國立交通大學
生物科技研究所
碩士論文
熱帶念珠菌失去異質合子性導致 5-Flucytosine 抗藥性及
鑑別 CaNDT80 活化區重要胺基酸之研究
Loss of heterozygosity contributes to the resistance to
5-flucytosine in Candida tropicalis and the study of
identifying the crucial amino acids in the activation
domain of CaNDT80
研究生 : 吳佳真
指導教授 : 楊昀良博士
熱帶念珠菌失去異質合子性導致 5-Flucytosine 抗藥性及
鑑別 CaNDT80 活化區重要胺基酸之研究
Loss of heterozygosity contributes to the resistance to
5-flucytosine in Candida tropicalis and the study of
identifying the crucial amino acids in the activation
domain of CaNDT80
研究生 : 吳佳真 Student : Chia-Chen Wu
指導教授 : 楊昀良 博士 Adviser : Dr. Yun-Liang Yang
A Thesis Submitted to Institute of Biological Science and Technology National Chiao Tung University
in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science
in
Biological Science and Technology July 2009
Hsinchu, Taiwan, Republic of China
中文摘要
實驗室先前在 C. tropicalis 臨床菌株的 5-flucytosine (5-FC) 感受性測 詴中分離到抗藥衍生株。根據前人研究，破壞 pyrimidine 生合成途徑任何 一個蛋白質，或是影響其調控都會導致 5-FC 抗藥性。於是將 parental strain 與其抗藥衍生株進行相關抗藥基因 FCY1、FCY2、FUR1 和 URA3 序列分 析，發現有些 parental strains 的 FCY2 為異質合子型，但其抗藥衍生株卻 變成同質合子型。因此更進一步以 SAT1 flipper 建構 FCY2 同質合子置換 株及單股缺陷突變株，並證實失去異質合子性與 5-FC 抗藥性發生有關。 但 FCY2 失去異質合子性所造成的 5-FC 抗藥有兩個可能原因，第一， Fcy2p 第 91 個胺基酸由 Met 變為 Ile；第二，promoter 序列的變異使
FCY2 mRNA 表現量下降。
本研究第二部分與排藥幫浦 CDR1 相關，文獻指出其大量表現與 azoles 抗藥性相關，然而其調控機制目前瞭解並不多。實驗室先前於 C.
albicans genomic DNA library 中篩選到 CaNDT80 為 CDR1 可能的正向
轉錄因子。經由序列比對 CaNDT80 與 S. cerevisiae 的 ScNDT80 為同源基 因，它們的 DNA 結合區有 35％ 相同度和 53％ 相似度，有趣的是活化區 卻沒有任何相似性，這是一段全新的序列，沒有人研究過它的功能。因此 利用 error-prone PCR 在 CaNDT80 活化區產生隨機突變，建構成一個 library，想要找出哪些胺基酸對於調控 CDR1 扮演重要的角色。為了達到 這個目標，於是分別建構了以 chloramphenicol 及 kanamycin 為報導基因 的篩選性質體的 clones，用來剔除 library 中帶有 nonsense 及 frameshift mutations 的 clones，以利日後的研究。初步測詴顯示於適當濃度的抗生素 培養基中，此二質體均具有篩選功能，可作為之後的應用。
Abstract
In the laboratory, C. tropicalis clinical isolates were selected for derivatives resistant to 5-flucytosine (5-FC). Researchers have previously shown that disruption of the function of any protein involved in pyrimidine biosynthetic pathway or regulation could contribute to 5-FC resistance. Accordingly, four genes , FCY1, FCY2, FUR1 and URA3 involved in pyrimidine biosynthetic pathway was sequenced. The result revealed that some strains were heterozygous in FCY2 encoding purine cytosine permease (PCP), whereas their drug-resistant derived strains were homozygous. I further used the SAT1 flipper to generate homozygous strains and single allele mutants in FCY2 and demonstrated that the 5-FC resistance was associated with loss of heterozygosity (LOH) in C. tropicalis. According to the result, there are two possibilities of LOH in FCY2 contributing to 5-FC resistance. One was that the change of M91I in PCP was affecting the function and the other was that FCY2 mRNA expression was decreased in the resistant allele.
My second project was to study the regulation of drug resistance. Previously in the laboratory, a C. albicans genomic DNA library screening identified CaNDT80 as a positive regulator of CDR1, an efflux pump for the azole resistance in C. albicans. CaNdt80p is 672 amino acids in length and homologous to ScNdt80p (592 aa) in S. cerevisiae. There are 35% identity and 53% similarity between their DNA-binding domains. Interestingly, their
activation domains share no similarity. The sequence of the activation domain of CaNdt80p is novel and has not yet been characterized.
Hence, I have conducted a study to construct the library containing randomly mutated DNA sequences of the activation domain of CaNDT80 by error-prone PCR to identify
important residues for the function and also constructed two plasmids using chloramphenicol and kanamycin, separately, as reporters to eliminate the undesired nonsense and frameshift mutations in the library for future studies. According to testing results, reporter plasmids are potential tools with selective functions in appropriate conditions.
誌 謝 沒想到一轉眼兩年就過去了，能夠順利畢業要感謝的人很多。首先感 謝指導教授楊昀良老師和國衛院羅秀容老師，願意收留我這個沒有實驗室 經驗的新手進實驗室，兩年來在研究上細心指導與寶貴意見，啟發我獨立 思考和解決問題的能力，使我獲益良多。另外，擔任口詴委員的彭慧玲老 師，給我許多論文上的建議，使本論文能夠更完善。由於上述三位老師的 提攜，讓我順利取得學位，不勝感激。 當然實驗室的伙伴是平時支持我努力的動力。記得初到國衛院人生地 不熟，惠菁學姐幫我找落腳處和帶我熟悉環境，使我倍感窩心，學姐送我 的神秘小禮物，讓我在最後一個月實驗若有神助。還有超短程交通車司機 既準媽媽向寧、活潑開朗的美麗準新娘子瑋婷，和保養得宜完全看不出生 過小孩的琬立，沒事和你們閒聊是我最大的樂趣。才不會忘記你們的臨床 四寶：號稱有實驗神之手的大總管誌偉、夜夜笙歌總是”我是說…”的啟宏、 很愛 murmur 的 knockout king 志兆，和廚藝精湛又賢慧的德斌，謝謝你們 在我實驗有挫折的時候幫忙想辦法，平時又有娛樂的功能，讓我的研究生 生活多了很多歡笑。交大實驗室的刻苦耐勞之妳一定會成功的淑萍、溫柔 婉約的淑貞、羽球球友旻秀、老是被我調侃但脾氣好好的敏書、開朗大方 的阿毛、擁有自我風格的小倩、實驗室好媽媽兼口詴戰友的馨儀、英文一 級棒又是團購好咖的妍寧、實驗室我最美的阿澎、直率爽朗的阿大、妹妹 的老爸重延、可愛帶點迷糊的禎憶、認真好學的幸璇，以及在新竹認識的 朋友們，因為有你們使隻身在異地求學的我不寂寞。 最後，我要感謝我的家人，因為你們的支持和鼓勵，讓我無後顧之憂， 全心全意的完成學業，在此謹將此論文獻給各位，表達我無限的感謝之意。
目 錄 頁數 中文摘要 ……… i 英文提要 ……… ii 誌謝 ……… iii 目錄 ……… iv 表目錄 ……… vii 圖目錄 ……… viii 一、 緒論 I………. 1
1.1 Candidiosis 和 Candida tropicalis 介紹………. 1
1.2 常用臨床抗真菌藥物……… 2 1.3 5-flucytosine 抗藥分子機制先前研究……….. 5 1.4 論文研究目的 I………. 5 二、 材料 I………. 7 2.1 菌株……… 7 2.2 質體……… 8 2.3 引子 for C. tropicalis……… 8 2.4 藥品詴劑……… 10 2.5 緩衝溶液……… 11 2.6 培養液和培養基……… 11 2.7 儀器設備……… 12 三、 方法 I………. 14 3.1 DNA 方法……….. 14 3.1.1 大腸桿菌質體純化……… 14 3.1.2 洋菜膠內 DNA 萃取和 PCR 產物純化……… 14 3.1.3 萃取真菌 genomic DNA………... 14 3.1.4 聚合酶連鎖反應……… 14 3.1.5 DNA 黏合反應………. 15 3.1.6 TA cloning……….. 15 3.2 E. coli 轉形反應-熱休克法……….. 15 3.2.1 製備 E. coli 轉形細胞……… 15 3.2.2 轉形反應……… 16 3.3 Candida 轉形反應-電穿孔法………... 16 3.3.1 製備 Candida 轉形細胞……….. 16 3.3.2 轉形反應……… 16
