科技部補助專題研究計畫報告
探討NO對於骨代謝的影響並開發可經皮緩釋NO donor之微針系
統應用於雌激素缺乏之骨質疏鬆症治療(第3年)
報 告 類 別 ： 成果報告 計 畫 類 別 ： 個別型計畫 計 畫 編 號 ： MOST 106-2221-E-006-058-MY3 執 行 期 間 ： 108年08月01日至109年07月31日 執 行 單 位 ： 國立成功大學醫學系 計 畫 主 持 人 ： 陳毓宏 共 同 主 持 人 ： 陳美瑾 計畫參與人員： 碩士班研究生-兼任助理：楊茵茵 大專生-兼任助理：黃鈺珈 大專生-兼任助理：陳羿綸 博士班研究生-兼任助理：邱鈺琇本研究具有政策應用參考價值：■否 □是，建議提供機關
（勾選「是」者，請列舉建議可提供施政參考之業務主管機關）
本研究具影響公共利益之重大發現：□否 □是
中 華 民 國 109 年 09 月 01 日
中 文 摘 要 ： 停經後的婦女因缺乏雌激素，導致蝕骨細胞過度活化，易引發原發 性骨質疏鬆症。低濃度的一氧化氮(NO)具有調整免疫系統之能力 ，能促使胸腺細胞凋亡以及減少 T 細胞增殖，進而減緩腫瘤壞死因 子-α(Tumour necrosis factor-α, TNF-α)刺激蝕骨細胞分化 ，以抑制骨吸收，達到治療骨鬆的效果。本研究以 molsidomine 作 為 NO donor，並利用 core-shell 微針系統包覆藥物，讓微針鑲 嵌至皮膚中緩釋molsidomine，提高生物可利用率與降低每日服藥之 不便性。本微針乃以聚乳酸聚乙醇酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]作為包覆藥物之主材料(core)，探討不同 PLGA 共聚物比例及黏度對藥物釋放之影響；於微針外層塗覆聚乙烯 吡咯烷酮與聚乙烯醇之混和物[poly(vinyl alcohol) and
poly(vinyl pyrrolidone) blends, PVP/PVA]形成殼狀結構，賦予 微針更高的機械強度以加深穿刺深度。經體外藥物釋放評估 ，LA：GA = 85：15 之 PLGA 能於兩週內以接近零次釋放的方式釋 放藥物(R2 = 0.97, n=5)，且無初期突釋與二次釋放發生。PVP/PVA 的外層殼狀結構，可明顯提高 PLGA 微針之穿刺深度，由 665 ± 142 μm 加深至 948 ± 35 μm (n=6)，顯示殼狀結構不僅可加深穿 刺深度，亦更加提高穿刺之穩定性。以去卵巢化誘發原發性骨鬆之 S.D.大鼠進行有效性測試，每兩週分別給予 2 片(低劑量)、3 片 (高劑量)微針，同時以每日注射雌激素作為正控制組。治療 8 週後 微針高劑量組之骨密度及其他骨參數皆明顯高於未治療組，並與正 控制組於統計上無明顯差異，且亦能明顯抑制血中 TNF-α 濃度 ，證實長期釋放 NO 能調節因缺乏雌激素而導致的骨質流失、協助 骨骼修復，具有治療原發性骨質疏鬆症之潛力。 中 文 關 鍵 詞 ： 原發性骨質疏鬆症、一氧化氮釋放劑、腫瘤壞死因子、緩慢釋放 英 文 摘 要 ： In postmenopausal women, estrogen deficiency causes
osteoclasts over activation, which easily suffers from primary osteoporosis. Low concentration of nitric oxide can regulate the immune system, which causes thymocytes
apoptosis, reduces T cell proliferation, and slows down tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) to stimulate
osteoclasts differentiation, thus suppressing bone resorption. In this study, we developed a core-shell
microneedle (MN) system for sustained transdermal delivery of molsidomine, a NO donor and evaluated its feasibility for treatment of osteoporosis. In the MN system,
[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA] was used as a core material to encapsulate molsidomine; [poly(vinyl alcohol) and poly(vinyl pyrrolidone) blends, PVP/PVA] was selected as a shell material to provide
mechanical strength for improving MN insertion
capability. The in vitro drug release study showed that MN made by PLGA with LA:GA = 85:15 provided an
approximate zero-order release profile (R 2 = 0.97, n = 5) for two weeks and no initial burst release or second
PVP/PVA shell can improve the insertion depth from 665 ± 142 μm to 948 ± 35 μm (n = 6), demonstrating the shell enhance the MN puncture stability.
Ovariectomized (OVX) Sprague Dawley rat was used as a model of postmenopausal osteoporosis to evaluate the MN efficacy. The animals were divided into four groups: untreated (OVX), low-dose (two patches per two weeks) MN, high-dose MN
(three patches per two weeks), and estradiol (E2, daily injection) treated groups. After 8 weeks of treatment, the bone mineral density and other bone parameters of the high-dose MN group were significantly higher than those of the untreated group, and there was no statistical difference compared to the E2 group. Additionally, the TNF-α levels were significantly reduced in both MN groups. These results demonstrated that using the PLGA-PVP/PVA core-shell microneedle for sustained release of molsidomine could be a potential therapeutic strategy for the treatment and prevention of postmenopausal bone loss.
