產能厭氧菌群高通量定量分析平台

國立成功大學

新進教師學術研究計畫

期末報告

產能厭氧菌群高通量定量分析平台

計畫主持人: 吳哲宏 博士

計畫參與人員： 徐茂軒、陳薇羽 研究生

執行單位: 環境工程系

日期: 九十九年五月三十一日

利用階層寡核甘酸引子延伸(HOPE)技術定性定量分析 工業廢水厭氧生物處理系統中甲烷菌群結構

摘 要：最近，一項稱為階層寡核甘酸引子延伸(Hierarchical Oligonucleotide Primer Extension, HOPE)新型定性定量分子生物技術的成熟發展，使複雜環境生 物樣本中微生物社群結構可以進行高通量的分析。本研究為了建立 HOPE 分析甲 烷菌群結構的高通量平台，針對目前已知 30 屬之甲烷菌的 16S rRNA 序列分成三 大類進行核甘酸引子設計，經測試與最佳化實驗條件成功獲得 12 組不同階層專 一性的引子。然後，測試 9 種處理工業廢水的厭氧污泥，結果顯示 Methanosarcinales 目的甲烷菌群的 16S rRNA 基因豐富度佔所有古細菌的 83%以上，以中溫型的

Methanosaeta、Methanosarcina 以及 Methanomethylovorans 分別為不同系統中主 要優勢的甲烷菌群。本研究發展的 HOPE 分析平台可有效地提供反應槽厭氧污泥 中甲烷菌群結構的定性定量分析，此技術可應用於研究不同厭氧生物環境中甲烷 菌的生態。

關鍵字: 甲烷菌、定量分析、階層引子延伸、菌群結構分析

Hierarchical Oligonucleotide Primer Extension Analysis for Methanogens in Anaerobic Bioreactors Treating Industrial Wastewater

Abstract: In this study, a newly developed molecular method called hierarchical

qualitatively analyze methanogenic Archaea in the sludge from anaerobic reactors treating industrial wastewaters. In total, twelve oligonucleotide primers with specificity at the various hierarchical levels were designed and successfully applied in the HOPE assays to detect the methanogens frequently observed in the anaerobic sludge. The results showed that the detected methanogens by the developed HOPE assay could cover an abundance of at least 83% in the domain Archaea present in 9 different sludge samples. It was further observed that the methanogenic populations in the order Methanosarcinales were highly abundant, in which members in the genera of (mesotrophic) Methanosaeta、Methanosarcina or Methanomethylovorans were the predominant methanogenic populations in the respective anaerobic sludge from bioreactors. The HOPE assay can provide fast analysis for the methanogens in engineered ecosystems and may be applicable for samples from other environments.

Keywords: Methanogen, Quantification, HOPE, Microbial Community Analysis

1. 前言

在厭氧環境甲烷菌利用有機物降解過程之代謝產物如氫氣或乙酸產生甲烷， 常與其他厭氧菌群形成共營(syntrophic)的生態而影響有機物的分解效率，因此監 測甲烷菌的菌群結構與菌群大小有助於提升厭氧處理程序的效能。近二十年來， 分子生物技術的成熟發展，提供快速分析甲烷菌群多樣性的平台。例如反應槽污

泥樣本提取總DNA 後，利用聚合酶鍊鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)複

製16S rRNA 標記基因，然後建立選殖基因庫(cloning library)並進行親緣樹之分

析，序列鑑定結果可得知污泥中主要菌群的身分；根據已有或自行建立的基因序 列資料庫設計寡核酸引子或探針，進行螢光原位雜合(Fluorescence in situ Hybridization)或即時定量聚合酶鍊鎖反應(real-time quantitative PCR)等定量分 析，可測定污泥中特定菌群的豐富度 (圖 1)。然而，生物樣本進行選殖基因庫分 析時需要消耗相當多的人力與時間，雖然提供微生物基因序列訊息，但不適用於 大量樣本數的研究。不僅如此，目前普遍用於菌群定量之分生技術亦存在專一性 不足、分析通量偏低等缺點。因此，發展簡易、快速及高通量之定性定量分析技 術是必要的。