四、 結果 I……….…… 20
4.1 以 broth microdilution 分 析 Candida tropicalis 的 parental strain 和其抗藥衍生株之間對於 5-flucytosine 的感受性差異……… 20
4.2 將有興趣組別的 URA3、FUR1、FCY1、FCY2 基因定 序分析……… 21
4.3 挑選對 5-FC 非常敏感菌株定序 FCY2 ORF 作為對照 組……… 22
4.4 建 構 SAT1 flipper 所 需 質 體 LOB319 、 LOB320、 LOB321 及 LOB322……… 22
4.5 建構 FCY2 (273G)/ FCY2 (273G) 和 FCY2 (273T)/ FCY2 (273T) 的同質合子置換菌株….……… 23
4.6 建構 FCY2 (273G)/ fcy△ 和 FCY2 (273T)/ fcy△ 的 單股缺陷突變株……… 24
4.7 以 broth microdilution 分析 YM020291、同質置換菌 株和單股缺陷突變株之間對 5-flucytosine 的感受性差 異……… 24 五、 討論 I……….……… 25 5.1 C. tropicalis 臨 床 分 離 株 對 於 5-FC 抗 藥 探 討……… 25 5.2 探討 URA3、FUR1、FCY1、FCY2 序列與不同物種間 5-FC 抗藥性的產生……….. 25 5.3 Loss of heterozygosity 發生機制探究與抗藥性產生的 關係……… 29 5.4 Purine-cytosine permease 在不同物種間對於抗藥性的 相關研究和蛋白質相似度……… 30 5.5 其他可能牽涉 5-FC 抗藥機制討論……… 31 六、 緒論 II……… 32 6.1 Candida albicans 介紹……….. 32 6.2 Azoles 類藥物抗藥分子機制………... 32
6.3 Candida drug resistance gene：CDR1 介紹………. 33
6.4 CDR1 的 cis-和 trans-acting factor……… 34
6.4.1 Cis-acting factor………. 34 6.4.2 Trans-acting factor……….. 34 6.5 論文研究目的 II………..…………. 36 七、 材料 II……… 37 7.1 菌株……… 37 7.2 質體……… 37
7.3 引子……… 38 7.4 藥品詴劑……… 40 7.5 緩衝溶液……… 41 7.6 培養基和培養液……… 42 7.7 濾紙……… 43 7.8 儀器設備……… 43 八、 方法 II……… 44 8.1 易誤聚合酶連鎖反應……… 44
8.2 E. coli 轉形反應－電穿孔法 library scale……… 44
8.3 啤酒酵母轉形反應－LioAc method………. 44
8.3.1 製備啤酒酵母轉形細胞……… 44
8.3.2 轉形反應……… 45
8.4 β–galactosidase colony lift filter assay……….…….. 45
8.5 從啤酒酵母中萃取質體 DNA 並轉形到 E. coli……... 46 九、 結果 II……… 47 9.1 建構 CDR1348 promoter 驅動 lacZ 為報導基因的啤酒 酵母 SLO121……… 47 9.2 以 site-directed mutagenesis 進 行 前 人 所 篩 選 CaNDT80 活 化 區 的 可 能 重 要 胺 基 酸 突 變 ， 並 以 β-galactosidase filter assay 測詴………... 48
9.3 測詴 error-prone PCR 在不同鎂離子濃度下合成錯誤 率……… 48
9.4 以 β-galactosidase filter assay 來篩選 library………… 49
9.5 建構篩選質體 LOB295 並測詴……….. 49 9.6 建構篩選質體 LOB324 和 LOB325 並測詴………… 50 十、 討論 II……… 54 10.1 以 error-prone PCR 進行隨機突變探討………….…… 54 10.2 篩選質體 LOB295 結果討論……….…. 54 10.3 篩選質體 LOB324 和 LOB325 結果討論……… 56 十一、 結論……… 59 十二、 未來展望 60 十三、 參考文獻……… 62
附錄一 pyrimidine biosynthetic pathway in Candida albicans….. 120
表目錄
頁數 表一、 5-flucytosine broth microdilution 的 24 小時與 48 小時 MIC
整理……….………....…… 71 表二、 FUR1 定序結果整理……….……..…… 73 表三、 FCY2 定序結果整理………..……… 74 表四、 有 LOH 現象的六組 FCY2 和上下游各 500bp 定序結果整 理……….…… 75 表五、 CaNDT80 活化區隨機突變 library 挑選其中 10 菌落定序結 果……….…… 76
表六、 經由 β-galactosidase filter assay 篩選的 CaNDT80 活化區隨 機突變 library 定序結果………..………….……
77 表七、 測詴篩選質體功能的 CaNDT80 活化區突變插入片段序列…. 82
圖目錄
頁數 圖一、 broth microdilution 48 小時 5-FC 藥盤照片………. 83 圖二、 YM020347、YM020715 及 YM020112 之 URA3 於核苷
酸 791 的定序波峰圖………. 88
圖三、 有 LOH 現象的六組 FCY2 ORF 於 273 nt 定序波峰圖.... 89
圖四、 對 5-FC 非常敏感菌株定序 FCY2 ORF 比對結果與定序
波峰圖………... 91
圖五、 建 構 SAT1 flipper 所 需 的 質 體 LOB319 、 LOB320 、 LOB321 及 LOB322 示意圖………. 92 圖六、 LOB319 質體的序列比對和定序波峰圖……….. 93 圖七、 LOB319、LOB320、LOB321 及 LOB322 限制內切酶圖 譜……….….. 94 圖八、 以 SAT1 flipper 建構同質合子置換株示意圖………….….. 95 圖九、 以 SAT1 flipper 建構單股缺陷突變株示意圖………….….. 96 圖十、 以 PCR 確認 SAT1 cassette 是否進入正確位子，和以限 制酵素 Bbs I 確認菌株置換與突變情形……….. 97 圖十一、 定序 YLO415、YLO416、YLO417 和 YLO418 上游區域 比對結果及定序波峰圖………... 98 圖十二、 以 broth microdilution 分析同質合子置換株和單股缺陷突 變株對 5-FC 感受性……….. 100
圖十三、 C. tropicalis 、 S. cerevisiae 和 C. albicans 的
purine-cytosine permease 蛋白質序列比對……… 101 圖十四、 質體 LOB285 建構示意圖與限制酵素圖譜………. 103 圖十五、 SLO121 建構示意圖與轉形不同質體後 β-galactosidase 活性測詴………... 104 圖十六、 CaNDT80 活 化 區 可 能 重 要 胺 基 酸 以 site-directed mutagenesis 突變定序結果………. 105
圖十七、 以 β-galactosidase filter assay 測詴 CaNDT80 活化區的
可能重要胺基酸突變是否對功能有影響……….. 106
圖十八、 error-prone PCR 在不同鎂離子濃度下合成錯誤率……….. 107 圖十九、 第三次以 β-galactosidase filter assay 篩選 CaNDT80 活
化區隨機突變 library 轉形株結果……… 108
圖二十、 篩選質體 LOB295 設計圖與限制內切酶圖譜………. 110 圖二十一、 以 fusion PCR 進行 LOB137 序列突變之結果………….. 112 圖二十二、 篩選質體 LOB324 和 LOB325 設計圖………... 113 圖二十三、 LOB324 和 LOB325 限制內切酶圖譜………. 115
圖二十四、 於不同的培養基測詴 LOB324 和 LOB325 的篩選功能... 116 圖二十五、 於不同的培養基測詴 LOB324 篩選功能……….. 117 圖二十六、 於不同的培養基測詴 LOB325 篩選功能………. 119 圖二十七、 於 不 同 濃 度 之 篩 選 抗 生 素 培 養 基 測 詴 LOB324 和
一、緒 論 I
1.1 念珠菌症 (Candidiosis) 和 熱帶念珠菌 (Candida tropicalis) 介紹
在過去二十年，念珠菌 (Candida species) 感染的數量以及嚴重性有逐 年增加的趨勢 (Weinberger et al., 1997)。念珠菌是人類常見的伺機性共生真 菌，當宿主的微生物菌相改變或免疫力低落時，就會轉成致病菌造成局部 感染 (Calderone and Frozi, 2001)，如口腔、泌尿道或生殖道，在免疫力受損 的病患 (如 AIDS、器官移植、癌症化療)，念珠菌極有機會侵犯宿主全身器 官 ， 造 成 嚴 重 的 系 統 性 感 染 (systemic infection) ， 進 而 威 脅 宿 主 生 命
(Bustamante, 2005; Georgopapadakou and Walsh, 1996)。在美國念珠菌是第四
大血液感染的病原菌，大約佔 10％ 的比例 (Edmond et al., 1999)，因此美 國每年治療念珠菌症的花費估計超過十億美元 (Miller et al., 2001)。在台 灣，國立台灣大學醫學院附設醫院統計念珠菌院內感染發生率從 1981 到 1993 增加了二十七倍 (Chen et al., 1997; Hung et al., 1996)，無疑地，念珠 菌感染已經成為公共衛生主要議題。
臨床上嚴重的念珠菌感染最主要的病原菌是 Candida albicans，但是其 他念珠菌的感染也有越來越有其重要性存在 (Rangel-Frausto et al., 1999;
van't Wout, 1996)，其中 Candida tropicalis 是亞洲太平洋地區及巴西第二大
的念珠菌病原 (Colombo et al., 2006; Pfaller and Segreti, 2006)，在台灣地區 念珠菌臨床分離株 C. tropicalis 佔有約 16~25％ 的比率，明顯高於其他地 區 (5~11％) (Ruan and Hsueh, 2009)。不像 C. albicans 是人類黏膜上的常見 共生菌，C. tropicalis 則是常常在重度真菌感染的病患中被分離出 (Horn et
al., 1985; Komshian et al., 1989)。C. tropicalis 是雙倍體子囊菌 (diploid ascomycetes)，目前只有發現利用無性生殖進行繁殖，在宿主的皮膚和腸胃 道 可 發 現 它 蹤 跡 (Odds, 1988; Rangel-Frausto et al., 1999; van't Wout, 1996)。根據地區、危險因子 (risk factor) 和研究年代的不同，約有 4％-24 ％ 的念珠菌菌血症 (candidemia)患者是因為感染 C. tropicalis 所引起
malignancies 的病患是重要的病原菌 (Abi-Said et al., 1997; Kontoyiannis et
al., 2001; Marr et al., 2000; Wingard, 1995)，大約 60％ 至 80％ 帶有 C.
