、蛋白質表現（Protein Expression）、蛋白質交 互作用 (Protein Interactions）、高速蛋白質體定位法（High-Throughput

Proteomic Mapping）、蛋白質修飾（Post-translation Modification) 和膜蛋白 質（Membrane Proteins）等的學科。日後即可藉由蛋白質體學的研究結果，

試著推敲出標的蛋白質的作用方法及目的；也就是檢查某一生物體內的所 有蛋白質，進而拼湊出它在細胞中的代謝途徑與它在生物體中的主要功 能；以及可利用此法對某些因蛋白質所引起的疾病進行檢測及預防[1-2]。

近年來由於分析蛋白質的方法愈來愈多，速度也越來越快，使得蛋白 質體學研究的腳步也一日千里，其中的一樣分析工具是質譜儀（Mass

Spectrometer）的使用。質譜儀可以快速的將由膠體電泳方法中分離得到的 蛋白質，將其序列排列出來，並且與由生物資訊所整合而成的資料庫進行 比對分析，以發現新的或突變的蛋白質，而利於對疾病診治或其它生物學 的發展。

LC/ESI-MS 是一種軟性離子分析技術，其優點是其所產生的離子是多 價離子，可使得大分子量的分析物在適當的 m/z 值被偵測到，這種方法可 以偵測 100000 左右分子量的蛋白質，且具有較低的背景雜訊，分析物的濃 度可低於 10^-15莫耳以下，但其最大的缺點是不適用於高塩類濃度的沖提液 條件，因為塩類會造成偵測結果的背景雜訊增大，因此處理樣本時，就必

須儘可能的去除塩類。此外電噴灑游離化的過程中也會受液滴大小、表面 電荷、液體之表面張力、溶劑揮發性以及離子溶劑結合強度等各項所影響。

所以需要選擇低表面張力，高揮發性，低離子溶劑結合能力等的沖提溶劑，

如甲醇（Methanol），乙烯腈（Actonitrie, ACN）等有機溶劑是較為合適的。

質譜儀與液相層析（Liquid Chromatography, LC）相連結，同時擁有了 二者的好處。質譜的好處如前所介紹的，而層析的好處在於它可以利用沖 堤的條件將所需檢測物質一一分離出，更加提昇質譜儀的分析能力。

液相層析[14]的運用一直相當的廣泛，其主要原因是因為它適用於非揮 發性及熱不安定性物質的分離。比如像胺基酸，蛋白質，核酸，藥物或其 它有機物、無機物等等。一般根據層析方法的不同可分為四類：包括分離 極性之非離子性物質的分配層析法（partition chromatography），使用於非極 性物質分析的吸附層析法（adsorption chromatography），對於低分子量的離 子性物質可使用離子交換層析法（ion exchange chromatography），而根據分 子量大小的分離過程則使用大小排除層析法或稱膠體層析法（gel

chromatograophy）。

其中分配層析法是此四種液相層析最被常用的。此層析法根據靜相填 充在支撐物上的方式，又可分為液相－液相層析法和鍵結相層析法，目前 以後者最被常用。鍵結相的管柱之填充物大都以矽膠或剛硬矽膠為基質而 得之合成粒子，直徑常用的有 3、5、10μm，表面鍵結有矽醇基（SiOH）。

利用動相和靜相的極性又可將分配層析法區分成正相和逆相層析法。正相 層析法的靜相是以水或三乙二醇附著在矽膠上，動相則使用一些非極性溶 劑如已烷或異丙醚等；而逆相層析法的靜相則是非極性的碳氫化合物，動 相則是使用極性溶液如水、甲醇或乙烯腈等。

在逆相層析法的鍵結相填充物常用矽烷的Ｒ基，Ｒ基代表著烷基或取 代烷基，一般是 C8（正烷基）或 C18（正 18 烷基）。沖提液的 pH 值常介 於 2-8 之間，而常用的沖提液極性選用中或高極性，一般會使用兩種溶劑的 混合，以便得到所需的極性指數，而有利於層析物質之適用。

