中華民國第五十一屆中小學科學展覽會
作品說明書
科 別：生物科 組 別：高中組
作品名稱：不給糖就搗蛋-蛀牙細菌的抑制
關 鍵 詞：Bacillus horikoshii、轉糖鏈球菌、蛀牙
編 號：
摘要：
本實驗的目的是希望能找出人類牙齒上的主要菌種。牙齒的疾病，是由某些細菌會形成 難以破壞的生物膜，導致細菌能長期滋長，並破壞牙齒的琺瑯質，使牙齒中的鈣質流失，最 後導致蛀牙的情形；本實驗主要內容是採取牙齒上的垢物進行培養，然後加以定序找出細菌 種類與名稱，再以拮抗菌的概念，希望能找出能有效抑制導致蛀牙細菌的菌種，以菌種間互 相制衡的方式，抑制其生長，進而研發菌劑，使服用後可減少蛀牙發生機率。
壹、研究動機：
“牙痛不是病，痛起來要人命”，相信很多人對於牙痛，都有著不堪回首的經驗；齲齒(蛀 牙)是目前國人從老到少皆常見到的口腔疾病，每當看牙醫時，那高頻的鑽牙器具所發出的聲 音也往往令人對看牙齒敬而遠之，也因此讓很多人就算蛀牙也不願意去看牙醫，導致蛀牙情 況惡化，最終甚至要抽神經或拔牙。記得之前看過一則恐佈的新聞，一位四十多歲的壯年男 子，因為忍住牙痛，遲遲不肯就醫，導致細菌流入血液、胸腔，引發敗血症而身亡。〝蛀牙不 治療，小心出人命〞，因為小看或害怕而不去看牙醫，很容易讓自己曝入在危險之中，蛀牙絕 非小事，但治療時的疼痛卻也讓許多人無法忍耐。減少蛀牙最常使用的方法就是飲食過後立 即的刷牙漱口，但是週遭同學中有些人就算不常刷牙也依然有一口好牙齒，沒有蛀牙的困擾；
但是有些人卻是飯後立即刷牙，卻依然有蛀牙產生；我們對於這種情形相當好奇，於是開始 去尋找蛀牙的成因與機制。
在查詢相關的資料後，我們得知蛀牙主要是受到轉糖鏈球菌( streptococcus mutans) 的影 響，它會形成一種生物膜而使牙齒開始蛀蝕，由於不清楚它的作用機制及形成的原因，我們 開始深入的研究，後來我們從台大微生物學研究所張家瑜的碩士論文中，得知轉糖鏈球菌可 代謝多種糖類產生乳酸，而使得牙菌斑(dental plaque)局部環境 pH 值降到 4 以下，因而 造成牙釉質的脫鈣而造成齲齒。另外在一篇江俊斌副教授的文章中我們也得知會引起人類牙 齒蛀牙之細菌，主要是突變型鏈球菌(或稱轉糖鏈球菌)、黏性放線菌和乳酸桿菌血鏈球菌、
緩鏈球菌、糞腸球菌和乳酸桿菌等。 因此，我們決定以我們的牙齒為樣本，找出是否存在著 這些細菌，及是否有其他的細菌能抑制這些造成蛀牙的細菌。
我們決定以各自的牙齒為實驗對象，分析其上可能附著生長的微生物，實驗進行以本組 同學狀態不同的牙齒來分析，當中有一個人一個禮拜沒刷牙，希望藉此能保留下更完整的細 菌菌相。若能在我們的牙齒上找到能拮抗造成蛀牙的細菌的結抗菌，表示這可能此細菌可能 附著或存在於日常食物當中，進而可以將此類食物推薦給大眾，或是針對蛀牙菌的拮抗菌製 成生物製劑，讓預防齲齒不再費神困難。
貳、研究目的：
一、比對找出口腔中常見的細菌 二、找出抑制蛀牙菌拮抗菌種
三、檢測此拮抗菌可否對其它次要的蛀牙菌產生抑制
參、研究設備及器材：
一、實驗原料：
組員 A〈一週無刷牙〉 組員 B〈僅白天刷牙〉 組員 C〈日夜皆刷牙〉
牙垢 牙垢 牙垢
二、實驗藥品：
Genomic DNA PCR
Lysozyme buffer F＇primer Extraction solution R＇primer Proteinase K stock solution buffer
RNaseA dNTP Protein Precipitation solution Taq
Isopropanol ddH2O Ethanol
Ligatoin 藍白篩
PEG 4000 solution IPTG TA vector Xgal
DNA ddH2O Ligase
Extract plasmid Transform Solution 1 Mgcl2
Solution 2 Cacl2