tropicalis 的 neutropenia 患者最後會發展成侵入性感染 (Kontoyiannis et
al., 2001; Pfaller et al., 1987; Sandford et al., 1980)，所以在美國會預防性地給 予這些病患服用 fluconazole 來減少院內血液感染 (nosocomial bloodstream infection) 發生 (Abi-Said et al., 1997; Kontoyiannis et al., 2001)。
1.2 常用臨床抗真菌藥物 由於念珠菌與人類都是真核生物，故和人類某些生理過程相當相似。 因此大多數的抗真菌藥物容易對人體產生副作用，必須依循適當的劑量使 用，並且這些藥物往往為抑菌劑而非殺菌劑，所以藥物治療下產生選擇性 壓力使得抗藥性菌株佔有優勢。故希望透過研究念珠菌抗藥性的產生機 制，尋找適當藥物標的 (drug target)，以期做為新一代抗真菌藥物開發契機
(Berman and Sudbery, 2002)。直到現今，臨床用來治療真菌感染症的藥物根
據作用方式主要分為以下四大類：
(1) Polyenes:
有 amphotericin B、pimaricin 和 nystatin。ergosterol 是真菌細胞膜最 主要的膽固醇，與哺乳類動物的 cholesterol 類似。ergosterol 的功能是維持 細胞膜完整性 (integrity) 和流動性 (fluidity)，確保膜上蛋白質有適當功能
(Lupetti, 2002)。polyenes 類藥物會與 ergosterol 結合嵌入細胞膜，形成離
子 通 道 (ion channel) 使 胞 內 物 質 由 內 滲 出 ， 破 壞 離 子 梯 度 (proton gradient)，造成菌體死亡 (Vanden Bossche et al., 1994)。此類殺真菌劑 (fungicidal) 主要用來治療嚴重的系統性感染，不過因具有嚴重的副作用和 細胞毒性，所以臨床上以短期治療為主，因此可能與抗藥性發生率低有關。 有研究指出長期使用 amphotericin B 產生的念珠菌抗藥株與一般敏感株相 比，細胞膜的 ergosterol 含量明顯下降 (White et al., 1998)。
(2) Ergosterol biosynthesis inhibitor:
此 類 藥 物 產 生 細 胞 毒 性 較 小 ， 是 臨 床 最 常 使 用 的 抗 真 菌 藥 物 。 thiocarbamates、allylamines 和 azoles 主要與 ergosterol 合成途徑的酵素作 用 ， thiocarbamates (tolnaftate 和 tolciclate) 與 allyalmines (naftifine 和 terbinafine) 抑 制 squalene epoxidase (ERG1) 將 squalene 轉 換 成 2’3-oxidosqualene (Ryder, 1992)。azoles 類則可分成兩類，包括治療皮膚及 黏膜感染局部使用的 imidazoles (ketoconazole 和 miconazole) 與採口服或 注射治療侵入性感染的 triazoles (fluconazole、itraconazole 和 voriconazole)
(Vermitstky & Edlind, 2004)，它們的藥物標的是 ERG11 的產物, lanosterol
14α-demethylase。lanosterol 14α-demethylase 屬於 cytochrome p-450 的酵 素，以 heme moiety 作為活化中心 (Hitchcock, 1991)，如果 lanosterol 14α-demethylase 活性被 azoles 抑制會造成無法產生 ergosterol，使這個細 胞膜最主要的膽固醇耗盡，並且累積中間產物 14α-methylsterols，例如 lanosterol 和 14α-methyl-3-6-diol，抑制細胞生長 (Kelly et al., 1997)。與 imidazoles 相比之下，triazoles 因為有較好的 pharmacokinetics，更安全、 有效，所以漸漸在治療系統性感染的治療取代 imidazoles。但是由於 azoles 作用機制為抑制真菌生長而非殺菌，所以此類藥物長期治療下容易篩選出 抗藥性菌株，最早是以 ketoconazole 治療慢性黏膜皮膚念珠菌症 (chronic mucocutaneous candidiasis) 的病患中分離出 azoles 抗藥菌株 (Horsburgh &
Kirkpatrick, 1983)，之後在長期使用 azoles 藥物的後天免疫不全症候群
(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS) 病患也發現了抗藥菌株
(Rex et al., 1995; Albertson et al., 1996; Georgiev, 1998; White, 1997; Perea et
al., 2001)。
(3) Cell wall synthesis inhibitor:
雖然真菌和人類都是真核生物，但是真菌具有細胞壁是最大的差異。 真 菌 細 胞 壁 最 主 要 的 成 分 是 1, 3-β-glucan 。 echinocadins 主 要 與 1, 3-β-glucan synthase 作 用 ，抑 制細 胞壁 1, 3-β-glucan 合成 (Radding et
al.,1998)，導致細胞壁異常脆弱無法承受滲透壓力，是很有效也是最新一代
的殺真菌劑，而且對於宿主所產生的細胞毒性極小 (Georgopapadakou, 2001;
Tkacz & DiDomenico, 2001)。caspofungin 是第一個通過 US Federal Drug
Agency (FDA) 核准的此類藥物，用於臨床治療曲黴病 (aspergillosis) 和傳 播性念珠菌感染 (disseminated Candida infection) 的此類藥物，對 Candida spp. (包括對於 polyenes 和 azoles 已有抗藥性者) 都有殺菌效果，可抑制
Aspergillus spp. 生 長 (Letscher-Bru and Herbrecht, 2003) ， 目 前 還 有 micafungin 和 anidulafungin 也已核准用於臨床治療。
(4) Nucleic acid synthesis inhibitor:
5-flucytosine (5-FC) 最早在 1957 年合成用來當作抗癌藥物，但因沒有 預期抗腫瘤的效果，不過後來發現能對抗真菌後，於是在 1968 年開始用 於治療 cryptococcosis 和 candidiasis (Vermes et al., 2000)。5-FC 本身並沒 有抗真菌活性，但可透過進入 pyrimidine salvage pathway 後產生核苷酸類
似物，破壞 DNA 和蛋白質合成 (請參考附錄一)。首先 ， 5-FC 利用
purine-cytosine permease 吸收進入菌體後，隨即被 cytosine permease 去氨 基 (deamination) 轉換成能抗真菌的 5-fluorouracil (5-FU)。5-FU 透過兩種 機制達到抗真菌的效果，第一，5-FU 之後被 uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) 轉換成 5-fluorouridine monophosphate (FUMP) 和 5-fluorouridine diphosphate (FUTP)，FUTP 可取代 uridylic acid 合成 RNA，抑制蛋白質合
成 (Bennett, 1996; Scholer, 1980; Waldorf and Polak, 1983; White et al.,
1998)；第二，5-FU 代謝成 FUMP 後，還原成 uridine monophosphate pyrophosphoryl (FdUMP) ， FdUMP 會 抑 制 合 成 thymidine 的 必 要 酵 素 thymidylate synthetase ，因此 DNA 合成受阻 (Polak and Scholer, 1980;
Diasio et al.,1978)，造成真菌死亡。哺乳動物因為缺乏 cytosine deaminase ，
所 以 對 5-FC 沒 有 直 接 的 毒 性 效 應 ， 但 有 案 例 服 用 5-FC 會 有 hepatotoxicity 和 bone-marrow depression 等嚴重副作用，機制目前不清
et al., 2000)。目前 5-FC 常與 amphotericin B 或 azole 類的藥物，如 fluconazole 結合使用，減少因 5-FC 單一用藥產生抗藥性 (Sheehan, 1999)。
1.3 5-flucytosine (5-FC) 抗藥分子機制先前研究
在 S. cerevisiae 和 C. albicans 的研究下，5-FC 抗藥原因有底下幾個 可能機制：第一，pyrimidine salvage pathway 上的任一蛋白質產生突變導致 功能性缺陷，例如：purine-cytosine permease 突變可能造成 5-FC 無法運送 吸 收 進 入 菌 體 內 發 揮 作 用 ， cytosine deamease 和 uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) 突變則可能使 5-FC 不能轉換成具有抗 菌活性的代謝產物；第二，pyrimidine de novo biosynthetic pathway 中的任 一基因變異，例如：造成 URA3 的大量表現，或對受質親和力變佳，並失 去 對 UPRT (pyrimidine salvage pathway 重 要 調 控 酵 素 )負 向 回 饋 抑 制 (negative feedback inhibition) (Jund and Lacroute, 1970)，增加 UMP 合成， 與類似物 5-FUMP 進行競爭 (Hope et al., 2004; Polak, 1977)。
對 於 5-FC 抗 藥 性 的 發 生 率 根 據 物 種 的 不 同 而 有 所 差 異 。 除 了
Candida krusei 對於 5-FC 的 primary resistance 高達 28％ 外，其他念珠
菌只有小於 5％ 的發生率 (Pfaller et al., 2002)，不過在巴黎由 French National Regerence Center for Mycoses and Antifungals (NRCMA) 從血液取 得的臨床分離菌株 C. tropicalis 高達 35％，且序列分析發現 5-FC 敏感株
URA3 在 529 nt 的 位 置 不 是 A/A 就 是 A/G ， 但 是 抗 藥 株 則 是 G/G
(Desnos-Ollivier et al., 2008)，但是目前 C. tropicalis 對於 5-FC 抗藥分子機
制並沒有其他相關報導。
1.4 論文研究目的 I
實驗室同仁柯惠菁以 E-test 分析 C. tropicalis 臨床分離株 (97 株) 對 於 amphotericin B、fluconazole、voriconazole、caspofungin 和 5-flucytosine (5-FC) 五種藥物的感受性，於 48 小時在 5-FC 抑菌圈分離到抗藥衍生 株 ， 將 其 編 號 ，選 出 YM020347-R1、 YM020671-R1、 YM020743-R1、
YM060071-R1 和 YM060369-R1 再以 E-test 測詴藥物感受性，結果 5-FC 抑菌圈完全消失，顯示衍生株對 5-FC 產生抗藥性，因此本研究欲透過以 下過程來探究其機制。 (1)透過 URA3、FUR1、FCY1、FCY2 這四個基因涉及 pyrimidine 生合成 途徑 (請參考附錄一)，同時也是代謝 5-FC 使其具有抗菌活性的主要基 因，以序列分析找到敏感性的 parental strain 和其抗藥衍生株之間的遺 傳差異，來探討 C. tropicalis 對 5-FC 的抗藥機制為何。