科技部補助專題研究計畫成果報告
（□期中進度報告/■期末報告）
探討 NO 對於骨代謝的影響並開發可經皮緩釋 NO donor 之微針系統
應用於雌激素缺乏之骨質疏鬆症治療(3/3)
計畫類別：■個別型計畫 □整合型計畫
計畫編號：MOST 106-2221-E-006 -058 -MY3
執行期間：108 年 7 月 31 日至 109 年 8 月 1 日
執行機構及系所：國立成功大學醫學系
計畫主持人：陳毓宏
共同主持人：陳美瑾
計畫參與人員：萬祖瑜、林子堯、楊茵茵、邱鈺琇
期中報告處理方式：
1. 公開方式：
□非列管計畫亦不具下列情形，立即公開查詢
■涉及專利或其他智慧財產權，□一年■二年後可公開查詢
2.「本研究」是否已有嚴重損及公共利益之發現：■否 □是
3.「本報告」是否建議提供政府單位施政參考 ■否 □是， （請列舉提供
之單位；本部不經審議，依勾選逕予轉送）
中 華 民 國 109 年 08 月 31
目錄
摘要... II 1. 前言... 3 2. 研究方法... 4 2.1 包覆 molsidomine 之 PLGA 微針製備 ... 4 2.2 包覆藥物微針之體外藥物釋放... 4 2.3 微針機械強度測試... 4 2.4 微針穿刺測試... 5 2.5 包覆 molsidomine 之 PLGA 微針其治療有效性評估 ... 5 3. 結果與討論 ... 5 3.1 包覆 molsidomine 之 PLGA 微針 ... 5 3.2 含藥 PLGA 之體外藥物釋放 ... 5 3.3 微針機械強度測試... 6 3.4 微針穿刺測試... 6 3.5 微針於原發性骨質疏鬆症之治療結果... 6 3.5.1 微電腦斷層影像分析(micro-CT) ... 7 3.5.2 脛骨中脂肪含量... 7 3.5.3 血中腫瘤壞死因子(TNF-α)濃度 ... 7 4. 結論... 8 參考文獻... 8 圖... 10 表... 19摘要
停經後的婦女因缺乏雌激素，導致蝕骨細胞過度活化，易引發原發性骨質疏鬆症。低濃度的一氧 化氮(NO)具有調整免疫系統之能力，能促使胸腺細胞凋亡以及減少 T 細胞增殖，進而減緩腫瘤壞死因 子-α(Tumour necrosis factor-α, TNF-α)刺激蝕骨細胞分化，以抑制骨吸收，達到治療骨鬆的效果。本研 究以 molsidomine 作為 NO donor，並利用 core-shell 微針系統包覆藥物，讓微針鑲嵌至皮膚中緩釋 molsidomine，提高生物可利用率與降低每日服藥之不便性。本微針乃以聚乳酸聚乙醇酸共聚物 [poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]作為包覆藥物之主材料(core)，探討不同 PLGA 共聚物比例及黏度對 藥物釋放之影響；於微針外層塗覆聚乙烯吡咯烷酮與聚乙烯醇之混和物 [poly(vinyl alcohol) and poly(vinyl pyrrolidone) blends, PVP/PVA]形成殼狀結構，賦予微針更高的機械強度以加深穿刺深度。經 體外藥物釋放評估，LA：GA = 85：15 之 PLGA 能於兩週內以接近零次釋放的方式釋放藥物(R2 = 0.97, n=5)，且無初期突釋與二次釋放發生。PVP/PVA 的外層殼狀結構，可明顯提高 PLGA 微針之穿刺深度， 由665 ± 142 μm 加深至 948 ± 35 μm (n=6)，顯示殼狀結構不僅可加深穿刺深度，亦更加提高穿刺之穩 定性。以去卵巢化誘發原發性骨鬆之 S.D.大鼠進行有效性測試，每兩週分別給予 2 片(低劑量)、3 片(高 劑量)微針，同時以每日注射雌激素作為正控制組。治療 8 週後微針高劑量組之骨密度及其他骨參數皆 明顯高於未治療組，並與正控制組於統計上無明顯差異，且亦能明顯抑制血中 TNF-α 濃度，證實長期 釋放 NO 能調節因缺乏雌激素而導致的骨質流失、協助骨骼修復，具有治療原發性骨質疏鬆症之潛力。 關鍵詞：原發性骨質疏鬆症、一氧化氮釋放劑、腫瘤壞死因子、緩慢釋放
Abstract
In postmenopausal women, estrogen deficiency causes osteoclasts over activation, which easily suffers from primary osteoporosis. Low concentration of nitric oxide can regulate the immune system, which causes thymocytes apoptosis, reduces T cell proliferation, and slows down tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) to stimulate osteoclasts differentiation, thus suppressing bone resorption. In this study, we developed a core-shell microneedle (MN) system for sustained transdermal delivery of molsidomine, a NO donor and evaluated its feasibility for treatment of osteoporosis. In the MN system, [poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA] was used as a core material to encapsulate molsidomine; [poly(vinyl alcohol) and poly(vinyl pyrrolidone) blends, PVP/PVA] was selected as a shell material to provide mechanical strength for improving MN insertion capability. The in vitro drug release study showed that MN made by PLGA with LA:GA = 85:15 provided an approximate zero-order release profile (R2 = 0.97, n = 5) for two weeks and no initial burst release or second release occurred. Compared to the MN without the shell, the PVP/PVA shell can improve the insertion depth from 665 ± 142 μm to 948 ± 35 μm (n = 6), demonstrating the shell enhance the MN puncture stability. Ovariectomized (OVX) Sprague Dawley rat was used as a model of postmenopausal osteoporosis to evaluate the MN efficacy. The animals were divided into four groups: untreated (OVX), low-dose (two patches per two weeks) MN, high-dose MN (three patches per two weeks), and estradiol (E2, daily injection) treated groups. After 8 weeks of treatment, the bone mineral density and other bone parameters of the high-dose MN group were significantly higher than those of the untreated group, and there was no statistical difference compared to the E2 group. Additionally, the TNF-α levels were significantly reduced in both MN groups. These results demonstrated that using the PLGA-PVP/PVA core-shell microneedle for sustained release of molsidomine could be a potential therapeutic strategy for the treatment and prevention of postmenopausal bone loss.
