國立臺灣大學生命科學院生化科技學系 碩士論文
Department of Biochemical Science and Technology College of Life Science
National Taiwan University Master Thesis
母乳維生素 A 和 D 含量與嬰兒異位性皮膚炎關聯性之探討 Study on association of human breast milk vitamin A and D levels
with atopic dermatitis in the breastfed infants
沈蓓婷 Pei-Ting Shen
指導教授：林璧鳳博士 Advisor: Bi-Fong Lin, Ph.D.
中華民國 105 年 8 月
Aug, 2016
摘要
異位性皮膚炎 (atopic dermatitis, atopic eczema) 為常見過敏性皮膚炎疾病，全 球約有 15-20%孩童及 1-3%成人罹患此病。近年來免疫相關疾病的研究指出，飲食 為異位性皮膚炎罹患風險及嚴重程度的影響因子。維生素 A 與 D 具有免疫調節作 用，國人維生素 A 與 D 攝取有缺乏之虞，維生素 A 與 D 的營養狀況與過敏疾病發 生率是否有關聯性，值得探討。已知哺乳能降低嬰兒異位性皮膚炎罹患率，然而 近年門診發現異位性皮膚炎嬰兒也多有哺餵母乳，因此，推測是否與母乳的營養 成分有關。故本研究目的為探討嬰兒異位性皮膚炎是否與母乳的營養素的含量有
關，尤其是維生素 A 和 D3。本研究與台大醫院小兒科過敏門診合作，收募受試者
為六個月齡以下異位性皮膚炎嬰兒 48 位為病例組，健康嬰兒 47 位作為控制組，
測定母親之母乳的 retinol、25-hydroxyvitamin D3 (25-(OH) D3) 及細胞激素含量，
並對母親進行一個月的飲食頻率問卷調查。結果顯示，母親的鉀、鋅、維生素 B1、
菸鹼素、維生素 B6及酒精攝取量，與嬰兒的 SCORAD 呈顯著正相關。中重度 AD 組的母親熱量攝取較 health 組少，與輕度 AD 組相比，母親的鋅、維生素 B1及膽 固醇攝取量較高。此外，中重度 AD 組的母乳 25-(OH) D3與 TGF-β 含量顯著低於 health 組，而母乳 retinol 含量有較輕度 AD 組低的趨勢。綜合以上，六個月齡以下 嬰兒所攝取母乳的維生素 D 及 TGF-β 含量越少，可能增加嬰兒罹患異位性皮膚炎 的風險及嚴重程度。
關鍵字：異位性皮膚炎、母乳、維生素 A、維生素 D、TGF-β、母親飲食
Abstract
Atopic dermatitis, also known as atopic eczema, is a common allergic skin disease.
There are 15-20% children and 1-3% adults suffer from atopic dermatitis all over the world. Some studies showed that diet affects the risk and severity of atopic dermatitis. It had been known that vitamin A and D regulate immune response. There are high proportion of people have the status of vitamin A and D deficiency in Taiwan, while the correlation between the vitamins and incidences of allergic diseases is still unclear. Also, studies had showed that breastfeeding can lower the risk of atopic dermatitis. However, there are many breastfed infants suffer from atopic dermatitis nowadays, we hypothesize that breast milk nutrition might affect the morbidity rate and severe of atopic dermatitis. Therefore, the aim of this research is to investigate the association between human breast milk vitamin levels and atopic dermatitis status. We cooperate with the department of the pediatric allergy at NTU hospital. There are 48 infants with atopic dermatitis and 47 health infants who are under 6-months of age participated in this research, we collected breast milk from all infants’ mothers to detect retinol, 25-hydroxyvitamin D3 (25-(OH) D3) and cytokine levels, and we also analyzed maternal diet by FFQ (food frequency questionnaire). Results showed that the correlation between K, Zn, vitamin B1, niacin or alcohol from maternal diet in AD group and SCORAD (SCORing Atopic Dermatitis) were significantly positive. The moderate-AD group took less energy than the health group did, but it took more in Zn, vitamin B1 and cholesterol than the mild-AD group did. In addition, breast milk 25-(OH) D3 and TGF-β levels in the moderate-AD group were significantly lower than they were in the health group. We also found that breast milk retinol levels in the moderate-AD group were lower than they were in the mild-AD group. In conclusion, if the infants under 6 months of age take lower breast milk 25-(OH) D3 and TGF-β, it might increase the risk and severe of atopic dermatitis.
Key words: atopic dermatitis, breast milk, vitamin A, vitamin D, TGF-β, maternal diet.
目錄
口試委員會審定書 ...i
摘要 ... ii
Abstract ... iii
圖目錄 ...vi
表目錄 ... vii
縮寫對照表 ... viii
第一章、緒論 ... 1
第一節、文獻回顧 ... 1
一、異位性皮膚炎 ... 1
二、母乳 ... 7
三、維生素 A ... 9
四、維生素 D ... 13
第二節、研究動機與架構 ... 19
第二章、材料與方法 ... 21
第一節、母親飲食頻率問卷調查 ... 21
一、研究對象及病情分數 ... 21
二、飲食頻率問卷 (food frequency questionnaire, FFQ) ... 21
第二節、母乳的維生素 A (retinol) 檢測與分析 ... 22
一、檢體收集與處理 ... 22
二、檢測方法 ... 23
第三節、母乳的維生素 D (25-(OH) D3)檢測與分析 ... 24
一、檢體收集與處理 ... 24
二、檢測方法 ... 24
第四節、母乳的細胞激素檢測 ... 27
一、檢體收集與處理 ... 27
二、檢測方法 ... 27
三、統計分析 ... 28
第三章、結果與討論 ... 29
第一節、母親飲食頻率問卷調查 ... 29
一、嬰兒家族成員病史與異位性皮膚炎關聯性 ... 29
二、母親營養攝取狀況 ... 31
三、母親飲食與嬰兒異位性皮膚炎 ... 33
第二節、母乳的維生素 A 與 D3含量 ... 40
一、母乳的維生素 A (retinol) 含量... 40
二、母乳視網醇含量對嬰兒異位性皮膚炎影響 ... 42
三、母乳的維生素 D (25-(OH) D3) 含量 ... 44
四、母乳 25-(OH) D3含量對嬰兒異位性皮膚炎影響 ... 46
第三節、母親飲食對母乳維生素 A 和 D 含量影響 ... 48
第四節、母乳的細胞激素濃度 ... 50
第四章、綜合討論與總結 ... 54
第一節、實驗限制 ... 54
第二節、綜合討論 ... 54
一、母乳維生素 D 的方法檢測 ... 54
二、嬰兒維生素 A 與 D 攝取狀況... 55
三、飲食維生素 D 與母乳 ... 56
第三節、總結 ... 56
第五章、參考文獻 ... 57
附錄 ... 69
圖目錄
圖 1- 1. 過度免疫反應的四種類型 ... 2
圖 1- 2. 異位性皮膚臨床症狀及組織病理圖 ... 3
圖 1- 3. 異位性皮膚炎免疫調節途徑 ... 6
圖 1- 4. 維生素 A 代謝途徑 ... 10
圖 1- 5. 視網酸調節 T 細胞分化形成示意圖 ... 12
圖 1- 6. 維生素 D3代謝途徑 ... 14
圖 1- 7. 維生素 D 與免疫系統的交互作用 ... 16
圖 1- 8. 維生素 A 與 D3對過敏反應的影響 ... 18
圖 1- 9. 實驗流程圖 ... 20
圖 3- 1. 維生素 A (retinol) 之標準品層析圖譜及標準曲線 ... 40
圖 3- 2. 母乳的視網醇含量與嬰兒異位性皮膚炎病情的相關性 ... 43
圖 3- 3. 維生素 D (25-(OH) D3) 標準品的母離子與子離子質譜圖 ... 44
圖 3- 4. 母乳的 25-(OH) D3含量與嬰兒異位性皮膚炎病情的相關性 ... 46
圖 3- 5. 25-(OH) D3含量與嬰兒異位性皮膚炎病情的相關性 ... 47
圖 3- 6. 母乳的 TGF-β 濃度與嬰兒異位性皮膚炎病情的相關性 ... 51
表目錄
表 2- 1. 母乳樣品維生素 D3 (25-(OH) D3) 檢測法之質譜儀設定值 ... 25
表 2- 2. 母乳樣品維生素 D3 (25-(OH) D3) 檢測法之子離子設定值 ... 25
表 2- 3. 母乳樣品維生素 D3 (25-(OH) D3) 檢測法之流動相及流速 ... 26
表 3- 1. 受試者的相關資料 ... 29
表 3- 2. 家庭成員健康狀況及母親飲食習慣 ... 30
表 3- 3. 母親哺乳期間飲食的營養素攝取量 ... 32