(2)利用實驗室 SAT1 flipper 技術進行 C. tropicalis 的特定基因序列置換與 缺陷性突變，得到兩股相同的同質合子型置換株和單股缺陷突變株，並 測詴其對於 5-FC 的感受性是否發生改變，來驗證突變的存在是否與抗 藥性有關。
二、材 料 I
2.1 菌株 (strains)
1. Escherichia coli：DH5α
2. Candida tropicalis：除表一所列之臨床分離株外，以及下面所列：
No. genotype Susceptibility of
5-flucytosine
parental strain YLO415 FCY2 (273G)/FCY2 (273G) with
SAT1 cassette 0.5 μg/ml YM020291
YLO416 FCY2 (273G)/FCY2 (273G) with
SAT1 cassette 0.5 μg/ml YM020291
YLO417 FCY2 (273T)/FCY2 (273T) with
SAT1 cassette 64 μg/ml YM020291
YLO418 FCY2 (273T)/FCY2 (273T) with
SAT1 cassette 64 μg/ml YM020291
YLO419 FCY2 (273T)/fcy2△ with SAT1
cassette 64 μg/ml YM020291
YLO420 FCY2 (273G)/fcy2△ with SAT1
cassette 0.5 μg/ml YM020291
YLO421 FCY2 (273T)/fcy2△ with SAT1
cassette 64 μg/ml YM020291
3. Broth microdilution 的標準菌株 (standard controls)：
No. species Susceptibility of 5-flucytosine YLO6 (ATCC○R 6258) C. krusei 4.0~16 μg/ml
YLO7 (ATCC○R 22019) C. parapsilosis 0.12~0.5 μg/ml
2.2 質體 (plasmids)
No. 特性
LOB319 C. tropicalis FCY2 的 G 股 SAT1 flipper 同源重組和基因補救質體
LOB320 C. tropicalis FCY2 的 T 股 SAT1 flipper 同源重組和基因補救質體
LOB321 C. tropicalis FCY2 的 G 股 SAT1 flipper 基因剔除質體
LOB322 C. tropicalis FCY2 的 G 股 SAT1 flipper 基因剔除質體
2.3 引子 (primers) for C. tropicalis
Name Sequence (5’→3’) position Reference
HJL1205 ATCATTAGTTCAGATGGTAAAGTCTTG FCY1 up stream -81~-55 Desnos-Ollivier et al., 2008 HJL1206 CCTTTTTAGTAACATGTCTATTCTCCA
FCY1 down steam
25~ORF +221 HJL1207 TGCCCATAAATTAAATGCAGAA FCY2 up stream -88~-67 HJL1208 GGAAGCAACAAACCCAAAAA FCY2 ORF +650~+631 HJL1209 TGCTGCCGATTATGTTGTTT FCY2 ORF +567~+568 HJL1210 GTGAAAACGAGCCAATCCAT
FCY2 down steam
HJL1211 TCATCAAAACCATGTCTGCTG
FUR1 up stream
-11~ ORF +10
HJL1212 AAGTGTATGTAGTGATAATTGCTATGC
FUR1 down steam
83~57 HJL1413 ATTGGATAGTCCCTCTAAACTCACTACTA URA3 up stream -60~-32 HJL1414 AGCATTAGTTATATCACTCCACGATGAA URA3 ORF +366~+339 HJL1415 TGCCGATATTGGAAATACAGTTA URA3 ORF +285~+307 HJL1416 AATCAACTATTCAAGTTGACCG
URA3 down steam
6~ ORF +792 HJL1420 ggtaccTCAACTCAACCCCAAAGT FCY2 up stream -500~-483 本實驗 HJL1421 ctcgagCCCAAGGAGAAAGTAGCA FCY2 ORF +44~+27 HJL1422 CGGATTCAATGTAGCCAG FCY2 ORF +1272~+1289 HJL1423 GTCATTCCATGTCGTGGT
FCY2 down steam
441~424
HJL1424 ctcgagGTCATTCCATGTCGTGGT
FCY2 down steam
441~424
HJL1477 CTGTTGCTCCAGGTGAATCa
FCY2 down steam
554~535
2.4 藥品詴劑
Amersham Biosciences : rTaq DNA polymerase (Cat. No. 27-0798-06) BIO-RAD: 50 x TAE (Cat. No. 161-0773)
Difco laboratories :
Bacto agar (Cat. No. 214040), LB agar (Cat. No. 244520), yeast nitrogen base w/o amino acid (Cat. No. 291940), LB broth (Cat. No. 244620), YPD broth (Cat. No. 242820), BHI (Cat. No. 0037-17)
Invitrogen :
Agarose (Cat. No. 15510-027), 1kb plus DNA ladder (Cat. No. 12308-011) NEB : Calf intestinal(CIP), Restriction Enzymes
Promega : T4 DNA ligase(Cat. No. M-1801) Sigma Chemical Co. :
Dithiothreitol (DTT) (Cat. No. D9779), Disodium
ethylenediamine-tetraacetate (EDTA) (Cat. No. E-5134), Glass – beads (425~600μm) (Cat. No. G9268-500G), Histidine (Cat. No. H-8125), Lithium acetate(CH3COOLi)(Cat. No. L-6883), L-leucine (Cat. No. L-8000), Polyethylene Glycol3350 (PEG3350) (Cat. No. P4338), Uridine(Cat. No. U-3003), 5–Flucytosine (SI-F7129),
E Merck. Germany:
Chloroform (Cat. No. 1.0244511000), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Cat. No. S26740), Ethanol (Cat. No. K33534874), Ethidium bromide(Cat. No.
K27928515), Glucose (Cat. No. K33069537), N,N-dimethylformamide (Cat.No. K27226853), Potassium chloride (KCl) (Cat. No. K24252236), Isopropanol (Cat. No. K32632434), Sodium carbonate (Na2CO3) (Cat. No.
A375692), Sodium hydroxide (NaOH) (Cat.No.B886298), Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrogen chloride (Tris-HCl)
(Cat.No.8382T006), Sodium chloride (NaCl) (Cat. No. K29779304), Triton X-100 (Cat. No. K23841503)
USB:
Glycerol (Cat.No.US16374), phenol: chloroform: isoamyl alcohol (Cat. No US75831)
2.5 緩衝溶液 (buffers)
10 x TE buffer (pH 7.5 & pH 8.0):
20 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5& 8.0), 8 ml 0.25M EDTA (pH 8.0) 加無菌二 次水至體積 200 ml
10X (1 M) Lithium Acetate (LioAc):
40.8 g Lithium Acetate加無菌二次水至體積400 ml 1X TE/LioAc solution (現配現用)
1 ml 10 x TE buffer, 1 ml 1 M Lithium Acetate 加無菌二次水至體積 10 ml
2.6 培養液和培養基
DYT
1.6 g Tryptone, 1 g Yeast extract, 0.5 g NaCl 加無菌二次水水至體積 100 ml
BHI broth: (Difco, Cat. No. 0037-17)
33.7% Calf brain infusion solids, 13.5 % Beef heart infusion solids, 27 % Proteose peptone, 5.4 % Glucose, 13.5 % Sodium chloride, 6.7 % Disodium phosphate
LB (Lucia-Bertni) broth: (Difco, Cat. No. 244620) 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl
LB/ ampicillin broth:
1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 100 μg/ml ampicillin LB/ kanamycin broth:
LB/ Chloramphenicol broth:
1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 34 μg/ml Chloramphenicol SD broth: (Difco, Cat. No. 291940)
0.67% Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acid, 2 % dextrose YPD borth: (Difco, Cat. No. 242820)
2% Bacto-peptone, 1% yeast extract, 2% dextrose YPD agar
2 % Bacto-peptone, 1% yeast extract, 2% dextrose
2.7 儀器設備 程式溫度控制儀 PTC-200 (MJ Research) 迴轉式震盪培養箱 (TKS) 落地型高速離心機 J2-MC (Beckman) 桌上型高速冷凍離心機 (Heraeus) 桌上型低速冷凍離心機 ( SORVALL RT7)
微量高速離心機 DENVILLE 260D (DENVILLE SCIENTIFIC INC) 電子天平 AT261 DeltaRange (METTLER TOLEDO)
GG4002-S (METTLER TOLEDO) 加熱攪拌器 (CORNING)
酸鹼度計微電腦自動溫度 (HANNA instruments) 單槽乾浴器 (Violet Bio Sciences, Inc.)
恆溫水浴器 (CHERNG HUEI Co.)
