科技部補助專題研究計畫成果報告 期末報告
探討嗜中性顆粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白調控鼻咽癌轉移 之分子機制
計 畫 類 別 ： 個別型計畫
計 畫 編 號 ： MOST 106-2314-B-040-014- 執 行 期 間 ： 106年08月01日至107年07月31日 執 行 單 位 ： 中山醫學大學醫學系
計 畫 主 持 人 ： 辛宗翰 共 同 主 持 人 ： 林巧雯
計畫參與人員： 碩士級-專任助理：蘇俊文
中 華 民 國 107 年 10 月 29 日
中 文 摘 要 ： 鼻咽癌是一種發生在頭頸部的癌症，好發於東亞地區，其中男性發 生率比女性高三倍，而造成鼻咽癌病患死亡的主因則是癌轉移。癌 瘤細胞轉移(metastasis) 是癌症導致死亡以及治療複雜度提昇的主 要原因; 而癌細胞轉移已知與多種細胞生理改變密切相關，如改變 癌瘤細胞與胞外基質間adhesion的能力，破壞細胞間交互作用的力 量等。嗜中性顆粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin ; NGAL)，與許多癌症的致病過 程有密切的相關性已是不爭的事實。而且NGAL也被發現會調控基質 金屬蛋白水解酵素(MMPs)並與MMP-9形成complex。但是NGAL與鼻咽 癌的致癌過程及其相關性卻仍不清楚。本實驗分析三株鼻咽癌細胞 (HONE-1、NPC-39及NPC-BM)其NGAL的表現量。並以NGAL的siRNA系統 及NGAL overexpression vector改變其NGAL的量，結果發現在處理 NGAL siRNA的HONE-1細胞中，其轉移能力有明顯的促進效果; 反之
，在NGAL大量表現的鼻咽癌細胞株中，發現其轉移能力則有明顯的 抑制效果。而我們利用illumina RNA-sequencing的分析方式，發現 IFIT2 (Interferon Induced Protein with Tetratricopeptide Repeats 2)基因有明顯的變化。但利用西方墨點法分析方式只發現 癌症轉移相關蛋白 MMP-2 在處理NGAL siRNA的HONE-1細胞中有明顯 的上升。而進一步分析illumina RNA-sequencing的數據也發現TLR- 10 在處理NGAL siRNA的HONE-1細胞中有明顯的上升。總結，我們的 結果發現NGAL此蛋白表現，在鼻咽癌細胞中，可能藉由負調控來影 響鼻咽癌細胞的轉移能力，而且可能與MMP-2及TLR-10有關。
中 文 關 鍵 詞 ： 鼻咽癌、細胞轉移、嗜中性顆粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白、基 質金屬蛋白水解酵素
英 文 摘 要 ： Nasopharyngeal carcinoma (NPC), a cancer occurring in head and neck, has the highest incidence in the East Asian region, while the incidence of males is three times higher than that of females. Metastasis of cancer cells, a primary cause of cancer death. Metastasis of cancer cells involves multiple processes and various cytophysiological changes, including changed adhesion capability between cells and extracellular matrix (ECM) and damaged intercellular interaction. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and NGAL/MMP-9 complex have been found to play an important role in tumorigenicity, proliferation and
metastasis in many cancers. However, little evidence of a direct relationship between NGAL expressions and NPC. In this study, we compared the protein expression of NGAL in three NPC cell lines (HONE-1, NPC-39 and NPC-BM). We then established the NGAL-expressing plasmid and NGAL siRNA systems and found that the migration ability was
dramatically increased in HONE-1/NGAL siRNA cell. In contrast, overexpression of NGAL in NPC-BM cell showed notably reduced the migration ability. We also found NGAL siRNA decreasing IFIT2 (Interferon Induced Protein with Tetratricopeptide Repeats 2) expression via illumina RNA-
sequencing. Moreover, NGAL siRNA increased the protein expression of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and TLR-10 (Toll like receptor-10). In conclusion, it can be inferred that knockdown NGAL induces MMP-2 and TLR-10 gene
expression, which consequently induces the metastasis of nasopharyngeal carcinoma cells.
