高同源性物種之 ENG1 相關研究 - ENG1 之相關研究 - 探討剔除白色念珠菌ENG1之影響

1.4 ENG1 之相關研究

1.4.2 高同源性物種之 ENG1 相關研究

不同物種中

ENG1 之研究，在啤酒酵母菌 (S. cerevisiae) 和裂殖酵母

(Schizosaccharomyces pombe) 的 endo-1,3-β-glucanases 屬於醣基水解酶 (glycosyl hydrolases) 家族 81 (family 81, GH81)，皆發表與細胞分裂有關，剔除

ENG1 會造成細胞分裂的缺陷 (Baladrón et al., 2002; Martín-

Cuadrado et al., 2003; Coutinho et al., 1999)。

在啤酒酵母菌 (S. cerevisiae) 中，比對出其 Eng1p 和 CaEng1p 在保留 區 (conserved region) 有高達 54％同源性 (identity)，而啤酒酵母菌 ENG1 的轉錄只表現在營養性細胞中 (vegetative cells)，在孢子繁殖 (sporulation) 過程中表現量則顯著下降以致無法被偵測 (Baladrón et al., 2002)。而啤酒酵母菌有一轉錄因子

ACE2 也可活化及轉譯出和 endo-1,3-

β-glucanases 相同功能之蛋白質，研究發現 ace2 突變株中，偵測不到 ENG1 和

CTS1 (轉譯出 chitinase) 基因之表現，故認為 ENG1 轉錄需要 Ace2p，

且此現象與

CTS1 相似 (Baladrón et al., 2002; Doolin et al., 2001)。

在裂殖酵母 (S. pombe)中，Eng1p 則參與了初級中隔 (primary septum) 裂解的過程 (Martín-Cuadrado et al., 2003)。而在煙麴菌 (Aspergillus

fumigatus) 中，缺少 ENG1 轉譯之蛋白質並無造成明顯不同的表現型

(phenotype) (Mouyna et al., 2002)。

1.5 CaENG1 與 MTL 基因 (mating type like) 之研究

白色念珠菌目前尚未發現有性生殖，雖然近來研究發現白色念珠菌可進行接合作用 (mating) 以及無性生殖周期 (parasexual cycle)，但並不能進行減數分裂 (meiosis) (Hull et al., 2000; Tzung et al., 2001; Bennett and Johnson, 2003; Forche et al., 2008)。白色念珠菌雖然可經由增加 mating type locus 之變異而誘發其進行接合 (Magee and Magee, 2000; Hull et al., 2000)，但在正常生長下，極少機率進行 mating，故其基因雜交 (genetic crosses) 極具困難 (De Backer et al., 2001)。

誘發白色念珠菌進行接合作用，首先需將白色念珠菌由a/α 型態細胞轉變為a/a 或 α/α 型態之細胞：白色念珠菌在五號染色體上帶有 MTLa1 之基因，而另一條allele 則帶有 MTLα1 和 MTLα2 (Hull and Johnson, 1999)。當給予白色念珠菌山梨糖 (sorbose) 培養時，會致使白色念珠菌

失去一條五號染色體 (Janbon et al., 1998)，推測因為負調控利用山梨糖 (negative regulator of the sorbose-utilization gene) 之基因存在於五號染色體上，當減少此負調控者的表現，例如失去其中一條五號染色體，則可以使菌株生長於山梨糖培養基中 (Bennett and Johnson, 2005)。當將菌株移除山梨糖培養的環境以後，剩下的一條五號染色體將會進行複製，產生兩條相同的五號染色體，故形成基因型a/a 或 α/α 的 a-type 細胞或 α-type 細胞 (Janbon et al., 1998; Janbon et al., 1999)。

而a-type 細胞及 α-type 細胞則較容易進行 white-opaque 型態轉變，當菌株轉變為opaque 型態時，進行接合的效率約為 white 型態 10⁶倍 (Miller and Johnson, 2002)。文獻也指出，opaque 型態之細胞可分泌高表現量之毒性因子aspartyl proteinase，white 型態則無此現象 (Morrow et al., 1992)；動物實驗中則發現 white 型態細胞較 opaque 型態細胞更具毒性，

而opaque 型態則適合在感染處聚集增生 (Kvaal et al., 1997; Kvaal et al., 1999)；white-opaque 型態轉換也影響了白色念珠菌的致病機轉 (Gow, 2002; Johnson, 2003; Magee and Magee, 2004; Soll, 2004)。