詴管震盪器Vortex-2 genie (Scientific Industry) 全光域多功能分析系統 (Molecular Devices) 倒立顯微鏡 (OLYMPUS)
數位相機 COOLPIX 990 (Nikon)
基因脈衝儀 GENE PULSERⅡ(BIO-RAD) 往覆式細菌接種套組(Cathra)
電泳影像擷取分析系統 (Alpha Innotech Corporation) 水平式電泳槽SUB-CELL GT ( BIO- RAD)
玻璃雙門 4 ºC 冷凍櫃 (LEVEL) -30 ºC 直立式雙門冷凍櫃 (SANYO) -80 ºC 超低溫冷凍櫃 UltimaⅡ (REVCO)
三、方 法 I
3.1 DNA 方法
3.1.1 大腸桿菌 (E. coli) 質體純化
使用 Qiagen Inc 的產品 QIAprep spin miniprep kit （Cat. No. 27106、
28106），萃取出大腸桿菌的質體。要純化大量的大腸桿菌質體時，使用的
是 VIOGENE 的產品 Midi PlusTM
Ultrapure Plasmid Extraction System （Cat. No. GDV2002）。
3.1.2 洋菜膠內 DNA 萃取和 PCR 產物純化
萃取出洋菜膠內特定的 DNA 片段和純化 PCR 產物使用 Qiagen Inc 的產品 QIAprep gel extraction kit （Cat. No.28706）。
3.1.3 萃取真菌 genomic DNA
純 化 C. albicans 、 或 C. tropicalis 的 genomic DNA 用 的 是 EPICENTRE 的產品 MasterPureTM Yeast DNA Purification Kit （Cat. No. MPY80200）。
以上均依照廠商說明書操作。
3.1.4 聚合酶連鎖反應 （Polymerase Chain Reaction，PCR）
本實驗聚合酶連鎖反應所使用的 DNA 模版 （DNA template） 有質 體 DNA，或是白色念珠菌、熱帶念珠菌的 genomic DNA，利用所設計的 引子夾出所要的片段並放大之。將下列物質混合於 0.2 ml 之微離心管：總 體積為 50 μl 的反應液中加入 5 μl 的 10 X DreamTaqTM
buffer、1.25 unit DreamTaqTM DNA polymerase （5 unit/μl, Fermentas, Cat. No. EP0701）、4 μl 的 2.5 mM dNTP、1 μl 的 25 mM MgCl2、50 μM 的 Forward primer 和
Reverse primer 各 0.5 μl、DNA 模版 （0.01 ng ~ 1 ng 質體 DNA, 白色念 珠菌、熱帶念珠菌的 genomic DNA 約 0.1 ~ 1 μg）、無菌二次水。反應步驟
為：（1）95℃, 5 分鐘 （2）95℃, 30 秒 （3）50 ~ 60℃, 30 秒 （依引子 Tm
值減 5℃） （4）72℃，時間依照欲合成片段大小決定 （DreamTaqTM
DNA polymerase 合成速率 1 Kb / min） （5）重複（2）~（4）步驟 30 次 （6） 72℃, 5 分鐘 （7）4℃ 停止反應。
3.1.5 DNA 黏合反應 （DNA ligation）
黏合反應使用 EPICENTRE 的 Fast-LinkTM
DNA Ligation Kit （Cat. No.
LK6201H），以適當限制酶處理的載體 DNA （vector DNA） 和欲黏合的
DNA 片段 （insert DNA），取莫爾濃度比為載體 DNA：欲黏合的 DNA 片
段等於 1：3，加入內含 2 unit 的 DNA ligase 總反應體積為 15 μl 的反 應液中，在 16℃ 下進行黏合反應至隔天。
3.1.6 TA cloning
使用 Promega 的 pGEM-T Easy Vector System （Cat. No. A1360）。
3.2 E. coli 轉形反應 （transformation）－熱休克法 （heat-shock） 3.2.1 製備 E. coli 轉形細胞 （competent cell）
前一天從凍管劃菌到 LB plate 以 37℃ 培養，次日用滅菌過的牙籤挑 起單一菌落培養在 2 ml LB Broth 以 37℃ 震盪培養，隔天取 1 ml 的菌液 加上 300 ml DYT 在 37℃ 震盪培養 1〜1.5 小時 （OD600＝0.4〜0.6，細
胞密度勿超過 108 cells/ml），之後至於冰上 10 分鐘 （以下操作維持在 4 ℃），然後以轉速 4000 rpm 離心 10 分鐘去除上清液，加入 300 ml 50mM CaCl2 （ice-cold）輕輕的使 E.coli 重新懸浮再置於冰上 20 分鐘，接下來
以轉速 4000 rpm 離心 10 分鐘去除上清液，加入 40 ml 50 mM CaCl2 使
E.coli 重新懸浮，再加入 glycerol 使其最後濃度為 15％ （約加入 8 ml 100
％ glycerol），最後將製備好的轉形細胞以體積為 200 μl 分裝到 1.5 ml 微 離心管後存於 -80℃ 備用。
3.2.2 轉形反應 事先將黏合反應溶液置於 70℃ 乾浴槽上 15 分鐘終止黏合反應，並 將製備好的轉形細胞置於冰上解凍 （約 5 分鐘），取適當體積的黏合反應 溶液（ 小於轉型細胞體積的 10％） 加入轉形細胞中輕拍混合，置於冰上 30 分鐘後，移到 42℃ 水浴槽熱休克 1.5 分鐘，就迅速移至冰上 2 分鐘， 再加入 1 ml DYT 以 37℃ 震盪培養 1 小時，然後以轉速 8000 rpm 離心 2 分鐘吸取 1 ml 上清液丟棄，將剩下的菌液混合後用玻璃珠均勻塗於含適 當抗生素的培養基，放到 37℃ 培養箱至隔天看結果。 3.3 Candida 轉形反應－電穿孔法 (electroporation) 3.3.1 製備 Candida 轉形細胞 轉形方法是根據前人的報導所修改 (Kohler et al., 1997)。將欲轉形的菌 株養在 3 ml YPD 中於 30℃ 以轉速 150 rpm 震盪培養至隔天，再取 5 μl 轉養至 50 ml YPD 震盪培養至隔天 OD600 = 1.6~2.2，即可以轉速 5000 rpm 離心 5 分鐘收菌，之後將 pellet 重新懸浮於 1ml 10X TE buffer、1 ml 1M Litium acetate 和 8 ml ddH2O，並於 30℃ 震盪培養 1 小時後，再加入 250
μl 1M dithiothreitol (DTT) 於 30℃ 震盪培養 30 分鐘，接下來加入 40 ml ddH2O 充分混合後就離心去除上清液，將 cell pellet 以 25 ml ice-cold
ddH2O 混合清洗，便在 4℃ 下以轉速 5000 rpm 離心 5 分鐘去除上清 液，以 5 ml 1M ice-cold sorbitol 清洗，再離心去上清液，加入 50 μl 1M ice-cold sorbitol 置於冰上備用。 3.3.2 轉形反應 將欲轉形的線性 DNA (2~3 μg) 和 40 ml 的轉形細胞混合均勻後，加 入已在冰上欲冷的 0.2 cm cuvette 溝槽中，輕輕 cuvette 拍打使去除氣泡和 讓細胞完全在 cuvette 底部。電穿孔條件為 1.8 KV, 200Ω, 25μF，完成後加 入 1 ml ice-cold sorbitol 沖洗，離心去除上清液加入 1 ml YPD 在 30 ℃ 震 盪培養 1 小時，便可以取適量的菌量塗於含有 200 μg nourseothricin 的
YPD plate 進行篩選，在 30 ℃ 下培養二到三天至菌落達適當大小，即挑 起劃單一菌落再進行確認。
3.4 CLSI Broth Microdilution Method (5-flucytocine: 0.125~64 μg/ml)
根據 Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, 1997) 所發佈的 M27A 說明書操作。實驗操作前須先配製適量 RPMI 1640 broth （pH7.0, Gibco BRL, Cat. No. 31800022）、無菌 0.85% NaCl，放置於 1 liter 的血清 瓶中，並裝上分注吸管後置於 4℃ 冰箱中備用。配好 2 倍濃度梯度之抗 藥性詴驗培養盤 （避光），放置於 -80℃ 冰箱中備用。
第一天
1. 自 -80℃ 冰櫃中取出標示有編號的單一菌株存菌管，用竹棒挖取少許菌 液，放到含有 1.0 ml BHI （Cat. No. 237500）的 24-well plate。置於 35℃ 培養箱培養。 2. 取出所需數量的 12×75 ㎜ 玻璃詴管，以標示筆標示待測菌株編號，置於 鐵架，以鋁箔紙覆蓋後，利用高壓滅菌鍋進行滅菌，滅菌後取出備用。 3.取無菌離心管，標示待測菌株編號後，放置於鐵架上備用。 第二天 1. 至 -80℃ 冰櫃中取出適量已配製好的 2 倍濃度梯度之抗藥性詴驗培養 盤，放置於室溫下，回溫備用。
2. 取出經 24 小時 35℃ 培養的 24-well plate，利用 Pipet 混合均勻，吸 取 100 μl 菌液，加入含有 2 ml 0.85% NaCl 的玻璃詴管，以震盪器充分 混合均勻。
3. 利用 colorimeter 調整使菌液約為 0.5 McFarland （1~5×106 CFU/ml）， 過高或偏低可透過加入適量 0.85% NaCl 或菌液來調整。
4. 以震盪器充分混合均勻後, 依序以 0.85% NaCl 十倍稀釋，再二十倍稀 釋，最後以 RPMI 1640 broth 十倍稀釋。