英 文 關 鍵 詞 ： nasopharyngeal carcinoma, cell metastasis, neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL, MMP
中文摘要
鼻咽癌是一種發生在頭頸部的癌症，好發於東亞地區，其中男性發生率比 女性高三倍，而造成鼻咽癌病患死亡的主因則是癌轉移。癌瘤細胞轉移(metastasis) 是癌症導致死亡以及治療複雜度提昇的主要原因; 而癌細胞轉移已知與多種細 胞生理改變密切相關，如改變癌瘤細胞與胞外基質間 adhesion 的能力，破壞細胞 間交互作用的力量等。嗜中性顆粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白 (neutrophil
gelatinase-associated lipocalin ; NGAL)，與許多癌症的致病過程有密切的相關性已 是不爭的事實。而且 NGAL 也被發現會調控基質金屬蛋白水解酵素(MMPs)並與
MMP-9 形成 complex。但是 NGAL 與鼻咽癌的致癌過程及其相關性卻仍不清楚。
本實驗分析三株鼻咽癌細胞 (HONE-1、NPC-39 及 NPC-BM)其 NGAL 的表現量。
並以 NGAL 的 siRNA 系統及 NGAL overexpression vector 改變其 NGAL 的量，
結果發現在處理 NGAL siRNA 的 HONE-1 細胞中，其轉移能力有明顯的促進效 果; 反之，在 NGAL 大量表現的鼻咽癌細胞株中，發現其轉移能力則有明顯的抑 制效果。而我們利用 illumina RNA-sequencing 的分析方式，發現 IFIT2 (Interferon
Induced Protein with Tetratricopeptide Repeats 2)基因有明顯的變化。但利用西方墨 點 法分 析方 式只 發現 癌症 轉 移相關 蛋 白 MMP-2 在處理 NGAL siRNA 的
HONE-1 細胞中有明顯的上升。而進一步分析 illumina RNA-sequencing 的數據也 發現 TLR-10 在處理 NGAL siRNA 的 HONE-1 細胞中有明顯的上升。總結，我 們的結果發現 NGAL 此蛋白表現，在鼻咽癌細胞中，可能藉由負調控來影響鼻 咽癌細胞的轉移能力，而且可能與 MMP-2 及 TLR-10 有關。
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背景
人體的鼻咽位在鼻腔正後方與鼻腔相通、咽喉上方及顱底的正下方，兩 側為耳咽管的開口區，後方為頭顱枕部和脊椎骨區，下方則是與口咽相通。
鼻咽癌在全球以中國人的罹患率最高，好發年齡分布於 40~50 歲之間，主要
分佈於廣東省，因此亦稱「廣東癌」。目前醫學研究中發現，造成鼻咽癌的主
因有三種：遺傳因子、環境飲食及病毒感染。鼻咽癌常見於黃種人，好發於 中國南方 (湖南、福建、廣東、廣西)及東南亞地區，高發病率地區的人若是 遷移到其他地區，其後代依然具有高度罹癌風險，這代表鼻咽癌的發生率具 有種族敏感性 [1]。環境的污染包含居家或工作中空氣含甲醛、煙、粉塵、木 屑、石棉的汙染，Henderson 等人研究發現，幼年時期居住在高汙染環境中，
成年後罹患鼻咽癌的機率將會提高[2]而飲食方面，長期吸煙、喝酒以及食用 過多醃漬物如：鹹魚、鹹菜等，都會提升罹患鼻咽癌的機率[3]。Epstein Barr 病毒 (EBV)是人類泡疹病毒第四型，與許多癌症相關，像是淋巴癌、鼻咽癌 以及胃癌，其中 EBV 病毒主要會造成細胞型態為未分化型的鼻咽癌形成，表 現的 EBV 基因為 EBNA1、LMP1、LMP2A、LMP2B [4]。另外，第 12 對染色 體的增加及 3q、11q、14q 的缺失，與 p53 基因的突變，都會造成罹患鼻咽癌 的機率增加[5]。
癌症最致命的原因主要是癌轉移，而在所有頭頸部癌症中，鼻咽癌是最 容易轉移的一種癌症。由於鼻咽腔位置較為隱密，發生病變時不容易查覺，
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加上鄰近頸部淋巴結，接近 70~80%鼻咽癌病患會發生癌轉移至淋巴結，其中 又有 5~8%的病患在治療期間會發生遠端轉移，例如肺臟、肝臟及骨骼，包含 骨盆、肋骨及脊椎的轉移[6]。鼻咽癌的第一轉移位置為咽後淋巴結，其次是 上頸部淋巴結。由於鼻咽位在身體中線解剖區，不僅容易發生同側頸部淋巴 轉移，也會轉移到對側頸部淋巴[7-8]。