Solution 3 PCR elution Washing solution A DFbuffer
Washing solution B Wash buffer
ddH2O ddH2O
三、實驗設備、器材：
微量吸管〈2µl、20µl、200µl、1000µl〉
〈一〉、高壓滅菌器 〈二〉、製冰機
〈三〉、-20 度冰箱 〈四〉、-80 度冰箱
〈五〉、37 度培養箱 〈六〉、56 度培養箱
〈七〉、大型離心機 〈八〉、PCR 機器
〈九〉、電泳用具 〈十〉、無菌操作台
肆、研究過程或方法：
一、流程圖：
↓
摳牙垢
塗盤
↓
挑菌落
↓
抽genome DNA
↓
PCR
↓
↓
定序
Ligation
藍白篩
↓
檢測是否對次要蛀牙菌產 生抑菌圈
↓
看結果
↓
基因轉殖到載體
實驗說明：
〈一〉挑選細菌
↓
以液態培養在Lb broth內
↓
由其中挑選幾個獨立的菌落 將所摳下的牙垢已序式析列分 別塗盤
〈二〉、抽 genome DNA
加入RNaseA 4μl 37 ℃ 15-30min
↓
56 ℃培養1-3小時
↓
加入20μl proteinase K stock solution, vortex
↓
加入600μl Extract solution, vortex
加入180μl Lysozyme buffer ,vortex 培養37 ℃ 30min
↓
↓
晾乾pellet 5-10min
↓
離心top speed 1min 去上清 液
↓
去上清液 加入1ml 70％酒精
↓
離心top speed 1min
↓
取上清液到tube，再加入600 μl isopopanol,倒轉數次 直
到DNA黏稠狀
↓
取2.5ml 菌 離心 13000rpm 2min 去上清液
↓
加入ddH2O 30μl 5min回溶 加入200 μl Protein Precipitation
solution , vortex
↓
離心top speed 3min
〈三〉、PCR
20-25cycl ddH2O 36μl
dNTP 5μl
PCR buffer 4μl F primer 2μl R primer 2μl
Taq 1μl
DNA 0.5μl
94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃
5分 30秒 30秒 30秒 72℃
以此方法將所需的 DNA 片段放大數倍，始較不易受到汙染
〈四〉、clean up
取100μl PCR sample
↓
加入5倍體積 DF buffer vortex
架column 加入上步驟之液體
↓
↓
離心 13000rpm 30sec
↓
去除濾液 加入wash buffer 600μl
↓
靜置1min 離心 13000rpm 30sec
去除濾液 乾轉3min 換column到
↓
加入40 μl ddH2O 靜置2min 離心
〈五〉、Ligation 10X ligation buffer
50％ PEG4000 solution TA vector DNA ligase
1μl 1μl 1μl 6μl 1μl
2.放室溫 1 小時〈22℃〉
3.以 4 度，overnight 培養
〈六〉、transform
↓
↓
前一天養菌1/100
↓
取200μl 至20ml 錐形瓶 養3 小時
加入CaCl2 100μl / 管
↓
加入ligation 之物
↓
冰上放5min
放入50ml離心管 離心 6000rpm 5min
冰上放20min →42 ℃ 1min30sec →冰上放20min
↓
↓
倒上清液 加入MgCl2 大力搖
↓
離心6000rpm 5min 倒上清液
↓
加入900μl LB 預養1小時
↓
離心6000rpm 5min 去上清液
加入CaCl2 靜置20min
↓
離心6000rpm 5min 倒上清液
↓
塗盤
〈七〉、藍白篩
1. 預養再 37 度培養箱一小時 2.
