三、 方法 I
3.1 DNA 方法
3.1.6 TA cloning
使用 Promega 的 pGEM-T Easy Vector System （Cat. No. A1360）。
3.2 E. coli 轉形反應 （transformation）－熱休克法 （heat-shock）
3.2.1 製備 E. coli 轉形細胞 （competent cell）
前一天從凍管劃菌到 LB plate 以 37℃ 培養，次日用滅菌過的牙籤挑 起單一菌落培養在 2 ml LB Broth 以 37℃ 震盪培養，隔天取 1 ml 的菌液 加上 300 ml DYT 在 37℃ 震盪培養 1〜1.5 小時 （OD600＝0.4〜0.6，細 胞密度勿超過 108 cells/ml），之後至於冰上 10 分鐘 （以下操作維持在 4
℃），然後以轉速 4000 rpm 離心 10 分鐘去除上清液，加入 300 ml 50mM CaCl2 （ice-cold）輕輕的使 E.coli 重新懸浮再置於冰上 20 分鐘，接下來 以轉速 4000 rpm 離心 10 分鐘去除上清液，加入 40 ml 50 mM CaCl2 使 E.coli 重新懸浮，再加入 glycerol 使其最後濃度為 15％ （約加入 8 ml 100
％ glycerol），最後將製備好的轉形細胞以體積為 200 μl 分裝到 1.5 ml 微 離心管後存於 -80℃ 備用。
3.2.2 轉形反應
事先將黏合反應溶液置於 70℃ 乾浴槽上 15 分鐘終止黏合反應，並 將製備好的轉形細胞置於冰上解凍 （約 5 分鐘），取適當體積的黏合反應 溶液（ 小於轉型細胞體積的 10％） 加入轉形細胞中輕拍混合，置於冰上 30 分鐘後，移到 42℃ 水浴槽熱休克 1.5 分鐘，就迅速移至冰上 2 分鐘，
再加入 1 ml DYT 以 37℃ 震盪培養 1 小時，然後以轉速 8000 rpm 離心 2 分鐘吸取 1 ml 上清液丟棄，將剩下的菌液混合後用玻璃珠均勻塗於含適 當抗生素的培養基，放到 37℃ 培養箱至隔天看結果。
3.3 Candida 轉形反應－電穿孔法 (electroporation) 3.3.1 製備 Candida 轉形細胞
轉形方法是根據前人的報導所修改 (Kohler et al., 1997)。將欲轉形的菌 株養在 3 ml YPD 中於 30℃ 以轉速 150 rpm 震盪培養至隔天，再取 5 μl 轉養至 50 ml YPD 震盪培養至隔天 OD600 = 1.6~2.2，即可以轉速 5000 rpm 離心 5 分鐘收菌，之後將 pellet 重新懸浮於 1ml 10X TE buffer、1 ml 1M Litium acetate 和 8 ml ddH2O，並於 30℃ 震盪培養 1 小時後，再加入 250 μl 1M dithiothreitol (DTT) 於 30℃ 震盪培養 30 分鐘，接下來加入 40 ml ddH2O 充分混合後就離心去除上清液，將 cell pellet 以 25 ml ice-cold ddH2O 混合清洗，便在 4℃ 下以轉速 5000 rpm 離心 5 分鐘去除上清 液，以 5 ml 1M ice-cold sorbitol 清洗，再離心去上清液，加入 50 μl 1M ice-cold sorbitol 置於冰上備用。
3.3.2 轉形反應
將欲轉形的線性 DNA (2~3 μg) 和 40 ml 的轉形細胞混合均勻後，加 入已在冰上欲冷的 0.2 cm cuvette 溝槽中，輕輕 cuvette 拍打使去除氣泡和 讓細胞完全在 cuvette 底部。電穿孔條件為 1.8 KV, 200Ω, 25μF，完成後加 入 1 ml ice-cold sorbitol 沖洗，離心去除上清液加入 1 ml YPD 在 30 ℃ 震 盪培養 1 小時，便可以取適量的菌量塗於含有 200 μg nourseothricin 的
YPD plate 進行篩選，在 30 ℃ 下培養二到三天至菌落達適當大小，即挑 起劃單一菌落再進行確認。
3.4 CLSI Broth Microdilution Method (5-flucytocine: 0.125~64 μg/ml) 根據 Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, 1997) 所發佈的 M27A 說明書操作。實驗操作前須先配製適量 RPMI 1640 broth （pH7.0, Gibco BRL, Cat. No. 31800022）、無菌 0.85% NaCl，放置於 1 liter 的血清 瓶中，並裝上分注吸管後置於 4℃ 冰箱中備用。配好 2 倍濃度梯度之抗 藥性詴驗培養盤 （避光），放置於 -80℃ 冰箱中備用。
