Methylene Blue

第三章 實驗結果與討論

3.1 核黃素應用潛力探討

核黃素包含核黃素單核苷酸（Flavin monoucleotide，FMN）和核 黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，FAD），維生素 B2

（簡稱 VB2）即是核黃素的重要衍生物之一，由糖醇-D-核糖醇

（D-ribitol）與 7,8-二甲基-異喀嗪（7,8-dimethyl-isoalloxazine）所構 成：

N N

NH N

O

O

H₃C H₃C

CH₂

Vitamin B

4a 1 2 43 5

7 6

8 9 10

CH C

H CH₂

OH OH OH

核黃素是部份去氫酶（Dehydrogenases）與核黃素蛋白

（Flavoproteins）的輔酶，負責生物體電子傳遞與進行去氫化反應。

根據文獻報導，核黃素中的雜環結構（isoalloxazine）是核黃素主要 電子傳遞與催化反應中心，例如 FAD 與 FMN 可將 NADH 轉換成 NAD⁺或進行如圖 3-1 所示的氧化還原反應：

N

N

NH

N C

H₃

C H₃

O

O

OH OH

OH O X

N⁺

N

NH

N C

H₃

C H₃

O^-

O R

H

N

N

NH

N H C

H₃

C H₃

O

O R

H

Riboflavin , X=H FMN , X=

FAD , X=

N O O

OH OH P

O

OH O

O O

P N

N N NH₂ P O

O

O^-

H⁺+ e^- H⁺+ e^-

FADH‧(FMNH‧)(semiquinone) FADH₂(FMNH₂)(fully reduced) isoalloxazine ring

圖 3-1 VB2、FMN 與 FAD 進行氧化還原反應之示意圖。

對於 VB2、FAD 與 FMN，我們發現：VB2、FAD、FMN 在無氧 環境下會顯現出一對可逆的氧化還原波。然加入氧氣後，該波的還原 峰會如圖 3-2(A)~(C)所示般變大，而氧化峰則幾乎完全消失。此一結 果顯示：當核黃素衍生物被還原時，可進行下列反應而將電子間接傳 給氧氣：

Q + e^- → Q^-. 式 3-1

Q^-. + O2 → Q + O2

-. 式 3-2

顯示 VB2等應具有將電子從還原態生化物質傳遞給氧氣或過氧化氫 的潛力，其中 Q 代表 VB2、FAD 與 FMN。

-0.2 -0.3 -0.4 -0.5 -0.6 -0.7 0

10 20 30 40 50

(A) VB

2

(d)

(c) (b)

(a)

I/µA

E/ V vs. SCE

-0.2 -0.3 -0.4 -0.5 -0.6 -0.7 0.0

10.0 20.0 30.0 40.0

50.0 (B) FAD _(d)

(b)

(c) (a)

I/µA

E/ V vs. SCE

-0.2 -0.3 -0.4 -0.5 -0.6 -0.7 -5

0 5 10 15 20 25 30 35 40

45 (C) FMN ^(d)

(c) (b)

(a)

I/µA

E/ V vs. SCE

圖 3-2 碳電極在 0.1 M KCl 中所測得的 CV 圖譜，其中(a)在氮氣下；

(b)在氧氣下；(c)含有 1×10^-4 M 核黃素（氮氣下）；(d)含有 1×10^-4 M 核黃素（氧氣下）。（A）為 VB2；（B）為 FAD；（C）為 FMN；掃描

我們也對核黃素催化還原過氧化氫的能力進行探討，其結果如圖 3-3 所示。我們發現：VB2、FAD 與 FMN 的還原峰隨著過氧化氫的添 加而呈現增大趨勢，其電流變化幅度遠大於不加核黃素(左上圖中插 圖)。根據這些結果，我們認為核黃素應具有催化還原過氧化氫的潛 力。

0 -200 -400 -600 -800 -2

0 2 4 6 8 10 12 14 16

400 200 0 -200 -400 -600 -800 -2

0 2 4 6 8 10 12 14

I/µA

E/ mV vs. SCE

VB₂

I/µA

E/ mV vs. SCE

0 50 100 150 200 250 300 350 0.5

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 VB₂

(b) (a)

Y = 1.55817 + 0.01494 * X R²=0.98207

Y = 0.56885 + 0.00413 * X R²=0.98327

I/µA

[H₂O₂]/ mM

0 -200 -400 -600

-2 0 2 4 6 8 10

FAD

I/µA

E/ mV vs. SCE

0 50 100 150 200 250 300 350 0.5

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

(b) (a)

FAD

Y = 2.85833 + 0.01156 * X R²=0.99662

Y = 0.49833 + 0.00612 * X R²=0.96645

I/µA

[H₂O₂]/ mM

0 -200 -400 -600

0.0 4.0

8.0 FMN

I/µA

E/ mV vs. SCE

0 50 100 150 200 250 300 350 0.5

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

(b)

FMN (a)