表 3- 4. 母親哺乳期間營養攝取不足或超過人數比例 ... 33
表 3- 5. 健康、輕度與中重度異位性皮膚炎嬰兒之母親的能量營養素 攝取狀況 ... 34
表 3- 6. 健康、輕度與中重度異位性皮膚炎嬰兒之母親的纖維與礦物質 攝取狀況 ... 35
表 3- 7. 健康、輕度與中重度異位性皮膚炎嬰兒之母親的脂溶性維生素與膽固醇 攝取狀況 ... 36
表 3- 8. 健康、輕度與中重度異位性皮膚炎嬰兒之母親的水溶性維生素與酒精 攝取狀況 ... 37
表 3- 9. 母親的能量營養素、纖維與礦物質攝取狀況與嬰兒 SCORAD 之相關性 ... 38
表 3- 10. 母親的維生素、膽固醇與酒精攝取狀況與嬰兒 SCORAD 之相關性 ... 39
表 3- 11. 母乳樣品維生素 A (retinol) 檢測法之檢量極限、回收率及變異係數 ... 40
表 3- 12. 不同月齡嬰兒哺餵之母乳的視網醇含量 ... 41
表 3- 13. 不同程度異位性皮膚炎嬰兒哺餵之母乳的視網醇含量 ... 42
表 3- 14. 母乳樣品維生素 D (25-(OH) D3) 檢測法之檢量極限、回收率 及變異係數 ... 44
表 3- 15. 不同月齡健康與異位性皮膚炎嬰兒哺餵之母乳的 25-(OH) D3含量 ... 45
表 3- 16. 不同程度異位性皮膚炎嬰兒哺餵之母乳的 25-(OH) D3含量 ... 46
表 3- 17. 哺乳期間母親飲食含量與母乳的視網醇及 25-(OH) D3含量之相關性 .... 49
表 3- 18. 不同程度異位性皮膚炎嬰兒哺餵之母乳的 IL-6 及 TNF-α 濃度 ... 50
表 3- 19. 不同健康狀態母親所分泌的母乳 TGF-β 濃度 ... 50
表 3- 20. 不同程度異位性皮膚炎嬰兒哺餵之母乳的 TGF-β 濃度 ... 51
表 3- 21. 不同月齡健康與異位性皮膚炎嬰兒哺餵之母乳的 TGF-β 濃度 ... 52
表 3- 22. 母乳的視網醇、25-(OH) D3及 TGF-β 含量之相關性 ... 53
表 4- 1. 不同研究的母乳 25-(OH) D3含量檢測方法之比較 ... 55
縮寫對照表
縮寫 全名
1,25-(OH)2-D3 1,25-dihydroxyvitamin D3
24,25-(OH)2-D3 24,25-dihydroxyvitamin D3
25-(OH) D3 25-hydroxyvitamin D3
α-TE α-tocopherol equivalent DBP vitamin D-binding protein DRIs dietary reference intakes
EAE experimental autoimmune encephalomyelitis ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
FFQ food frequency questionnaire IFN-γ interferon-γ
HBD human β-defensins HRP horseradish peroxidase IBD inflammatory bowel disease
ISAAC The International Study of Asthma and Allergies in Childhood IL interleukin
IU international units MLN mesenteric lymph node MS multiple sclerosis
MUFA monounsaturated fatty acids PP Peyer’s patches
PUFA polyunsaturated fatty RA retinoic acid
RALDH retinal dehydrogenase RARs retinoic acid receptors RBP retinol-binding protein RDH retinol dehydrogenase RE retinol equivalent RXRs retinoid X receptors
SCORAD SCORing Atopic Dermatitis sIgA secretory IgA
Th helper T cells
TMB tetramethylbenzidine TNF-α tumor necrosis factor alpha Treg regulatory T cells
UL tolerable upper intake levels
UNICEF The United Nations Children's Emergency Fund VDR vitamin D receptor
第一章 緒論
第一章、緒論 第一節、文獻回顧
一、異位性皮膚炎
過敏為過度免疫反應所產生的症狀，當身體暴露於過敏因子 (如：花粉、食物、
藥物…….等) 時，免疫反應若無法正常被調控，將會引起嚴重的發炎反應，輕微 症狀如：流鼻水、呼吸困難、搔癢等，嚴重則會引起休克甚至是死亡。統計至 2007 年為止，台灣過敏疾病罹患人口超過六萬六千人，許多人甚至同時患有多種過敏 性疾病 (Hwang et al., 2010)，其中異位性皮膚炎為常見過敏性疾病之一。
(一) 過度免疫反應 (hypersensitivity)
當身體的免疫反應無法受到調控時，將導致過度免疫反應，造成組織發炎或 是器官功能異常等情形，依照機制的不同可分為第 I、II、III、IV 型過度免疫反應。
第 I 型過度免疫反應為 IgE 所誘導產生的過敏反應 (IgE-mediated hypersensitivity)，
由於過敏原與特定 B 細胞結合後，會促使 B 細胞產生大量的 IgE 抗體，而後 IgE 會結合到肥大細胞 (mast cells) Fcε 受體上，促進細胞進行顆粒作用 (degranulation)，
釋出組織胺、細胞激素，造成紅、腫、癢等症狀，此類過敏疾病包含氣喘、過敏 性鼻炎 (allergic rhinitis)、異位性皮膚炎等。第 II 型為由抗體主導的毒殺性過度免 疫反應 (antibody-mediated hypersensitivity)，形成原因為 IgG、IgM 抗體結合到細 胞上，活化補體 (complement) 系統或毒殺型 T 細胞 (cytotoxic T cells)，進而破壞 目標細胞，由於血液不相容所引起的溶血反應即為此類。第 III 型為免疫複合體 (immune complex) 所導致 (immune complex-mediated hypersensitivity)，當抗體與抗 原結合形成的免疫複合體無法被清除時，將會堆積於組織，活化補體系統並吸引 嗜中性白血球 (neutrophils)，造成劇烈過敏反應，相關疾病如紅斑性狼瘡 (systemic lupus erythematosus) 。 第 IV 型 為 細 胞 主 導 的 過 度 免 疫 反 應 (cell-mediated hypersensitivity 或 delayed-type hypersensitivity)，因抗原活化的第一型輔助 T 細胞
第一章 緒論
(type 1 helper T cells, Th1) 分泌細胞激素，促使巨噬細胞 (macrophages) 及毒殺型 T 細胞的活化及浸潤，所造成的過度免疫反應，此類疾病包含痲瘋 (leprosy)、結 核病 (tuberculosis)。
圖 1- 1. 過度免疫反應的四種類型 (Kuby, 2007) Figure 1-1. The four types of hypersensitivity.
(二) 異位性皮膚炎簡介
異 位 性 皮 膚 炎 (atopic dermatitis) ， 又 被 稱 做 異 位 性 濕 疹 (atopic eczema, eczema)，為常見慢性過敏皮膚疾病，全球約有 15-20%的兒童及 1-3%的成人罹患 此疾病 (Asher et al., 2006)，其中有 70%發生於五歲以下的孩童身上 (Nutten, 2015)。
ISAAC (The International Study of Asthma and Allergies in Childhood) 於 2006 年全 球統計結果，指出異位性皮膚炎盛行率有增加的趨勢 (Williams et al, 2008)，加上 持續性的搔癢感會嚴重地影響患者的作息，甚至影響患者家人生活品質 (McKenna
& Doward. 2008)，因此近年來有許多學者投入此疾病的研究。
第一章 緒論
異位性皮膚炎常見症狀為反覆性搔癢感，此外皮膚上會有濕疹斑塊及受損破 裂的情形產生，其症狀隨著年紀分成三種階段，嬰兒時期，濕疹斑塊大多出現在 臉頰與頭皮上，到了兒童時期，症狀會開始蔓延至頸部及四肢的背面，接著青少 年及成年期，就會佈滿整個頭部、頸部及四肢。將疾病以疾病症狀分類則分為急 性及慢性，前者表皮部分會開始產生病變，並有血管擴張情況產生，後者則會出 現表皮增厚情形 (Thomas. 2008)。雖然異位性皮膚炎病理已知，但確切致病原及致 病機制及尚未完全清楚，目前只知一些因子如：遺傳基因、飲食、環境因子、免 疫調節等可能與此疾病發生有關 (Nutten, 2015)。由於異位性皮膚炎病患血清通常 含有過量 IgE 及劇烈發炎反應，因此多數大多學者著重探討免疫反應與異位性皮 膚炎關聯性。
圖 1- 2. 異位性皮膚臨床症狀及組織病理圖 (Thomas. 2008) 圖 A-C：異位性皮膚 炎臨床症狀。圖 D：急性異位性皮膚炎組織病理圖。圖 E：慢性異位性皮膚炎組織 病理圖。
Figure 1-2. Clinical, histologic aspects of atopic dermatitis.
第一章 緒論
(三) 異位性皮膚炎的免疫反應
1. 先天性免疫反應系統 (innate immune response system)
先天性免疫反應為非專一性免疫防禦機制，能第一時間快速防止外來物入侵，
但不具記憶性，也無法提供長久性保護 (Alexander et al., 2002)。先天性免疫反應 系統包含皮膚、黏膜等物理屏障，以及胃酸及體液抗菌物質等化學屏障，參與的 細胞包含自然殺手細胞 (natural killer cells)、肥大細胞、嗜酸性白血球 (eosinophils)、
嗜鹼性白血球 (basophils)、巨噬細胞、嗜中性白血球、吞噬細胞 (phagocytic cells) 以及樹突細胞 (dendritic cells) 等。
皮膚為先天性免疫系統第一道防線，正常皮膚會產生抗菌肽 (cathelicidin) LL-37、防禦素 (human β-defensins) HBD-1、HBD-2、HBD-3 以及抗生素 (dermcidin) (Thomas. 2008) 防禦外來病菌入侵，但異位性皮膚炎患者因皮膚受損，無法正常分 泌這些抗菌肽對抗外來物，加上皮膚上的角質化細胞 (keratinocytes) 會誘導由樹 突細胞促進的第二輔助型 T 細胞 (type 2 helper T cells，Th2) 極化 (polarization)，
分泌大量的細胞激素 (cytokines) 及趨化素 (chemokines) ，使得皮膚發炎、紅腫 等。
皮膚上也存在兩種表皮樹突細胞：蘭格罕細胞 (Langerhans' cells) 及發炎樹突 表皮細胞 (inflammatory dendritic epidermal cells, IDECs)，差異在於前者存於正常 皮膚，而後者則是出現於發炎皮膚，兩者皆會表現 IgE 的受體 FcεRI (Novak & Bieber.
