質體

No. 特性

LOB319 C. tropicalis FCY2 的 G 股 SAT1 flipper 同源重組和基因補救質體

LOB320 C. tropicalis FCY2 的 T 股 SAT1 flipper 同源重組和基因補救質體

LOB321 C. tropicalis FCY2 的 G 股 SAT1 flipper 基因剔除質體

LOB322 C. tropicalis FCY2 的 G 股 SAT1 flipper 基因剔除質體

2.3 引子 (primers) for C. tropicalis

Name Sequence (5’→3’) position Reference

HJL1205 ATCATTAGTTCAGATGGTAAAGTCTTG

FCY1 up stream

-81~-55

Desnos-Ollivier et al., 2008 HJL1206 CCTTTTTAGTAACATGTCTATTCTCCA

FCY1 down steam

25~ORF +221

HJL1207 TGCCCATAAATTAAATGCAGAA

FCY2 up stream

-88~-67

HJL1208 GGAAGCAACAAACCCAAAAA

FCY2 ORF

+650~+631

HJL1209 TGCTGCCGATTATGTTGTTT

FCY2 ORF

+567~+568

HJL1210 GTGAAAACGAGCCAATCCAT

FCY2 down steam

20~1

HJL1211 TCATCAAAACCATGTCTGCTG

FUR1 up stream

-11~ ORF +10

HJL1212 AAGTGTATGTAGTGATAATTGCTATGC

FUR1 down steam

83~57

HJL1413 ATTGGATAGTCCCTCTAAACTCACTACTA

URA3 up stream

-60~-32

HJL1414 AGCATTAGTTATATCACTCCACGATGAA

URA3 ORF

+366~+339

HJL1415 TGCCGATATTGGAAATACAGTTA

URA3 ORF

+285~+307

HJL1416 AATCAACTATTCAAGTTGACCG

URA3 down steam

6~ ORF +792

HJL1420 ggtaccTCAACTCAACCCCAAAGT

FCY2 up stream

-500~-483

本實驗

HJL1421 ctcgagCCCAAGGAGAAAGTAGCA

FCY2 ORF

+44~+27

HJL1422 CGGATTCAATGTAGCCAG

FCY2 ORF

+1272~+1289

HJL1423 GTCATTCCATGTCGTGGT

FCY2 down steam

441~424

HJL1424 ctcgagGTCATTCCATGTCGTGGT

FCY2 down steam

441~424

HJL1477 CTGTTGCTCCAGGTGAATCa

FCY2 down steam

554~535 HJL814 CTCAACATGGAACGATCTAGC in SAT1 cassette

2.4 藥品詴劑

 Amersham Biosciences : rTaq DNA polymerase (Cat. No. 27-0798-06)

 BIO-RAD: 50 x TAE (Cat. No. 161-0773)

 Difco laboratories :

Bacto agar (Cat. No. 214040), LB agar (Cat. No. 244520), yeast nitrogen base w/o amino acid (Cat. No. 291940), LB broth (Cat. No. 244620), YPD broth (Cat. No. 242820), BHI (Cat. No. 0037-17)

 Invitrogen :

Agarose (Cat. No. 15510-027), 1kb plus DNA ladder (Cat. No. 12308-011)

 NEB : Calf intestinal(CIP), Restriction Enzymes

 Promega : T4 DNA ligase(Cat. No. M-1801)

 Sigma Chemical Co. :

Dithiothreitol (DTT) (Cat. No. D9779), Disodium

ethylenediamine-tetraacetate (EDTA) (Cat. No. E-5134), Glass – beads (425~600μm) (Cat. No. G9268-500G), Histidine (Cat. No. H-8125), Lithium acetate(CH3COOLi)(Cat. No. L-6883), L-leucine (Cat. No.

L-8000), Polyethylene Glycol3350 (PEG3350) (Cat. No. P4338), Uridine(Cat. No. U-3003), 5–Flucytosine (SI-F7129),

 E Merck. Germany:

Chloroform (Cat. No. 1.0244511000), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Cat. No.

S26740), Ethanol (Cat. No. K33534874), Ethidium bromide(Cat. No.

K27928515), Glucose (Cat. No. K33069537), N,N-dimethylformamide (Cat.No. K27226853), Potassium chloride (KCl) (Cat. No. K24252236), Isopropanol (Cat. No. K32632434), Sodium carbonate (Na2CO3) (Cat. No.