Y = 2.258 + 0.01254 * X R²=0.97858

Y = 0.48833 + 0.00671 * X R²=0.98198

I/µA

[H₂O₂]/ mM

圖 3-3 VB2（上）、FAD（中）與 FMN（下，各 0.1 mM，pH 3）逐 量添加 H2O2時所測得之 CV 圖譜（左），其中[H2O2]：0 ~ 300 mM。

插圖為無催化劑之控制實驗，掃描速率為 0.05 V/s。右圖：電流與[H2O2]

有鑒於 VB2、FAD 與 FMN 在生化反應上的應用潛力，我們試圖 利用氧化還原法，將 VB2、FAD 與 FMN 修飾於碳電極表面上，探討 其成為分子探針元件的潛力。根據圖 3-4 所示的結果，我們發現：若 以碳電極作為工作電極，再以電位掃瞄法連續循環掃瞄 20 圈，電極 上僅顯現出微小氧化還原峰（插圖），顯示 VB2、FAD 與 FMN 似乎 難以有效吸附於碳電極表面。推測其原因，可能是 VB2、FAD 與 FMN 分子較大且具有長鏈結構，因此不利在電極表面進行吸附。

1.0 0.5 0.0 -0.5

-15 -10 -5 0 5 10 15

-0.2 -0.4 -0.6 -2.0

0.0 2.0

I/µA

E/ V vs. SCE

(A) VB₂

I/ µA

E/ V vs. SCE

1.0 0.5 0.0 -0.5

-5 0 5 10 15

0.0 -0.3 -0.6 -1.0

-0.5 0.0 0.5 1.0

I/µA

E/ V vs. SCE

(B) FAD

I/µA

E/ V vs. SCE

1.0 0.5 0.0 -0.5

-5 0 5 10

0.0 -0.3 -0.6 -0.4

0.0 0.4 0.8 1.2

I/µA

E/ V vs. SCE

(C) FMN

I/ µA

E/ V vs. SCE

圖 3-4 VB2 (0.1 mM，A)、FAD (1 mM，B) 與 FMN (0.5 mM，C)以 碳電極在 0.1 M KCl 中連續掃瞄 20 圈所測得的 CV 圖譜，其中掃描 速率為 0.02 V/s。插圖：掃瞄完畢後，電極上所顯現的 CV 圖譜。

有鑑於上述缺憾，我們於是尋找具有與核黃素類似結構的化合 物，如 phenothiazine，模擬核黃素藉在生化系統中的電子傳遞功能；

部分具有核黃素結構或特性的類核黃素，其結構如下所示：

S N

S+ N

H₂N NH₂

(H₃C)₂N N(CH₃)₂

Methylene Blue

Thionine acetate

N (H₃C)₂N

NO₂

N(CH₃)₂

⊕

Methylene Green

OAc^-

1/2ZnCl₂ Cl^-

Cl^-

N

S N

N⁺ CH₃ H₃C

H H Cl^-

CH₃

Toluidine Blue O N

NH N

N⁺ CH₃ H₃C

H H Cl^-

CH₃

Neural red

O N

N⁺ C₂H₅

C₂H₅ H₂N

Nile Blue A 2

SO₄^2-

3.2 類核黃素與 NADH、NAD⁺之交互作用探討

上述類核黃素雖具有與核黃素類似結構，然其催化潛力則有待探 討。我們於是以 NADH 與 NAD⁺進行探測。根據文獻報導⁽²²⁾，NADH 與 NAD⁺是去氫酶的輔酶，負責傳遞電子。倘若類核黃素可與 NADH 或 NAD⁺進行交互作用，則有助於電極與 GDH 間的電子傳遞。有鑑 於此，我們於是對前述類核黃素與 NADH 與 NAD⁺間的交互作用，進 行光、電化學研究。

3.2.1 類核黃素與 NADH、NAD⁺間的光譜分析

根據圖 3-5 所示的 UV-Vis 吸收光譜，部分類核黃素如 Thionine，

其特徵吸收峰（如在 600 nm）會隨著 NADH 的添加而逐漸下降。此 一光譜變化顯示：Thionine 等應可與 NADH 進行交互作用。雖然在 250 nm 與 340 nm 處的吸收度也會產生變化，此乃 NADH 的特徵吸 收峰，與反應無關。

200 300 400 500 600 700 800

0.0 0.5 1.0 1.5

(f) (a)

ABS

λ/ nm

-5.2 -5.0 -4.8 -4.6 -4.4 -4.2 -4.0 -3.8 -0.4

0.0 0.4 0.8

1.2 Y = 5.66404 + 1.20601 * X R²=0.9949

n=1.21 K=4.61*10⁵

log[(A o/A) - 1] (λ ab: 600 nm)

log[NADH]

圖 3-5 Thionine (33 µM)於水溶液中逐量添加 NADH 所測得之吸收 光譜(左)，其中[NADH]：(a) 0; (b) 0.25; (c) 0.5; (d) 0.75; (e) 2; (f) 4 eq。