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1. 前言
隨著醫療水平的提升，社會逐漸步向高齡化，而人口老化亦衍生出許多疾病，其中一項便是骨質 疏鬆症，過度活化的蝕骨細胞不斷進行骨吸收分解骨質，弱化骨骼強度，而雌激素具有調節體內細胞 因子(cytokine)基因轉錄的能力，抑制促炎因子或腫瘤壞死因子活化蝕骨細胞[1]，因此若缺乏雌激素， 體內骨代謝便會因為蝕骨細胞過度增生而失衡，使骨吸收的速率大於骨生成[2]。有文獻指出，雌激 素缺乏會使體內 IL-7 增加，導致胸腺活化生產出大量 T 細胞，分泌出大量 TNF-α，進而促使蝕骨細 胞分化及成熟，造成蝕骨細胞大量增生[3, 4]，形成原發性骨質疏鬆症。另有文獻指出切除卵巢之大 鼠血中 NO level 會較未切除者低[5]，顯示雌激素缺乏可能會導致體內自行合成 NO 的能力下降，使 體內沒有足夠的 NO 調控過度活化的胸腺細胞以抑制 T 細胞的輸出。一氧化氮能與體內的超氧離子反 應成過氧亞硝基，過氧亞硝基對活化的胸腺細胞較為敏感，可藉此促使其細胞凋亡，減少 T 細胞的 增殖，降低體內 TNF-α 濃度[6, 7]。文獻中的動物實驗也證明每日塗抹硝化甘油能治療切除卵巢誘發 骨質疏鬆症之大鼠，為證實骨質疏鬆症可能為體內缺乏一氧化氮所誘發的症狀，觀察一氧化氮抑制劑 L-NAME 與雌激素共同治療骨鬆大鼠之治療結果，發現 L-NAME 對於雌激素的治療具有抑制效果， 推測為一氧化氮抑制劑影響 NOS 合成一氧化氮的能力，顯示雌激素調節骨代謝的能力可能與 NOS 分 泌一氧化氮相關[8, 9]。先前本實驗室研究曾探討以心血管用藥 molsidomine 作為 NO donor，免除硝 化甘油在臨床應用上具有藥物耐受性(tolerance)的缺點[10]，找出其治療骨鬆的 NO 最佳給藥劑量，評 估其應用在治療骨鬆之可行性。透過口服低(2 μg/day)、中(60 μg/day)及高(200 μg/day)劑量的 molsidomine，治療去卵巢化誘發原發性骨鬆小鼠三個月，發現口服低劑量 molsidomine 可明顯降低促 發炎因子(TNF-α)的濃度與脛骨組織中脂肪之比例，證明低劑量之組別具有最佳之骨質修復能力。研究目的
本研究以心血管疾病用藥 molsidomine 作為 NO donor，基於先前研究之結果，以每日能給予低劑 量的 molsidomine 為目標[11]，透過生物相容性良好的聚乳酸聚乙醇酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA] 作為藥物載體，開發可長效經皮緩釋 NO donor 之微針，並經由體外藥物釋放觀察各組 不同性質之 PLGA 微針的釋放天數與藥物釋放之線性程度，評估何組 PLGA 所製成之微針於後續動 物實驗具有最佳藥物釋放結果。同時於 PLGA 外圍塗布 PVP/PVA 形成 core-shell 結構以提高 PLGA 微針之機械強度及穿刺深度，並經由材料測試機進行微針壓縮測試、體外豬皮穿刺測試應證。在動物 實驗將微針刺入去卵巢並誘發骨質疏鬆症之 S.D.母鼠皮膚並鑲嵌於其中，以長期緩釋 molsidomine， 透過細分口服低劑量 molsidomine 所設計的兩組微針治療組(X2 組、X3 組)與 OVX 組、臨床上治療原 發性骨質疏鬆症的正 control 雌激素治療組比較治療結果，進一步確認透過 PLGA 於皮膚中緩釋低劑 量 molsidomine 的有效濃度。動物實驗之有效性則透過 micro-CT 分析脛骨骨參數、檢測脛骨中脂肪 含量、血中 TNF-α 濃度進行評估，期望 NO donor 具治療原發性骨質疏鬆症之效果。
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2. 研究方法
2.1 包覆 molsidomine 之 PLGA 微針製備
(1)微針尖端製備：
將 30 mg molsidomine 與 300 mg 不同黏度之 PLGA( LA:GA = 50：50，I.V. = 0.21 dl/g、LA：GA = 75:25，I.V. = 0.19 dl/g、LA：GA = 75:25，I.V. = 0.53 dl/g、LA：GA = 85:15，I.V. = 0.38 dl/g )分別加 入 1 mL 乙酸乙酯中以 votex 震盪均勻，取 200 μL molsidomine/PLGA 溶液置於 PB8 微針模具，以離 心灌模的方式將材料灌入模具中，離心條件為 5000 rpm，5 分鐘，之後刮除模具上剩餘之溶液，再以 5000 rpm 離心 45 分鐘將灌入模具內的材料離心至針尖，為方便觀察微針於後續動物實驗之鑲嵌情況， 另再配製添加 1 mg coumarin 之 PLGA 含藥溶液以上述方式製成微針前端。為使 PLGA 堅實以便後續 支撐軸接合，將模具放置於 37°C 烘箱中乾燥 12 小時，即完成含藥之 PLGA 尖端製備(圖 1)。 (2)微針後端支撐軸製備：