第一天
1. 自 -80℃ 冰櫃中取出標示有編號的單一菌株存菌管，用竹棒挖取少許菌 液，放到含有 1.0 ml BHI （Cat. No. 237500）的 24-well plate。置於 35℃
培養箱培養。
2. 取出所需數量的 12×75 ㎜ 玻璃詴管，以標示筆標示待測菌株編號，置於 鐵架，以鋁箔紙覆蓋後，利用高壓滅菌鍋進行滅菌，滅菌後取出備用。
3.取無菌離心管，標示待測菌株編號後，放置於鐵架上備用。
第二天
1. 至 -80℃ 冰櫃中取出適量已配製好的 2 倍濃度梯度之抗藥性詴驗培養 盤，放置於室溫下，回溫備用。
2. 取出經 24 小時 35℃ 培養的 24-well plate，利用 Pipet 混合均勻，吸 取 100 μl 菌液，加入含有 2 ml 0.85% NaCl 的玻璃詴管，以震盪器充分 混合均勻。
3. 利用 colorimeter 調整使菌液約為 0.5 McFarland （1~5×106 CFU/ml）， 過高或偏低可透過加入適量 0.85% NaCl 或菌液來調整。
4. 以震盪器充分混合均勻後, 依序以 0.85% NaCl 十倍稀釋，再二十倍稀 釋，最後以 RPMI 1640 broth 十倍稀釋。
5. 將已回溫的抗藥性詴驗培養盤標示檢體編號，將稀釋好的 RPMI 1640 broth 菌液混合均勻後，倒入無菌藥品槽，利用 12 爪 Pipet 裝上 11 支
tips，吸取 100 μl 菌液，同時加入 A 列 1~11 行 的培養盤中，第 12 行 不加菌液，為無菌操作的對照組 （注意 tip 不要沾到藥盤裡的 RPMI）。 6. 更換 tips，重複步驟 4 跟 5，依序將檢體分別加入 B~H 列。
7. 添加完畢後，蓋上抗藥性詴驗培養盤蓋子，放入 35℃ 培養箱中培養。
第三天
讀取培養盤菌液生長濃度
1. 開啟 Biotrack II plate reader 電源，於主畫面中進入 select method 中選 YEAST 後，機器會進入 YEAST 模式。
2. 啟動電腦。在桌面上點選 Bio DC 程式捷徑，開啟視窗後，點選 run，
在點選 new data 後即可讀取培養盤讀值
3. 取出已經 35℃ 培養 24 小時 的抗藥性詴驗培養盤，放在具有 96-well plate 專用承載盤的震盪器上，調整震盪速度於 2~3 之間，震盪時間約 1 分鐘。
4. 震盪均勻後，將培養盤蓋子移開，將培養盤放置於 Biotrack II plate reader 的讀取槽內。在 Biotrack II plate reader 上輸入該培養盤的編號後，接著 選點 run，則培養盤會進入機器內部，先進行 5 sec 的 pre-mix 後，再 接著讀取吸光值。讀取完畢後培養盤會退出，且在電腦程式中顯示出 96- well 的 OD 數值。
5. 將培養盤取出，並將培養盤蓋子蓋上，重複操作步驟 3、4、5 直到全部 的培養盤都讀取完成後，於 Bio DC 點選 finish 將結果匯出到 Excel 並存檔，培養盤放回 35℃ 培養箱繼續培養 24 小時。
分析結果，判讀 MIC 數值。
1. 開啟存有 OD 讀值的 Excel 檔，將所有資料轉貼到新的 Excel，再利用 Excel 的運算功能，先進行歸零減除 Blank 的運算，再運算每一 well 與 Postive (growth) control 的百分比數值。
2. 利用 Excel 中 If 函數的功能 〔if(value <=50,”R”,mic conc.)〕，在 Flucytocine 若百分比數值 >50，則顯示 R，若百分比數值 <=50 則顯示 該 well 的詴藥濃度。
3. 讀取 MIC 數值，將結果輸入資料庫中。
第四天
讀取 48 小時培養盤黴菌生長濃度，重複第三天的操作方式，讀取 MIC 數值，並將結果輸入資料庫中。Flucytocine 的 MIC 數值判讀為以 48 小 時時菌量混濁度為不加藥的正對照組的百分之五十的藥物濃度。
四、結 果 I
4.1 以 broth microdilution 分析 Candida tropicalis 的 parental strain 和 其抗藥衍生株 (derivated resistant strain) 之間對於 5-flucytosine (5-FC) 的感受性差異