右圖為 log[(A0/A) – 1]與 log[NADH]之關係圖。

假設類核黃素（簡稱 M）與 NADH（簡稱 L）可進行下述反應，

而 K 為其平衡常數：

M + nL → complex 式 3-3 K = [complex]/[M][L]ⁿ 式 3-4 則 [complex] = K[M][L]ⁿ 式 3-5 若 M 的起始濃度為 CM

0，且在特定波長處（如 600 nm）的最大吸收 度為 A0，加有 L 時的吸收度為 A，則

CM

0 = [M] + [complex] 式 3-6 A0 = k CM

0 式 3-7

A = k [M] 式 3-8

其中 k 為比例常數。若 [L] » CM 0

則 CM

0= [M]×(1 + K[L]ⁿ) 式 3-9 因為 A0 = A{1 + K×[L] ⁿ} 式 3-10 所以 (A0/A) – 1 = K×[L]ⁿ 式 3-11 log [(A0/A) – 1] = log K + n log [L] 式 3-12 若以 log[(A0/A) – 1]對 log[L]作圖，理論上可獲得一線性關係，並可 於截距處求得 log K，而從斜率可得到 n。根據圖 3-5 中的右圖，我們 估計 Thionine 與 NADH 的 K 值約為 4.6×10⁵，而 n 約為 1.2。這些結 果顯示在水溶液中，每莫耳 Thionine 約可與 1 莫耳的 NADH 進行反

應。根據類似分析方法，我們也對其他類核黃素進行探討，其結果則 列於附錄 3-50~3-54 及表 3-1 中。

表 3-1 類核黃素與 NADH 反應之平衡常數與配位數。

____________________________________________________

K (n)

--- 類核黃素 UV-Vis 光譜分析法 螢光光譜分析法 ____________________________________________________

Thionine 4.6×10⁵ (1.2) 1.4×10⁵ Toluidine blue 1.6×10³ (0.93) 6.5×10⁴ Methylene blue 4.0×10³ (0.95) 1.4×10⁴ Neutral red 1.0×10⁴ (1.1) 3.5×10³ Nile blue ~ 7.7×10³ Methylene green 5.4×10³ (0.84) 1.1×10⁴

____________________________________________________

此外，我們也發現：若改添加 NAD⁺，類核黃素溶液的吸收光譜 並無明顯變化，如圖 3-6 以及附錄 3-55 所示，其中僅有 NAD^＋的特徵 吸收峰（250 nm）的吸收度會隨之上升，顯示在水溶液中類核黃素不 易與 NAD⁺進行交互作用。

200 300 400 500 600 700 800 0.0

0.5 1.0 1.5 2.0

[NAD⁺] 8 eq

0

Thionine

ABS

λ/ nm

圖 3-6 Thionine (33 µM) 添加 NAD⁺所測得之吸收光譜。

根據上述結果，我們推測：類核黃素可接受 NADH 所供應的電子 而形成還原態的類核黃素，但較難將電子傳遞給 NAD⁺。與 NADH 的 反應中，以 Thionine 與 Neutral red 的反應性較高，其次是 Toluidine blue、 Methylene green 與 Methylene blue，至於 Nile blue 則最弱。對 此，我們也以螢光光譜分析進行探討，添加 NADH 與 NAD⁺的實驗結 果列於圖 3-7~3-8、附錄 3-56~3-61 以及表 3-1 中。

600 620 640 660 680 700 720 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

Thionine

(j) (a)

F/ a.u.

λ/ nm

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1.2 1.3 1.4 1.5 1.6

Y = 1.38757 -0.01612 * X R²=-0.31109

[Fo /F - 1] / [NADH]

[NADH]/eq.

圖 3-7 Thionine (10 µM)於水溶液中添加 NADH 之螢光光譜，其中 [NADH]：(a) 0; (b) 0.33; (c) 0.66; (d) 1; (e) 1.33; (f) 1.66; (g) 2; (h) 3; (i) 4; (j) 8 eq。右圖為[(F⁰/F) – 1]/[NADH]對[NADH]作圖。

600 620 640 660 680 700 720

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

F / a. u .

λ

/ nm

圖 3-8 Thionine (10 µM)於水溶液中添加 NAD⁺所測得之螢光光譜，

其中[NAD⁺]：0 ~ 8 eq。

根據螢光光譜分析，Thionine 等類核黃素添加 NADH 時，螢光強 度會隨之下降;若添加 NAD⁺，則無明顯變化。此結果證實 Thionine 等類核黃素可與 NADH 進行交互作用，但不易與 NAD⁺進行反應。針 對類核黃素與 NADH 之反應，其機制可能有三：

I、基態類核黃素與 NADH 進行反應 II、激態類核黃素與 NADH 進行反應

III、基態與激態類核黃素均可與 NADH 進行反應

若以第三種機制作為考慮，類核黃素的螢光淬熄應符合下述關係:

[(F^o/F) - 1]/[Q] = (K + Ksv) + K×Ksv[Q] 式 3-13 其中 K 與 Ksv分別為基態類核黃素與激態類核黃素與 NADH 反應的 平衡常數以及 Stern-Volmer 淬熄常數，Q 代表 NADH。根據式 3-13，