A375692), Sodium hydroxide (NaOH) (Cat.No.B886298), Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrogen chloride (Tris-HCl)

(Cat.No.8382T006), Sodium chloride (NaCl) (Cat. No. K29779304), Triton X-100 (Cat. No. K23841503)

 USB:

Glycerol (Cat.No.US16374), phenol: chloroform: isoamyl alcohol (Cat. No US75831)

2.5 緩衝溶液 (buffers)

 10 x TE buffer (pH 7.5 & pH 8.0):

20 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5& 8.0), 8 ml 0.25M EDTA (pH 8.0) 加無菌二 次水至體積 200 ml

 10X (1 M) Lithium Acetate (LioAc):

40.8 g Lithium Acetate加無菌二次水至體積400 ml

 1X TE/LioAc solution (現配現用)

1 ml 10 x TE buffer, 1 ml 1 M Lithium Acetate 加無菌二次水至體積 10 ml

2.6 培養液和培養基

 DYT

1.6 g Tryptone, 1 g Yeast extract, 0.5 g NaCl 加無菌二次水水至體積 100 ml

 BHI broth: (Difco, Cat. No. 0037-17)

33.7% Calf brain infusion solids, 13.5 % Beef heart infusion solids, 27 % Proteose peptone, 5.4 % Glucose, 13.5 % Sodium chloride, 6.7 % Disodium phosphate

 LB (Lucia-Bertni) broth: (Difco, Cat. No. 244620) 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl

 LB/ ampicillin broth:

1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 100 μg/ml ampicillin

 LB/ kanamycin broth:

1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 50 μg/ml kanamycin

 LB/ Chloramphenicol broth:

1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 34 μg/ml Chloramphenicol

 SD broth: (Difco, Cat. No. 291940)

0.67% Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acid, 2 % dextrose

 YPD borth: (Difco, Cat. No. 242820)

2% Bacto-peptone, 1% yeast extract, 2% dextrose

 YPD agar

2 % Bacto-peptone, 1% yeast extract, 2% dextrose

2.7 儀器設備

程式溫度控制儀 PTC-200 (MJ Research) 迴轉式震盪培養箱 (TKS)

落地型高速離心機 J2-MC (Beckman) 桌上型高速冷凍離心機 (Heraeus)

桌上型低速冷凍離心機 ( SORVALL RT7)

微量高速離心機 DENVILLE 260D (DENVILLE SCIENTIFIC INC) 電子天平 AT261 DeltaRange (METTLER TOLEDO)

GG4002-S (METTLER TOLEDO) 加熱攪拌器 (CORNING)

酸鹼度計微電腦自動溫度 (HANNA instruments) 單槽乾浴器 (Violet Bio Sciences, Inc.)

恆溫水浴器 (CHERNG HUEI Co.)

詴管震盪器Vortex-2 genie (Scientific Industry) 全光域多功能分析系統 (Molecular Devices) 倒立顯微鏡 (OLYMPUS)

數位相機 COOLPIX 990 (Nikon)

基因脈衝儀 GENE PULSERⅡ(BIO-RAD) 往覆式細菌接種套組(Cathra)

電泳影像擷取分析系統 (Alpha Innotech Corporation) 水平式電泳槽SUB-CELL GT ( BIO- RAD)

玻璃雙門 4 ºC 冷凍櫃 (LEVEL) -30 ºC 直立式雙門冷凍櫃 (SANYO) -80 ºC 超低溫冷凍櫃 UltimaⅡ (REVCO)

三、方 法 I

3.1 DNA 方法

3.1.1 大腸桿菌 (E. coli) 質體純化

使用 Qiagen Inc 的產品 QIAprep spin miniprep kit （Cat. No. 27106、

28106），萃取出大腸桿菌的質體。要純化大量的大腸桿菌質體時，使用的 是 VIOGENE 的產品 Midi Plus^TM Ultrapure Plasmid Extraction System

（Cat. No. GDV2002）。

3.1.2 洋菜膠內 DNA 萃取和 PCR 產物純化

萃取出洋菜膠內特定的 DNA 片段和純化 PCR 產物使用 Qiagen Inc 的產品 QIAprep gel extraction kit （Cat. No.28706）。

3.1.3 萃取真菌 genomic DNA

純 化 C. albicans 、 或 C. tropicalis 的 genomic DNA 用 的 是 EPICENTRE 的產品 MasterPure^TM Yeast DNA Purification Kit （Cat. No.

MPY80200）。

以上均依照廠商說明書操作。

3.1.4 聚合酶連鎖反應 （Polymerase Chain Reaction，PCR）

本實驗聚合酶連鎖反應所使用的 DNA 模版 （DNA template） 有質 體 DNA，或是白色念珠菌、熱帶念珠菌的 genomic DNA，利用所設計的 引子夾出所要的片段並放大之。將下列物質混合於 0.2 ml 之微離心管：總 體積為 50 μl 的反應液中加入 5 μl 的 10 X DreamTaq^TM buffer、1.25 unit DreamTaq^TM DNA polymerase （5 unit/μl, Fermentas, Cat. No. EP0701）、4 μl 的 2.5 mM dNTP、1 μl 的 25 mM MgCl₂、50 μM 的 Forward primer 和 Reverse primer 各 0.5 μl、DNA 模版 （0.01 ng ~ 1 ng 質體 DNA, 白色念 珠菌、熱帶念珠菌的 genomic DNA 約 0.1 ~ 1 μg）、無菌二次水。反應步驟