2005)，並活化下游相關後天性免疫反應。關於異位性皮膚炎的先天性免疫反應相 關文獻較少，但先天性反應常與調控後天性免疫反應有關，因此扮演相當重要的 角色。與異位性皮膚炎相關後天性免疫反應將於以下做詳細說明。
第一章 緒論
2. 後天性免疫反應系統 (adaptive immune response system)
後天性免疫反應又稱為適應性免疫反應，為專一性免疫防禦機制，透過先天 性免疫反應細胞，將抗原呈現給能辨認特定抗原的後天性免疫反應細胞後，啟動 專一性的免疫防禦作用，藉此清除外來病原菌，具有多樣性及記憶性特性。後天 免疫反應可分成以 T 細胞主導的細胞性免疫 (cellular immunity)，以及 B 細胞主導 的體液性免疫 (humoral immunity)。
T 淋巴球前趨細胞來自骨髓，經血液循環進入胸腺發育成成熟 T 細胞，接著 進行正選擇 (positive selection)，淘汰掉無法辨認自我主要組織相容性複合體 (major histocompatibility comples, MHC) 的 T 細胞後，存留下來的 T 細胞再經由負 選擇 (negative selection) 去除會辨認且殺死自身細胞的 T 細胞，最後發育成熟為 CD4+或 CD8+T 細胞，這些先天性 T 細胞 (naïve T cells) 辨認到外來抗原，會活化 形成作用型 T 細胞 (effector T cells)，包含毒殺型 T 細胞、輔助型 T 細胞 (helper T cells, Th) 及調節型 T 細胞 (regulatory T cells, Treg)。
異位性皮膚炎的患者會有第二型輔助 T 細胞極化現象，其所分泌的 IL-4、IL-5、
IL-13 能促使 B 細胞產生 IgE，導致急性異位性皮膚炎產生。若外在過敏原、病菌 或是持續性的搔癢行為造成皮膚受損後，將吸引 IDECs、嗜酸性白血球及巨噬細 胞浸潤至皮層，分泌 IL-12 誘導 T 細胞趨化成 Th1，並分泌 γ 型干擾素 (interferon-γ, IFN-γ)，促使角質化細胞行細胞凋亡 (apoptosis)，此時為該疾病的慢性階段。
第一章 緒論
圖 1- 3. 異位性皮膚炎免疫調節途徑 (Leung et al., 2004) Figure 1-3. Immunologic pathways in atopic dermatitis.
異位性皮膚炎急性階段會有大量 IgE 產生，且患者血清 IgE 含量與疾病嚴重程 度有顯著正相關 (Laske & Niggemann. 2004)，雖然仍有一些研究發現例外的病例 (Novak & Bieber. 2003)，但若血清 IgE 含量過高，將可能造成更劇烈發炎情況。現 今治療異位性皮膚炎的方法有許多種，大多會使用類固醇、抗發炎或抗組織胺的 藥物，使得發炎反應被抑制，但治療效果有限。為了可以提早預防此疾病產生，
許多研究致力於找出影響異位性皮膚炎的因子，近年來發現飲食營養素含量會影 響免疫反應，因此目前許多研究開始著重於探討飲食習慣與異位性皮膚炎間的相 關性。
第一章 緒論
(四) 飲食因子與異位性皮膚炎
已有研究證實飲食會影響異位性皮膚炎的產生，一些會引起過敏反應的食物，
如：精緻穀物、牛奶、蛋、花生……等，都可能增加罹患異位性皮膚炎的風險 (Chang et al., 2015)。Shaheen 及 Newson 等人 (2004) 調查指出，異位性皮膚炎患者與正常 人相比血中亞麻油酸含量較高 (linoleic acid, n-6 PUFA precursor) 及 n-3 PUFA 含量 較低，此外一些研究調查也指出孩童飲食若攝取較多的魚類，罹患異位性皮膚炎 的風險較低 (Alm et al., 2009; Oien et al., 2010)，補充 DHA (docosahexaenoic acid) 也有助於減緩病情 (Koch et al., 2008)。另有研究指出維生素 A 與 D 在異位性皮膚 炎中扮演重要的角色，關於維生素 A 與 D 與免疫反應的關聯性，將於後續做詳細 的介紹。
二、母乳 (一) 簡介
世界衛生組織 (WHO)、聯合國兒童基金會 (The United Nations Children's Emergency Fund, UNICEF) 等國際組織皆建議哺餵純母乳 (exclusive breastfeeding) 直至嬰兒六個月月齡，並於六個月後添加副食品。母乳為嬰兒早期主要營養來源，
提供嬰兒生長發育所需養分，內含營養素及生物活性因子 (bioactive factor)，包含 蛋白質、碳水化合物、脂肪酸、維生素、礦物質、生長因子 (growth factor)、細胞 激素 (cytokine) 及免疫球蛋白 (immunoglobulin) 等 (Ballard&Morrow, 2013)。母 乳內含成分約有 6.9-7.2%乳糖 (lactose)、0.8-0.9%蛋白質及 3-5%脂肪等巨量營養 素 (macronutrient)，且每 100 mL 母乳能提供 60-75 kcal 熱量，不同母乳分泌階段，
其內含成分會有所差異 (Jenness, 1979)，以因應嬰兒不同時期生長所需 (Fujita et al., 2012)。
第一章 緒論
依照產後的時間，將母乳分成初乳 (colostrum)、過渡乳 (transitional milk) 及 成熟乳 (mature milk) (Andreas et al., 2015)。初乳為分娩後 0-5 天內所分泌，與後期 成熟乳相比，內含較少的乳醣及脂肪，含有較多的蛋白質、生長因子、細胞激素 及免疫球蛋白 (Kulski&Hartmann, 1981; Saint et al., 1984; Castellote et al., 2011)；成 熟乳則為分娩後 10-14 天後所分泌，提供較多熱量 (Gidrewicz&Fenton, 2014)。
(二) 母乳對嬰兒免疫系統與疾病的影響
研究指出哺乳能夠預防孩童肥胖、降低免疫疾病罹患率及死亡率，對成長與 發育也有良好影響 (Goldman et al., 2007)，此外母乳內免疫球蛋白、免疫細胞及細 胞激素等也能影響嬰兒體內免疫系統發育 (Turfkruyer&Verhasselt, 2015)。
母乳內含有許多免疫細胞，如：巨噬細胞、幹細胞及白血球 (leukocyte) 等 (Ichikawa et al., 2003; Indumathi et al., 2012)，其中含量最多的為白血球 (Hassiotou et al., 2013)。初乳白血球包含 40-50%巨噬細胞、40-50%嗜中性白血球及 5-10%淋 巴細胞 (lymphocyte) (Brooker , 1980; Goldman&Goldblum, 1997; Xanthou, 1998)。這 些源自於母親血液的細胞，能透過乳腺上皮細胞 (mammary epithelium) 轉移至母 乳內，嬰兒再藉由母乳獲得以上細胞；此外，嬰兒消化系統尚未發育完全，胃中 pH 值相較於成年人高，能使這些白血球生存 (Sheldrake&Husband, 1985; Jain, 1989)，並進一步影響嬰兒免疫系統，如：抗體或細胞激素的分泌 (Parigi et al., 2015)，
過去也有研究指出，母乳的巨噬細胞能夠促使嬰兒體內樹突細胞分化，進而活化 T 細胞 (Yagi et al., 2010)。
IgA 為母乳內含量最多、最主要的非特異性抗體，能夠協助嬰兒出生後黏膜免 疫系統的形成 (Parigi et al., 2015)。母乳的 sIgA (secretory IgA) 則能被嬰兒腸道樹 突細胞所辨識，活化下游抗發炎訊息傳遞，進而使嬰兒腸道環境較為抗發炎 (Kadaoui& Corthésy, 2007)。母乳也含有許多細胞激素，細胞激素能通過嬰兒腸壁，
進入血液循環影響嬰兒免疫細胞活性 (Ballard&Morrow, 2013)，其中以 TGF-β 含量 最多 (Penttila, 2010)。母乳 TGF-β 能夠藉由胃酸轉換成活化態，調節嬰兒發炎反
第一章 緒論
應及傷口癒合 (Nakamura, 2009)，也能預防過敏氣喘疾病 (Verhasselt et al., 2008)。
母乳的細胞激素含量也反映了母親的健康狀態，過去研究指出患有過敏疾病母親 所分泌的母乳內，細胞激素 IL-4 及趨化素 MIP-1α 濃度顯著較健康組高 (Rudloff et al., 1999)，Böttcher 等人 (2000) 研究結果也顯示，過敏母親母乳內 IL-4、IL-5 及 IL-13 濃度顯著高於健康組。
研究指出長期哺餵母乳能夠降低許多自體免疫疾病罹患率，包含第一型糖尿 病 (type I diabetes)、發炎性腸道疾病 (inflammatory bowel disease，IBD) 及多發性 硬化症 (multiple sclerosis, MS) (Klement et al. 2004; Conradi et al., 2013; Lund-Blix et al., 2015)，多數研究結果也發現純母乳比配方奶更能降低嬰兒過敏疾病罹患風險 (Tariq et al., 1998; Oddy wt al., 1999; Kull et al., 2005; Turck, 2005)。與異位性皮膚炎 相關研究，Wetzig 等人 (2000) 調查結果顯示，五個月月齡以下異位性皮膚炎嬰兒，
哺乳人數顯著較健康組低；另一項研究調查則顯示，有過敏疾病家族史的孩童，
前三個月月齡內哺乳能有效降低異位性皮膚炎罹患率 (Gdalevich et al., 2001)，此 外 Snijders 等人 (2007) 研究調查指出，哺乳超過九個月嬰兒組與未哺乳組相比，
有顯著較低的異位性皮膚炎罹患率。
三、維生素 A (一) 簡介
維生素 A (vitamin A) 為脂溶性維生素，調控人體視覺、生長發育及細胞分化 等重要功能。動植物性食品來源廣泛含有維生素 A，動物性來源主要為視網醇 (retinol)、視網醛 (retinal)、視網酸 (retinoic acid, RA)，一般所稱的維生素 A 即為 視網醇；植物性來源主要則為類胡蘿蔔素 (carotenoid)，需經由代謝轉換成有活性 的維生素 A，其中以 β-胡蘿蔔素 (β-carotene)，轉換為維生素 A 的單位效率最高，
藉由中間雙鍵斷裂分解成視網醛，因此 β-胡蘿蔔素又可稱為維生素 A 先質
(provitamin A)。
第一章 緒論
圖 1- 4. 維生素 A 代謝途徑 (O'Byrne&Blaner, 2013) Fig. 1-4. Metabolic pathway of vitamin A.