若以[(F^o/F) - 1]/[Q]對[Q]作圖，即可從截距與斜率估計出類核黃素與 NADH 反應的 K 與 Ksv數值，其結果亦列於表 3-1 中。我們發現：螢 光分析法所得之 K 值與以 UV-Vis 吸收光譜所得的 K 值頗為一致，因 此我們推論：類核黃素的螢光淬熄效應主要來自靜態淬熄

（Steady-state quenching）。我們也以暫態螢光分析(Transient emission analysis)對類核黃素的動態淬熄進行探討，發現類核黃素的生命期多 短於 10 ns，低於目前本系現有儀器之偵測極限，因此無法在此論點 上獲得獨立結論。

3.2.2 溶液態類核黃素與 NADH 作用之電化學分析

除了進行上述光學分析外，我們也對類核黃素與 NADH 間的電 化學行為進行探討。實驗結果顯示：若以碳電極直接氧化 NADH，其 起始電位約為 0.6 V，如圖 3-9 所示。然若將類核黃素加入溶液中時，

NADH 的氧化可發生在較負的電位（圖 3-10 以及附錄 3-62~3-66）。 由此可知，類核黃素具有催化氧化 NADH 的潛力。

0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -14

-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2

(f) (a)

I/ µ A

E/ V vs. SCE

圖 3-9 以碳電極於 0.1 M KCl 中直接氧化 NADH 所得之 LSV 圖譜，

其中[NADH]：(a) 0; (b) 0.2; (c) 0.4; (d) 0.6; (e) 0.8; (f) 1 mM。掃瞄速 率：0.05V/s。

0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -10.0

-8.0 -6.0 -4.0 -2.0 0.0 2.0 4.0

(l) (a)

I/µA

E/ V vs. SCE

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -9

-8 -7 -6 -5 -4 -3

-2 Y = -2.546-6.45038* X R²=0.99557

Ipa/ µA

[NADH]/ mM

圖 3-10 Thionine (10^-4M) 添加 NADH 之 LSV 圖譜，其中[NADH]：

0 ~10 eq。掃瞄速率：0.05 V/s。下圖為 Ipa對 CNADH作圖。

唯我們也發現類核黃素與 NADH 反應時，顯現出不盡相同的圖 譜，因此我們推測各種類核黃素所涉及的反應機制不盡相同，可能涉 及下列四種機制：

[I] M^- M + e^-, E₁^o'

M + xNADH Mk ^- + xNAD⁺ + 2xe^- + xH⁺ (k is independent of E)

[II] M^- M + e^-, E₁^o'

M + xNADH Complex, K

Complex Mk ^- + xNAD⁺ + 2xe^- + xH⁺, (E₂^o'~E₁^o')

[III] M^- M + e^-, E₁^o'

M + xNADH M^- + xNAD⁺ + 2xe^- + xH⁺, E₂^o' k = k₀ e

k

[(1- α)nf(E - E₂^o')]

k = k₀ e[(1- α)nf(E - E₂^o')]

[IV] M^- M + e^-, E₁^o'

M + xNADH Complex, K

Complex Mk ^- + xNAD⁺ + 2xe^- + xH⁺, (E₂^o')

我們嘗試以這些機制對類核黃素與 NADH 的電化學行為進行分 析，唯其數學較為複雜，我們將於下節以薄層電極（Thin-layer electrode）分析之。雖然如此，由於大部分類核黃素在電位 0.25 V 處 存在下列近似關係：

I

κ

表 3-2 類核黃素之 I_pa與 C_NADH線性關係之

κ

類核黃素 溶液態 氧化聚合法 偶氮修飾法 自然吸附法

Thionine 6.45 1.43 13.96 10.14

Toluidine blue 8.39 1.55 10.89 11.54

Methylene blue 2.03 4.7 3.55 1.89

Neutral red 5.09 ~ 2.69 1.78

Nile blue 0.21 ~ 0.12 0.79

Methylene green 6.03 4.397 3.84 5.43

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

2 4 6 8 10 12

Methylene green

Nile blue Neutral red

Methylene blue Toluidine blue

Thionine

|I p a |/ µ A

[NADH]/ eq.

圖 3-11 各類核黃素(溶液態)逐量添加 NADH 所得之|I_pa|與 C_NADH線 性關係比較。

3.2.3 溶液態類核黃素與 NAD⁺作用之電化學分析

除了探討與 NADH 的反應外，我們也電化學探討類核黃素與 NAD⁺間的作用，其結果如圖 3-12 與附錄 3-67~3-71 所示。我們發現 若在類核黃素溶液中添加 NAD⁺時，類核黃素本身的還原峰會逐漸變 小，但在較正電位會出現新的氧化還原峰。

類核黃素的還原峰之會隨 NAD⁺的添加而往正電位偏移，可能由 幾種因素所造成：第一，類核黃素可與 NAD⁺形成錯合物;第二，NAD⁺ 為路易士酸，當其添加時會造成溶液中的 pH 變小。由於此一原因，