Alpha pheromone 由 α opaque 細胞分泌，並影響接合初期時的 a opaque 細胞 (Miller and Johnson, 2002; Lockhart et al., 2003)。在 2006 年研究以 microarray 分析發現，在營養源不足、甘露醇 (mannitol) 作為唯一碳源之培養環境下 (SpiderM 培養基)，給予野生株 SC5314 衍生出之 opaque 狀態a/a 細胞 alpha pheromone (10 μg/ml)，其 CaENG1 表現較正常情況下 減少了三倍以上的表現量 (Bennett and Johnson, 2006; Côte and Whiteway, 2008)。而 CaENG1 與 MTL 基因之相互影響，或在 white-opaque 型態轉 變中扮演之角色目前並無研究探討。

1.6 篩選標記之介紹

研究白色念珠菌之基因功能的困難度在於：一、基因雜交 (genetic crosses) 是困難的 (De Backer et al., 2001)。二、沒有已知質體 (plasmid)，

故目前沒有較方便突變基因的方法 (Matthews et al., 1997)。三、由於是雙倍體真菌，因此剔除基因需要重覆流程 (Pla et al., 1996)。四、轉形的效率很低。先前研究常以營養性篩選標記 (ARG4, HIS1, URA3 marker) 剔除白色念珠菌標的基因 (Dennison et al., 2005)，不但要在三種不同的篩選標記上建構標的基因上下游相似序列，花費較多的時間，也因白色念珠菌沒有已知質體、轉形困難，增加了基因剔除的難度 (Matthews et al., 1997; De Backer et al., 2001)。且近年來研究發現篩選標記 URA3 會隨插入 不同基因體中的位置而有不同程度的表現量，進而影響菌株型態之變化，而剔除

URA3 的菌株則無毒性 (avirulence) (Lay et al., 1998; Staab and

Sundstrom, 2003; Kirsch and Whitney, 1991; Cole et al., 1995)。白色念珠菌 對宿主細胞之附著力及其它毒性因子也會因

URA3 表現的程度而受影響

(Bain et al., 2001)。因此以 URA3 篩選標記作為研究白色念珠菌中標的基 因之工具會無法避免

URA3 此基因在菌株內表現而帶來的影響 (Staab

and Sundstrom, 2003)。

故近年來發展適用於白色念珠菌野生株 SC5314 之篩選標記 SAT1 flipper (Reuss et al., 2004)，其所在之質體 pSFS2 上帶有白色念珠菌

caSAT1，可抗藥物 nourseothricin 以作為篩選；以及 caFLP，轉譯出蛋白

質 (site-specific recombinase) 會和 SAT1 flipper 兩端特定序列 FRT

(minimal FLP recombination target sequence) 結合，彎曲兩端 FRT 包圍之 DNA 序列並進行切除，進而將序列從基因體中 pop-out，而後只剩下一端 FRT 序列留於基因體中，此法可減少外來基因對白色念珠菌造成之影響 (Reuss et al., 2004; Wirsching et al., 2000;Luetke and Sadowski, 1995;

Shaikh and Sadowski, 2000)。而 pop-out 篩選標記另一好處，則可再重覆

使用篩選標記剔除另一股allele 之標的基因，故節省許多時間與精力。

1.7 本文之研究起源及目的

由於白色念珠菌伺機感染免疫功能不全之患者，造成嚴重症狀且有高 致死率 (Kullberg and Filler, 2002; Ruan and Hsueh, 2009 )，而近年來抗藥性菌株的產生，使得治療上更加困難 (De Backer et al., 2001)。白色念珠菌細胞壁的相關基因應是理想的藥物標的，在細胞壁中1,3-β-glucan 為主要成分之ㄧ，而β-glucan 也被研究證實與宿主的免疫機制相關

(Nakagawa et al., 2003a; Brown and Gordon, 2003)。CaENG1 之蛋白質產物 為endo-1,3-β-glucanase，裂解 β-glucan 中 1,3 共價鍵 (Esteban et al., 2005)。研究證實在不同物種中 ENG1 和細胞分裂相關 (Baladrón et al., 2002; Martín-Cuadrado et al., 2003; Esteban et al., 2005)；在酵母菌型態至 菌絲型態轉變期間

CaENG1 表現量下降 (Esteban et al., 2005)；剔除 CDC14 導致細胞分裂嚴重的缺陷，且 CaENG1 表現量顯著減少

(Clemente-Blanco et al., 2006)；剔除 SEP7，野生株侵入性生長所必須之 基因，CaENG1 表現量明顯上升 (González-Novo et al., 2008)。以上研究顯示了