國際上維生素 A 活性以視網醇當量 (retinol equivalent, RE) 來表示，維生素 A 含量以國際單位（international units, IU）或微克 (μg) 表示，每 1 RE 即為 1 μg 視 網醇或 6 μg β-胡蘿蔔素，也相當於 3.3 IU 的視網醇或 10 IU 的 β-胡蘿蔔素。根據 行政院衛福部國人膳食營養素參考攝取量 (dietary reference intakes, DRIs)， 20 歲 以上男性建議每日攝取 600 μg，20 歲以上女性則為 500 μg，每日攝取上限為 3000 μg。世界衛生組織將維生素 A 缺乏定義為血清視網醇濃度低於 0.70 μmol/L。維生 素 A 能藉由飲食攝取，動物性來源食物如：蛋、動物肝臟、魚肝油、全脂奶……
等，植物性來源食物如：胡蘿蔔、番薯、南瓜、菠菜、綠花椰菜……等。
第一章 緒論
維生素 A 缺乏時可能造成夜盲症 (night blindness)、乾眼症 (xerophthalmia)，
也會降低抵抗力，增加呼吸道或腸胃道感染風險，或是其他免疫相關疾病產生 (Stephensen, 2001)，全球缺乏維生素 A 族群主要為兒童或孕婦，主要原因皆為飲 食維生素 A 攝取不足所導致。維生素 A 很少會有攝取過多的情況，大多是因為額 外攝取過多補給品，且若攝取過多時將導致維生素 A 堆積於肝臟，並造成中毒症 狀，包含頭痛、食慾不振、毛髮乾燥、皮膚脫落……等，甚至當孕婦維生素 A 攝 取過多時將會有畸形胎產生 (Sanclemente et al., 2009)。
(二) 維生素 A 與免疫反應
維生素 A 對於細胞生長分化及免疫反應皆有調控功能，當身體攝取視網醇後 會被視網醇脫氫酶 (retinol dehydrogenase, RDH) 氧化成視網醛，接著再被視網醛 脫氫酶 (retinal dehydrogenase, RALDH) 轉化成視網酸。視網酸會與 RARs (retinoic acid receptors, RARs) 及 RXRs (retinoid X receptors, RXRs) 兩種異元二聚體 (heterodimer) 結 合 ， 引 發 轉 錄 作 用 來 調 控 下 游 相 關 細 胞 生 長 或 免 疫 途 徑 (Brown&Noelle, 2015)。
視網酸在腸道免疫扮演重要角色，原因為腸繫膜淋巴結 (mesenteric lymph node, MLN) 及皮耶氏體 (Peyer’s patches, PP) 內的樹突細胞，內含 aldh1a2 和 aldh1a1 兩種轉錄出視網醛脫氫酶 (分別為 RALDH2 和 RALDH1) 的基因，能藉 此合成視網酸，進而執行維生素 A 相關細胞生長或免疫反應途徑 (Hirakiyama et al., 2004)。過去許多研究皆指出，樹突細胞所合成出來的視網酸能夠調節 CD4+T 細胞 的分化及可塑性 (plasticity) (Benson et al., 2007; Elias et al., 2007; Mucida et al., 2007)，當 CD4+T 細胞受到視網酸的刺激後，能夠使之較容易趨化成 Th1 並抑制分 化形成 Th17，此外也能增加調節型 T 細胞的穩定性。除了 T 細胞以外，B 細胞也 會受到維生素 A 的影響，近年一篇 review 指出維生素 A 能夠調節 B 細胞生長發育，
也能夠藉由調節 B 細胞內基因重組作用來影響抗體製造過程，對於未來的免疫治 療扮演相當重要的角色 (Ross et al., 2011)。
第一章 緒論
圖 1- 5. 視網酸調節 T 細胞分化形成示意圖 (Brown&Noelle, 2015) Fig. 1-5. Retinoic acid regulation of T cell differentiation.
當維生素 A 缺乏時會導致皮膚的乾燥及角質化，呼吸道、腸胃道及泌尿道的 上皮細胞也會有所影響，使得黏膜細胞受損，所合成的醣蛋白量下降，造成免疫 第一道防線受損。維生素 A 缺乏時也會影響嗜中性白血球發育，使巨噬細胞所分 泌的細胞激素增加，降低自然殺手細胞活性，導致發炎現象產生 (Stephensen, 2001;
de Pee & Dary, 2002)。維生素 A 與免疫疾病的相關研究，Xiao 等人 (2008) 利用小 鼠實驗性自體免疫腦脊髓炎 (experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 模 式探討視網酸對於此疾病的影響，發現視網酸能夠增加 Foxp3+ Treg 細胞及抑制 Th17 細胞 發育 進而 減緩病 情 。 此外給 予 由紅斑 性狼瘡 所引 發 的腎絲 球腎炎 (glomerular disease) 動物模式視網酸，能夠有效降低 T 細胞及巨噬細胞浸潤於腎絲 球 (Pérez de Lema et al., 2004)，Nurmatov 等人 (2011) 調查研究營養素對氣喘及 過敏疾病影響，結果顯示氣喘患者血清維生素 A 含量顯著較正常人低。由於維生
第一章 緒論
素 A 與免疫反應有著密切關係，這幾年陸續有許多學者開始著重研究維生素 A 與 異位性皮膚炎關聯性，以下將針對維生素 A 與異位性皮膚炎的免疫反應作詳細的 說明。
(三) 維生素 A 與異位性皮膚炎
Hozyasz 等人 (2004) 檢測 25 名患有異位性皮膚炎孩童及 18 名健康孩童血清 視網酸含量，結果顯示患有異位性皮膚炎孩童血清視網酸含量顯著較低，同樣 Pesonen 等人 (2007) 研究中持續追蹤 200 名新生兒至 20 歲，並在 2、4、12 個月 及 5、11 歲時利用 HPLC 檢測血清中視網醇含量，結果指出，異位性皮膚炎 5 歲 孩童的血清視網醇含量也顯著較正常孩童低。
四、維生素 D (一) 簡介
維 生 素 D (vitamin D) 為 一 種 脂 溶 性 維 生 素 ， 自 然 界 主 要 以 麥 角 鈣 醇 (ergocalciferol，維生素 D2) 及膽鈣醇 (cholecalciferol，維生素 D3) 這兩種型態存在，
前者能由浮游生物、無脊椎動物、真菌及植物合成 (Combs, 2008)，後者則是脊椎 動物皮 膚經 由波 長 295–300 nm 的 紫外 光 照射後 ，由 前驅 物 7-去 氫膽 固醇 (7-dehydrocholesterol) 所形成，因此又稱為「陽光維他命」，而一般所稱的維生素 D 為維生素 D3的統稱。
當身體獲得維生素 D 後，會與血漿維生素 D 結合蛋白 (vitamin D-binding protein ， DBP) 結 合 ， 並 將 其 運 輸 至 肝 臟 ， 利 用 肝 臟 的 25-hydroxylase 將 cholecalciferol 轉化成 25-hydroxyvitamin D3 (25-(OH) D3) 後，經血液循環運輸到達 腎臟，再進一步由腎臟內 1α-hydroxylase 代謝成具有活性的 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2-D3)，能調控鈣與磷的代謝，在骨骼發育與生長扮演重要角色。
25-(OH) D3 也 能 經 由 腎 臟 內 另 一 種 酵 素 24-hydroxylase ， 將 其 代 謝 成
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24,25-dihydroxyvitamin D (24,25-(OH)2-D3)，此種型態也能經由血液循環到其它組 織，但其活性較 1,25-(OH)2-D3低。
圖 1- 6. 維生素 D3代謝途徑 (Eva et al., 2014) Fig. 1-6. Metabolic pathway of vitamin D3.