類核黃素的電位隨之偏移。針對第二點可能性，我們將 NAD⁺改為 HCl，發現 Toluidine blue 的還原電位也會向往正電位偏移。由此可 知，NAD⁺確實具有路易士酸的效果。雖然如此，Toluidine blue 的氧 化還原峰卻不會因磷酸緩衝溶液添加而分裂成兩個峰。有鑑於此，我 們推測 NAD⁺之所以會令類核黃素電位偏移，不僅是因路易士酸的效 應，類核黃素與 NAD⁺間的錯合反應也是因素之一。若進一步將 NAD⁺ 與 H⁺對 Toluidine blue 的效應進行比較，我們發現添加 NAD⁺與 H⁺對 電流的效應有所不同（圖 3-13）。由此可知，類核黃素也會與 NAD⁺ 反應，只是強度較微弱罷了。

0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 -0.5 -0.6 -0.7 -2

-1 0 1 2 3 4 5 6 7

I/µA

E/ V vs. SCE ^{0 40000 80000 120000}

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

4.0 Y = 0.7176 + 2.708E-5 * X R²=0.98732

(∆I ∞- ∆I o)/(∆I-∆I o)

[NAD⁺]^-1/ M^-1

圖 3-12 Methylene blue (10^-4M)於水溶液中添加 NAD⁺所測得之 LSV 圖譜，其中[NAD⁺]：0~1.5eq。掃瞄速率：0.05 V/s。右圖為[(ΔI∞-Δ Io)/(ΔI-ΔIo)]對[NAD⁺]^-1作圖。

0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -3

-2 -1 0 1 2 3

E/ V vs. SCE (A)

I/µA

0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6

-3 -2 -1 0 1 2 3

E/ V vs. SCE (B)

I/ µA

0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 (C)

I/µA

E/ V vs. SCE

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0

1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4

2.6 (D)

(b) (a)

I pc/ µA

-log[L]

圖 3-13 (A) Toluidine blue(10^-4M)於水溶液中逐量添加 NAD⁺ (0~3 eq)。(B) Toluidine blue(10^-4M)於水溶液中逐量添加 H⁺ (0~3 eq。(C) Toluidine blue(10^-4M)於磷酸緩衝溶液中所得的 CV 圖譜，其中 pH：

7.95~2.37。掃瞄速率：0.05 V/s。(D) (a) Toluidine blue 逐量添加 H⁺ 之檢量線；(b) Toluidine blue 逐量添加 NAD⁺之檢量線。

對於類核黃素與 NAD⁺間的錯合反應，假設類核黃素（M）可與 NAD⁺（L）進行下列反應，K 為其平衡常數：

M + yL ---> complex, K 式 3-15 CM

0 = [M] + [complex] 式 3-16 CL

0 = [L] + y[complex] 式 3-17

K= [complex]/[M][L]^y 式 3-18

根據式 3-16～3-18 可得：

[M] = CM

0/(1+ K [L]^y) 式 3-19

[complex] = CM

0K [L]^y/(1+ K [L]^y) 式 3-20 若 CL

0 >> CM

0 , [L] ≈ C_L⁰ 則 [M] = CM

0 /{1+ K(CL

0)^y} 式 3-21

[complex] = CM 0K(CL

0)^y/{1+ K(CL

0)^y} 式 3-22 由於 M 之還原峰會隨 L 的增加而變小，並在另一電位生成一新還原 峰，因此我們也可根據這兩個還原峰電流分析 K。若令

I = Ic + I1 + I2 式 3-23

I1 = k1[M] , I2 = k2[complex] , Ic = charging current

∆I = I – Ic = I₁ + I₂ = k₁[M] + k₂[complex] 式 3-24 若 CL

0 = 0, [M] = C_M⁰, [complex] = 0

則 ∆I0 = k₁ C_M⁰ 式 3-25

若 CL

0 >> CM

0 , [M] ≈ 0, [complex] ≈ C_M⁰ 則 ∆I^∞ = k2CM

0 式 3-26

=>∆I = k1[M] + k2[complex] = ∆I0[M]/CM

0 + ∆I∞[complex]/CM

0 式 3-27

∵ CM

0 = [M] + [complex] 式 3-28

∆I = ∆I0[M]/CM

0 + ∆I∞{CM

0 - [M]}/CM

0 式 3-29

=> CM

0/[M] = (∆I0-∆I∞)/(∆I- ∆I∞) = 1 + K[L]^y ≈ 1 + K(C_L⁰)^y 式 3-30 若以(∆I0- ∆I∞)/(∆I- ∆I∞)對(CL

0)^y作圖(y = 1,2,3...)，便可求得 K。同樣 地，也可根據新峰分析 K：

∵ CM

0 = [M] + [complex] 式 3-31

∴ ∆I = ∆I0{CM

0 - [complex]}/CM

0 + ∆I∞[complex]/CM

0 式 3-32

=> CM

0/[complex] = (∆I∞- ∆I0)/(∆I– ∆I0) ≈ 1 + 1/K(C_L⁰)^y 式 3-33 若以(∆I^∞-∆I0)/(∆I– ∆I0)對 1/(CL