當正常細胞轉變成惡性腫瘤細胞時，需要特殊的訊息傳導使其不斷的增 生、逃脫細胞凋亡、誘發惡性腫瘤細胞組織周圍血管增生，以供應足夠的養 分，另外也提升惡性腫瘤細胞對周圍組織的侵襲和轉移能力[9]。而過程中惡 性腫瘤細胞需要分泌大量的蛋白酶(proteinase)，例如: matrix metalloproteinases
(MMPs)、urokinase plasminogen activator (u-PA)，造成細胞外基質的分解，使 癌細胞會穿過細胞外基質，進而造成癌轉移[10]。惡性腫瘤細胞本身會製造
MMPs，在癌症期數增加時某些 MMPs 亦會相對的增加，而 MMPs 具有蛋白 分解活性可分解膠原蛋白，在腫瘤破裂的基底膜處可測得大量的 MMPs，現 已證實是用來作局部侵襲和遠處轉移，主要在於助長癌細胞穿透基底膜，由 血管或淋巴管滲入組織而達轉移之目的[11-13]。
嗜中性顆粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated
lipocalin ; NGAL)屬於 lipocalin 家族成員之一，其分子量約 25kDa，可以與細 胞表面接受器結合因而形成大分子結合體。此外，NGAL 的表現量也與細胞 增殖、分化和發炎有關 [14]。除此之外，有越來越多的研究指出 NGAL 與癌
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症的致癌過程有關，其中包含胃癌、食道癌、大腸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、
乳癌、肝癌和前列腺癌 [15-17, 18-21]，表示 NGAL 與腫瘤細胞形成有密切的 關係。例如有文獻指出以乳癌模式證實 MCF-7 細胞內大量表現 NGAL 會增加 腫瘤生長和保護 MMP-9 不受到降解因而促進乳癌細胞轉移和血管新生[17]；
此外有文獻也證實 MCF-7 乳癌細胞大量表現 NGAL 會透過 ER 來調控 Slug 轉錄因子來抑制 E-cadherin 表現，因而促進 epithelial-mesenchymal transition
(EMT)形成。因此 NGAL 扮演著促進乳癌細胞移動和侵襲角色[22]。同時有文 獻證實抑制 NGAL 表現會減少與乳癌細胞內 MMP-9 形成複合物，因而減少乳 癌細胞轉移現象產生[23-25]。但是，截至目前為止，NGAL 在鼻咽癌的致癌 及轉移過程卻是完全沒有任何文獻探討。因此本實驗擬探討 NGAL 在鼻咽癌 轉移的表現及其相關訊息傳遞。
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材料方法
1. 鼻咽癌細胞培養及處理
NPC-39 及 NPC-BM 是台灣本土的鼻咽癌細胞株，利用此細胞株較能符合 台灣本土的情況。而 HONE-1 是購自 ATCC，此細胞可用於與本土細胞株比較。
鼻咽癌細胞株(HONE-1, NPC-39, NPC-BM)利用 DMEM+RPMI 培養基培養，加入 適量 antibiotics 及 10% heat-inactivated FCS。在送入 NGAL overexpression 與 NGAL knockdown 細胞於細胞培養箱中培育 24、48、72 小時後，取出 cell lysate 進行 Western blot 分析 NGAL、IFIT2、MMP-2、MMP-9 蛋白表現；並收取細胞 進行 in vitro migration assay。
2. cell migration 分析
利用 48 well Boyden chamber 的分析方法，lower chamber 為含有 10% FBS 的 DMEM，將細胞轉殖 NGAL 的 siRNA 或 overexpression vector 後，以 0.05%