配製重量比為 1：1：2 (PVP／PVA／DI water)的 PVP / PVA 水溶液，將溶液均勻鋪於支撐層模具 表面，以真空烘箱抽氣將水溶液灌入 PT6 模具中，真空條件為 – 600 mmHg，15 分鐘，隨後取出模 具並刮除剩餘水溶液，重新將 PVP/PVA 水溶液均勻鋪於模具表面，置於抽氣通風櫃中待其自然乾燥 後脫模，即完成 PVP/PVA 後端支撐軸製備(圖 1)。
(3)含 molsidomine 之 PLGA 微針製備：
將重量比為 1：1：2 (PVP／PVA／DI water)的 PVP / PVA 水溶液均勻鋪於含 PLGA 尖端之模具上， 置入真空烘箱，真空條件為 – 600 mmHg，1 分鐘，取出烘箱將殘餘之水溶液刮除，隨後將支撐軸插 入含 PLGA 之 PB8 模具中，目的為黏合 PLGA 尖端與 PVP/PVA 支撐軸，再放入 37°C 烘箱待黏合層 固化，即完成含 molsidomine 之 PLGA 微針製備(圖 1)。
(4)Core-shell 微針結構製備
將重量比為 1：1：2 (PVP／PVA／DI water)的 PVP / PVA 水溶液均勻鋪於 PB 微針模具上，以離 心灌模的方式將材料灌入模具中，離心條件為 5000 rpm，5 分鐘，取出模具後刮除剩餘溶液，即可將 先前製備好的 PLGA 微針插入 PB 模具中，置於 37°C 烘箱 12 小時待 PVP/PVA 固化即可脫模，為方 便觀察 shell 是否確實包覆於 PLGA 周圍，另再配置添加 R6G 之 PVP / PVA 水溶液以相同手法製成 core-shell 微針(圖 1)。
將完成的含藥微針回溶於適量的乙腈(acetonitrile)中，利用 HPLC 定量包覆的藥量，並以立體顯 微鏡與螢光顯微鏡拍攝製備完成的含藥微針之形態。
2.2 包覆藥物微針之體外藥物釋放
將各組別單片 PLGA 微針( LA：GA = 50：50, I.V. = 0.21、LA：GA = 75：25, I.V. = 0.19、LA：GA = 85：15, I.V. = 0.38、LA：GA = 75：25, I.V.= 0.53 )浸入 4 mL PBS 溶液中，並置於恆溫震盪水槽中 持續震盪(37°C, 100 rpm)，於 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 天取 1 mL 水溶液以 HPLC 進行藥物 濃度檢測，計算累積藥物釋放量，每次取樣後皆添加 1 mL 之新鮮 PBS 溶液，以維持 4 mL 之 PBS 含量。
2.3 微針機械強度測試
5 為每分鐘 0.1 mm 直至微針破碎，觀察其應力-應變曲線，亦於針尖下壓 400 μm 時停止壓縮(可承受最 大應力處)，取出試片以立體顯微鏡觀察其壓縮後形貌[12]。為觀察兩組微針於相同應力壓縮下之樣貌， 設定載具於感應至特定應力時停止壓縮，特定應力分別為 50 N、100N、200N 三組，並以立體顯微鏡 觀察，以比較相同應力下微針的壓縮形貌。 2.4 微針穿刺測試 利用實驗室自製微針貼膚器，以彈簧施予 10 N 力道將微針刺入已除毛後的 S.D.大鼠皮膚中，並 待 24 小時確認皮膚完全癒合後，以 CO2犠牲取皮進行冷凍切片，利用倒立式顯微鏡激發 coumarin 螢 光，並觀察穿刺深度與微針鑲嵌狀況。 2.5 包覆 molsidomine 之 PLGA 微針其治療有效性評估 將 20 隻 10 週齡之 S.D.母鼠進行卵巢切除手術(ovariectomy,OVX)，並以兩週時間誘發原發性骨 質疏鬆症，做為雌激素缺乏之動物模型，再給予為期 2 個月的治療，以每日給予口服低劑量 molsidomine(2 μg/day)為目標，設計微針所需施打的數量，文獻中口服嗎多明之平均藥物利用率約 50% (44~60%) [5, 6]，因此藉由口服途徑實際傳入體內之治療心血管劑量約為 1 μg/day per mice，以 S.D 大 鼠為治療模型需將此劑量乘以 17 倍(以平均 20 g 之小鼠換算體重為 340 g 之大鼠)，此劑量 17 μg/day per rat 落於施打兩片(X2 組，12 μg/day per rat)與三片(X3 組，18 μg/day per rat)PLGA 微針每日釋放藥量 之間，因此任意將 20 隻大鼠分成四組，各別為 OVX：去除卵巢未治療大鼠、X2：施打含 molsidomine 之 PVP/PVA core-shell 微針兩片，每兩週施打一次、X3：施打含 molsidomine 之 PVP/PVA core-shell 微 針三片，每兩週施打一次、E2：每日皮下注射 10 μg/1 kg 劑量雌激素(圖 2)[13]，於第二個月將大鼠 透過犧牲，取其血液及脛骨並保存於 10%福馬林中，以微電腦斷層掃描儀(micro-computed tomography) 進行脛骨組織(tibia)斷層造影，並利用 CT Analyzer 軟體分析骨參數，分析完畢後將脛骨透過脫鈣液脫 去脛骨組織之鈣質，再進行石蠟切片及組織染色觀察脛骨，並以 Image J 分析脂肪比例。為證明血液 中 TNF-α 濃度與骨代謝相關，亦利用 TNF-α 分析套組檢測血液中 TNF-α 濃度。
3. 結果與討論