0)^y作圖，便可求得(K)^-1。根據上述推 導，我們以[(ΔI^∞-ΔIo)/(ΔI-ΔIo)]與[NAD⁺]^-y關係對各類核黃素進行 分析，其結果附於圖 3-12 與附錄 3-67~3-71 中，所得 K 值與配位數 則列於表 3-3 內。

表 3-3 類核黃素與 NAD⁺反應之 K 值與配位數。

類核黃素 溶液態 氧化聚合 偶氮修飾法 自然吸附

Thionine n = 1

K= 9.56×10³

n = 1

K= 4.01×10³

n = 1

K= 1.37×10⁴

n = 1

K= 3.77×10⁴ Toluidine blue n = 1

K= 6.51×10³

n = 1

K= 9.16×10³

n = 1

K= 3.07×10⁴

n = 1

K= 2.78×10⁴ Methylene blue n = 1

K= 3.69×10⁴

n = 1

K= 3.87×10⁴

~ n = 1

K= 3×10⁴ Neutral red n = 1

K= 1.04×10⁴

n = 1

K= 1.58×10⁴

n = 1

K= 3.95×10⁴

n = 1

K= 3.76×10⁴ Nile blue n = 1

K= 4.4×10³

n = 1

K= 5.1×10³

~ n = 1

K= 2.26×10⁴ Methylene green n = 1

K= 8.54×10²

n = 1

K= 2.93×10⁵

~ ~

3.2.4 類核黃素修飾電極製備以及與 NADH、NAD⁺反應之電化學分析 為進一步探討可否以類核黃素製備「分子探針」以及瞭解類核黃 素與 NADH 及 NAD⁺間的反應機制，我們嘗試以下述三種修飾方法製 備類核黃素修飾電極：

I 氧化聚合法 II 偶氮修飾法 III 自然吸附法

實驗顯示（圖 3-14）：若將碳電極與類核黃素，如 Toluidine blue，共 置，Toluidine blue 會逐漸自我吸附於電極上。

400 0 -400 -800 -1200

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

I/ µ A

E/ mV vs. SCE

圖 3-14 碳電極浸泡於含 Toluidine blue 的 KCl 溶液中 22 小時後所測 之 CV 圖譜。掃瞄速率：0.05 V/s。

除自然吸附（Self adsorption）外，我們也發現部分具有 amino group（-NH2）的類核黃素可以氧化聚合方式（Anodic polymerization）

及偶氮化（Diazotation）方式修飾於電極表面上。例如，若將 Thionine 氧化，Thionine 可聚合在電極表面上（圖 3-15 A），但若以這種修飾 電極催化氧化 NADH，幾乎不具效力(圖 3-15 B)。雖然如此，以這種 方式修飾在電極上的 Thionine 仍可與 NAD⁺進行錯合（圖 3-16），這 些行為與溶液態 Thionine 的行為不盡相同。

1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2-0.4 -50

-40 -30 -20 -10 0 10 20 (A)

I/µA

E/ V vs. SCE

0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -8

-6 -4 -2 0 2 4 6 (B)

I/µA

E/ V vs. SCE

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -4.4

-4.2 -4.0 -3.8 -3.6 -3.4

(C)

Y = -3.46 -1.43* X R²=0.97615

Ipa/ µA

[NADH]/ mM

圖 3-15 碳電極於 Thionine (1mM)在電位-0.5 ~ 1.5 V 間連續掃瞄 10 圈時所測得之 CV 圖譜（A），其中掃瞄速率：0.02 V/s。(B)該修飾電 極於 KCl 溶液中逐量添 NADH，其中[NADH]：0~1 mM。掃瞄速率：

1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -10

-5 0 5 10

I/µA

E/ V vs. SCE

0 20000 40000 60000 80000 100000 0

6 12 18

24 Y = 0.362 + 2.491E-4 * X R²=0.99962

(∆I ∞- ∆I o)/(∆I-∆I o)

[NAD⁺]^-1/ M^-1

圖 3-16 上圖所述 Thionine 修飾電極於 KCl 溶液中逐量添加 NAD⁺所 測得之 LSV 圖譜，其中[NAD⁺]：0~0.6 mM。掃瞄速率：0.05 V/s。右 圖為[(ΔI^∞-ΔIo)/(ΔI-ΔIo)]對[NAD⁺]^-1作圖。

我們也利用偶氮修飾法以及自然吸附法製備 Thionine 修飾電極，

其結果如圖 3-17 與 3-18 所示。以這兩種方法所製成的修飾電極，其 表面上的類核黃素可 NADH 及 NAD⁺反應，與溶液態者較相似，但是 效果較差，顯示：以氧化聚合方式製備類核黃素修飾電極，會造成類 核黃素喪失部份氧化還原特性。

0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 -0.5 -0.6 -2

0 2 4 6 8 10 12 14 16

18 (A)

I/µA

E/ V vs. SCE

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -10

-8 -6 -4 -2 0 2 4 (B)