1M IPTG 10μl Xgal 20μl ddH2O 70μl
↓
塗盤(要避光)
↓
將轉殖完的菌塗到 PLATE 上
↓
挑選白色的菌落
轉殖成功才取 沒有轉殖成功不要
〈八〉、Extract plasmid
離心 13000rpm 5min
↓
200μl solution III , 輕搖5次
↓
↓
去除濾液空轉5min column換到新 tube
↓
600μl washing solution B 離心 1min
200μl solution II , 輕搖5次
↓
200μl solution I, vortex
↓
↓
60μl ddH2O 3min
↓
離心 3min
600μl washing solution B 離心1min
500μl washing solution A 離心 1min
架column 取上清液 並離心1min 菌液離心13000rpm 1min
↓
〈九〉、檢測是否對次要蛀牙菌產生抑菌圈
↓
將欲抑制的菌 200μl 塗到培養皿上
↓
↓
若可拮抗中央紙片周圍會有一 圈澄清的區域，即為拮抗圈
培養 overnight
將可能為拮抗菌的菌液 10μl 滴在中 央紙片上
長滿菌落的未拮抗區塊 中央紙片
拮抗環
預抑制的細菌分為四種，乳酸菌 A、乳酸菌 B、酵母菌 A、酵母菌 B 由於某細菌許以其最適合的生長環境為準，因此將培養基分為兩種 1. MRS broth 加 Agar
2. LB broth 加 Agar 加葡萄糖〈Glucose〉
伍、研究結果：
一、抽 plasmid 後電泳確認有抽到 plasmid，表示定序出來之細菌確實為牙垢裡取出的
〈圖一〉
Bacillus horikoshii
二、以細菌 16S rRNA 的基因定序比對出菌種：
〈圖二〉
圖二、將培養的細菌送去定序，再到 NCBI 網站查詢，紅框處的細菌〈Bacillus horikoshii〉
根據論文為能抑制蛀牙菌-轉糖鏈球菌〈streptococcus mutans〉產生生物膜之拮抗菌。
〈圖三〉
Bacillus horikoshii
三、刷牙時間不同，與找到之細菌比較
一週無刷牙 僅白天刷牙 日夜皆有刷
找到可抑制轉糖鏈球菌形 成生物膜的細菌〈Bacillus horikoshii〉
無找到與蛀牙相關之細菌 無找到與蛀牙相關之細菌
四、檢測此拮抗菌可否對蛀牙菌產生抑制 照成蛀牙之細菌：
主要 轉糖鏈球菌〈streptococcus mutans〉
Bacillus horikoshii 抑制效果 可抑制其生物膜生長 次要：測試四隻會產酸破壞琺瑯質之細菌
細菌種類 抑制效果
酵母菌 A 無效〈圖四〉
酵母菌 B 無效〈圖五〉
乳酸菌 A 無效〈圖六〉
乳酸菌 B 無效〈圖七〉
圖四、因為無抑菌圈的產生，所以 Bacillus horikoshii 無抑制效用
圖五、因為無抑菌圈的產生，所以 Bacillus horikoshii 無抑制效用
圖六、因為無抑菌圈的產生，所以 Bacillus horikoshii 無抑制效用
圖七、因為無抑菌圈的產生，所以 Bacillus horikoshii 無抑制效用
五、轉糖鏈球菌的作用機制
轉糖鏈球菌是一株經常在人類口腔中被發現的革蘭氏陽性兼性厭氧菌，含有乳酸脫氫 酶，能將焦葡萄酸（pyruvic acid）轉變為乳酸，乳酸進而傷害牙齒的琺瑯質。
它又具有一種 glucosyltransferase 的酶，可將葡萄糖聚合成 glucans。glucans 是一種細菌 體外的多醣類，黏性很大，細菌可藉此物質集聚一起並且依附在牙齒表面繁殖，形成齒斑。
此外 glucans 又會減低唾液清洗口腔的能力。
在酸性條件下，S.mutans 仍然可以生存。它還可製造細菌體內的另一種多醣類