CaENG1 在型態變化上的重要性。

承襲實驗室先前發表之論文，以營養篩選標記 ARG4、URA3 及 HIS1 剔除

CaENG1，結果發現 CaENG1 和篩選標記 URA3 會影響白色念珠菌

菌絲的生成：剔除

CaENG1 降低同環境下細胞菌絲的生長；而營養性篩

選標記

URA3 則會增加同環境下細胞菌絲的生長，此二者對菌絲生長出

現相反的誘因，故於結果判斷上顯得困難 (交大碩士論文謝志豪, 2006)。然而重新檢驗先前建構之 Caeng1 突變株、驗證營養性篩選標記 影響菌絲生長之程度，以及確認實驗流程之設計需耗費大量時間。

因此本論文之目的為排除營養性篩選標記 URA3 之影響，探討 CaENG1

對白色念珠菌型態變化及致病力是否相關。實驗策略為以抗藥性篩選標記剔除

CaENG1，再以南方點墨法和 RNA 表現量來檢驗突變株之建構，

之後進行突變株的性狀分析，觀察剔除

CaENG1 後的結果是否與先前之

研究相符合，以求更進一步確認

CaENG1 對白色念珠之影響為何。

二、材料與儀器

2.1 菌株 (strain)

(1) Escherichia coli (strain：DH5α)：

其基因型為

supE44△lacU169 (Φ80lacZ△M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1。

(2) Candida albicans：

菌株 (Strain) 基因型 (Genotype) 來源 (Sources) SC5314 wild-type strain (Gillum

et al.,1984)

BWP17

arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3

(Wilson et al., 1999) JKC19

cph1/cph1 EFG1/EFG1

(Liu et al.,1994)

HLC52

CPH1/CPH1 efg1/efg1

(Lo et al., 1997)

HLC54

cph1/cph1 efg1/efg1

(Lo et al., 1997)