的 trypsin-EDTA 打下所有細胞並用 trypan blue 計算細胞數，然後注入固定量的 細胞(104-1.5×104 cell/well) 於 upper chamber，待細胞移動 24 小時以後，取下 薄膜，以甲醇固定細胞 10 分鐘，風乾 5 分鐘之後，以 Giemsa (1：20)染色 1 小時，最後固定住薄膜，擦拭掉薄膜之上層細胞，在 400×顯微鏡底下每個 well 隨機選取 3 個視野，數 5 個 wells，作移動細胞數之統計。
3. NGAL 或 IFIT2 的測定
利用 western blot 測定 NGAL 或 IFIT2 的量。首先製備 12.5% SDS-PAGE 電
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泳膠片，置於電泳槽中，並加入電泳緩衝液。取 16 μl sample (蛋白總量 20 μg)，
加入 4 μl loading buffer，將 sample denature (99℃，10 min)之後再 loading 到電 泳片中，以 140 伏特進行電泳分離。大約 3 小時之後，將膠拆下後進行蛋白轉移，
將膠體置入冰冷之 transfer buffer，將預先浸濕的 NC paper 蓋在膠體上面後裝入 transfer holder ，於 4℃下，以 100 伏特進行轉漬 1 小時之後，取出 NC paper 加 入 blocking buffer ，在室溫下搖動一個小時。然後加入一級抗體 (Anti-NGAL) 於 TBS buffer ，在 4℃下反應 overnight，之後以 washing buffer (TBS+0.05% Tween 20)清洗三次，每一次 10 分鐘。接著再加入二級抗體於 TBS buffer，於室溫作用 二個小時，之後以 washing buffer 清洗三次，每一次 10 分鐘。最後加入 25 ml substrate buffer 進行呈色反應，待 NC paper 上有明顯的 band 出現，即以水終 止反應，並晾乾。
4. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
取 4 μg 的 RNA，加入適量的 DEPC-H2O (總體積為 33 μl)，以 70℃處理 5 分鐘去除 hairpin。再加入 0.25 μl (40 U/μl) RNase inhibitor，再加入 10 μl 5 倍 RT buffer 及 4 μl (2.5mM) dNTP，和 1 μl (50 pmole/μl) Oligo dT 及 1 μl (200 U/μl) RTase，在 42℃反應 1 小時之後，以 99℃作用 5 分鐘後保存於 4℃。接著取 5 μl cDNA 加入 26 µl DEPC-H2O，加入 primer-5'和 primer-3' 各 5 µl ，加入 (2.5 mM) dNTP 3.2 µ l 及 10 倍 PCR buffer 5 µl 最後再加入 DNA polymerase 0.5 µl (2 U/µl)，
置於溫度循環機 94℃1 分鐘之後，annealing 溫度 1 分鐘，72℃ 2 分鐘，共 30 個循環，最後再以 72℃反應 20 分鐘，並於 4℃保存。
5. DNA 電泳
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預先配置 2 % agarose gel，取 5 µl 的 PCR 產物加入 1 µl 的 loading dye 充份混合後。於電壓 100V，進行電泳 45 分鐘之後，以 1 µg/ml ethidium bromide 染色，再以 ddH2O 退染，於 UV 燈下分析所要的位置是否有表現。
6. 即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)分析
Real-time PCR 所使用之 PCR primer 和 TagMan MGB probe 為 Applied Biosystems。在 Primer 其 5’端標定 FAM (6-carboxyfluo-rescein) reporter florescent dye，3’端標定 MGB (minor groove binder)，此為 non-fluorescent quencher。以 StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 進行分析，25 μl 之混合反應劑內含 5μl DEPC-H2O、各 1.25 μl 之 20X 標的 primers 與 probes、12.5 μl 2X PCR master mix 和 5μl cDNA。所得之相對值根據標準濃度曲線計算各基因 mRNA 及 GAPDH mRNA 表現量。