I/µA

E/ V vs. SCE

0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -6

-4 -2 0 2 4 6 8 (C)

I/µA

E/ V vs. SCE ^{-12 -11 -10 -9 -8 -7}

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

(D) Y = 5.19741 + 0.46537 * X R²=0.99884

x=0.46 k=43.64

ln(I ∞/I o)

ln[NADH]

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -10

-9 -8 -7 -6 -5 -4

(E)

Y = -4.1 -13.962* X R²=0.99144

Ipa/ µA

[NADH]/ mM

0 20000 40000 60000 80000 100000 0

2 4 6 8

(F) Y = 0.583 + 7.279E-5 * X R²=0.99732

(∆I ∞- ∆I o)/(∆I-∆I o)

[NAD⁺]^-1/ M^-1

圖 3-17 （A） Thionine（1 mM）經偶氮化後在 HCl 中被電碳極在 0~-0.6 V 間連續還原 10 圈而吸附於碳電極所得之 CV 圖譜。掃瞄 速率：0.02 V/s。（B）該修飾電極於 KCl 溶液中逐量添加 NADH（0~1 mM）之 LSV 圖譜。掃瞄速率：0.05 V/s。（C）逐量添加 NAD⁺所 得之 LSV 圖譜，其中[NAD⁺]：0~0.3 mM。掃瞄速率：0.05 V/s。（D）

ln(I∞/Io)與 ln[NADH]關係圖。（E）Ipa對 CNADH作圖。（F）[(ΔI∞-Δ Io)/(ΔI-ΔIo)]對[NAD⁺]^-1作圖。

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0 -14

-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4

0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -4

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

I/µA

E/ V vs. SCE

(A)

I/µA

E/ V vs. SCE

0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -6

-4 -2 0 2 4 6 (B)

I/µA

E/ V vs. SCE

-12 -11 -10 -9 -8 -7

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

(C) Y = 6.38 + 0.564 * X R²=0.98186

x=0.56 k=142.7 ln(I ∞/I o)

ln[NADH]

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -14

-12 -10 -8 -6 -4 -2

(D)

Y = -2.43 -10.14* X R²=0.99863

Ipa/ µA

[NADH]/ mM

0 20000 40000 60000 80000 100000 0

2 4

(E) Y = 0.987 + 2.647E-5 * X R²=0.99897

(∆I ∞- ∆I o)/(∆I-∆I o)

[NAD⁺]^-1/ M^-1

圖 3-18 （A）以自然吸附法製得之 Thionine 修飾電極於 KCl 溶液中 逐量添加 NADH 時所得之 LSV 圖譜，其中[NADH]：0~1 mM。插圖 為自然吸附 8 小時後之 CV 圖譜。掃瞄速率：0.05V/s。（B）添加 NAD⁺ 時所得之 LSV 圖譜，其中[NAD⁺]：0~0.5 mM。掃瞄速率：0.05 V/s。

我們也以前述三種方式將其他類核黃素製備成修飾電極，再藉以 探討與其 NADH 及 NAD⁺間的反應，其結果如附錄 3-72~3-86 所示。

對於這些修飾電極添加 NADH 之電化學行為，我們推測：電極上的 類核黃素仍依循前節所述四種反應制與 NADH 進行反應。有鑑於此，

我們利用薄層電極模型(Thin-layer electrode)對其電化學行為進行模 擬。若固定於電極表面的類核黃素(M)可與 NADH(L)進行如機制[I]

的反應：

[I] M

M + ne

, E

'

M + xNADH M k

+ xNAD

+ 2xe

+ xH

(k is independent of E)

氧化態類核黃素（M）與 NADH 進行反應生成 NAD^＋，其中反應速 率常數（k）與所施加電位無關，

則 I/nFV = -dCr(t)/dt + 2kCo[L]^x

其中 V 為 M 在電極表面的體積。假設電子傳遞數（n）等於 1，L 代 表 NADH，

∵CM

0 = Co(t) + Cr(t) 式 3-34 Co(t)/Cr(t) =θ₁ = exp[nF(E-E1

0’)/RT] 式 3-35

∴Co(t) = θ1Cr(t) , CM

0 = θ1Cr(t) + Cr(t) = Cr(t)(1 + θ1)

∴Cr(t) = CM

0/(1 +θ1) , Co(t) = CM

0θ₁/(1 + θ1) 式 3-36 I/nFV = -d[CM

0/(1 + θ1)]/dt + 2k[CM

0θ₁/(1 + θ1)][L]^x 式 3-37

I/nFVCM

0 = nFυθ1/RT(1 + θ1)² + 2k[θ1/(1 + θ1)][L]^x 式 3-38 其中 υ = dE/dt，即 scan rate

當 θ₁
∞ , I^∞/nFVCM

0 ≈ 2k[L]^x 式 3-39 當 θ₁
1(即 E = E^10’), I0/nFVCM

0 = nFυ/4RT 式 3-40 I∞/I0 = 8k[L]^xRT/nFυ 式 3-41 以 ln(I∞/I0)對 ln [L]作圖，即可求 k 與 x_。