EHK1

CaENG1/Caeng1::FRT

本實驗

EKG7

Caeng1::FRT/Caeng1::FRT

本實驗 EKP2

Caeng1::FRT/Caeng1::FRT

本實驗 EGR

Caeng1::FRT/CaENG1::FRT

本實驗 WT-1a

WT-2a WT-3a

a/a, CaENG1/ CaENG1 交大楊昀良實驗室博士生柯惠菁

菌株 (Strain) 基因型 (Genotype) 來源 (Sources) pSFS2 帶有

SAT1 marker，可抗

nourseothricin。並含 caFLP 及

pSAT1-BA pSAT1-B 質體外接 CaENG1 上 游約600 bp 的片段。

本實驗

pRes20 pSAT1-B 質體外接 CaENG1 上 pENG1A-F GCAATAGAAGCCTGCAAACTCATAAA ENG1 gene：

-863～-838 ENG1-3656-F GGCTCTGCATATTATAACGACCACGATTT ENG1 gene：

＋2656～＋2684 SAT1-860-R GCTACAACTCAGAGCACGCTAGACAAATT pSFS2 plasmid：

＋267～＋239 resA-F GGGGTACCGTCATTAACAATTGAGATGAAAAG

KpnⅠ

ENG1 gene：

-703～-680

resB-R CCCTCGAGGACATGAGTACCCAAAAGATAC XhoⅠ

ENG1 gene：

＋3706～＋3685 DSR1 GCTTCCTTTGTAATTGTAACTGCATCTG ENG1 gene：

＋747～＋719 DSR2 CCGTTGTTGTCGACACCAGCAGGAATTG ENG1 gene：

＋1375～＋1346

DS3 CCAATGGGTCTATTTCCTTTATATCG ENG1 gene：

＋785～＋810

DS4 CCAGTTCAAGTTCAGAAAGTGTTG ENG1 gene：

＋1214～＋1238

DS5 GCTGAATTGTCTGCCTTGGTTAC ENG1 gene：

＋1651～＋1674

DS6 GCCACTGTTCTGGGAAGTGTATC ENG1 gene：

＋2060～＋2081

DS7 GGTTAGTGAAATCATACAGGATGAA ENG1 gene：

＋2484～＋2508 ENG1OB-R GGTGTGCAGTAGAATGAGGAATGACATTC ENG1 gene：

＋3990～＋3962 HJL00134-F TTGAAGCGTGAGAGGCTAGGAG MTLa1 gene：

＋109～＋129 HJL00135-R ATCAATTCCCTTTCTCTTCGATTAGG MTLa1 gene：

＋595～＋570 HJL00136-F TTCGAGTACATTCTGGTCGCG MTL α1 gene：

＋56～＋76

HJL00137-R TGTAAACATCCTCAATTGTACCCGA MTLα1 gene：

＋571～＋547 ACT1-F GGATTCTGGTGATGGTGTTACTC ACT1 gene：

＋1120～＋1142 ACT1-R ACCATGTTCCCAGGTATTGC ACT1 gene：

＋1590～＋1571 FN-F GGCAACTGGTTTGTTCGTCACTT ENG1 gene：

＋2871～＋2893 FN-R CCAGTCCAGCCACTATCAACATT ENG1 gene：

＋3291～＋3268 註：灰色部分為限制酶酵素切位，底線部分為外加之核苷酸

2.4 化學藥品

z Difco laboratories

Bacto agar (Cat. No. 143175)，YPD broth (Cat. No. 235141XB)，Nutrient broth (Cat. No. 149018)，D-mannitol(Cat. No.217020，Yeast nitrogen base w/o amino acid (Cat. No. 145368)

z J.T Baker

Tris base (Cat. No. 4109-01)，Triton X-100 (Cat. No. X198-07)，

Formaldehyde (Cat. No. 15512)，3-N-Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (Cat. No. 1132612)

z Amersco：

Glycerol (Cat. No. 0854-1L-PTM)，Phenol (Cat. No. 0945-400ML) z Roche：

DIG DNA labeling mix (Cat. No. 1277065)，Anti-DIC-AP (Cat. No.

1093274)，CSPD (Cat. No. 1655884)，DIG Easy Hyb (Cat. No. 11603558 001)，Blocking reagent (Cat. No. 1096176)

z Sigma Chemical Co.

Dithiothreitol (DTT) (Cat. No. D9779)，Glassbeads (425~600 μm) (Cat. No.

G9268-500G)，Lithium acetate (CH₃COOLi) (Cat. No. L-6883) Congo red (Cat. No. C6767)

z Merck

Chloroform (Cat. No. 1.0244511000)，Dodecyl sulfate sodium (SDS) (Cat.

No. 113760.0100)，Ethanol (Cat. No. K33534874)，Potassium chloride (KCl) (Cat. No. K24252236)，Sodium acetate (Cat. No. 1.06268.0250)，Sodium hydroxide (NaOH) (Cat. No. B886298)，Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrogen chloride (Tris-Cl) (Cat. No. 8382T006)，Sodium chloride (NaCl) (Cat. No. K29779304)，Maleic acid (Cat. No. S27857)，Tween 20 (Cat. No.

P-1379)，Triton X-100 (Cat. No. K23841503) z Scharlau

LB agar (Cat. No. 01-385)，LB broth (Cat. No. 02-385) z AppliChem

Ampicillin (Cat. No. A0839) z Invitrogen

Goat serum (Cat. No. 01-6201)，SuperScript^TM One-Step RT-PCR with Platinum Taq (Cat. No. 10928-034)

z Fluka

Calcofluor white stain (Cat. No. F3397) z Werner Bioagents

Nourseothricin (Cat. No. 5.1000) z Kodak

X-film (Cat. No.1651454) z Subenzyme：

1kb DNA ladder (Cat. No. SEM11C001)

2.5 酵素 z NEB

BamHⅠ (Cat. No. R0136S)，BspEⅠ (Cat. No. R0540S)，BsrGⅠ (Cat. No.

R0575S)，EcoRⅠ (Cat. No. R0101S)，HpaⅠ (Cat. No. R0105S)，KpnⅠ (Cat. No. R0142S)，NotⅠ (Cat. No. R0189S)，SacⅡ (Cat. No. R0157S)，

XbaⅠ (Cat. No. R0145S)，XhoⅠ (Cat. No. R0146S)

2.6 藥品配製

2.6.1 培養基及培養液配製 z LB (Luria-Bertni) 培養液

1％ tryptone，0.5％ yeast extract，1％ NaCl z LB/Ampicillin 培養基

1％ tryptone，0.5％ yeast extract，1％ NaCl，1.5% agar，50 µg/ml Ampicillin

z YPD 培養液

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose z YP/Maltose 培養液

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ maltose z YPD/10％ goat serum 培養液

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose，10％ goat serum z YPD 培養基