7. 統計分析
各組實驗數據以平均值加減標準誤 (mean ± standard error )表示，統計則以 SPSS 軟體進行分析，各處理組之間在 p value 值≦0.05 時才具統計上的顯著差 異。
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結果
我們首先以三株鼻咽癌細胞 (HONE-1、NPC-39 及 NPC-BM)觀察其內生性 NGAL 的表現量。利用 RT-PCR 及 Western blot 技術得知，在鼻咽癌細胞株中，
HONE-1 的 NGAL mRNA 及蛋白表現量較高，而 NPC-BM 表現量較低 (Figure 1)。
為了觀察 NGAL 表現量在鼻咽癌細胞株所造成的影響，我們進一步將內生性 NGAL 表現量高的 HONE-1 細胞以 NGAL siRNA 系統降低其表現量，並且將 NGAL 表現量低的 NPC-BM 鼻咽癌細胞以 overexpression vector 大量表現 NGAL，
並利用 RT-PCR 及 Western blotting 的分析方式確認其結果。結果發現將內生性
NGAL 表現量高的 HONE-1 細胞轉殖 NGAL siRNA，其 NGAL 的 mRNA 及蛋白 表現的確有明顯的下降 (Figure 2A& Figure 2C)。而將 NGAL 表現量低的
NPC-BM 鼻咽癌細胞以 overexpression vector 大量表現 NGAL，其 NGAL 的 mRNA 及蛋白表現的確有明顯的上升 (Figure 2B & Figure 2D)。
接著以 Boyden chamber assay 觀察 NGAL 是否會影響鼻咽癌細胞株轉移能力，
結果顯示，處理 NGAL siRNA 後的 HONE-1 細胞株爬行能力明顯增加 (Figure
3A)，而大量表現 NGAL 的 NPC-BM 細胞株其轉移能力則是下降 (Figure 3B)。
藉由以上結果我們可以得知，NGAL 的表現量在鼻咽癌細胞中，可能藉由負調控 來影響其轉移能力。
為了進一步觀察 NGAL 在鼻咽癌細胞株中調控的下游機制，我們將處理 NGAL siRNA 的 HONE-1 細胞株及大量表現 NGAL 的 NPC-BM 細胞株，利用
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illumina RNA-sequencing 的分析方式，找出 NGAL 影響鼻咽癌轉移的下游相關基 因。比較 NGAL siRNA 的 HONE-1 細胞株及大量表現 NGAL 的 NPC-BM 細胞株 的差異基因，可以發現其中有 11 組基因 (Figure 4)。將這 11 組基因以 Heat map 方式呈現 (Figure 4)，並且搜尋文獻，發現近年有越來越多研究顯示第一型干擾 素訊息傳遞路徑與癌症的生長、轉移或致癌過程有關。其中 IFIT2 (Interferon
Induced Protein with Tetratricopeptide Repeats 2)正是與第一型干擾素訊息傳遞路 徑 (Interferon alpha/beta signaling pathway)有關的蛋白，而文獻也指出 IFIT2 與口 腔癌轉移有關。但利用西方墨點法分析方式只發現癌症轉移相關蛋白 MMP-2 在處理 NGAL siRNA 的 HONE-1 細胞中有明顯的上升 (Figure 5)，其他如上皮細 胞間質轉化 (Epithelial-mesenchymal transition; EMT)的 E-cadherin、vimentin、
MMP-9 及 IFIT-2 的 蛋 白 表 現 都 沒 有 明 顯 的 改 變 。 而 進 一 步 分 析 illumina RNA-sequencing 的數據也發現 TLR-10 在處理 NGAL siRNA 的 HONE-1 細胞中 有明顯的上升 (Figure 6)。綜合以上結果，我們的結果發現 NGAL 此蛋白表現，
在鼻咽癌細胞中，可能藉由負調控來影響鼻咽癌細胞的轉移能力，而且可能與 MMP-2 及 TLR-10 有關。