使用像甲醇或乙稀腈等有機溶及含有與分析物所帶之電荷相反的離子 性化合物所構成的動相層析液稱之為離子對層析，也就是本實驗所用的方 法。與分析物相反的離子與分析物形成離子對後，形成電中性物質，因而 能被逆相管柱而滯留。離子對層析適用於分離小的無機或有機離子。

在管柱本身的分離效率方面，分離的作用是極性物質的碳氫鏈之間或 碳氫鍵之間的交互作用所形成。如果具有不同分子量但同樣具有極性的分 析物也可以被分離出來，但必須藉由溶劑和靜相，非極性或具分離能力的 靜相來進行分離。在管柱中通常以二氧化矽為支撐物，表面可以覆蓋含碳 數不同之碳鏈，形成一般所謂的＂逆相層析管柱＂，依碳氫鏈和二氧化矽 結合的方式不同，可分為＂brush＂或＂bulk＂型[3]。Brush 型即一般我們所 稱的＂monomeric＂，在一個二氧化矽上只接配一條碳鏈；而 bulk 型即

是＂polymeric＂，在一個二氧化矽上，除了原有的碳鏈之外，在碳鏈上的 另外再形成矽烷醇基團，這新形成的基團可以和更多的試劑反應，而成交 聯的聚合物結構。由於管柱中含碳鏈的長短，也影響著分析物在管柱中的 滯留能力，即可被吸附胜肽的多寡，因而在此時實驗中我們也比較了 C4

（n-butyl)， C8（n-octyl），C18（n-octadecyl)之管柱。

在實驗的樣品中，我們選擇了牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin）。

此樣品的分子量在 66KDa，胺基酸數約有 607 個，但其中的雙硫鍵卻有 17 個。在實驗的進行中必須進行雙硫鍵的裂解作用，才能被胰蛋白酶進行反 應。比起其它沒有雙硫鍵且分子量也小的肌紅蛋白，或是其它分子量大，

但雙硫鍵的數目過多或過少的情形下，對實驗結果的比較，BSA 是較理想 的選擇。

第三章 實驗方法

本實驗是當管柱靜相含有不同碳鏈時，對分析結果的影響。在實驗中 所有的溶液配製過程都使用去離子水。

一， 實驗藥品與材料：

在本實驗中所使用的試劑皆是分析級試藥。

1. 修飾劑（Modifiers）：

甲酸（Formic Acid)，Merck

三氟乙酸 TFA （Trifluoroacetic acid），Fluka

五氟丙酸 PFHA （Perfluoroheptanoic acid），Sigma 七氟丁酸 HFBA （Heptafluorobutanoic acid），Sigma 2. 乙烯腈（Acetonitrile)，Merck

3. 甲醇（Mathanol），Merck。

4. DTT：dithiothreitol， Promaga 5. IAA：2-Iodacetamid， Merck。

6. 絶對酒精（99.9%），Merck。

7. 醋酸：Acetic Acid， Merck。

8. 聚丙烯： Acrylamide，Promaga

9. TEMED：N, N, N’, N’,-tetramethylethylene diamine（四甲基乙基二胺）， Promaga

10. 胰蛋白酶（Trypsin）：Modified，Promega 11. 染色劑Ⅰ：Instant blue，吉恩馬克

12. 染色劑Ⅱ：Coomassie Brillant Blue 試劑，Bio-Rad。

13. 染色劑Ⅲ：Sypro® Ruby 試劑，Prove。

14. BSA 樣品：Bovine Serum Albumin，感謝慈濟大學劉朝榮副敎授純化濃 縮提供。

二，實驗儀器：

1. 液相層析質譜儀：LCQDUO，配有 ESI 離子源介面，Thermo Finning LC/ESI-MS/MS

2. 液相層析幫浦：Hitachi LC pump L-7100 3. 自動取樣機：TSP4000

4. 振盪器：Scientific Industries Vortex-Genine 2 5. 超音波震盪器：Branson，PC620-1

6. 乾燥機：Speed Vacuum，Savant SC110，Refrigerated Vapor Trap RVT400 7. 加熱器：Thermolyne