3.1 包覆 molsidomine 之 PLGA 微針 根據立體顯微鏡拍攝之結果(圖 3)，PLGA 微針整體針長約為 1000 μm，前端 PLGA 針尖約為 450 μm；於 PLGA 針尖塗布 PVP/PVA 後，透過螢光顯微鏡觀察經 coumarin 染色之 PLGA core 與 R6G 染 色之 PVP/PVA shell 的微針(圖 4)，證實 PVP/PVA 確實包覆於 PLGA core 外圍，形成 shell 之結構，整 體針長則約為 1200 μm。3.2 含藥 PLGA 之體外藥物釋放
各組 PLGA 微針貼片所包覆的藥物含量因使用的 PLGA 性質不同而有所變化，以 HPLC 所測定 LA：GA = 50：50, I.V. = 0.21、LA：GA = 75：25, I.V. = 0.19、LA：GA = 85：15, I.V. = 0.38、LA： GA = 75：25, I.V.= 0.53 製成之 PLGA 微針單片含藥量分別為 127 μg、79 μg、85 μg、116 μg(n=5)。上 述各組材料於體外藥物釋放測得的釋放時長分別為 4、4、14、28 天(圖 5)，對應的線性程度則分別為 0.9998、0.9887、0.972、0.8905(圖 6)。文獻上以 PLGA 為藥物載體主要具有 first release 及 second release 兩時期不同的藥物釋放速率，除 LA：GA = 75：25, I.V.= 0.53 此組高黏度的材料於藥物釋放期間出現
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second release 導致藥物釋放線性程度下降以外，其餘三組材料皆於 first release 期間釋放完其包覆的 藥物。考慮藥物釋放天數以及釋放線性度，後續則使用 LA：GA = 85：15, I.V. = 0.38 該組材料所製成 的微針結合 PVP/PVA 形成 core-shell 結構進行活體實驗，期望 PLGA 克服 molsidomine 半衰期短，需 一日口服四次之不便性。
3.3 微針機械強度測試
為證明 PVP/PVA shell 可提升 PLGA 微針的機械強度，分別將透過 LA：GA = 85：15, I.V. = 0.38 所製成之 PLGA 微針與 PLGA-PVP/PVA core-shell 微針置於材料測試機載台上，以 0.1 mm/min 之下壓 速率進行微針壓縮測試。由(圖 7)可見未加上 PVP/PVA shell 的黑色曲線於下壓 0.4 mm 之深度前，微 針能承受的應力緩慢上升至 0.2 N，但與 PLGA-PVP/PVA core-shell 紅色曲線相較起來，微針所能承受 的應力較差，同樣下壓 0.4 mm 的深度，PLGA-PVP/PVA core-shell 可承受的最大應力接近 0.6 N。由 上述結果推測 PVP/PVA 有較高的楊氏係數，使 PLGA 微針受 PVP/PVA 包覆而具有更佳的機械強度， 因此微針整體對抗應變的能力獲得提升，同時於下壓 0.4 mm 處可觀察到材料可承受的最大破壞強度， 隨後所受應力下降，並於下壓 0.6 mm 處上升，此現象與 PLGA 微針下壓 0.6 mm 時相同，推測為載 具壓至 PVP/PVA 後端支撐軸使應力急遽上升，如 PVP/PVA supporting layer 之藍色曲線。從立體顯微 鏡觀察兩組微針於下壓 0.4 mm(可承受最大應力處)時之形貌(圖 8)，可見 PLGA 微針針尖已嚴重塌扁， 僅剩支撐軸長度，而 PLGA-PVP/PVA core-shell 針尖經壓縮後仍保留部分機械強度，使原本應被壓縮 至200 μm 垂直高度的針尖回彈至 400 μm。後續觀察於相同應力壓縮下，PLGA 與其含 PVP/PVA shell 微針之樣貌，兩組微針於感應到 50 N、100 N、200 N 三種應力時停止壓縮，並藉由立體顯微鏡觀察 針尖狀態。於(圖 9)可觀察到不含 PVP/PVA shell 之微針感應到 50 N、100 N 之應力時針尖產生斷裂， 200 N 時僅剩後端 PVP/PVA supporting layer，說明無 shell 保護，針尖較為脆性；而含 PVP/PVA shell 之微針感應到三種不同應力時皆未發生斷裂，僅長度縮短，證實 shell 同時提供 PLGA 較高之機械強 度，亦賦予其韌性。
3.4 微針穿刺測試
分別將透過 LA：GA = 85：15, I.V. = 0.38 所製成之 PLGA 微針與 PLGA-PVP/PVA core-shell 微針 透過活體穿刺，並於 24 小時待微創口完全癒合後，犧牲大鼠並取下施打微針之部位皮膚，進行組織 切片觀察穿刺深度，計算平均穿刺深度，並整理於表 1 中。於圖 10(A)之 PLGA-PVP/PVA core-shell 組中可以觀察到微針以鑲嵌於皮膚內，且其微創口已完全癒合，穿刺深度可達近1000 μm，而未加 shell 之組別圖 10(B)則穿刺深度較淺，約為 600 μm，並且會造成微創口癒合時將 PLGA 針尖推出皮膚外的 情況。
3.5 微針於原發性骨質疏鬆症之治療結果
