建構篩選質體 LOB324 和 LOB325 並測詴

本實驗改造質體選用專門用來表現蛋白質的質體 LOB137 (pET-43.1a (+)-Factor Xa)，本身帶有 ampicillin 標記，並分別建構使用 kanamycin resistant gene 和 chloramphenical resistant gene (chloramphenicol acetyltransferase , CAT) 作為篩選標記 (selective marker) 的質體。因為 LOB137 在 lacI ORF 上有接入 CaNDT80 活化區隨機突變 DNA 片段所 需的切位 BstE II，所以首先必須去除之，於是設計在不改變 lacI 胺基酸的 情況下帶有想要突變序列的互補引子 HJL1461 和 HJL1462。以 LOB137 為模板，分別用引子 HJL1461 和 HJL1509 進行聚合酶連鎖反應夾取片段

一，以及引子 HJL1508 和 HJL1462 夾取片段二。再將片段一和二混合，

利用兩片段重疊互補區域，以引子 HJL1508 和 HJL1509 合成全長約 1500 bp 的片段，之後用限制酵素 Apa I 和 Sph I 切下中間約 780 bp 的部 分，再以相同的切位接進 LOB137，最後用限制酵素 BstE II 和定序 lacI ORF 確認核苷酸 632T 是否成功改變為 A (圖二十一)，所得質體命名為 LOB323。

篩選質體細部設計如圖二十二所示，chloramphenical 作為篩選標記的 質體 LOB324 建構方式是以質體 pSFS2A 為模板，利用引子 HJL1457 和 HJL1458 進行聚合酶連鎖反應夾出 CAT ORF，定序確認序列正確後，然後 以限制酵素 Nde I 和 Xho I 接進 LOB323。Kanamycin 作為篩選標記的質 體 LOB325 則是以質體 LOB64 為模板，利用引子 HJL1459 和 HJL1460 進行聚合酶連鎖反應夾出 kanamycin resistant gene ORF，定序確認序列正確 後 ，同樣地 以限制 酵素 Nde I 和 Xho I 接進 LOB323。 HJL1457 和 HJL1459 都在不影響篩選標記 ORF 的表現下，增加切位 Afl II 和 BstE II，最後以限制酵素確認結構正確 (圖二十三)。將 LOB324 和 LOB325 養 在含有適當篩選抗生素的培養基，確認質體上隨機突變片段的篩選標記具 有功能後，分別把包含 wild type 序列、missense、frameshift (deletion 和 insertion)，以及 nonsense mutation 共五種插入片段，以限制酵素切位 Afl II 和 BstE II 接入後，並轉形至 BL21 (DE3) 進行測詴。

因為 pET Expression System Vector 上的 T7 promoter 由 lac operator 所控制，所以加入 IPTG 作為 inducer，使 T7 promoter 能夠驅動後面基因 之表現。於是將 LOB324 與接入五種測詴插入片段者依序轉印複製到含有 34 μg/ml chloramphenical 加上 0.5 mM IPTG、34 μg/ml chloramphenical 加 上 1 mM IPTG 和 100 μg/ml ampicillin 的 LB 培養基中；同樣地，LOB325 與接入五種測詴插入片段者複製到含有 50 μg/ml kanamycin 加上 0.5 mM IPTG、50 μg/ml kanamycin 加上 1 mM IPTG 和 100 μg/ml ampicillin 的 LB 培養基。預計會在含有篩選插入片段用的抗生素培養基會長出菌落的有 wild type 、 missense mutation 和 空 的 質 體 (LOB324 或 LOB325) ， 在

ampicillin 培養基所有的質體都會生長，測詴結果整理於圖二十四。在 chloramphenical 作 為 篩 選 抗 生 素 的 LOB324 的 部 分 ， 在 34 μg/ml chloramphenical 加上 0.5 mM IPTG 生長狀況，如預計的含有篩選插入片段 wild type、missense mutation 和空的質體 (LOB324 或 LOB325) 均有生 長，只不過 wild type 與 missense mutation 生長狀況不如空質體 LOB324 好，並且三者生長狀況與 ampicillin 培養基比較明顯來得差。在 kanamycin 作為篩選抗生素的 LOB325 的部分，在 50 μg/ml kanamycin 加上 0.5 mM IPTG 生長狀況，只有帶有 deletion mutation 片段的不長，其餘均有零星菌 落長出，不符合預計。而且兩組都有當 IPTG 濃度增加反而會讓菌長不好 的現象，並與 ampicillin 培養基相比都明顯來得差。

為了瞭解 IPTG 是否對 BL21 (DE3)的生長造成影響，所以將 LOB324 與 LOB325，以及分別包含五種測詴插入片段者依序轉印複製到只含有篩 選用抗生素、篩選用抗生素加上 0.5 mM IPTG、只含 0.5 mM IPTG 和 100μg/ml ampicillin 的 LB 培養基上進行測詴。Chloramphenical 作為篩選 抗生素的 LOB324 的結果 (圖二十五)，顯示只有在 34 μg/ml

chloramphenical 上含有篩選插入片段 wild type 和 missense mutation 的菌 落長出，但生長狀況並不佳。在34 μg/ml chloramphenical 加上 0.5 mM IPTG 培養基上，除了質體 LOB324 有微量零星的菌落生成，其他狀況都不長，

0.5 mM IPTG 培養基與 ampicillin 培養基生長狀況一致，顯示 IPTG 並不 會抑制 BL21 (DE3) 的生長。Kanamycin 作為篩選抗生素的 LOB325 結果 (圖二十六)，顯示只有在 50 μg/ml kanamycin 上如預計的含有篩選插入片 段 wild type、missense mutation 和空質體 LOB325 均有生長，nonsense 和 insertion mutation 則有些微菌落產生，但明顯長的比前三者差，deletion 完 全不長。在 50 μg/ml kanamycin 加上 0.5 mM IPTG 培養基上，只有帶有 deletion mutation 片段的不長，其餘均有零星菌落長出，但生長狀況比起在 只有 50 μg/ml kanamycin 培養基上狀況差，0.5 mM IPTG 培養基則與 ampicillin 培養基生長狀況一致。

為了瞭解抗生素的濃度是否會影響篩選效果，於是將 chloramphenical

濃度減半為 17 μg/ml 進行 LOB324 測詴，顯示原於 34 μg/ml

chloramphenical 生長不佳之帶有 wild type 和 missense mutation 片段的菌 落因抗生素濃度降低而生長情形變好，且帶有 LOB324 空質體者也變好，

但是空質體生長狀況仍比前兩者差一些；另外，LOB325 因在 50 μg/ml kanamycin 上帶有 nonsense 和 insertion mutation 者有些微菌落產生，所以 提高 kanamycin 濃度 0.5 倍 為 75 μg/ml，希望能殺死這些非預期的菌 (圖 二十七)，結果顯示的確能抑制其生長，不過也發現與 LOB324 相同情形，

空質體生長狀況比帶有 wild type 和 missense mutation 片段的兩者差。