維生素 D 含量以 IU 或 μg 表示，1 μg 維生素 D3之生物活性相當於 40 IU，根 據行政院衛福部國人膳食營養素參考攝取量，建議每日攝取 5 μg，未滿一歲幼兒 和五十歲以上年長者建議攝取 10 μg，懷孕後婦女則建議每日增加攝取 5 μg。當血 中的 25-(OH) D3含量低於20 ng/mL (50 nmol/L) 時即視為維生素 D 缺乏，而當攝 取超過 100 μg (4000 IU) 時，則會造成維生素 D 中毒。維生素 D 能透過日照 10-15
第一章 緒論
分鐘獲得一天所需含量 (約 2000-4000 IU)，也能藉由飲食攝取獲得，自然界含有 維生素 D 的食物種類不多，常見食物如：菇類、魚肝油、深海魚 (如：鮭魚、鮪 魚或鯖魚)，市面上也有販賣維生素 D 營養補充品，如：添加維生素 D 的奶粉及市 售維他命 D 等。維生素 D 食物來源詳見附錄三。
當維生素 D 缺乏時將會造成許多疾病的產生，包含兒童時期的佝僂病 (rickets) 及成人的軟骨症 (osteomalacia) 等，以及增加牙周病、骨質疏鬆症罹患率的風險 (Lamni-Keefe et al., 2008)，也會影響鈣質吸收，並有肌肉抽蓄、疼痛以及肌無力情 況產生 (Joshi et al., 2010)。此外，缺乏維生素 D 也與自體免疫疾病、心血管疾病、
傳染疾病、癌症、糖尿病等疾病形成有關 (Lori & Hector. 2010; Agmon-Levin et al., 2013; Olliver et al., 2013)。
(二) 維生素 D 與免疫反應
維生素 D 能夠調節身體許多功能，包含細胞的增生與分化，此外也具有調節 先天性免疫反應及後天性免疫反應的功能 (Hewison, 2011)。維生素 D 主要是利用 1,25-(OH)2-D3 與維生素 D 受體 (vitamin D receptor, VDR) 結合後啟動下游途徑 (Yasmin et al., 2005)。一些免疫細胞包括巨噬細胞、樹突細胞、T 細胞及 B 細胞等 皆能合成 1,25-(OH)2-D3及表現 VDR，這些細胞能藉此利用維生素 D 調節免疫反應 (Aranow, 2011)。
先天性免疫反應系統，維生素 D 能夠促進單核球分化成成熟的巨噬細胞 (Abe et al., 1981)，活化存在於巨噬細胞的溶酶體 (lysosomes) 內的抗菌胜肽 (Segaert, 2008)，增強其抗菌功能並抵抗外來物。維生素 D 也能夠影響樹突細胞的抗原呈現 功能 (antigen presentation)，進而調控後天性免疫反應 (Hewison et al., 2003)。後天 性免疫反應系統，維生素 D 不僅能夠抑制 CD4+ T 細胞的增生，也能夠抑制 Th1 及 Th17 細胞分泌細胞激素 (Mahon et al., 2003; Sun, 2010)，此外維生素 D 也會降 低 B 細胞所產生的 IgE 含量 (Hartmann et al., 2011)。
第一章 緒論
圖 1- 7. 維生素 D 與免疫系統的交互作用 (Muehleisen & Gallo, 2013) Fig. 1-7. Interactions of vitamin D and the immune system.
維生素 D 對於許多免疫反應的調控也反應於許多免疫疾病，有研究指出居住 於高緯度地區的人由於長期日照不足而缺乏維生素 D，較易罹患多發性硬化症 (Grant & Holick, 2005)，此外也發現高緯度地區的人，較易罹患氣喘及異位性皮膚 炎 (Weiland et al., 2004)。一項研究指出，利用紫外線增加體內 25-(OH) D3，能夠 顯 著 降 低 罹 患 第 一 型 糖 尿 病 的 風 險 ， 並 認 為 是 藉 由 抑 制 促 發 炎 細 胞 激 素 (pro-inflammatory cytokine) 分泌，如：腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor alpha, TNF-α) (Mohr et al., 2008)。
第一章 緒論
維生素 D 除了影響 T 細胞主導的免疫疾病外，也會影響 B 細胞相關免疫疾病，
Chen 等人 (2007) 實驗發現 1,25-(OH)2-D3會降低 B 細胞的增生能力，以及維持 B 細胞的恆定 (homeostasis)，能藉此抑制 B 細胞的過度活化並做為治療紅斑性狼瘡 的可能療法。
(三) 維生素 D 與異位性皮膚炎
先前研究指出異位性皮膚炎患者血清 25-(OH) D3含量顯著較正常人低 (Oren et al., 2008; Cheng et al., 2014)，另外有研究指出血清 25-(OH) D3含量與異位性皮膚 炎病情嚴重程度 (SCORAD 分數) 也有顯著負相關性 (Peroni et al., 2011; Mutgi et al., 2013; Baek et al., 2014)，Amestejani 等人 (2012) 也提到補充維生素 D 1600 IU (相當於 40 μg 維生素 D)，能有助於減緩異位性皮膚炎症狀，另外，臨床上利用紫 外光直接照射患者，促使體內大量合成維生素 D，以此治療此疾病 (Garritsen et al., 2014)。以上研究都證實了維生素 D 與異位性皮膚炎間的相關性。
維生素 D 影響異位性皮膚炎的可能機制很多，包含調節表皮上的發炎反應，
或是影響免疫細胞的功能。先天性免疫方面，1,25-(OH)2-D3 能夠促進角質化細胞 的分化及調節細胞的生長 (Gurlek et al., 2002)，也能降低角質化細胞所分泌的 IL-6 及 IL-8，進而降低發炎反應 (Komine et al., 1999)。維生素 D 也能影響到樹突細胞 及調節型 T 細胞等後天性免疫細胞功能，不論 in vitro 或是 in vivo 實驗，皆證實維 生素 D 能夠抑制樹突細胞的成熟，並促進調節型 T 細胞的分化 (Adorini et al., 2004;
Gregori et al., 2001)。已有研究指出 1,25-(OH)2-D3能夠抑制分泌 Th1 促發炎細胞激 素 (IL-2, IFN-γ, TNF-α)，並增加 Th2 抗發炎細胞激素 (IL-3, IL-4, IL-5, IL-10) 的 產生 (Lemire et al., 1995; Boonstra et al., 2001)，藉此調節 Th1 及 Th2 平衡。
第一章 緒論
綜合以上，維生素 A 與 D3具有免疫反應調節功能，且在異位性皮膚炎上扮演
相當重要的角色。目前尚未有維生素 A 與 D3對異位性皮膚炎詳細調控機制，已知
維生素 A 及 D3能夠降低體內 Th1、Th17 及 Th2，進而影響如自體免疫疾病及過敏 疾病嚴重程度，也能增加 Treg 抑制發炎反應，此外維生素 D3也能降低 IgE 分泌量，
故被認為能藉此降低異位性皮膚炎嚴重程度 (Julia et al., 2015)。
圖 1- 8. 維生素 A 與 D3對過敏反應的影響 (Julia et al., 2015) Fig. 1-8. Impact of vitamin A and vitamin D3 on allergic reactions.
第一章 緒論
第二節、研究動機與架構
一、研究動機
罹患異位性皮膚炎人口數逐漸增加 (Williams et al, 2008)，且多好發於五歲以 下孩童 (Nutten, 2015)。早期嬰幼兒營養主要來源為母乳，許多研究指出哺乳能降 低嬰兒疾病罹患率，包含肥胖及免疫疾病 (Goldman et al., 2007)，也與嬰兒異位性 皮膚炎罹患率有顯著負相關 (Wetzig et al., 2000; Gdalevich et al., 2001; Snijders et al., 2007)，但也有研究指出哺乳可能會增加異位性皮膚炎罹患風險 (Giwercman et al., 2010)，此外，近年兒童過敏門診發現不論健康或異位性皮膚炎嬰兒皆有哺餵母 乳的案例，推測可能為母乳的營養成分影響異位性皮膚炎罹患率及嚴重程度。母 乳內含的營養素與生物活性因子皆可能影響嬰兒免疫系統及疾病發生率，其中維 生素 A 與 D 在異位性皮膚炎的預防及治療上扮演重要角色，但母乳內維生素 A 與 D 含量與嬰兒異位性皮膚炎之間的關聯性尚未得知，因此本研究欲探討母乳的維 生素 A 和 D 含量與嬰兒異位性皮膚炎的關聯性。
二、研究架構 本研究欲探討：
1. 母親飲食狀況與嬰兒異位性皮膚炎的相關性
2. 母乳的維生素 A 與 D3含量對嬰兒異位性皮膚炎的影響
3. 母乳的細胞激素濃度對嬰兒異位性皮膚炎的影響
第一章 緒論
圖 1- 9. 實驗流程圖
Fig. 1-9. Experimental protocol.