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose，2％ Bacto-agar z YPD/nourseothricin 培養基

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose, 2％ Bacto-agar，200 μg/ml Nourseothricin

z YPD/4％ goat serum 培養基

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose，2％ Bacto-agar，

4％ goat serum

z YPD/Uridine/4％ goat serum 培養基

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose，2％ Bacto-agar，

4％ goat serum，80 mg/L uridine z Bacto agar/4％ goat serum 培養基 2％ Bacto-agar，4％ goat serum z Solid spider 培養基

1％ nutrient broth，1％ mannitol，0.2％ K₂HPO₄，1.35％ Bacto-agar z YEPS 培養基

1％ yeast extract，2％ peptone，2％ sorbose，2％ Bacto-agar 2.6.2 緩衝溶液及試劑

z 20 mM MaCl₂

0.406 g MaCl₂ dissolved in dd H₂O to 100 ml z Freezer solution

50 mM CaCl₂，15％ glycerol z 10 X Tris-EDTA (10 X TE)

100 mM Tris-Cl，10 mM EDTA (pH 7.5)

z 3 M Sodium acetate (NaOAC)

40.83 g NaOAC dissolved in dd H₂O to 100 ml (pH 7.0) z 1 M Dithiothreitol (DTT)

3.09 g DTT dissolved in 0.01 M NaOAC 20 ml，store at -20℃

z 1 M Lithium acetate (LiOAC)

20.4 g LiOAC dissolved in dd H₂O to 200 ml (pH 7.5) z 1 M Sorbitol

33.4 g sorbitol in dd H₂O to 200 ml z Breaking buffer

2％ Triton X-100，1％ SDS，0.1 M NaCl，1 X TE z Denaturation solution

0.5 M NaOH，1.5 M NaCl z Neutralization solution

0.5 M Tris-Cl，1.5 M NaCl (pH 7.5) z 20 X SSC

3 M NaCl，0.3 M Sodium citrate (pH 7.0) z Dectection buffer

0.1 M Tris-Cl，0.1 M NaCl (pH 9.5)

0.1 M Maleic acid，0.15 M NaCl (pH 7.5) z 10 X Blocking buffer

1％ (w/v) blocking reagent (Roche) dissolved in maleic acid buffer z 10％ (w/v) SDS

10 g SDS dissolved in dd H₂O to 100 ml (pH 7.2) z 10％ (w/v) Potassium hydroxide

10 g potassium hydroxide dissolved in dd H₂O to 100 ml z RNA isolation buffer (RIB)

2.5 M NaCl，0.5 M Tris-Cl，0.25 M EDTA，1％ (w/v) SDS，0.1％ DEPC (diethyl pyrocarbonate)

z 10 X MOPS (3-N-Morpholinopropanesulfonic acid)

0.2 M MOPS (pH 7.0)，20 mM sodium acetate，10 mM EDTA (pH 8.0) in DEPC-treated H₂O

2.7 儀器設備

微電腦多功能冷凍高速離心機 Cebtrifuge 5804R (eppendorf) 離心機 KUBOTA 5100 (KUBOTA CORPORATION)

微量高速冷凍離心機 Centrifuge 5415R (eppendorf) 雜交連結器 (UVITEC)

電子防潮箱DX106 (台灣防潮科技) 超純水製造機 Simplicity (MILLIPORE)

震盪器 VORTEX-GENIE2 G560 ( SCIENTIFIC INDUSTRICS ) 平面式震盪器 S-101 (FIRSTEK SCIENTIFIC)

加熱攪拌器 S101（FIRSTEK SCIENTIFIC）

乾燥加熱板 DB102（Violet BioSciences, Inc.）

酸鹼值檢測計 Φ360（BECKMAN）

電子天秤 PB153-S ( METTLER TOLEDO ) 往復式恆溫水槽 B206（FIRSTEK SCIENTIFIC）

水浴槽 B-100 (FIRSTEK SCIENTIFIC)

迴轉式震盪培養箱 721SR (WISDOM APPARATUS MFG COMPANY) 恆溫式震盪培養箱 B206（FIRSTEK SCIENTIFIC）

梯度核酸增殖儀 labcycler (SENSQUEST) 脈衝器 MicroPulser^TM (BIO-RAD)

核酸計算儀 GeneQuant pro (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) 電磁式奈米級偵測儀 ND-100 (NanoDrop)

無菌操作台 Legrand (CHERNG HUEI)