將實驗室同仁柯惠菁從 E-test 藥盤所收集的 Candida tropicalis 的衍 生株 (若取兩個 isolates 編號為 R1 及 R2；只有一株則為 R) 及其 parental strain 為一組，總共 35 組 (102 株菌)，以 broth microdilution 測 minimal inhibition concentration (MIC)，並將 24 小時和 48 小時的讀值整 理於表一。圖一為 48 小時藥盤照片。結果判讀以 48 小時抑制 50％ 菌 量生長的藥物濃度為此菌株之 MIC，如果菌株的 MIC ≦ 4 μg/ml 代表對 5-FC 感 受 性 是 敏 感 的 (susceptible) ， MIC 為 8-16 μg/ml 是 中 間 性 (intermediate)，MIC ≧ 32 μg/ml 是抗藥性的 (resistant)。
雖 然 根 據 broth microdilution 的 結 果 YM020055 、 YM060051 、 YM060071 和 YM060173 這四組衍生株對 5-FC 的感受性歸類為敏感 (MIC ≦ 4 μg/ml)，但是除了 YM060051-R2 和其 parental strain 的 MIC 是 一致之外 (0.125 μg/ml)，其他的組別衍生株與其 parental strain 相較之下都 是更加地不敏感。且在全部 35 組之中，超過 80％ 組別的衍生株已達到 5-FC 抗藥的程度 (MIC ≧ 32 μg/ml)。
為了探討各組 parental strain 與衍生抗藥株之間 MIC 的差異究竟是 否受到基因層次因素的影響，以瞭解產生 5-FC 抗藥性的機制為何，於是 挑選有興趣的組別分析相關基因的序列。挑選標準為：1. 同組的 parental strain 對 5-FC 是敏感的之外，兩個 isolates-R1 及 R2 感受性為中間性和 抗藥性的 YM020438、YM060088、YM060616 這三組；2. 組內 R1 與 R2 在 24 小時的 MIC 都相同，並且 48 小時的 MIC 也很接近，但是和其他 兩 組 相 較 之 下 有 程 度 上 差 異 ( 敏 感 性 及 抗 藥 性 ) 的 YM060173 、 YM020055、YM060369 這三組；3. 組內 R1 與 R2 的 24 小時 MIC 有 差異，但是 48 小時卻都非常一致地達到抗藥程度 (MIC ≧ 64 μg/ml) 的
YM020743、YM020112 這二組；4. 組內 R1 與 R2 的 24 小時 MIC 一 致，但是組別之間有差異，並且於 48 小時卻都具有抗藥性 (MIC≧32 μg/ml) 的 YM020715、YM020347、YM020291 這三組；5. 以及其 parental strain 的 MIC 與其他組相較之下較為抗藥的 YM060800、YM060210 這二組，以上 13 組，總共 38 株菌株將分析以下基因的序列。
4.2 將有興趣組別的 URA3、FUR1、FCY1、FCY2 基因定序分析
URA3、FUR1、FCY1 及 FCY2 是涉及 pyrimidine 生合成途徑的主要 基因，希望透過這四個基因 ORF (open reading frame) 的序列分析找到敏感 性的 parental strain 和其抗藥衍生株之間的差異，來探討 C. tropicalis 對 5-FC 的抗藥機制為何，序列分析結果整理於表二和表三。
URA3 (807 nt, orotidine-5’-phosphate decarboxylase, ODCase) 的序列分 析，只有在 parental strain-YM020112 第 791 個核苷酸是 C/T 的異質合子 型 (heterozygous) ， 兩 個 抗 藥 衍 生 株 都 是 T/T 的 同 質 合 子 型 (homozygous)，造成第 264 個胺基酸由 Thr (ACC) 變成 Ile (ATC) 是有差 異的之外 (圖二 (B))，其他 12 組 parental strain 和抗藥衍生株之間序列並 無差異，在組別之間的差別則是除了 YM020347 和 YM020715 與抗藥衍 生株第 791 個核苷酸是 C/T (圖二 (A))，其他組別則都是 C/C。