建立實驗方法及問卷設計與修訂
專業醫師診斷及評分 SCORAD
母乳收集
FFQ (quantitative)問卷調查
資料與數據彙整並建檔
統計與結果分析
維生素 A 與 D3及細胞激素檢測與分析 與台大醫院小兒科過敏門診相關醫療人員聯繫並開始收案
第二章 材料與方法
第二章、材料與方法
第一節、母親飲食頻率問卷調查
一、研究對象及病情分數
本研究與台大兒童醫院合作，以六個月以下患有異位性皮膚炎嬰兒患者為研 究對象，並以健康嬰兒作為控制組。異位性皮膚炎病情分數由台大兒童醫院黃彥 銘醫師評斷，利用 1993 年由 European Task Force on Atopic Dermatitis 開發的 SCORAD 評分標準系統 (SCORing Atopic Dermatitis，SCORAD) 進行評估，主要 是依據疾病分布面積 (Area Score)、局部病灶嚴重程度 (Intensity Score)、患者主觀 症狀 (Subjective Symptoms Score) 三大類進行計算。本研究計算公式調整為 Area Score/5+7×Intensity Score/2。依照病情嚴重程度分成健康 health (SCORAD=0)、
輕度 mild-AD (SCORAD<15)、中重度 moderate-AD (SCORAD≥15) 三組 (分組依 據參考 Kunz et al., 1997)。
二、飲食頻率問卷 (food frequency questionnaire, FFQ)
由本實驗室博士班黃薰儀學姊設計問卷。經由詢問參與意願後，由黃薰儀學 姊調查健康與異位性皮膚炎嬰兒母親家庭成員過敏病史、過去一個月內飲食習慣、
攝取食物頻率及含量、健康保健食品使用頻率及含量，並計算攝取總熱量及各種 營養素含量。飲食頻率問卷內容詳見附錄二。
第二章 材料與方法
第二節、母乳的維生素 A (retinol) 檢測與分析
一、檢體收集與處理
收集第一節所論述嬰兒母親的母乳，分裝於 15 mL 離心管，並存放於-80oC 冰 箱，待日後進行處理。取出 0.5 mL 母乳加入 2 mL 乙醇混合去蛋白質，接著加入 2 mL 濃度為 0.1 mol/L 的抗壞血酸 (L-ascorbic acid)，震盪 1 分鐘混合，用以防止維 生素 A 氧化。加入 1 mL 濃度為 10 M 氫氧化鉀混合，置於 80oC 水浴 30 分鐘，並 置於冰上冷卻後加入 2 mL 正己烷，震盪 5 分鐘混合，4oC 離心 2330×g 共 10 分鐘。
取上層有機層溶液，利用氮氣吹乾，再用甲醇回溶 0.5 mL，過 0.45 μm Nynon 膜，
供作檢液待日後上機檢測分析。Retinol 標準品用甲醇配製成體積 1 mL，濃度各為 5, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0 ppm，作以標準曲線。處理過程皆須避光。(萃取過 程參考：Kučerová et al., 2013)
【試劑】
1. Retinol 標準品 (Sigma, SI-R7632)。
2. Ethanol 乙醇 (Merck, 1.00983.2500)。
3. L-ascorbic acid 抗壞血酸 (Sigma, A7506)。
4. 氫氧化鉀 KOH (nacalai tesque, 28616-45)。
5. n-hexane 正己烷 (J.T. Baker, 9304-03)。
6. Methanol 甲醇 (J.T. Baker, 9830)。
7. 13mm Nylon 0.45 μm 針筒過濾器 (Recenttec, R7-SFNY013045NC)。
第二章 材料與方法
二、檢測方法
視網醇為維生素 A 動物性來源之一，過去文獻指出，維生素 A 透過視網醇結 合至視網醇結合蛋白 (retinol-binding protein, RBP) 運送至乳腺 (Green et al., 2001)，此外過去研究檢測母乳維生素 A 時，其形式也多為視網醇 (Tomiya et al., 2015; Klevor et al., 2016)，因此本研究檢測母乳視網醇作為維生素 A 的指標。
利用 HPLC (Waters Type W600E Gradient Controller 及 600 System Pump) 進行 檢測，管柱為 Luna® 5 µm C18(2) 100 Å , LC Column 250 x 4.6 mm, Ea (phenomenex，
00G-4252-E0)，流動相為 100%甲醇，波長為 325 nm。檢測器設定 (Waters 486 Tunable Absorbance Detector) UV 值為 325 nm，流速調整為 1mL/min，進行分析。
利用注針器 (HAMILTON, 80530) 吸取樣品 25-30 μl，排出氣泡注入 HPLC 系統內 分析，系統注入 20 μl，利用 SISC 32 軟體進行檢測分析。利用外標準法計算樣品 濃度，公式為 x=(y-4154.4)/199098，其中 x 及 y 分別為濃度及面積。
【試劑】
1. Methanol 甲醇 (J.T. Baker, 9830)。
2. Milli-Q 水。
第二章 材料與方法
第三節、母乳的維生素 D (25-(OH) D
3)檢測與分析
一、檢體收集與處理
收集第一節所論述嬰兒母親的母乳，分裝於 15 mL 離心管，並存放於-80oC 冰 箱，待日後進行處理。取出 1 mL 母乳加入 2 mL 乙腈，超音波水域震盪 30 分鐘，
接著加入甲醇：milli Q 水=1：1 溶液 2 mL，混合後再加入 4mL 正己烷，置於超音 波水域震盪 30 分鐘，接著 4oC 離心 2330×g 共 20 分鐘。取上層有機層溶液，利用 氮氣吹乾，再用 LC/MS 等級甲醇回溶 0.5 mL，過 0.22 μm PVDF (polyvinylidene difluoride，PVDF) 膜，供作檢液待日後上機檢測分析。25-(OH) D3標準品用甲醇 配置成體積 1 mL，濃度各為 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0 ppm，作以標準曲線。
處理過程皆須避光。(萃取過程參考：行政院衛福部，2008)
【試劑】
1. 25-(OH) D3標準品 (Sigma, FL-17938)。
2. Acetonitrile 乙腈 (Merck, 1.00030.4000)。
3. Methanol 甲醇 (J.T. Baker, 9830)。
4. n-hexane 正己烷 (J.T. Baker, 9304-03)。
5. 13mm PVDF 0.22 μm 針筒過濾器 (立行科技, MF2513-6A)。
二、檢測方法
維生素 D 動物性來源為維生素 D3，截至目前為止，何種型態的維生素 D (目 前多數研究檢測膽鈣醇或 25-(OH) D3) 能作為母乳維生素 D 含量指標尚有爭議，
但過去文獻指出，母乳內存在的維生素 D 結合蛋白與 25-(OH) D3具有高度親和性 (Houghton & Vieth, 2006)，故本研究檢測 25-(OH) D3含量作為母乳維生素 D 含量 指標。
第二章 材料與方法
利 用 Ultraperformance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometer (Waters Acquity UPLC Quattro Premier XE MS) 進行檢測 (以下簡稱 UPLC-MS/MS)，管柱為 CORTECS UPLC C18 Column, 90Å , 1.6 µm, 2.1 mm X 30 mm (Waters，186007092)，質譜設定值設定條件如表 2-1、2-2 所示，流動相梯度如 表 2-3 所示。將 UPLC-MS/MS 設定好儀器設定值後，開啟質譜儀氮氣及氬氣，並 將液相層析儀依序進行 purge、tubing 平衡、管柱平衡。平衡好後將管柱溫度設為 23oC、樣品溫度設為 4oC、樣品注射體積設為 10 μl，開始進行分析。分析好後用 弱清洗液及強清洗液清洗管線，將管柱保存 90%甲醇。此檢測法利用 MassLynx V4.1 軟體進行檢測分析。本檢測法利用外標準法進行樣品濃度計算，每次檢測皆 重新利用標準品校正檢量線做計算，最後濃度稀釋 2 倍 (萃取過程樣品濃縮 2 倍)。
表 2- 1. 母乳樣品維生素 D3 (25-(OH) D3) 檢測法之質譜儀設定值 Table 2-1. Mass spectrometry conditions of 25-(OH) D3 in breast milk.
Ion mode ESI+
Capillary voltage (kV) 3
Cone voltage (V) 45
Parent ion (m/z) 401.09
Desolvation temperature (oC) 450 Desolvation gas (L/hr) 700
Source temperature 120
表 2- 2. 母乳樣品維生素 D3 (25-(OH) D3) 檢測法之子離子設定值 Table 2-2. Mass spectrometry conditions of 25-(OH) D3 in breast milk.
Daughter ion Collision (V)
106.60 35
104.73 45
第二章 材料與方法
表 2- 3. 母乳樣品維生素 D3 (25-(OH) D3) 檢測法之流動相及流速
Table 2-3. Flow rate, mobile phase and gradient of 25-(OH) D3 in breast milk.