8. 氮氣產生器：Parker 76-94，頤華

9. 離心機：centrifuge 5415 D，eppondrof。

10. 逆相液相層析管柱（Reverse-Phage Columns）：Vydac C4 column：Vydac 製

C8 column：Vydac 製

C18 column (monomeric silane ) ：Vydac 製 C18 column ( polymeric silane) ：Vydac 製 SC18 column：Supelco 製

11. 所有種類的 tip 和 1.5mL 的離心管都先用甲醇處理過。

三，實驗方法：

圖 1 : 實驗之流程圖 製做 10% SDS-PAGE, 並將標的蛋

白質(BSA , 1μg)進行分離

取出蛋白質點, 進行 In-gel digestion

進行不同碳 鏈長的酸性 修飾劑之比 較

進行不同流速 對蛋白質分析 結果的比較 進行不同含碳

鏈長之管柱及 不同鍵結形式 的管柱之比較

Instant Blue,，

Coomassie Blue，銀染及 Sypro Ruby 四 種蛋白質染劑 的比較

得到最佳化的結果分別是：

以三氟乙酸(TFA)作修飾劑 使用 C18 polymeric 分析管柱 沖提劑流速為 5μL/min

在最佳化結果下進行靈敏度的測 試. 最低可以測得 BSA 0.5μg

Real Sample test:

先進行單盲測試，以β-actin 為標目物，結果得到 36%

的 protein coverage .

再進行雙盲測試，分別得到

A: acidic ribosomal phosphoprotein 10.5%

B: prohibitin36.3%

確定是否為該蛋白質，根據分子量及 PI.兩者相對照。

四，儀器的設定：

本實驗使用 TSP 公司的自動取樣儀 4000 型，與 Hitachi 公司所出產 的 L-7100 型 液相層析泵連結，一般使用時將流速設定為 40 uＬ/min。

之後與 ESI / MS 相接。使用 Finnigan Xcalibur 軟體。而比對軟體則採用

TurboSEQUEST 軟體。

在質譜儀的條件設定方面：

ESI Source

噴灑電壓（Spray Voltage）：4.5KV

鞘流氣體流速（Sheath Gas Flow Rate）：50.0 L/min 毛細管電壓（Capillary Voltage）：10V

毛細管温度（Capillary Temp）：250℃

Normalized

碰撞能量：30.0%

分子量範圍（m/z）：350~2000

不同碳鏈長之管柱實驗：

1. 在各沖提溶液中加入 TFA 0.05%，流速為 40uL/min。

2. 以上述之儀器條件分別進行 C4，C8，C18 管柱間之比較。

第四章 結果 管柱對蛋白質分析結果的影響

在分析管柱的方面，比較了 C4，C8，C18 的管柱。在 C18 的管柱方面 又分別比較 monomeric、polymeric；同時也選擇另一家廠商的 C18 管柱與 另外那四隻管柱做比較，以瞭解不同的廠家是否具有不同的差異。

以 BSA 為標的樣品，濃度為 1μg，同樣對各隻管柱進行四～五次的雙 重覆實驗，各自記錄下實驗結果。由 Vydac 製的管柱中，C4（圖 3）在蛋 白質的辨識率是 4.9%±1.2%，C8（圖 4）是 7.6%±1.2％，C18 中 monomeric

（圖 5）是 8.0%±2.6％， polymerica（圖 6）是 12.3%±0.4％，而 Supelco 製的 C18 管柱（圖 7）是 9.8%±2.7%。對得到的結果製成以下的統計圖。Y 軸代表 protein coverage，X 軸代表不同含碳鏈長的管柱。