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Figure 1
Figure 1. 將三株鼻咽癌細胞株 (HONE-1、NPC-39 及 NPC-BM)，以(A) RT-PCR 方式觀察 NGAL mRNA 表現量；(B)以 Western blot 方式觀察 NGAL 蛋白表現量。
結果發現 HONE-1 細胞株的 NGAL 表現量在三株細胞中最多，而 NPC-BM 細胞 株則是表現量最少。
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Figure 2
Figure 2.將 HONE-1 細胞株以 siRNA 系統降低 NGAL 表現量之後，利用 RT-PCR 及 Western blotting 的分析方式分析 NGAL 其 mRNA 及蛋白表現量，結果發現 其(A) mRNA 及 (C) 蛋白表現量皆下降；將 NGAL 在 NPC-BM 中轉染 NGAL vector 使其大量表現，利用 RT-PCR 及 Western blotting 的分析方式分析 NGAL 其 mRNA 及蛋白表現量，結果發現到(B) mRNA 及(D)蛋白表現量皆上升；
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Figure 3
Figure 3. 以 Boyden chamber assay 發現，HONE-1 細胞株的 NGAL 表現量下降，
會促進細胞轉移能力，而 NPC-BM 大量表現 NGAL 之後，會使細胞轉移能力下 降。
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Figure 4
Figure 4. 利用 illumina RNA-sequencing 的方式，分析 NGAL 影響鼻咽癌轉移的 下游相關基因。我們更交叉比對 NGAL siRNA 的 HONE-1 細胞株及大量表現
NGAL 的 NPC-BM 細胞株的差異基因，可以發現其中有 11 組基因有顯著且一致 性的差異。利用 Heat map 繪出 11 個下游基因在兩個群體中的差異程度，其中與 癌細胞轉移相關的基因可能為 IFIT2。
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Figure 5
Figure 5. 利用西方墨點法分析方式分析 NGAL、IFIT-2、E-cadherin、vimentin、
MMP-2 及 MMP-9 在處理 NGAL siRNA 的 HONE-1 細胞及轉染 NGAL vector 的 NPC-BM 細胞的表現量。
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Figure 6
Figure 6. 利用 real time PCR 分析方式分析 TLR-10 及 CYP7A1 在處理 NGAL siRNA 的 HONE-1 細胞的表現量。
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106年度專題研究計畫成果彙整表
計畫主持人：辛宗翰 計畫編號：106-2314-B-040-014-
計畫名稱：探討嗜中性顆粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白調控鼻咽癌轉移之分子機制
成果項目 量化 單位
質化
（說明：各成果項目請附佐證資料或細 項說明，如期刊名稱、年份、卷期、起 訖頁數、證號...等）
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專書論文 0 章
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本國籍
大專生 0
人次
碩士生 0
博士生 0
博士後研究員 0
專任助理 1 蘇俊文專任助理
非本國籍
大專生 0
碩士生 0
博士生 0
博士後研究員 0
專任助理 0
其他成果
（無法以量化表達之成果如辦理學術活動
、獲得獎項、重要國際合作、研究成果國 際影響力及其他協助產業技術發展之具體 效益事項等，請以文字敘述填列。）
無