Extension, HOPE)[1]的新型定性定量方法被開發出來，發展成為高通量環境菌群 之分析平台[1]。此方法的分析原理是根據 16S rRNA 基因序列資訊，針對多種微 生物分類階層設計不同長度之專一性寡核甘酸引子，在含有帶不同螢光染劑的雙 去氧核甘酸(dideoxynucleotides)溶液的 DNA-聚合酶熱循環反應過程，當引子黏合 至互補DNA 序列後，聚合酶將只能延伸出一個螢光性鹼基，因此酵素反應能非 常專一性地根據目標基因序列進行引子的標籤化，然後利用DNA 定序儀測定產 物中含有螢光性鹼基的引子種類與螢光強度，測得的多階層引子種類代表目標菌 群的親源資訊；根據階層引子的螢光強度，則進一步可計算目標菌群之相對豐度 [2]。當 HOPE 實驗操作條件完成最佳化後，只需要不到一天的分析時間，即可了 解環境樣本中目標菌群之身分與不同階層下的相對豐度(圖 1)。 本研究主要目的是發展適合厭氧生物反應槽中甲烷菌群定性定量的HOPE 分 析方法。我們先針對生物系統中已知普遍存在之甲烷菌群設計不同階層之寡核酸 引子，並進行實驗條件的最佳化，然後以九種生物反應槽污泥中之甲烷菌群為對 象，測試HOPE 分析方法的可行性。 Universal approach Novel approach Sample DNA

extraction PCR Cloning and sequencing Phylogenetic tree Probe design Quantitative approach

PCR HOPE Sample DNA extraction Qualitative analysis Quantitative analysis Qualitative and quantitative analysis at the same time

2. 實驗設備與方法

2.1 樣本收集與污泥 DNA 萃取

本研究收集9 種處理工業廢水的厭氧污泥，包含來自處理對苯二甲酸廢水之

實廠UASB (3)、處理紙廠廢水之實廠 UASB (1)、處理 LCD 廢水之實廠 UASB(4)、

以及處理對甲基苯甲酸之實驗室規模反應槽。污泥經過清洗、酵素消化及冷凍解 凍後以酚-氯仿法萃取 DNA，然後以酒精沉澱法回收 DNA[3]。

2.2 聚合酶鍊鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR)

每一PCR 反應液含 1 到 50ng 之 genomic DNA、1x 緩衝液、0.8mM 之 dNTP、

2.5U 之 DNA polymerase (Takara)及引子對 A109F (5’-ACKGCTCAKTAACACGTGGG-3’)及 1492R(5’-

AAGTGGTAACAAGGTARCCGTA-3’)，PCR 程式包含 20 到 25 個熱循環，於 95

℃下將DNA 變性 90 秒，接著引子黏合溫度為 52℃反應 60 秒，最後引子延伸反

應於72℃作用 90 秒(TProfessional Standard Gradient 96, Biometra)。

2.3 HOPE 階層引子

首先，從silva網站下載甲烷菌 16S rRNA序列資料庫(http://www.arb-silva.de/)，

2.4 階層寡核甘酸引子延伸技術(Hierarchical Oligonucleotide Primer Extension,

E 反應液總體積為 5μl，其中包含 2.5μl 的 SNaPshot premix 試劑 然後利用軟體ARB設計不同階層甲烷菌之專一性引子。在此所設計之引子黏合長 度皆控制在17~20 nt，G/C比例為 50%到 65%。為增加引子的分離效率，在某些 引子的5’端增加長度不超過 15 nt的無意義序列以改變其在電泳中的移動性。 HOPE) 每一HOP