由上述小鼠口服測定最佳治療劑量為 2 μg/day per mice，以文獻口服嗎多明之平均藥物利用率約 50% (44~60%) [14, 15]，藉由口服途徑實際傳入體內之治療心血管劑量約為 1 μg/day per mice，以 S.D 大鼠為治療模型需將此劑量乘以 17 倍(以平均 20 g 之小鼠換算體重為 340 g 之大鼠)，此劑量 17 μg/day per rat 落於施打兩片(X2 組，12 μg/day per rat)與三片(X3 組，18 μg/day per rat)PLGA 微針每日 釋放藥量之間，因此透過細分口服低劑量 molsidomine 所設計的兩組微針治療組與 OVX 組、臨床上 治療原發性骨質疏鬆症的正 control 雌激素治療組比較治療結果，進一步確認透過 PLGA 於皮膚中緩 釋低劑量 molsidomine 的有效濃度。經過兩個月的治療之後，取下大鼠脛骨以及採集血液評估治療結
7 果，透過微電腦斷層掃描儀(micro-CT)對大鼠脛骨生長板下 3 mm 進行斷層掃描造影。 3.5.1 微電腦斷層影像分析(micro-CT) 由脛骨幹骺端(metaphysis)之横截面以及 3D 重組圖(圖 11、12)，可觀察出未治療組因去除卵巢， 骨小樑結構明顯鬆散，顯示切除卵巢可以造成大鼠骨質流失，成功誘導骨質疏鬆症，並可直接觀察出 X2、X3、E2 組之骨小樑密度皆高於未治療組，顯示 X3 組與 E2 組皆能治療骨質疏鬆症，因此進一 步定量骨參數，以確認微針實驗組與注射雌激素正 control 組於治療上的差異。由骨參數中的骨密度、 BV/TV、骨小樑數量可得知含藥微針治療的 X3 組，以及臨床治療骨鬆之 E2 組的海綿骨骨質密度亦 皆較 control 組高，並與圖 11、圖 12 之微斷層掃描影像結果吻合。從骨質於整體骨組織中分布的疏密 角度來看，圖 13 中之 BMD 代表骨髓腔中骨質之密度，值越高則代表骨小樑數量越多，骨質流失之 情況越輕微，圖 14 中 BV/TV 則代表骨體積與骨表面積於整體骨髓腔中包含骨髓及海綿骨所佔比例， 數值越高，表示骨質流失情況越小。 在治療組的部分，X2 組雖然可由掃描影像、骨參數分析中看出有些許療效，但比起 control 組較 無明顯差異，推測其治療劑量剛好於最低有效劑量上下波動，又因 S.D.大鼠之個體差異而使最低有效 劑量於個體上有所不同，而使治療效果較不明顯，且呈現較明顯落差。相反的，X3 組比起 X2 組多 施打一片微針，治療劑量高於最低有效劑量，且不受個體差異影響，使得所有骨參數皆與未治療組皆 有明顯差異，並與 positive control 組之間無統計上的差別(p value >0.05)。而雌激素治療組之骨參數平 均值雖具有最佳的治療效果，但於各項骨參數中組內數據皆呈現零散分布，彼此間差異較大，顯示透 過雌激素治療較容易受個體差異影響。由上述結果顯示長期緩釋 molsidomine 並於體內釋放適量的 NO 具有治療原發性骨質疏鬆症之效果，並於後續實驗檢測 S.D.大鼠於治療結束後之體內 TNF-α 濃度， 以印證 NO 可緩解雌激素不足所引發的 TNF-α 濃度增加。
3.5.2 脛骨中脂肪含量
比較未治療及含藥微針治療組及 positove control 組之組織切片(圖 16)，相較於未治療組(control)， 治療組及 positive control 組皆有降低骨內脂肪的現象，然而比較各組脂肪比例(圖 15)，很明顯可以觀 察到 positive control 含有的脂肪比例最低，為其次為 X3 組，最高則為 control 組，X3 組雖平均治療 效果較雌激素略差，但組內差異較小，而 X2 組與 control 組於治療上無明顯差異，其中 X2 組和 E2 組 組 內 數 據 分 布 較 大 。 所 有 組 別 之 脂 肪 比 例 分 析 結 果 皆 與 上 述 骨 參 數 分 析 結 果 一 致 ， 顯 示 PLGA/PVP-PVA core-shell 微針可維持大鼠體內藥物濃度，落於治療濃度區間內較長的時間，以達到 治療效果。 3.5.3 血中腫瘤壞死因子(TNF-α)濃度 於給藥後 8 週犧牲並採集 S.D.大鼠之血液樣本，分析各組血中 TNF-α 濃度，由(圖 17)可觀察到 OVX-control 組血中 TNF-α 濃度比起其餘治療組皆較高，顯示雌激素缺乏確實會造成骨鬆小鼠體內 TNF-α 濃度提高，進而促使蝕骨細胞過度活化而導致骨質疏鬆症。比較兩組微針治療組與皮下注射雌 激素之正 control 組，MN-X2 組之組內差異較大，能與 micro-CT 之分析結果相應，證實該劑量因藥 物最低有效濃度之個體差異而始治療效果有較大的落差，無法釋出穩定且足量的 molsidomine 抑制卵
8
巢切除後造成的 TNF-α 過盛；若提高施打劑量，MN-X3 組呈現明顯降低大鼠血中的 TNF-α 濃度，和 SC-E2 組皆與 OVX-control 組有統計上之差異，顯示 NO donor 的劑量會影響抑制 TNF-α 的效果。SC-E2 組之 TNF-α 濃度的組內差異亦可對應到上述骨參數與海綿骨脂肪比例，證實透過雌激素抑制 TNF-α 之效果容易受固體差異影響，而使後續骨參數皆呈現組內治療效果落差較大的情形。
4. 結論