C o lu m n s

c 4 -2 1 4 c 8 -2 0 8 c 1 8 -2 3 8 c 1 8 -2 1 8 s c 1 8

protein coverage, %

0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4

圖 2：不同含碳鏈長的管柱對蛋白質的分析結果

第五章 討論 管柱

碳鏈的長短與分析物結合的能力有所差距。

一般逆相管柱的碳鏈可以分為 C4，C8，C18 不同的長度。通常碳鏈愈 短所能抓住的分析物也就愈少，反之也就愈多。在此實驗中，以 BSA 為標 的物，濃度為 1μg。從圖 4 中可以得知整個結果。但是在管柱的鏈結形式 中，可分為兩種，一種是 monomeric，另一種是 polymeric。而 polymeric 所 得到的結果比 monomeric 好。 C4（圖 3）所得到 protein coverage 是

4.9%±1.2%，平均得到 2~3 段的胜肽；C8（圖 4）是 7.6%±1.2％，平均得到 3~4 段的胜肽；C18 中 monomeric（圖 5）是 8.0%±2.6％，平均得到 4 段的 胜肽；polymerica（圖 6）是 12.3%±0.4％，平均得到 6~7 段的胜肽；而 Supelco 製的 C18 管柱（圖 7）是 9.8%±2.7%，平均得到 5 段的胜肽。

雖然 polymeric 所得到的胜肽較 monomeric 的來得多，但是所需的分離 時間較長；而 monomeric 所抓住的樣品量較少，但分離的時間較快。在同 樣都是 C18 管柱的情形下，流速對管柱的種類的影響並不明顯，只有樣品 量的多少會響影分離的效果。

第六章 結論

不同碳鏈長的管柱，同樣對蛋白質的有相當的分離效果，但是在 C18 的管柱中以 polymeric 的鍵結方式可以得到較佳的結果，monomeric 次之，

隨著含碳鏈長的縮短，辨識的結果也相對的減少。又以另一家廠商 Supelco 製的 C18 管柱的分離效果在本實驗中較 Vydac 的 monomeric 的好，但較

polymeric 的差一些。

第六章 參考文獻

1. 小泰生物科技期刊 初探蛋白質體學 責任編輯 2002/02/20

2. Aebersold R, Goodlett DR. Mass Spectrometry in proteomics. 2001; Chem Rev. 101, 269-296.

3. Heftmann E: Chromatography 第一版，台灣台北，眾光文化事業有限公 司，1983; pp138-140.

圖3-A：以C4逆相管柱分離蛋白質之質譜圖

圖3-B：以C4逆相管柱分離蛋白質之資料庫搜尋結果

圖3-C：以C4逆相管柱分離蛋白質之蛋白質比對結果

圖4-A：以C8逆相管柱分離蛋白質之質譜圖

圖4-B：以C8逆相管柱分離蛋白質之資料庫搜尋結果

圖4-C：以C8逆相管柱分離蛋白質之蛋白質比對結果

圖5-A：以C18 (monomeric) 逆相管柱分離蛋白質之質譜圖

圖5-B：以C18 (monomeric) 逆相管柱分離蛋白質之資料庫搜尋結果

圖5-C：以C18 (monomeric) 逆相管柱分離蛋白質之蛋白質比對結果

圖6-A：以C18 (polymeric) 逆相管柱分離蛋白質之質譜圖

圖6-B：以C18 (polymeric) 逆相管柱分離蛋白質之資料庫搜尋結果

圖6-C：以C18 (polymeric) 逆相管柱分離蛋白質之蛋白質比對結果

圖7-A：以SC18逆相管柱分離蛋白質之質譜圖

圖7-B：以SC18逆相管柱分離蛋白質之資料庫搜尋結果

圖7-C：以SC18逆相管柱分離蛋白質之蛋白質比對結果