(Ap t

2.5 細管電泳

PE 之產物混和 0.3μl 之 Gene Scan Liz size leader (Applied

Bio 管電泳

2.6 HOPE 產物相對豐富度之計算

度成正比的關係，可計算出標準品與待測樣

本中被延伸引子之濃度關係，如下：

Cstd為已知標準品被延伸引子之濃度。

plied Biosystem)，1 ng 的 DNA 模板及 15 pmol 的混合引子，其中 SNaPsho premix 含有 AmpliTaq DNA polymerase、緩衝溶液及螢光標記之 ddNTP。HOPE

熱循環之程序為20 個循環之變性反應(95℃，10 秒)，引子黏合(60℃，20 秒)，引

子延伸(72℃，30 秒)。在引子延伸反應之後，接著加入 1U 的 shrimp alkaline phosphatase (Roch Applied Science, Germany)，於 37℃培養 60-90 分鐘，並於 75

℃培養10 分鐘中止反應[1]。

毛

適當稀釋HO

system)及 10 μl 的 Hi-Di formamide (Applied Biosystem)後，即進行毛細

片段分析，包含變性(60℃)、樣本注射(2.1 kV, 40 s)及毛細管電泳分離 (15 min)， 所得螢光訊號以儀器配備之軟體GeneMapper 進行分析。 根據螢光強度(波鋒面積)與引子濃 其中Cq為未知被延伸引子之濃度， 校正因子(C.Fa-b)為利用參考菌株之 PCR 產物所得之引子 A 與引子 B 螢光強度 之 3. 比值，Aa代表被延伸引子A 之螢光強度(波鋒面積)，Ab代表被延伸引子B 之 螢光強度。 結果與討論

3.1 階層寡核酸引子設計

16S rRNA ge ，目前已被分離出之甲烷菌群分類為五個目，分別

Methnobacteriales Methanomicrobiales Methanosarcinales

Methanosacinales ，以維 Methanomicrobiales Methanobacteriales Methanosarcinales Methanosarcinales icrobiales 12 HOPE (tube1) Methanosarcinales (tube Methanomicrobiales 及 MS537-mod MML419 MX802 MXM407 thanos

ans Methanosaeta aeta

Arc MG1197-mod F2SC660-mod SMPP1252-mod GMG266 F3SC d ulleus 非 [4] 根據 ne 資料庫 為 、Methanococcales 、 、 及 Methanopyrales，這些甲烷菌只能利用單碳、乙酸、氫氣等簡單基質，並廣泛 存在於高溫極端環境、底泥、土壤、動物與昆蟲腸胃道及環工生物反應槽中，其 中除了在 的成員中有可利用醋酸、甲酸及甲基團之甲烷菌外， 在其他目的甲烷菌群皆只能利用氫氣、二氧化碳與甲酸等基質。在本篇研究，針 對厭氧生物反應槽中之常見之甲烷菌群進行偵測。 在厭氧生物反應槽中，必須有甲烷菌之存在才能避免氫氣及醋酸的累積 持發酵反應之效率。常見利用氫氣的甲烷菌群通常是在 及 兩個目下，而 目則有常見的利用醋酸之甲烷 菌群。本研究針對 目及Methanom 目的甲烷菌設計 組專一性引子。設計之引子將甲烷菌群分為三個階層，第一層所有之古細菌，第 二層為目，第三層為屬， 分析時分成兩個引子套組，第一組 專門針 對 目 及 以 下 的 屬 進 行 偵 測 ， 第 二 組 2) 則 針 對 目 以下的屬的甲烷菌分析。第一組有七組引子，包含 ARC911-mod、MSMX859-mod、 、 、 、 及