5. 將已回溫的抗藥性詴驗培養盤標示檢體編號，將稀釋好的 RPMI 1640 broth 菌液混合均勻後，倒入無菌藥品槽，利用 12 爪 Pipet 裝上 11 支
tips，吸取 100 μl 菌液，同時加入 A 列 1~11 行 的培養盤中，第 12 行 不加菌液，為無菌操作的對照組 （注意 tip 不要沾到藥盤裡的 RPMI）。 6. 更換 tips，重複步驟 4 跟 5，依序將檢體分別加入 B~H 列。 7. 添加完畢後，蓋上抗藥性詴驗培養盤蓋子，放入 35℃ 培養箱中培養。 第三天 讀取培養盤菌液生長濃度
1. 開啟 Biotrack II plate reader 電源，於主畫面中進入 select method 中選 YEAST 後，機器會進入 YEAST 模式。 2. 啟動電腦。在桌面上點選 Bio DC 程式捷徑，開啟視窗後，點選 run， 在點選 new data 後即可讀取培養盤讀值 3. 取出已經 35℃ 培養 24 小時 的抗藥性詴驗培養盤，放在具有 96-well plate 專用承載盤的震盪器上，調整震盪速度於 2~3 之間，震盪時間約 1 分鐘。
4. 震盪均勻後，將培養盤蓋子移開，將培養盤放置於 Biotrack II plate reader 的讀取槽內。在 Biotrack II plate reader 上輸入該培養盤的編號後，接著 選點 run，則培養盤會進入機器內部，先進行 5 sec 的 pre-mix 後，再 接著讀取吸光值。讀取完畢後培養盤會退出，且在電腦程式中顯示出 96- well 的 OD 數值。
5. 將培養盤取出，並將培養盤蓋子蓋上，重複操作步驟 3、4、5 直到全部 的培養盤都讀取完成後，於 Bio DC 點選 finish 將結果匯出到 Excel 並存檔，培養盤放回 35℃ 培養箱繼續培養 24 小時。
分析結果，判讀 MIC 數值。
1. 開啟存有 OD 讀值的 Excel 檔，將所有資料轉貼到新的 Excel，再利用 Excel 的運算功能，先進行歸零減除 Blank 的運算，再運算每一 well 與 Postive (growth) control 的百分比數值。
2. 利用 Excel 中 If 函數的功能 〔if(value <=50,”R”,mic conc.)〕，在 Flucytocine 若百分比數值 >50，則顯示 R，若百分比數值 <=50 則顯示 該 well 的詴藥濃度。
3. 讀取 MIC 數值，將結果輸入資料庫中。 第四天
讀取 48 小時培養盤黴菌生長濃度，重複第三天的操作方式，讀取 MIC 數值，並將結果輸入資料庫中。Flucytocine 的 MIC 數值判讀為以 48 小 時時菌量混濁度為不加藥的正對照組的百分之五十的藥物濃度。
四、結 果 I
4.1 以 broth microdilution 分析 Candida tropicalis 的 parental strain 和
其抗藥衍生株 (derivated resistant strain) 之間對於 5-flucytosine (5-FC) 的感受性差異
將實驗室同仁柯惠菁從 E-test 藥盤所收集的 Candida tropicalis 的衍 生株 (若取兩個 isolates 編號為 R1 及 R2；只有一株則為 R) 及其 parental strain 為一組，總共 35 組 (102 株菌)，以 broth microdilution 測 minimal inhibition concentration (MIC)，並將 24 小時和 48 小時的讀值整
理於表一。圖一為 48 小時藥盤照片。結果判讀以 48 小時抑制 50％ 菌
量生長的藥物濃度為此菌株之 MIC，如果菌株的 MIC ≦ 4 μg/ml 代表對 5-FC 感 受 性 是 敏 感 的 (susceptible) ， MIC 為 8-16 μg/ml 是 中 間 性 (intermediate)，MIC ≧ 32 μg/ml 是抗藥性的 (resistant)。
雖 然 根 據 broth microdilution 的 結 果 YM020055 、 YM060051 、 YM060071 和 YM060173 這四組衍生株對 5-FC 的感受性歸類為敏感 (MIC ≦ 4 μg/ml)，但是除了 YM060051-R2 和其 parental strain 的 MIC 是 一致之外 (0.125 μg/ml)，其他的組別衍生株與其 parental strain 相較之下都 是更加地不敏感。且在全部 35 組之中，超過 80％ 組別的衍生株已達到 5-FC 抗藥的程度 (MIC ≧ 32 μg/ml)。
為了探討各組 parental strain 與衍生抗藥株之間 MIC 的差異究竟是 否受到基因層次因素的影響，以瞭解產生 5-FC 抗藥性的機制為何，於是 挑選有興趣的組別分析相關基因的序列。挑選標準為：1. 同組的 parental strain 對 5-FC 是敏感的之外，兩個 isolates-R1 及 R2 感受性為中間性和 抗藥性的 YM020438、YM060088、YM060616 這三組；2. 組內 R1 與 R2 在 24 小時的 MIC 都相同，並且 48 小時的 MIC 也很接近，但是和其他 兩 組 相 較 之 下 有 程 度 上 差 異 ( 敏 感 性 及 抗 藥 性 ) 的 YM060173 、 YM020055、YM060369 這三組；3. 組內 R1 與 R2 的 24 小時 MIC 有 差異，但是 48 小時卻都非常一致地達到抗藥程度 (MIC ≧ 64 μg/ml) 的
YM020743、YM020112 這二組；4. 組內 R1 與 R2 的 24 小時 MIC 一 致，但是組別之間有差異，並且於 48 小時卻都具有抗藥性 (MIC≧32 μg/ml) 的 YM020715、YM020347、YM020291 這三組；5. 以及其 parental strain 的 MIC 與其他組相較之下較為抗藥的 YM060800、YM060210 這二組，以上 13 組，總共 38 株菌株將分析以下基因的序列。
4.2 將有興趣組別的 URA3、FUR1、FCY1、FCY2 基因定序分析
URA3、FUR1、FCY1 及 FCY2 是涉及 pyrimidine 生合成途徑的主要 基因，希望透過這四個基因 ORF (open reading frame) 的序列分析找到敏感 性的 parental strain 和其抗藥衍生株之間的差異，來探討 C. tropicalis 對
5-FC 的抗藥機制為何，序列分析結果整理於表二和表三。
URA3 (807 nt, orotidine-5’-phosphate decarboxylase, ODCase) 的序列分
析，只有在 parental strain-YM020112 第 791 個核苷酸是 C/T 的異質合子 型 (heterozygous) ， 兩 個 抗 藥 衍 生 株 都 是 T/T 的 同 質 合 子 型 (homozygous)，造成第 264 個胺基酸由 Thr (ACC) 變成 Ile (ATC) 是有差 異的之外 (圖二 (B))，其他 12 組 parental strain 和抗藥衍生株之間序列並 無差異，在組別之間的差別則是除了 YM020347 和 YM020715 與抗藥衍 生株第 791 個核苷酸是 C/T (圖二 (A))，其他組別則都是 C/C。
分析 FUR1 (657 nt, uracil phosphoribosyl transferase, UPRT) 的結果整
理於表二，所有組別 parental strain 和抗藥衍生株沒有不同，但是組別之間
會有序列上的差異，主要在 21、93、237、501 和 507 nt 有單一核苷酸多 型性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 發生，不過這些變化都不會改變 UPRT 的胺基酸組成。FCY1 (363 nt, cytosine deaminase) 在所有組別 parental strain 和抗藥衍生株序列並沒有不同，並且所分析的 38 株菌株序 列都一致，代表 FCY1 是序列相當保守的基因。
表三為 FCY2 (1317 nt, purine-cytosine permease, PCP) 定序整理，在組 別之間主要 102、225、273、750 和 756 nt 也有單一核苷酸多型性的情形， 但是特別的是 YM020112、YM020291、YM020347、YM00743、YM060088
和 YM060800 這六組抗藥衍生株和 parental strain 序列比較後發現在抗藥 衍生株中全為同質序列，其中 parental strain 在第 273 個核苷酸是 G/T 的 異質合子型，兩股所轉譯的 PCP 在第 91 個胺基酸分別是 Met (ATG) 和
Ile (ATT) (圖三)，但抗藥衍生株從定序結果顯示失去了能轉譯出第 91 個胺
基酸為 Met 的 G 股，只留下轉譯為 Ile 的 T 股，會不會是因為這個位 置 loss of heterozygosity (LOH) 的發生造成了抗藥性的產生？為了驗證這 個假設，利用實驗室已經建立好的 SAT1 flipper 技術進行 G 股和 T 股的 置換與缺 陷性突變，得到 兩股相同的同質 合子型置換株 (homozygous recombination strain) 和單股缺陷突變株 (single allele mutation strain)，並測 詴其對於 5-FC 的感受性是否發生改變。
4.3 挑選對 5-FC 非常敏感菌株定序 FCY2 ORF 作為對照組
將在 E-test 中對 5-FC 非常敏感並且 72 小時抑菌圈沒有長出抗藥衍 生株的 YM020367、YM020649、YM060302 和 YM060559 定序 FCY2