電泳影像處理系統 GEL DOC 2000（BIO-RAD）

4 ℃三門冰藏櫃 KS-101-MS ( MINI KINGKON ) -20 ℃冷凍櫃 ( WHITE-WESTINGHOUSE ) -86 ℃冷凍櫃 925/926（Forma Scientific）

倒立顯微鏡CK40 (OLYMPUS)

數位相機C-5050ZOOM (OLYMPUS) 實體顯微鏡

數位相機 K200D (PENTAX)

雷射掃瞄式共軛焦顯微鏡 (Laser Scanning Confocal Microscope) (Olympus)

三、方法與步驟

3.1 質體 DNA (plasmid DNA) 的萃取

取單一菌落培養約12～16小時後，離心1,125×g、12分鐘，去上清液。

以DNA isolation kit (Premier PM250) 萃取質體DNA。加入200 μl solution 1，混合均勻，將菌體移置新的1.5 ml 離心管，溫和反轉5次。加入200 μl solution 2，混合均勻，溫和反轉5次，等待2分鐘。再加入200 μl solution 3，

混合均勻，溫和反轉5次。迅速離心15,700×g、5分鐘，小心取上清液至spin column。離心15,700×g、1分鐘，倒掉過濾液。加入700 μl washing buffer，

離心15,700×g、1分鐘，倒掉過濾液。再加入700 μl washing buffer，離心 15,700×g、1分鐘，倒掉過濾液。Spin column 15,700×g空轉5分鐘。將spin column移置新的1.5 ml 離心管，於乾燥加熱板上65 ℃、5分鐘。以50 μl 二次無菌水或1 X TE buffer加入spincolumn中，靜置2分鐘。15,700×g、3 分鐘收下質體DNA，儲存於-20 ℃。

3.2 聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction)

以設計好之一對 primer，配合 DNA template 及 taq polymerase，可將欲得到之DNA 片段合成出來。將下列材料混合於 200 μl 微量離心管內：

3.2.1 一般 PCR 反應

1 unit (U) 的 Taq Polymerase (5 U/μl) (NEB M0267S)、10 X PCR buffer 5 μl、50 μM 的引子各 1 μl、2.5 mM dNTPs mixture 4 μl、0.1 μg 的 template DNA，補二次無菌水至總體積 50 μl，置於 PCR 溫度控制儀進行聚合酶連鎖反應。以此方法反應預計得到

CaENG1 上游 A region 及下游 B region。

3.2.2 Rescued CaENG1 PCR 反應

欲合成 CaENG1 上游之 A region 及 CaENG1 open reading frame 至下游

B region 之片段約為 4.4 kb。使用 Phusion^™High-Fidelity PCR Kit (NEB F

將離心管置於冰上30分鐘，4 ℃離心720×g、10分鐘，去上清液。加入2.5 ml預冷之0.1 M CaCl₂，置冰上1小時後可直接進行轉形。或置4 ℃ 12～16 小時後，低溫離心720×g、5分鐘，去上清液。加入2.5 ml預冷之freezer solution，混合均勻後，分裝至1.5 ml離心管，迅速儲存於 -80 ℃。（以上均為無菌操作）。

3.4 限制酶反應 (enzyme digestion)

3.4.1 確定質體 DNA 片段大小之限制酶反應

取 DNA 1 μg、1 U/kb 限制酶、10 X buffer 1 μl、10 X BSA 1 μl，補充無菌二次水至總體積10 μl，37 ℃水浴培養 1 小時，再以 0.8％洋菜膠電泳進行片段大小之分析。

3.4.2 為 clone 所需之限制酶反應

取 DNA 10μg、10 X buffer 5 μl、10 X BSA 5μl、限制酶 1 μl、補二次無菌水至總體積為50 μl，37 ℃反應 3 小時至 18 小時（依酵素特性）。反應完成後，以clean up kit (Premier CU250) 去除限制酶、buffer 及鹽類等，

所得到之DNA 片段用以進行下一步接合反應。

3.5 接合反應 (ligation)

將載體 DNA (vector DNA) 及欲插入之 DNA 片段 (insert DNA) 連結之反應條件為︰vector DNA 50～400 ng、insert DNA 和 vector DNA 莫耳濃度比為3︰1、10 X ligase buffer 1 μl、T4 DNA ligase (5 U/μl) (Fermentas EP0402) 0.4 μl，補無菌二次水至總體積 10 μl。4 ℃培養 12～16 小時，或

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