MXT390-mod ， 分 別 偵 測 古 菌 界 、 Methanosarcinales 目 、 Me arcina 、

Methanomethylovor 、 屬、以及在 Methanos 屬的中溫型及高

溫 型 兩 群 。 另 一 方 面 ， 第 二 組 分 別 以 引 子 911-mod 、 、

、 、 及 979-mo 偵 測 古 菌 界 、

Methanomicrobiales 目 、 Methanoc 、Methanoplanus 及 Methanolacina 、

Methanogenium 及 Methanofollis 屬的成員。在設計引子時，將 目標菌群之錯位

圖 2 HOPE 定性定量分析甲烷菌群的階層引子設計 3.2 以標準菌株測試 HOPE 引子組 利用參考菌株之PCR 產物為模板，進行兩引子套組中分別六至七組引子的波 峰分離及強度之測試，測試結果如圖 3。如圖顯示，每個引子的波峰皆可分離且 互無干擾，螢光強度亦足夠，所設計之引子套組可有效偵測不同階層之甲烷菌群。 1000 2000 3000 4000 b SMPP1252‐mod MG1197‐mod GMG266 F3SC979‐mod F2SC660‐mod ARC911‐mod 1000 2000 3000 4000 a MSMX859‐mod MML419 MX802 MXM407 MXT390‐mod ARC911‐mod MS537‐mod 圖 3 (a)引子套組 1 利用標準品進行波峰之分離及螢光強度測試。(b)引子套組 2 利用標準品進行波峰之分離及螢光強度測試。

3.3 以 HOPE 實測厭氧污泥甲烷菌群結構 在定性偵測方面，在9 種厭氧污泥樣本中皆偵測到屬於 Methanosacinales 目的 甲烷菌群，但屬於 Methanomicrobiales 目的成員則未在任何反應槽中被偵測到。 文獻中指出，反應槽中利用氫與甲酸之甲烷菌群主要被分類在Methanomicrobiales 目及 Methanobacteriales 目，然而只有在少數的反應槽中可以偵測到少量的 Methanomicrobiales 目的甲烷菌[5]。以 HOPE 定量分析取自處理工業廢水反應槽 9 種厭氧污泥的結果顯示，本研究設計的引子所偵測厭氧污泥中的甲烷菌群佔古 細菌16S rRNA 基因數量的 83%以上，分析結果如圖 4 顯示。根據在階層目之分 析結果，HOPE 定量數據顯示 Methanosarcinales 目是厭氧污泥中絕對優勢的甲烷 菌，其豐富度佔了古細菌 16S rRNA 基因數量 83%~105%，但利用氫氣之 Methanomicrobiales 目並沒有被偵測到，這表示反應槽中多為利用含甲基單碳化 合物及乙酸之甲烷菌群，其他利用氫氣或甲酸之甲烷菌群則為少數。 對苯二甲酸製程廢水之有機組成多為乙酸及苯環類化合物，其實廠UASB 的 處理功能相當良好，廢水 TOC 去除率可達 79%以上，且污泥已呈顆粒化型態； 處理對甲基苯甲酸之實驗室規模反應槽之植種污泥來自對苯二甲酸製程廢水實 廠 UASB，厭氧污泥在以對甲基苯甲酸為單一碳源的情況下亦有很好的 TOC 去 除率。在這些系統的厭氧污泥中，優勢的Methanosarcinales 目之甲烷菌群數量有 81%以上是 Methanosaeta 屬的成員，Methanosaeta 為利用乙酸當作單一碳源產生 甲烷之甲烷菌屬，多優勢於操作良好系統之顆粒化汙泥[6]。 另一方面，取自 LCD 廢水之實廠 UASB_B 系統，污泥中的 Methanosarcina 屬的甲烷菌卻佔 Methanosarcinales 目總 16S RNA 基因數量的 93.7%以上。文獻

中指出 Methanosarcina 屬多存在於連續攪拌式反應槽(continuously stirred-tank)中 [7]，鮮少優勢於 UASB，但在此兩個反應槽中卻看到不同之情況，這可能是因為

Methanosarcina 屬的細胞生長速率較 Methanosaeta 屬的快速，而且其可利用之基

水中主要成分是四甲基氢氧化铵(tetramethylammonium hydroxide, TMAH)，可能 是造成污泥中 Methanosarcina 屬甲烷菌數量上優勢的原因之一。