由口服 molsidomine 治療移除卵巢 4 個月誘發原發性骨質疏鬆症之 C57BL/6 母鼠，使用低劑量(2 μg/day per mice)，可大幅降低血液 TNF-α的濃度，且於 TRAP 染色結果也顯示蝕骨細胞的活性下降， 證明一氧化氮具有能力緩解雌激素缺乏引起血液 TNF-α的濃度提升，進而抑制骨吸收(bone resorption) 過度旺盛之現象，並會隨著使用之 molsidomine 劑量提高而下降，口服低劑量的 molsidomine 亦可降 低骨內脂肪含量，顯示有能力減少骨間內質幹細胞分化成脂肪細胞，間接增加幹細胞分化成造骨細胞， 提高骨生成的速率。由於 molsidomine 的藥物半衰期過短，無法維持體內作用的一氧化氮濃度影響治 療效果，因此利用 PLGA 微針作為 molsidomine 之藥物載體，控制藥物釋放速率，並提高給藥之便利 性。由體外藥物釋放之結果，觀察到黏度較低的 PLGA 如：PLGA75：25 (I.V. = 0.19)、PLGA 50：50 (I.V. = 0.21)，其藥物釋放速率過高，無法長期緩釋藥物，而黏度較高的 PLGA 如：PLGA 75：25(I.V. = 0.53)雖然能緩釋藥物長達一個月，但卻出現 PLGA 二次釋放的情形而使釋放曲線之線性回歸程度降 低，因此使用黏度居中的 PLGA 如：PLGA 85：15(I.V. = 0.38)，使藥物釋放時間為 2 週，且釋放曲線 回歸程度達 0.97，克服 molsidomine 藥物半衰期過短，需高頻率服用的不便。為增強微針之機械強度， 提高穿刺深度與穩定性，於 PLGA 上塗覆一層 PVP/PVA 形成 core-shell 結構，使微針所能承受的壓縮 應力由 0.2 N 提升至 0.6 N，並在體內穿刺鼠皮發現穿刺深度由未塗覆 shell 的 666 μm 加深至 949 μm， 證實 PVP/PVA shell 所提供的機械強度能加強微針之穿刺能力，使 PLGA core 能順利鑲嵌於皮膚中。 透過 PLGA-PVP/PVA core-shell 微針治療卵巢切除誘導原發性骨質疏鬆症的 S.D 大鼠兩個月後， 未治療 OVX-Control 組的血中 TNF-α 濃度約為 53.5 ± 1.0 pg/ml，明顯高於 MN-X3 組的 30.5 ± 2.0 pg/ml 以及 SC-E2 正控制組的 25.0 ± 3.6 pg/ml，同時於脛骨海綿骨脂肪比率亦發現 OVX-Control 組脛骨組織 切片，其脂肪比率遠高於 MN-X3、SC-E2 組，證實 TNF-α 與骨質疏鬆症之間具有關聯性，體內高濃 度的 TNF-α 會刺激蝕骨細胞過度活化，導致骨質大量流失。進一步以微電腦斷層掃描近端脛骨之骨 密度、BV/TV，亦發現 MN-X3、SC-E2 組於各項骨參數皆與 OVX-Control 組有明顯差異，雖然 MN-X3、 SC-E2 兩組並無統計上的差別，但 SC-E2 組間的治療效果差距較大，推測以雌激素治療較容易受個體 差異影響，或皮下注射對維持藥物於特定區間的能力較藥物載體差，顯示透過 PLGA 維持血中 NO 於 特定濃度可以調節因雌激素缺乏造成的免疫失調，抑制蝕骨細胞過度活化，減少骨質流失。
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圖
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圖 3、(A)(B)為 PLGA 微針經立體顯微鏡拍攝之結果，綠色針尖為經 coumarin 染色之 PLGA；(C)倒立 式螢光顯微鏡下之 PLGA 微針形貌，綠色針尖為經 coumarin 染色之 PLGA
圖 4、倒立式及多光子共軛交螢光顯微鏡下之 PLGA-PVP/PVA core shell 微針形貌：倒立式螢光顯微 鏡下(A)經 coumarin 染色之 PLGA core；(B)經 R6G 染色之 PVP/PVA shell；(C)微針整體之 core-shell 形貌與結構分佈
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圖 5、PLGA 微針體外藥物釋放：(A)四款微針於 pH = 7.4、10 mM PBS 中進行體外藥物釋放，第 4、 14、21、28 天分別為：PLGA 75：25, I.V. = 0.19 與 PLGA 50：50, I.V. = 0.21(空心、實心圓形)、PLGA 85：15, I.V. = 0.38(三角形)、PLGA 75：25, I.V. = 0.53(菱形)釋放完畢之天數
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圖 7、微針機械強度測試：藍色曲線為 PVP/PVA supporting layer，經壓縮後應力急遽上升；綠色曲線 為未加 PVP/PVA shell 之 PLGA 微針，每根針前端抗壓強度約為 0.2 N；紅色曲線為具 PVP/PVA shell 之 PLGA 微針，每根針前端抗壓強度約為 0.6 N
圖 8、微針於可承受最大應力時之壓縮形貌：立體顯微鏡下(A)未加 PVP/PVA shell 之 PLGA 微針經壓 縮測試前；(B)經壓縮測試後；(C)具 PVP/PVA shell 之 PLGA 微針經壓縮測試前；(D)經壓縮測試後； PVP/PVA shell 添加 R6G 使其呈現紅色，PLGA 添加 coumarin 使其呈現綠色