Time (mins) Flow rate (mL/min) % Methanol % NH4Ac
0.0 0.5 30 70
0.5 0.5 30 70
3.5 0.5 90 10
4.5 0.5 90 10
5.0 0.5 30 70
7.0 0.5 30 70
【試劑】
1. 有機相：methanol 甲醇 (J.T. Baker, 9830)。
2. 水相：5 mM 醋酸銨 (ammonium acetate, NH4Ac. Merck, 1.01116.0500) 溶於 milli-Q 水。(當日現配)
3. 100% Milli-Q 水。(當日現配)
4. Weak wash solvent 弱清洗液：10% methanol，90% milli-Q 水。
5. Strong wash solvent 強清洗液：60% methanol，20% acetonitrile，20% milli-Q 水。
第二章 材料與方法
第四節、母乳的細胞激素檢測
一、檢體收集與處理
收集第一節所論述嬰兒母親的母乳，分裝於 15 mL 離心管，並存放於-80oC 冰 箱，待日後進行處理。取出 1 mL 母乳放置於 eppendorf，4oC 離心 700×g 共 10 分 鐘，將脂質層 (上層) 去除，再以 4oC 離心 10000×g 共 30 分鐘，取出上清層 (乳 清) 至另一個 eppendorf，目的為去除母乳內細胞碎片等雜質。(參考：Böttcher et al., 2000)
二、檢測方法
以酵素免疫分析法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 進行分析，所 使用的廠牌皆為 e-Bioscience。於 96 孔盤加入 capture antibody (1o Ab) 100 μl/well 靜置於 4oC 隔夜，以 PBST 清洗 3 次，以 diluent assay 溶液室溫 blocking 1 小時 (200 μl/well)，以 PBST 清洗 4 次後加入樣品與標準品 (詳細配置請見【試劑】) 室溫反 應 2 小時 (50 μl/well)，以 PBST 清洗 5 次後加入 detection antibody (2o Ab) 100 μl/well 室溫反應 1 小時，以 PBST 清洗 5 次後加入 HRP 100 μl/well 室溫避光反應 30 分鐘，
以 PBST 清洗 5 次後加入 substrate solution 100 μl/well 室溫避光呈色至適當，加入 stop solution 50 μl/well 中止反應，以 ELISA reader 測定 450 nm 吸光值。
【試劑】
1. Kit：TGF-β 為 88-8350；IL-6 為 88-7066；TNF-α 為 88-7346。
2. Coating buffer：10×coating buffer 以 PBS 稀釋至 1 倍使用。
3. Diluent assay：5×ELISA/ELISPOT Diluent 以 DI water (一次水) 稀釋至 1 倍使 用。
4. PBST：0.05% Tween 20 in PBS。
第二章 材料與方法
5. Capture antibody (1o Ab)：以 1×diluent assay 稀釋 250 倍使用。
6. Detection antibody (2o Ab)：以 1×diluent assay 稀釋 250 倍使用。
7. 標準品：以 diluent assay 稀釋，標準曲線範圍為 0-1000 pg/mL。
8. 樣品：TGF-β 需以 10μl 1 N HCl 室溫反應 10 分鐘，再以 10μl 1 N NaOH 中和 反應，其餘 IL-6 及 TNF-α 則直接使用。
9. HRP：以 1×diluent assay 稀釋 250 倍使用，需避光。
10. Substrate solution：TMB (Tetramethylbenzidine)，避光直接使用。
11. Stop solution：18 N H2SO4 以 DI water 稀釋 9 倍使用。
三、統計分析
所有實驗數據以 Mean± SD 表示，利用 SPSS Statistics 17.0 軟體進行 Student’s t-test、ANOVA、相關性分析及 Chi-square test，以 Duncan's new multiple range test 進行多重比較。#0.05<p<0.1，*p<0.05，**p<0.01。
第三章 結果與討論
第三章、結果與討論
第一節、母親飲食頻率問卷調查
一、嬰兒家族成員病史與異位性皮膚炎關聯性
本研究對象為六個月齡以下的嬰兒，包含患有異位性皮膚炎嬰兒 (AD 組) 48 位與健康嬰兒 (health 組) 47 位，其中異位性皮膚炎嬰兒又可分為輕度組 (mild-AD 組，簡稱 m-AD 組) 16 位，和中重組 (moderate-AD 組，簡稱 M-AD 組) 32 位。表 3-1 結果顯示，本研究受試者 AD 組的嬰兒平均月齡及體重顯著高於 health 組，其 他的嬰兒及母親各項資料兩組間無顯著差異。
表 3- 1. 受試者的相關資料 Table 3-1. Subjects characteristics.
Health AD
Characteristics Total Mild Moderate p value
Subject number 47 48 16 32
Infant
SCORAD 0 >0 <15 ≥15
Age (month) 2.74±0.92 3.53±0.93 3.09±1.07 3.75±0.78 <0.001 Weight (kg) 5.98±1.13 6.58±0.85 6.16±0.65 6.83±0.87 0.028 Height (cm) 59.5±3.6 59.6±10.9 54.3±16.9 62.7±2.6 0.970
Gender 0.444
Male (n) 31 28 7 21
Female (n) 16 20 9 11
Mother
Age (year) 34.2±3.9 34.7±3.5 33.9±4.1 35.2±3.0 0.594 Weight (kg) 56.1±5.7 56±6.6 55.6±8.26 56.3±5.7 0.985
Height (cm) 160±5 159±6 157±7 160±5 0.478
Values are expressed as mean±SD.Total subject in the AD group compared to the health group, data analyzed by Student’s t-test or Chi-square test.
第三章 結果與討論
至於母親、父親或嬰兒兄弟姊妹是否有過敏相關疾病，health 組及 AD 組之間 沒有顯著差異。Health 組及 AD 組的母親飲食習慣，包括食用點心與否 (本研究母 親皆未食用宵夜)、外食族與否，或服用魚油與否，兩組之間皆沒有顯著差異 (表 3-2)。
表 3- 2. 家庭成員健康狀況及母親飲食習慣
Table 3-2. The results of family history of allergic disease and mother’s eating habits.
Factor Yes (n) No (n) p value
Family history of Mother Health 16 15 0.535
allergic disease AD 19 13
Father Health 15 16 0.259
AD 11 21
Siblings Health 3 28 0.185
AD 7 25
Mother’s eating habits Dessert Health 16 15 0.259
AD 21 11
Fast-food junkie Health 26 5 0.421
AD 29 3
Fish oil Health 5 26 0.956
AD 5 27
Data analyzed by Chi-square test.
過去探討家族病史對孩童異位性皮膚炎的影響之相關研究，Böhme 等人 (2003) 調查 2614 位 4 歲孩童，研究結果指出，非 IgE 相關異位性皮膚炎孩童組，其雙親 罹患過敏性呼吸道疾病比率較高。Irene 等人 (2010) 調查 54 位 3 個月至 12 歲異 位性皮膚炎孩童，結果也是一級親屬罹患過敏疾病與孩童異位性皮膚炎發生率有 顯著相關性。一項調查 60 位 10 至 14 歲孩童研究結果也顯示，家族病史為孩童罹 患異位性皮膚炎風險之一 (Sokolovski, 2010)。近年土耳其 1377 位嬰兒異位性皮膚 炎 的 調 查 研 究 ， 也 指 出 家 族 過 敏 病 史 與 異 位 性 皮 膚 炎 罹 患 率 有 顯 著 相 關 性 (Doğruel wt al., 2016)，以上皆顯示，家族過敏病史會影響嬰兒異位性皮膚炎罹患率。
第三章 結果與討論
由表 3-2 結果可知，本研究家族過敏病史與嬰兒異位性皮膚炎罹患率未呈現顯著關 聯性，可能原因為本研究樣本數較少，而過去多數研究樣本數則超過千人，故造 成本研究結果與過去文獻有所不同。
二、母親營養攝取狀況
本研究有 95 位母親，取得飲食頻率問卷調查，以推算各營養素攝取含量。結 果如表 3-3~3-4，根據 2011 年行政院衛福部國人膳食營養素參考攝取量，本研究超 過 20%的母親攝取的鐵 (100%)、葉酸 (55.6%)、鈣 (44.4%)、熱量 (34.9%) 及維 生素 E (25.4%) 皆不足，其中以鐵與葉酸缺乏最為嚴重。不過，也有超過 20%的 母親攝取的鎂 (25.4%) 與菸鹼素 (20.6%) 超過上限攝取量 (tolerable upper intake levels, UL)。
過去文獻指出，2005-2008 年間台灣地區成年女性的鐵與葉酸營養狀況皆有缺 乏情況 (賴&高, 2001；陳 et al., 2008)，本研究有相同的現象。許等人 (2005) 探 討母親哺乳期所需營養研究指出，若母親熱量攝取不足將會減少乳汁分泌，為了 讓嬰兒獲得足夠養分，母親更需攝取足量營養素。此外，母親哺乳期間內會消耗 許多營養素及能量，因此適當補充營養素 (如：鈣、鐵、維生素等) 對母親是非常 重要的。
第三章 結果與討論
表 3- 3. 母親哺乳期間飲食的營養素攝取量 Table 3-3. Maternal diet during breastfeeding.
Values are expressed as mean±SD. RE: retinol equivalent.
Nutrients
Energy (kcal) 2939±1070
Protein (g) 150±52
Ca (mg) 1293±630
Mg (mg) 516±265
P (mg) 2161±872
Fe (mg) 22.6±7
Zn (mg) 21.1±6.5
RE (μg) 1924±777
Vitamin B1 (mg) 1.98±0.69 Vitamin B2 (mg) 2.96±1.76 Niacin (mg) 31.6±11.2 Vitamin B6 (mg) 2.97±0.98 Folate (μg) 501±166 Vitamin B12 (μg) 12.9±7.5 Vitamin C (mg) 243±94 Vitamin D (μg) 19.8±13 Vitamin E (mg) 21.7±7.9
第三章 結果與討論
表 3- 4. 母親哺乳期間營養攝取不足或超過人數比例
Table 3-4. The proportion of nutrient inadequacy and excessive diet in breastfeeding mothers.