（amylopectin 之類的化合物），這些多醣類會被轉化為有機酸。
轉糖鏈球菌須在固體上才能生長，因此不會附著於口腔黏膜繁殖。
葡萄糖〈C6H12O6〉
蔗糖〈C12H22O11〉 焦葡萄酸〈C3H4O3〉 乳酸〈C3H6O3〉 果糖〈C6H12O6〉
上述為細菌將蔗糖代謝為乳酸的過程
陸、討論：
一、經過實驗之後，在牙垢中發現此株菌-Bacillus horikoshii，且此菌可能與抑制蛀牙有關。
二、經過抑菌圈實驗後，我們發現 Bacillus horikoshii 對於引起蛀牙的次要細菌並無明顯的抑 制效果。
三、轉糖鏈球菌會引發蛀牙的發生，有文件顯示本組在牙垢中發現的 Bacillus horikoshii，可 能可以抑制轉糖鏈球菌的生物膜的產生，在日後可能會對防治蛀牙有極大的效果。本組組員 希望再繼續進行實驗，了解轉糖鏈球菌和 Bacillus horikoshii 之間的抑制作用。
柒、結論：
一、 我們的牙垢當中找到了一隻能抑制轉糖鏈球菌的細菌，證明它應該是藉由食物傳 入口中的，而它對轉糖鏈球菌的抑制作用，能讓轉糖鏈球菌的生物膜無法生長，
進而使轉糖鏈球菌的許多作用無法產生，讓其它能分解醣類的細菌無法繼續代謝 出酸來破壞琺瑯質，而達到治療蛀牙的效用。
二、 Bacillus horikoshii 僅僅對轉糖鏈球菌有用，因此要是次要的蛀牙菌，有了其他的 醣類來原，便又能產生破壞琺瑯質，使得牙齒繼續蛀牙。
三、未來展望：
原本設想是要雙管齊下對照進行驗證，一方面以定序比對分析，另一方面是以 DGGE 的 方式進行對照口中所有菌種，但由於時間的因素暫時未能得到結果，在未來的期望中，希望 能將 DGGE 的實驗流程執行完畢，就能更有效率的分析出牙齒上的菌種存在，到時或許就能 發現出更多牙齒上的秘辛，也能更了解出在牙齒上的細菌戰是如何發生的；而我們的第一部 分實驗也幸運的篩選出能拮抗轉糖鏈球菌的拮抗菌種，經由口中常見的產酸菌種進行拮抗實 驗，以兩隻乳酸菌、兩隻酵母菌，採取五循環的實驗機制，卻無法看出抑菌的效果，抑菌圈 也無產生的趨勢；但我們在論文中有找出，我們所篩選出來的Bacillus horikoshii菌確實能有效 抑制轉糖鏈球菌的生物膜形成。
在未來的發展上，正著手於Bacillus horikoshii菌的生長，了解其生物抑制的機制且是否使 用過量會危害人類口腔中的其他機制運作，位於哪些可食用的食物蔬果上能產生，要是能查 詢出確切的食物，或許加以推廣以天然的方式就能有效的減少國人蛀牙的發生機率，但如果 難以印證或生物體內的量過於稀少，導致無法有效的控制蛀牙菌的生長，最後的步驟我們會 朝生物製劑的方式進行考量，對於上段所說明的蛀牙主因─轉糖鏈球菌的菌種進行拮抗實 驗，先證實確切無誤的拮抗作用能順利產生，再找尋出較能符合經濟效益以及安全範圍的使 用量進行實驗，讓人類能成功免於蛀牙菌的威脅，以最天然的生物相剋的概念，進行便利且 快速的蛀牙治癒。
捌、參考資料：
一、http://www.bhp.doh.gov.tw/bhpnet/portal/Them.aspx?No=200712250008衛生署國民 健康局婦幼及生育保健組
二、碩士論文 轉糖鏈球菌酸敏感突變株的選殖及分析 張家瑜 1998 三、http://www.hvl.com.tw/tw/News_Info.asp?tmpId=40
四、Antibiofilm activity of coral-associated bacteria against different clinical M serotypes of Streptococcus pyogenes
五、http://210.60.226.25/science/content/1981/00070139/0006.htm