再者，在另一個LCD 廢水之實廠 UASB_A 的處理系統，污泥中優勢甲烷菌

群卻截然不同。其中一個樣本中Methanosacinales 目的甲烷菌佔古細菌 16S rRNA

基因數量的83.7%，但 Methanosarcinales 目中的 Methanosaeta 屬只佔 49.3%，HOPE

分 析 結 果 並 未 偵 測 的 其 他 屬 的 甲 烷 菌 如 Methanosarcina 或 Methanomethylovorans ， 這 顯 示 了 剩 下 50.7% 的 甲 烷 菌 群 可 能 是 在 Methanosarcinales 目下其他的屬(如 Methanolobus、Methanococcoides)或是未知的 甲烷菌。然而，在另一個樣本中，HOPE 定量分析結果發現 Methanomethylovorans 屬是非常優勢的甲烷菌，其豐富度為Methanosarcinales 目的 93%，此菌屬主要利 用含甲基單碳化合物為碳源產生甲烷。 處理紙廠廢水之實廠UASB 顆粒污泥中含有較特殊的甲烷菌群結構。HOPE 的分析數據顯示Methanosarcinales 目之甲烷菌群約佔古細菌 16S rRNA 基因數量 的90%，而 Methanosaeta 屬的豐富度卻只佔 Methanosarcinales 目的 66.2%，其他 厭氧污泥常見之甲烷菌屬皆無法被偵測到，所以在紙廠UASB 顆粒污泥尚存在 34.8%的甲烷菌屬是超出本研究所設計的引子可偵測範圍。另外，處理對苯二甲 酸廢水之實廠UASB 污泥樣本中也有類似的情形，例如，污泥中 46.6%的 Methanosaeta 屬成員為中溫型，剩下的 53.4%之 Methanosaeta 屬成員可能是未被 鑑定種，無法被引子偵測到。由於現有公開基因庫中缺乏相關的序列資料，為了 解這些未知之甲烷菌群，應進一步深入研究。 4. 結論與建議 本研究建立厭氧生物反應槽污泥中甲烷菌群快速定性定量的分析方法，HOPE 分 析法可以有效、專一地快速偵測污泥樣本中甲烷菌群之相對豐富度。分析9 個污 泥樣本結果顯示了83%之甲烷菌群都是在 Methanosarcinales 目的成員，以

Methanosaeta、Methanosarcina、Methanomethylovorans 三個屬的菌群分別在不同 厭氧污泥系統中佔優勢，且 HOPE 分析結果可知紙廠廢水之實廠 UASB 顆粒污泥 與LCD 廢水之實廠 UASB_A 處理系統污泥可能含有超出本研究偵測範圍的 Methanosarcinales 菌群。未來，除了這些甲烷菌，我們將增加偵測嗜氫甲烷菌群 的引子數目，以期HOPE 分析法可應用於各類廢水系統甲烷菌群之監測分析。 圖 4 針對 Methanosarcinales 目設計之引子組分析 9 種污泥樣本之結果。(a)以 偵測古細菌之 ARC911-mod 為參考引子，獲得的 Methanosarciales 目之甲烷菌群 相對豐富度；(b)以偵測 Methanosarcinales 目之 MSMX859-mod 為參考引子，獲 得的甲烷菌群數量佔 Methanosarcinales 目之相對豐富度。樣本 1 為處理紙廠廢 水之實廠 UASB 污泥；2、3 為處理 LCD 廢水實廠 UASB_A 不同日期採樣之污 泥，4、5 為處理 LCD 廢水之實廠 UASB_B 不同日期採樣之污泥；6、7、8 為處 理對苯二甲酸廢水之實廠 UASB 顆粒污泥，9 為處理對甲基苯甲酸之實驗室規模 反應槽污泥。 5. 參考文獻

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