ORF，結果整理於圖四，這四個菌株都在 273 nt 為 G/G 同質合子型。
4.4 建構 SAT1 flipper 所需質體 LOB319、LOB320、LOB321 及 LOB322
根據 FCY2 ORF 定序，用來進行 SAT1 flipper 挑選的是 parental strain 與抗藥衍生株之間 SNP 較少的 YM020291。建構同源重組 (homologous recombination) 和基因補救 (gene rescue)質體 LOB319 與 LOB320 ，以 YM020291 的 genomic DNA 為模板，分別用引子 HJL1420 和 HJL1424 夾出包含 FCY2 ORF 和上下游約 500 bp 的 A 與 B 區域，以及引子 HJL1422 和 HJL1423 夾出下游 B 區域，定序區別 G 股與 T 股後，FCY2 ORF 包含 A、B 區域利用限制酵素切位 Kpn I 和 Xho I，以及 B 區域利 用 Sac II 和 Sac I 接入 pSFS2A，如圖五所示，質體 LOB319 為 G 股序 列，質體 LOB320 為 T 股序列。質體定序只列出質體 LOB319 的部分結 果，因為 LOB319 在 FCY2 ORF 第 1143 個核苷酸從 T 突變成 G，密碼
以限制酵素圖譜確認質體建構整體上是否正確，結果於圖七 (A)，片段大小 都符合預計。
建構基因剔除 (gene knockout) 質體 LOB321 與 LOB322，則是分別 用引子 HJL1420 和 HJL1421 夾出包含 FCY2 上游約 500 bp 的 A 區 域，以及引子 HJL1422 和 HJL1423 夾出下游 B 區域，定序區別 G 股與 T 股後，A 區域利用限制酵素切位 Kpn I 和 Xho I，以及 B 區域利用 Sac II 和 Sac I 接入 pSFS2A，如圖五所示，質體 LOB321 為 G 股序列，質
體 LOB322 為 T 股序列。最後以限制酵素圖譜確認質體結構，結果於圖
七 (B)，片段大小都符合預計。
由於建構質體過程中，定序發現 FCY2 不只有 ORF 有 SNP，上游 -69、-224 和下游 201 nt 也有 SNP 位置，於是定序其抗藥衍生株上下游
片段，確認是否也是 LOH 範圍，並與其他五組的定序結果一起整理於表
四，結果顯示這六組 LOH 的區域涵蓋了 FCY2 ORF 及其上下游。
4.5 建構 FCY2 (273G)/FCY2 (273G) 和 FCY2 (273T)/FCY2 (273T) 的同
質合子 (homozygous) 置換菌株
將 LOB319、LOB320 以 Kpn I 和 Sac I 切下包含 FCY2 序列和
SAT1 cassette 的片段，純化後轉形至 YM020291 進行置換，如圖八所示。
經由 nourseothricin 篩選所得之菌株以 SAT1 cassette 上的引子 HJL814 和 B 區域更下游的 HJL1477 確認 SAT1 cassette 是否進入正確的位子後
(圖十 (A))，利用引子 HJL1207 和 HJL1210 夾出 FCY2 ORF，再以限制
酵素 Bbs I 確認 (辨認序列為 GAAGAC) 是否在第 273 核苷酸是否置換 成 G/G 或 T/T 的同質合子型 (圖十 (B))，將所得之 FCY2 (273G)/FCY2
(273G) 菌株命名為 YLO415 和 YLO416，FCY2 (273T)/FCY2 (273T) 命名
為 YLO417 和 YLO418。之後定序確認上游 -69、-224 的 SNP 位置是否
4.6 建構 FCY2 (273G)/fcy2△ 和 FCY2 (273T)/fcy2△ 的單股缺陷突變株
將 LOB321、LOB322 以 Kpn I 和 Sac I 切下包含 FCY2 上下游和
SAT1 cassette 的片段，純化後並轉形至 YM020291 進行 FCY2 基因剔除，
如圖九所示。經由 nourseothricin 篩選所得之菌株以 SAT1 cassette 上的引 子 HJL814 和 B 區域更下游的 HJL1477 確認 SAT1 cassette 是否進入正 確的位子後 (圖十 (A))，利用引子 HJL1207 和 HJL1210 夾出剩下那一股
FCY2 ORF ，再以限制酵素 Bbs I 確認被剔除的是 G 股還是 T 股後 (圖
十 (B)) ， 將 所 得 之 FCY2 (273G)/fcy2△ 菌 株 命 名 為 YLO420 ， FCY2
(273T)/fcy2△ 命名為 YLO419 和 YLO421。
4.7 以 Broth microdilution 分析 YM020291、同質置換菌株和單股缺陷突
變株之間對 5-flucytosine 的感受性差異
將以上所得之 FCY2 (273G)/FCY2 (273G) 和 FCY2 (273T)/FCY2 (273T) 的同質置換株、FCY2 (273G)/fcy2△ 和 FCY2 (273T)/fcy2△ 的單股缺陷突 變株，以及 parental strain YM020291、抗藥株 YM020291-R1 和
YM020291-R2 以 Broth microdilution 分析 MIC 藥盤照片和 MIC 值整理 於圖十二。FCY2 (273G)/FCY2 (273G)的 YLO415、YLO416，和
FCY2(273G)/fcy2△ 的 YLO420 的 MIC 讀值雖然與 YM020291 一致為
0.5 μg/ml，但是可從圖十二發現 YLO415、YLO416 和 YLO420 在第三行 長的菌量比 YM020291 少，代表此三菌株對於 5-FC 比 parental strain 更 敏感。另外 FCY2 (273T)/FCY2 (273T) 的 YLO417、YLO418，和 FCY2 (273G)/fcy2△ 的 YLO419、YLO421 的 MIC 和抗藥株 YM020291-R1、 YM020291-R2 不是大於 64 μg/ml，就是等於 64 μg/ml，對於 5-FC 都具 有抗藥性的。
五、討 論 I
5.1 C. tropicalis 臨床分離株對於 5-FC 抗藥探討
柯惠菁以 E-test 分析 C. tropicalis 臨床分離株對於藥物的感受性，36 ％ (35/97) 可以在 5-FC 抑菌圈分離到抗藥衍生株，比例上相當高。表示 C.
tropicalis 很容易對 5-FC 產生抗藥性 (in vitro)，在臨床上也因為真菌感染
5-FC 單一用藥容易造成抗藥性，所以 5-FC 常與 amphotericin B 或者 azole 類的藥物，如 fluconazole 結合使用 (Sheehan, 1999)。在本實驗中， 將 parental strain 長於 E-test 藥盤上， 48 小時後在 5-FC 抑菌圈裡就可以 很清楚看到衍生株菌落的產生，甚至有些菌株在 24 小時就可以看到菌 落。有可能是當 C. tropicalis 在 5-FC 的藥物篩選壓力下，48 小時之內就 可以啟動已存在的抗藥機制來做反應，或者有些抗藥性突變株早已存在於 自然族群中，現在經由藥物篩選出。之後將所收集的衍生株以及其 parental strain 總共 102 株菌 (35 組) 進行 MIC 分析，比較每一組對 5-FC 感受 性的差異，發現所有的 parental strain 都是屬於敏感性的，但是超過 80％ 組 別的衍生株已達到抗藥的程度 (MIC ≧ 32 μg/ml)，所以無論機制為何，C. tropicalis 對於 5-FC 是能有效地達到抗藥的結果。 5.2 探討 URA3、FUR1、FCY1、FCY2 序列與不同物種間 5-FC 抗藥性 的產生 根據 MIC 結果挑選有興趣的 13 組（38 個菌株，表一編號以紅色底 線標示者），並將挑選原則詳細列於結果 4.1。根據前人研究 pyrimidine de novo pathway 中的基因變異，例如：造成 URA3 的大量表現，或對受質親 和力變佳，會增加 UMP 合成，與 5-FC 的代謝物進行競爭，這是可能的 抗藥機制之一 (Hope et al., 2004; Polak, 1977)。以及 UV 處理 C. albicans
(Fasoli and Kerridge, 1988) 和 Saccharomyces cerevisiae (Jund and Lacroute,
1970) 的實驗顯示，發現破壞任何與 pyrimidine salvage pathway 上相關蛋 白 質 或 是 影 響 其 相 關 調 控 會 對 5-FC 產 生 抗 藥 性 ， 所 以 我 們 就 從
pyrimidine de novo pathway 的 URA3 和 salvage pathway 的 FUR1 、
FCY1、FCY2 這四個基因進行序列分析
首先，URA3 (orotidine-5’-phosphate decarboxylase, ODCase) 的結果只有 YM020112 在第 791 個核苷酸是 C/T 的異型合子，其抗藥衍生株 R1 和 R2 都是 T/T 的同型合子，分別在 ODCase 第 264 個胺基酸為 Thr (ACC) 和 Ile (ATC) 是有差異，其他組 parental strain 與抗藥衍生株之間序列一 致，組別之間的差別則是除了 YM020347 和 YM020715 與其抗藥衍生株 第 791 個核苷酸是 C/T 之外，其他組別則都是 C/C。至於核苷酸 791 的 改變是否對於 URA3 功能有影響，故造成對 5-FC 感受性變化，有待更多 的證據。URA3 的相關研究，由 Desnos-Ollivier 等人分析所收集的 C.