分析 FUR1 (657 nt, uracil phosphoribosyl transferase, UPRT) 的結果整 理於表二，所有組別 parental strain 和抗藥衍生株沒有不同，但是組別之間 會有序列上的差異，主要在 21、93、237、501 和 507 nt 有單一核苷酸多 型性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 發生，不過這些變化都不會改變 UPRT 的胺基酸組成。FCY1 (363 nt, cytosine deaminase) 在所有組別 parental strain 和抗藥衍生株序列並沒有不同，並且所分析的 38 株菌株序 列都一致，代表 FCY1 是序列相當保守的基因。
表三為 FCY2 (1317 nt, purine-cytosine permease, PCP) 定序整理，在組 別之間主要 102、225、273、750 和 756 nt 也有單一核苷酸多型性的情形，
但是特別的是 YM020112、YM020291、YM020347、YM00743、YM060088
和 YM060800 這六組抗藥衍生株和 parental strain 序列比較後發現在抗藥 衍生株中全為同質序列，其中 parental strain 在第 273 個核苷酸是 G/T 的 異質合子型，兩股所轉譯的 PCP 在第 91 個胺基酸分別是 Met (ATG) 和 Ile (ATT) (圖三)，但抗藥衍生株從定序結果顯示失去了能轉譯出第 91 個胺 基酸為 Met 的 G 股，只留下轉譯為 Ile 的 T 股，會不會是因為這個位 置 loss of heterozygosity (LOH) 的發生造成了抗藥性的產生？為了驗證這 個假設，利用實驗室已經建立好的 SAT1 flipper 技術進行 G 股和 T 股的 置換與缺 陷性突變，得到 兩股相同的同質 合子型置換株 (homozygous recombination strain) 和單股缺陷突變株 (single allele mutation strain)，並測 詴其對於 5-FC 的感受性是否發生改變。
4.3 挑選對 5-FC 非常敏感菌株定序 FCY2 ORF 作為對照組
將在 E-test 中對 5-FC 非常敏感並且 72 小時抑菌圈沒有長出抗藥衍 生株的 YM020367、YM020649、YM060302 和 YM060559 定序 FCY2 ORF，結果整理於圖四，這四個菌株都在 273 nt 為 G/G 同質合子型。
4.4 建構 SAT1 flipper 所需質體 LOB319、LOB320、LOB321 及 LOB322 根據 FCY2 ORF 定序，用來進行 SAT1 flipper 挑選的是 parental strain 與抗藥衍生株之間 SNP 較少的 YM020291。建構同源重組 (homologous recombination) 和基因補救 (gene rescue)質體 LOB319 與 LOB320 ，以 YM020291 的 genomic DNA 為模板，分別用引子 HJL1420 和 HJL1424 夾出包含 FCY2 ORF 和上下游約 500 bp 的 A 與 B 區域，以及引子 HJL1422 和 HJL1423 夾出下游 B 區域，定序區別 G 股與 T 股後，FCY2 ORF 包含 A、B 區域利用限制酵素切位 Kpn I 和 Xho I，以及 B 區域利
4.4 建構 SAT1 flipper 所需質體 LOB319、LOB320、LOB321 及 LOB322 根據 FCY2 ORF 定序，用來進行 SAT1 flipper 挑選的是 parental strain 與抗藥衍生株之間 SNP 較少的 YM020291。建構同源重組 (homologous recombination) 和基因補救 (gene rescue)質體 LOB319 與 LOB320 ，以 YM020291 的 genomic DNA 為模板，分別用引子 HJL1420 和 HJL1424 夾出包含 FCY2 ORF 和上下游約 500 bp 的 A 與 B 區域，以及引子 HJL1422 和 HJL1423 夾出下游 B 區域，定序區別 G 股與 T 股後，FCY2 ORF 包含 A、B 區域利用限制酵素切位 Kpn I 和 Xho I，以及 B 區域利