為：（1）95℃, 5 分鐘 （2）95℃, 30 秒 （3）50 ~ 60℃, 30 秒 （依引子 Tm 值減 5℃） （4）72℃，時間依照欲合成片段大小決定 （DreamTaq^TM DNA polymerase 合成速率 1 Kb / min） （5）重複（2）~（4）步驟 30 次 （6）

72℃, 5 分鐘 （7）4℃ 停止反應。

3.1.5 DNA 黏合反應 （DNA ligation）

黏合反應使用 EPICENTRE 的 Fast-Link^TM DNA Ligation Kit （Cat. No.

LK6201H），以適當限制酶處理的載體 DNA （vector DNA） 和欲黏合的 DNA 片段 （insert DNA），取莫爾濃度比為載體 DNA：欲黏合的 DNA 片 段等於 1：3，加入內含 2 unit 的 DNA ligase 總反應體積為 15 μl 的反 應液中，在 16℃ 下進行黏合反應至隔天。

3.1.6 TA cloning

使用 Promega 的 pGEM-T Easy Vector System （Cat. No. A1360）。

3.2 E. coli 轉形反應 （transformation）－熱休克法 （heat-shock）

3.2.1 製備 E. coli 轉形細胞 （competent cell）

前一天從凍管劃菌到 LB plate 以 37℃ 培養，次日用滅菌過的牙籤挑 起單一菌落培養在 2 ml LB Broth 以 37℃ 震盪培養，隔天取 1 ml 的菌液 加上 300 ml DYT 在 37℃ 震盪培養 1〜1.5 小時 （OD₆₀₀＝0.4〜0.6，細 胞密度勿超過 10⁸ cells/ml），之後至於冰上 10 分鐘 （以下操作維持在 4

℃），然後以轉速 4000 rpm 離心 10 分鐘去除上清液，加入 300 ml 50mM CaCl2 （ice-cold）輕輕的使 E.coli 重新懸浮再置於冰上 20 分鐘，接下來 以轉速 4000 rpm 離心 10 分鐘去除上清液，加入 40 ml 50 mM CaCl₂ 使 E.coli 重新懸浮，再加入 glycerol 使其最後濃度為 15％ （約加入 8 ml 100

％ glycerol），最後將製備好的轉形細胞以體積為 200 μl 分裝到 1.5 ml 微 離心管後存於 -80℃ 備用。

3.2.2 轉形反應

事先將黏合反應溶液置於 70℃ 乾浴槽上 15 分鐘終止黏合反應，並 將製備好的轉形細胞置於冰上解凍 （約 5 分鐘），取適當體積的黏合反應 溶液（ 小於轉型細胞體積的 10％） 加入轉形細胞中輕拍混合，置於冰上 30 分鐘後，移到 42℃ 水浴槽熱休克 1.5 分鐘，就迅速移至冰上 2 分鐘，

再加入 1 ml DYT 以 37℃ 震盪培養 1 小時，然後以轉速 8000 rpm 離心 2 分鐘吸取 1 ml 上清液丟棄，將剩下的菌液混合後用玻璃珠均勻塗於含適 當抗生素的培養基，放到 37℃ 培養箱至隔天看結果。

3.3 Candida 轉形反應－電穿孔法 (electroporation) 3.3.1 製備 Candida 轉形細胞

轉形方法是根據前人的報導所修改 (Kohler et al., 1997)。將欲轉形的菌 株養在 3 ml YPD 中於 30℃ 以轉速 150 rpm 震盪培養至隔天，再取 5 μl 轉養至 50 ml YPD 震盪培養至隔天 OD₆₀₀ = 1.6~2.2，即可以轉速 5000 rpm 離心 5 分鐘收菌，之後將 pellet 重新懸浮於 1ml 10X TE buffer、1 ml 1M Litium acetate 和 8 ml ddH2O，並於 30℃ 震盪培養 1 小時後，再加入 250 μl 1M dithiothreitol (DTT) 於 30℃ 震盪培養 30 分鐘，接下來加入 40 ml ddH2O 充分混合後就離心去除上清液，將 cell pellet 以 25 ml ice-cold ddH2O 混合清洗，便在 4℃ 下以轉速 5000 rpm 離心 5 分鐘去除上清 液，以 5 ml 1M ice-cold sorbitol 清洗，再離心去上清液，加入 50 μl 1M ice-cold sorbitol 置於冰上備用。