tropicalis 臨床菌株時，發現 5-FC 敏感株在 529 nt 的位置不是 A/A 就是
A/G，但是抗藥株則是 G/G (Desnos-Ollivier et al., 2008)，但是本實驗的菌 株無論是敏感株或是抗藥衍生株都是 A/A 的同型合子型，並沒有發現相同 的狀況。
FUR1 (uracil phosphoribosyl transferase, UPRT) 分析結果顯示所有組別
parental strain 和抗藥衍生株之間沒有不同，但是組別之間主要在 21、93、 237、501 和 507 核苷酸位置有 SNP 的差異，但是這些變化不會改變 UPRT 的胺基酸組成，將這些 SNP 差異和分離出菌株的醫院與採集的部位，如血 液、尿液做比較，沒有找到任何關連。UPRT 在 C. tropicalis 目前沒有相 關的研究文獻，但在 S. cerevisiae 中 UPRT 胺基酸 134 被報導過和 5-FC 抗藥性有關連 (Kern et al,. 1991)，在 C. albicans 有研究指出，在同源位置 核苷酸 301 的位置是同型合子型 C/C 對 5-FC 是敏感的，異型合子型 C/T 較不敏感，T/T 則會有抗藥性 (Dodgson et al, 2004)，同年 Hope 等人的研 究也指出在相同位置胺基酸 101 由 Arg (CGT) 被置換成 Cys (TGT) 與 5-FC 抗藥性有關。根據 Toxoplasma gondii 的 UPRT 3D 結晶結構所提供的 訊息 (Schumacher et al., 1998, and 2002)，推測 C. albicans 的 UPRT 胺基 酸 Arg101 可 能 與 Asp36 產 生 鹽 橋 (salt bridge) 後 ， 以 靜 電 力 (electrostatic force) 形成二聚體 (dimer)，再聚合成四聚體 (tetramer)，才使
UPRT 有適當酵素活性，所以如果 Arg101 被取代成 Cys 則無法與 Asp36 產生鹽橋 (Hope et al., 2004)。
FCY1 (cytosine deaminase) 在 38 株菌中的序列完全一致，表示這個基
因是非常保守的。在 Candida lusitaniae 的研究發現 FCY1 核苷酸 26T 置 換為 C，產生 missense mutation 使第 9 個胺基酸由 Met 變成 Thr，會對 5-FC 產生抗藥性 (Florent et al., 2009)，另外，同一個團隊研究 FCY2 突變 也有相同結果，而且當 5-FC 和 fluconaolze 同時存在時，不管 FCY1 或 是 FCY2 的突變都會產生交互抗性 (cross-resistance)，推測可能的機制是在
細 胞 之 外 5-FC 是 fluconaolze 運 送 吸 收 的 競 爭 抑 制 物 (competitive inhibitor) (Chapeland-Leclerc et al., 2005; Papon et al., 2007)，在 C. tropicalis 是否有相同競爭現象需要更進一步研究。
最後是 FCY2 (purine-cytosine permease, PCP) 序列分析，在組別之間 ORF 主要在 102、225、273、750 和 756 nt 發現有差異，比較不一樣的是 組 別 YM020112 、 YM020291 、 YM020347 、 YM020743 、 YM060088 和 YM060800 這六組抗藥衍生株和 parental strain 序列比較後，在抗藥衍生株 中發現原本的 SNP 消失，變成同質序列，發生了 Loss of heterozygosity (LOH) 的現象。在 102、225、750 和 756 nt 的 SNP 差異不會造成 PCP 胺 基酸組成改變，但是原本在第 273 個核苷酸是 G/T 的異質合子型的 parental strain，所轉譯的 PCP 在第 91 個胺基酸分別是 Met (ATG) 和 Ile
(ATT)，而抗藥衍生株從定序結果顯示只有轉譯為 Ile 的 T 股序列，會不 會是因為 T 股轉譯的 PCP 在第 91 個胺基酸的突變造成功能性的影響， 以致於產生抗藥？另外，也將這六組定序 FCY2 上下游 500 bp 找到各有 5 個和 1 個 SNP，所以也有可能因為 T 股的 promoter 上面的訊號區突 變造成 FCY2 mRNA 的表現量下降，造成其基因產物 PCP 產量不足，使 得 5-FC 無法經由 PCP 運送進入菌體內代謝達到抗菌效果，因此產生抗藥 性。 為了驗證 FCY2 的 LOH 現象與 5-FC 抗藥性有關，挑選抗藥衍生株 與 parental strain 之間 SNP 差異較少的 YM020291 (表四)，以 SAT1
flipper 進行 G 股和 T 股同源重組置換與單股缺陷性突變，得到兩股相同 的同質合子型置換株和單股缺陷突變株，測詴對 5-FC 的感受性。結果如
圖 十 二 所 示 ， 發 現 FCY2 (273G)/ FCY2 (273G) 同 質 置 換 株 和
FCY2(273G)/fcy2△ 單股缺陷突變株比 YM020291 更敏感一點，至於 FCY2
(273T)/FCY2 (273T) 同質置換株和 FCY2 (273T)/fcy2△ 單股缺陷突變株則 是比 YM020291 更加地抗藥 (≧ 64 μg/ml)，故抗藥衍生株不論是在 G 股 發生缺失了包含 FCY2 的部分片段，或者是因為 recombination 將 G 股置 換成 T 股，都能因此得到抗藥性，證實了 FCY2 的 LOH 現象與 5-FC 抗 藥性有關。由於定序同質合子型置換株的上游序列確認置換範圍，結果都 有置換到上游 -69、-224 的 SNP 位置，因此 FCY2 的 LOH 產生抗藥的 原因則有兩種可能：第一，T 股轉譯的 PCP 在第 91 個胺基酸變成 Ile， 可能造成功能性突變，例如：使 PCP 失去運送 5-FC 的能力；第二，T 股 上游的 SNP 為 promoter 訊號區，因為突變造成 FCY2 mRNA 的表現量下 降，使 5-FC 無法經由 PCP 運送進入菌體。因此 FCY2 (273G)/FCY2 (273G) 和 FCY2(273G)/fcy2△會比 YM020291 (FCY2 (273G)/FCY2 (273T)) 更敏感 的原因，可能是他們 FCY2 所產生的 PCP 具有正常功能，或是 FCY2 mRNA 表現量正常。針對 FCY2 上游 -69、-224 的 SNP 位置是否位於可 能的調節序列中，如 TATA box (5’-TATA(A/T)A(A/T)(A/G)-3’) (Basehoar et
al., 2004) ， 經 比 對 發 現 -314~-307 有 可 能 是 TATA box ， 序 列 為
5’-TATATATA-3’，但 -69、-224 則不在已知調節序列中。
本實驗序列分析之 13 個 parental strains 將 URA3、FUR1、FCY1 及
FCY2 序列的 SNP 位置差異與菌株分離的來源區域進行統整比較，沒有發
現兩者之關連性。另外，挑選在 E-test 對 5-FC 非常敏感並且 72 小時抑 菌 圈 沒 有 長 出 抗 藥 衍 生 株 的 YM020367 、 YM020649 、 YM060302 和 YM060559 定序 FCY2 ORF 做為對照，發現他們都是在 273 為 G/G 同質 合子型。所以推測這些菌株對 5-FC 如此敏感的可能原因，也許是因為在 藥物篩選下即使 LOH 機制啟動，但因他們只有 G 股，沒有 T 股可作為 置換模版，因此無法產生抗藥衍生株。
5.3 Loss of heterozygosity (LOH) 發生機制探究與抗藥性產生的關係
最早在某些癌症高危險群中發現他們在癌症相關基因為異型合子型 (heterozygosity)，例如 tumor suppressor，原本一股 (wild type allele) 有正常 功能，但另一股 (non-functional allele) 因突變失去功能，可能在 wild type allele 發 生 了 chromosome loss 或 缺 失 了 部 分 片 段 ， 也 可 能 因 為 recombination 將 wild type allele 置換成 non-functional allele，於是細胞不 正常增生，故導致癌症發生，以上的基因變化，稱為 Loss of heterozygosity (LOH) (Cavenee et al., 1983; Carr and Gottschling, 2008)。在 C. albicans 有研 究指出 LOH 與 azloe 抗藥性有關。Azole 類藥物 efflux pump-CDR1、
CDR2 的 轉 錄 因 子 Tac1 ， 因 為 LOH 讓 兩 股 變 成 hyperactive mutated
alleles，使 CDR1 和 CDR2 大量表現，或者是 LOH 發生在同樣的位於 chromosome 5 上的 azole 標的基因 ERG11 導致兩股為 mutant allele，使 藥 物 無 法 與 其 結 合 作 用 (Coste et al., 2007) ， 以 及 在 另 一 個 efflux pump-MDR1 的轉錄因子 MRR1 也發生 LOH 造成 azole 抗藥 (Dunkel et
al., 2008)。
LOH 發 生 的 原 因 可 能 是 gene conversion 、 allelic recombination/ break-induced replication，或者是 chromosome loss 和 reduplication 所導致
(Coste et al., 2007)，這些過程與 DNA repair 相關。Legrand et al. 將 C.
albican 中與 mismatch repair (MMR) (MEH1、PMS1) 和 double-strand break
repair (DSBR) (MRE11、RAD50、RAD52、YKU80) 的相關基因剔除，研究 指出 MMR mutant (msh2△/msh2△、pms1△/ pms1△) 和 DSBR mutant (rad50△/ rad50△) 在 fluconazole 的 E-test 抑菌圈產生抗藥菌落的頻率 增加，Legrand et al. 研究顯示 DNA repair pathway、genome instability 與藥 物抗藥性是彼此連結的 (Legrand et al., 2007)。因此在本實驗於 FCY2 發現 有 LOH 現象之菌株也許在 DNA repair 的機制有缺陷，故造成 genome 的不穩定，使得 LOH 發生，這可做為未來研究的方向之一。
5.4 Purine-cytosine permease (PCP) 在不同物種間對於抗藥性的相關研究
和蛋白質相似度
Purine-cytosine permease (PCP) 可 運 送 adenine 、 hypoxanthine 和 cytosine，以 proton gradient 作為運送物質能量 (Vanden Bossche et al., 1987)，5-FC 則是 cytosine 類似物 (fluorinated analogue)，也可被 PCP 所 運送，是 cytosine 的 competitive antagonist (Polak and Grenson, 1973)。在 S.
cerevisiae 中已有研究指出 FCY2 發生突變會造成 5-FC 抗藥性 (Jund and
Lacroute, 1970; Chevallier et al., 1975)，並且 Paluszynski et al. 發現 FCY2
突變株只在 5-FC 濃度低時有抗藥性，濃度高還是會抑制生長，表示可能 還有其他 5-FC 吸收途徑存在，於是找到同樣位於 chromosome 5 的同源 基因 FCY21 和 FCY22。他們分別與 FCY2 有 89％ 和 85％ 相似度
(Wagner et al., 2001; Paluszynski et al., 2006)，以基因剔除研究，發現同時失
去三個基因，對 5-FC 抗藥性比起任何一個基因單一突變效果更好。除此 之外，作者也提出 TPN1、FUR4 和 yOR071c (Stolz and Vielreicher, 2003;
Seron et al., 1999; Enjo et al., 1997) 也可能是參與 5-FC 運送的 permease
(Paluszynski et al., 2006)。在 C. albicans 中則有四個可能的 PCP 同源基
因：FCY21、FCY22、FCY23 和 FCY24，根據 PCP 輻射系統發生樹分析，
C. albicans 的 FCY21 和 FCY22 與 S. cerevisiae 運送 cytosine 的 FCY2
比較接近 (Schmidt et al., 1984; Weber et al., 1990)，FCY23 和 FCY24 則是 與 負責 運送維 他命 B6 的 Tpn1 親 源關 係較近 (Stolz and Vielreicher, 2003)，所以 FCY21 和 FCY22 可能是運送 5-FC 的 PCP 基因，另外，有 臨床分離抗藥性菌株在這兩個基因上發現胺基酸取代現象，但是目前仍需
要相關文獻提出有力的證據證實是否相關 (Hope et al., 2004)。在本研究
中，證實了 C. tropicalis 的 FCY2 基因的 LOH 現象與 5-FC 抗藥性產生 有關，其中一個可能的原因為 PCP 的第 91 個胺基酸可能扮演重要功能。 把 C. tropicalis 的 FCY2 蛋白質序列與 S. cerevisiae 的 FCY2、FCY21、 FCY22 和 C. albicans 的 FCY21 和 FCY22，以及另一個 C. tropicalis 可能