若 M 與 L 依據機制[II]進行反應，

[II] M

M + e

, E

'

M + xNADH Complex, K

Complex M k

+ xNAD

+ 2xe

+ xH

, (E

' ~ E

') (k is independent of E)

氧化態類核黃素（M）與 NADH 先形成錯合物後，於相同之類核黃 素氧化還原電位處再氧化生成 NAD^＋，其中反應速率常數（k）也與 所施加電位無關，

則 I/nFV = -dCr(t)/dt + 2d[complex]/dt 式 3-42 I/nFV = -dCr(t)/dt + 2k[complex] 式 3-43

∵[complex] = K[M][L]^x 式 3-44

∴I/nFV = -dCr(t)/dt + 2kK[L]^xCo(t) 式 3-45

∴CM

0 = θ1Cr(t)(1+ K [L]^x) + Cr(t) = Cr(t){1 + θ1 + θ1K[L]^x}式 3-48

∴Cr(t) = CM

0/[1 + θ1 + θ1K[L]^x] 式 3-49 Co(t) = θ1CM

0/[1 + θ1 + θ1K[L]^x] 式 3-50

∴ I/nFV = -dCr(t)/dt + 2kK[L]^xCo(t) 式 3-51 I/nFV = nFυCM0θ₁(1 + K[L]^x)/{RT[1 + θ1 + θ1 K [L]^x]²} +

2kK[L]^xC_M⁰θ₁/{1 + θ₁ + θ₁K[L]^x} 式 3-52 若 M 與 L 依機制[III]進行反應

[III] M

M + e

, E

'

M + xNADH M

+ xNAD

+ 2xe

+ xH

, E

' k' = k

e

k'

[(1- α)nf(E - E

')]

即氧化態類核黃素（M）與 NADH 反應後，於較類核黃素氧化還原 電位更正處（E₂^0’）氧化生成 NAD^＋，其中反應速率常數（k’）與所 施加電位成指數關係，

Let k0

’=k0×(A/V)

I = nFV(-dCr(t)/dt)+2nFA k(E)Co(t)[L]^x

I/nFV = -dC_r(t)/dt + 2(A/V)k(E)C_o(t)[L]^x 式 3-53 Let k’(E)=k(E)×(A/V)

I/nFV = CM

0nFυθ1/RT(1 + θ1)² + 2k’(E)[CM

0θ₁/(1 + θ1)][L]^x

= CM0

nFυθ1/RT(1 + θ1)² +

2k₀^’{exp[(1-α)nF(E- E₂^0’)/RT]}[C_M⁰θ₁/(1 + θ₁)][L]^x 式 3-54 I/nFV = C ⁰nFυθ /RT(1 + θ )² + 2 k ^’θ ^(1-α)θ C ⁰ [L]^x/(1 + θ ) 式 3-55

若 M 與 L 依機制[IV]進行反應：

k' = k

e [(1- α)nf(E - E

')]

[IV] M

M + e

, E

'

M + xNADH Complex, K

Complex M k

+ xNAD

+ 2xe

+ xH

, (E

' )

即氧化態類核黃素（M）與 NADH 先形成錯合物後，於較類核黃素 氧化還原電位更正處（E20’）再氧化生成 NAD^＋，其中反應速率常數

（k’）與所施加電位成指數關係，

則 I/nFV = -dCr(t)/dt + 2k’(E)[complex]

= nFυCM0θ₁(1+ K[L]^x)/RT[1 + θ1 + θ1K [L]^x]² +

2k’(E)K [L]^xC_M⁰θ₁/[1+θ₁+θ₁K [L]^x] 式 3-56 I/nFV = nFυCM

0θ₁(1 + K[L]^x)/RT[1 + θ1 + θ1K[L]^x]² + 2 k0

’{exp[(1-α)nF(E - E2

0’)/RT]}K[L]^xCM

0θ₁/[1 + θ1 + θ1K[L]^x] 式 3-57 I/nFV = nFυCM0θ₁(1 + K[L]^x)/{RT [1 + θ1 + θ1K[L]^x]²}+

2 k₀^’θ₂^(1-α)θ₁K [L]^xC_M⁰/[1 + θ₁ + θ₁K[L]^x] 式 3-58

各機制的電腦模擬結果如圖 3-19 所示，其中參數α為 0.1 較佳

1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -7

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0

2 1 0.5 0

[L] : 3 (A)

Ipa/µA

E/ V

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -200

-150 -100 -50 0

(B) 0

0.1 0.5

1 2 4 [L] : 1000

Ipa/µA

E/ V

1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -400

-300 -200 -100 0

Ipa/µA

(C) 0

0.2 0.4

[L] : 0.8

E/ V

1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0

-12 -10 -8 -6 -4 -2 0

Ipa/µA

(D) 0

0.5 1 5 10

[L] : 20

E/ V

圖 3-19 反應機制模擬圖：(A)機制[I] (B)機制[II] (C)機制[III]與(D)機 制[IV]。