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圖 9、PLGA 微針與 PLGA-PVP/PVA core-shell 微針感應至特定應力時之壓縮形貌：(A) 50 N；(B)100 N；(C)200 N；PVP/PVA shell 添加 R6G 使其呈現紅色，PLGA 添加 coumarin 使其呈現綠色
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圖 11、含藥微針及雌激素治療之 OVX 大鼠脛骨骨骺端電腦斷層掃描影像；其中 sham 組為先前本實 驗室研究之 micro-CT 掃描結果
圖 12、含藥微針及雌激素治療之 OVX 大鼠脛骨骨骺端海綿骨三維骨質重建影像，其中 sham 組為先 前本實驗室研究之 micro-CT 重組結果
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圖 13、三維分析脛骨骨骺端海綿骨之骨密度(BMD, n=4)
圖 14、三維分析脛骨骨骺端海綿骨之骨體積比例(BV/TV, n=4)
圖 15、PLGA-PVP/PVA core-shell 含藥微針治療 8 週，各組大鼠脛骨骨骺端海綿骨切片之脂肪比例分 析結果(n=4)
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圖 16、PLGA-PVP/PVA core-shell 含藥微針治療 8 週，各組大鼠脛骨組織切片之 H&E 染色結果
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表
表 1、以 PLGA 85：15, I.V. = 0.38 為 PLGA 前端之是否具有 PVP/PVA shell 之活體穿刺深度(n=6) Groups Mean (μm) ±S.D (μm)
PLGA 85：15 with shell 943 41 PLGA 85：15 without shell 666 143
106年度專題研究計畫成果彙整表
計畫主持人：陳毓宏 計畫編號：106-2221-E-006-058-MY3 計畫名稱：探討NO對於骨代謝的影響並開發可經皮緩釋NO donor之微針系統應用於雌激素缺乏之骨質 疏鬆症治療 成果項目 量化 單位 質化 （說明：各成果項目請附佐證資料或細 項說明，如期刊名稱、年份、卷期、起 訖頁數、證號...等） 國 內 學術性論文 期刊論文 0 篇 研討會論文 0 專書 0 本 專書論文 0 章 技術報告 0 篇 其他 0 篇 國 外 學術性論文 期刊論文 0 篇 研討會論文 21. Chen, Y.-L., Chang, C.-C., Chen, M.-C.*, “Sustained Release of Molsidomine Using Embeddable PLGA-PVP/PVA Core-Shell Microneedles for Primary Osteoporosis Treatment”, 2019 International Symposium on Novel and Sustainable Technology, 2019. 獲得First Prize of Poster Presentation Student.
2.Chen, Y.-L., Chang, C.-C., Chen, M.-C.*, “Sustained Release of Molsidomine Using Embeddable PLGA Microneedles for Primary
Osteoporosis Treatment” FAPS 2019 Polymer Congress, 2019. 獲得Sliver Award. 專書 0 本 專書論文 0 章 技術報告 0 篇 其他 0 篇 參 與 計 畫 人 力 本國籍 大專生 0 人次 碩士生 2 萬祖瑜、楊茵茵 博士生 2 林子堯、邱鈺琇 博士級研究人員 0 專任人員 0 非本國籍 大專生 0 碩士生 0
博士生 0 博士級研究人員 0 專任人員 0 其他成果 （無法以量化表達之成果如辦理學術活動 、獲得獎項、重要國際合作、研究成果國 際影響力及其他協助產業技術發展之具體 效益事項等，請以文字敘述填列。） 骨質疏鬆症是高齡化社會常見的疾病，臨床上治療骨鬆之 藥物，主要是針對骨代謝失調進行調節，忽略雌激素缺乏 所引發之發炎與免疫失衡的問題。本研究乃利用低濃度一 氧化氮(NO)所特有的免疫調節特性，以降低發炎情形來達 到治療骨鬆的效果。我們成功開發出可長效緩釋NO donor (molsidomine)之PLGA微針。以去卵巢化誘發原發性骨鬆 之S.D.大鼠進行有效性測試，每兩週分別給予低劑量與高 劑量之微針，同時以每日注射雌激素作為正控制組。治療 8週後微針高劑量組之骨密度及其他骨參數皆明顯高於未 治療組，並與正控制組於統計上無明顯差異，且亦能明顯 抑制血中TNF-α濃度，證實以微針長期經皮釋放NO能調節 因缺乏雌激素而導致的骨質流失、協助骨骼修復，預期可 大大降低用藥頻率，造福須長期進行藥物治療的廣大骨鬆 患者。