DRIs: dietary reference intakes, UL: tolerable upper intake levels, RE: retinol equivalent.
三、母親飲食與嬰兒異位性皮膚炎
若依嬰兒病情將其母親飲食資料分組，health 組與 AD 組的母親飲食攝取的總 熱量有顯著差異 (3179±1291 kcal vs. 2639±709 kcal)。由於分析不同組飲食頻率與 疾病關聯性，須做熱量校正才能比較 (Willett et al., 1997)。結果如表 3-5~3-8 所示，
M-AD 組母親熱量攝取仍低於 health 組的趨勢；M-AD 組母親鋅與膽固醇攝取有高 於 m-AD 組的趨勢；M-AD 組生素 B1攝取顯著高於 m-AD 組。
Nutrients <DRIs (%) >UL (%)
Energy (kcal) 34.9 -
Protein (g) 0.0 -
Ca (mg) 44.4 6.3
Mg (mg) 19.0 20.6
P (mg) 0.0 4.8
Fe (mg) 100.0 0.0
Zn (mg) 14.3 3.2
RE (μg) 1.6 11.1
Vitamin B1 (mg) 6.3 -
Vitamin B2 (mg) 4.8 -
Niacin (mg) 3.2 25.4
Vitamin B6 (mg) 9.5 0.0
Folate (μg) 55.6 0.0
Vitamin B12 (mg) 0.0 -
Vitamin C (mg) 12.7 0.0
Vitamin D (μg) 23.8 4.8
Vitamin E (mg) 25.4 0.0
第三章 結果與討論
表 3- 5. 健康、輕度與中重度異位性皮膚炎嬰兒之母親的能量營養素攝取狀況 Table 3-5. Macronutrients intakes among health, mild-AD and moderate-AD group.
Values are expressed as mean±SD. #0.05<p<0.1, compared to the health group analysed by Student’s t-test. MUFA: monounsaturated fatty acids, PUFA: polyunsaturated fatty acids.
Nutrients Group Energy adjusted (/1000kcal)
Energy (kcal) Health 3179±1291
Mild-AD 2820±837
Moderate-AD 2639±709# Carbohydrate (g) Health 128±18
Mild-AD 130±16
Moderate-AD 123±18
Protein (g) Health 51.4±7.3
Mild-AD 51.1±5.0
Moderate-AD 52.9±6.8 Total hydrolysis Health 53.0±7.0 amino acids (g) Mild-AD 52.7±4.8 Moderate-AD 53.7±6.5
Fat (g) Health 32.7±5.8
Mild-AD 32.0±6.8
Moderate-AD 34.1±6.2 Saturated fatty Health 35.6±5.7
acids (%) Mild-AD 34.3±6.4
Moderate-AD 33.7±4.8
MUFA (%) Health 32.3±1.8
Mild-AD 32.2±2.9
Moderate-AD 33.3±3.0
PUFA (%) Health 31.6±6.1
Mild-AD 33.2±7.5
Moderate-AD 32.6±5.6 Other fatty acids (%) Health 0.40±0.09
Mild-AD 0.39±0.18
Moderate-AD 0.37±0.07
第三章 結果與討論
表 3- 6. 健康、輕度與中重度異位性皮膚炎嬰兒之母親的纖維與礦物質攝取狀況 Table 3-6. Fiber and minerals intakes among health, mild-AD and moderate-AD group.
Values are expressed as mean±SD. #0.05<p<0.1, compared to the mild AD group analysed by Student’s t-test
Nutrients Group Energy adjusted (/1000kcal)
Fiber (g) Health 11.5±2.7
Mild-AD 11.1±2.7
Moderate-AD 11.4±3.3
Mineral (g) Health 7.63±1.03
Mild-AD 7.65±1.37
Moderate-AD 7.67±1.33
Na (mg) Health 903±224
Mild-AD 949±289
Moderate-AD 848±241
K (mg) Health 1639±374
Mild-AD 1585±308
Moderate-AD 1718±436
Ca (mg) Health 433±114
Mild-AD 445±164
Moderate-AD 435±133
Mg (mg) Health 177±54
Mild-AD 173±67
Moderate-AD 169±34
P (mg) Health 732±80
Mild-AD 714±81
Moderate-AD 740±110
Fe (mg) Health 7.78±1.86
Mild-AD 7.72±1.48
Moderate-AD 8.42±1.76
Zn (mg) Health 7.36±1.37
Mild-AD 6.96±0.82
Moderate-AD 7.62±1.09#
第三章 結果與討論
表 3- 7. 健康、輕度與中重度異位性皮膚炎嬰兒之母親的脂溶性維生素與膽固醇攝 取狀況
Table 3-7. Fat-soluble vitamin and cholesterol intakes among health, mild-AD and moderate-AD group.
Values are expressed as mean±SD. #0.05<p<0.1, compared to the mild AD group analysed by Student’s t-test RE: retinol equivalent, α-TE: α-tocopherol equivalent.
Nutrients Group Energy adjusted (/1000kcal)
Vitamin A (I.U.) Health 5339±2224
Mild-AD 5473±2715
Moderate-AD 5880±2268
RE (μg) Health 661±221
Mild-AD 665±286
Moderate-AD 708±245
α-carotene (μg) Health 171±121
Mild-AD 138±92
Moderate-AD 180±138 β-carotene (μg) Health 2768±1328
Mild-AD 2889±1598
Moderate-AD 3108±1321
Vitamin D (μg) Health 6.74±3.42
Mild-AD 6.80±3.26
Moderate-AD 6.45±3.2
Vitamin E (mg) Health 7.25±1.4
Mild-AD 7.41±1.4
Moderate-AD 7.77±1.55
α-TE (mg) Health 4.12±0.86
Mild-AD 4.04±0.63
Moderate-AD 4.39±0.87
Cholesterol (mg) Health 233±86
Mild-AD 227±81
Moderate-AD 288±185#
第三章 結果與討論
表 3- 8. 健康、輕度與中重度異位性皮膚炎嬰兒之母親的水溶性維生素與酒精攝取 狀況
Table 3-8. Water-soluble vitamin and alcohol intakes among health, mild-AD and moderate-AD group.
Values are expressed as mean±SD. *p<0.05, compared to the mild AD group analysed by Student’s t-test
Nutrients Group Energy adjusted (/1000kcal)
Vitamin B1 (mg) Health 0.69±0.15
Mild-AD 0.63±0.08
Moderate-AD 0.71±0.11* Vitamin B2 (mg) Health 1.00±0.25
Mild-AD 0.94±0.34
Moderate-AD 0.98±0.37
Niacin (mg) Health 11.11±2.41
Mild-AD 10.39±1.81
Moderate-AD 11.14±1.84 Vitamin B6 (mg) Health 1.03±0.23
Mild-AD 0.98±0.16
Moderate-AD 1.08±0.22
Folate (μg) Health 173±44
Mild-AD 175±54
Moderate-AD 183±45 Vitamin B12 (μg) Health 4.38±1.71
Mild-AD 4.81±1.77
Moderate-AD 4.05±1.36
Vitamin C (mg) Health 86.1±35.5
Mild-AD 84.6±30.9
Moderate-AD 89.8±30.8
Alcohol (g) Health 0.23±0.96
Mild-AD 0±0
Moderate-AD 0.09±0.31
第三章 結果與討論
將嬰兒異位性皮膚炎病情指標 (SCORAD) 與其母親飲食營養含量進行相關 性分析，結果顯示母親攝取的鉀、鋅、維生素 B1、菸鹼素、維生素 B6 及酒精 (米 酒等提味酒精含量)，與嬰兒的 SCORAD 呈顯著正相關 (表 3-9~3-10)。本研究問 卷並非針對各項營養素做設計，可能造成數據些許誤差，未來可再深入探討。
表 3- 9. 母親的能量營養素、纖維與礦物質攝取狀況與嬰兒 SCORAD 之相關性 Table 3-9. Correlation between macronutrients, fiber or minerals and SCORAD in the AD group.
Nutrients r value p value
Energy adjusted
Energy (kcal) 2639±709 -0.247 0.173
Carbohydrate (g) 123±18 -0.004 0.981
Protein (g) 52.9±6.8 0. 237 0.192
Total hydrolysis amino acids (g) 53.7±6.5 0.188 0.303
Fat (g) 34.1±6.2 -0.133 0.468
Saturated fatty acids (%) 33.7±4.8 -0.205 0.261
MUFA (%) 33.3±3.0 0.074 0.687
PUFA (%) 32.6±5.6 -0.006 0.976
Other fatty acids 0.37±0.07 -0.094 0.608
Fiber (g) 11.4±3.3 -0.044 0.812
Mineral (g) 7.67±1.33 0.075 0.685
Na (mg) 848±241 -0.208 0.253
K (g) 1718±436 0.371* 0.037*
Ca (mg) 435±133 -0.111 0.547
Mg (mg) 169±34 -0.023 0.899
P (mg) 740±110 0.056 0.761
Fe (mg) 8.42±1.76 0.225 0.217
Zn (mg) 7.62±1.09 0.450* 0.010*
*p<0.05. MUFA: monounsaturated fatty acids, PUFA: polyunsaturated fatty acids.