3.3.2 轉形反應

將欲轉形的線性 DNA (2~3 μg) 和 40 ml 的轉形細胞混合均勻後，加 入已在冰上欲冷的 0.2 cm cuvette 溝槽中，輕輕 cuvette 拍打使去除氣泡和 讓細胞完全在 cuvette 底部。電穿孔條件為 1.8 KV, 200Ω, 25μF，完成後加 入 1 ml ice-cold sorbitol 沖洗，離心去除上清液加入 1 ml YPD 在 30 ℃ 震 盪培養 1 小時，便可以取適量的菌量塗於含有 200 μg nourseothricin 的

YPD plate 進行篩選，在 30 ℃ 下培養二到三天至菌落達適當大小，即挑 起劃單一菌落再進行確認。

3.4 CLSI Broth Microdilution Method (5-flucytocine: 0.125~64 μg/ml) 根據 Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, 1997) 所發佈的 M27A 說明書操作。實驗操作前須先配製適量 RPMI 1640 broth （pH7.0, Gibco BRL, Cat. No. 31800022）、無菌 0.85% NaCl，放置於 1 liter 的血清 瓶中，並裝上分注吸管後置於 4℃ 冰箱中備用。配好 2 倍濃度梯度之抗 藥性詴驗培養盤 （避光），放置於 -80℃ 冰箱中備用。

第一天

1. 自 -80℃ 冰櫃中取出標示有編號的單一菌株存菌管，用竹棒挖取少許菌 液，放到含有 1.0 ml BHI （Cat. No. 237500）的 24-well plate。置於 35℃

培養箱培養。

2. 取出所需數量的 12×75 ㎜ 玻璃詴管，以標示筆標示待測菌株編號，置於 鐵架，以鋁箔紙覆蓋後，利用高壓滅菌鍋進行滅菌，滅菌後取出備用。

3.取無菌離心管，標示待測菌株編號後，放置於鐵架上備用。

第二天

1. 至 -80℃ 冰櫃中取出適量已配製好的 2 倍濃度梯度之抗藥性詴驗培養 盤，放置於室溫下，回溫備用。

2. 取出經 24 小時 35℃ 培養的 24-well plate，利用 Pipet 混合均勻，吸 取 100 μl 菌液，加入含有 2 ml 0.85% NaCl 的玻璃詴管，以震盪器充分 混合均勻。

3. 利用 colorimeter 調整使菌液約為 0.5 McFarland （1~5×10⁶ CFU/ml）， 過高或偏低可透過加入適量 0.85% NaCl 或菌液來調整。

4. 以震盪器充分混合均勻後, 依序以 0.85% NaCl 十倍稀釋，再二十倍稀 釋，最後以 RPMI 1640 broth 十倍稀釋。

5. 將已回溫的抗藥性詴驗培養盤標示檢體編號，將稀釋好的 RPMI 1640 broth 菌液混合均勻後，倒入無菌藥品槽，利用 12 爪 Pipet 裝上 11 支

tips，吸取 100 μl 菌液，同時加入 A 列 1~11 行 的培養盤中，第 12 行 不加菌液，為無菌操作的對照組 （注意 tip 不要沾到藥盤裡的 RPMI）。 6. 更換 tips，重複步驟 4 跟 5，依序將檢體分別加入 B~H 列。

7. 添加完畢後，蓋上抗藥性詴驗培養盤蓋子，放入 35℃ 培養箱中培養。

第三天

讀取培養盤菌液生長濃度

1. 開啟 Biotrack II plate reader 電源，於主畫面中進入 select method 中選 YEAST 後，機器會進入 YEAST 模式。

2. 啟動電腦。在桌面上點選 Bio DC 程式捷徑，開啟視窗後，點選 run，

在點選 new data 後即可讀取培養盤讀值

3. 取出已經 35℃ 培養 24 小時 的抗藥性詴驗培養盤，放在具有 96-well plate 專用承載盤的震盪器上，調整震盪速度於 2~3 之間，震盪時間約 1 分鐘。

4. 震盪均勻後，將培養盤蓋子移開，將培養盤放置於 Biotrack II plate reader 的讀取槽內。在 Biotrack II plate reader 上輸入該培養盤的編號後，接著 選點 run，則培養盤會進入機器內部，先進行 5 sec 的 pre-mix 後，再 接著讀取吸光值。讀取完畢後培養盤會退出，且在電腦程式中顯示出 96- well 的 OD 數值。

5. 將培養盤取出，並將培養盤蓋子蓋上，重複操作步驟 3、4、5 直到全部 的培養盤都讀取完成後，於 Bio DC 點選 finish 將結果匯出到 Excel 並存檔，培養盤放回 35℃ 培養箱繼續培養 24 小時。

分析結果，判讀 MIC 數值。

1. 開啟存有 OD 讀值的 Excel 檔，將所有資料轉貼到新的 Excel，再利用 Excel 的運算功能，先進行歸零減除 Blank 的運算，再運算每一 well 與 Postive (growth) control 的百分比數值。

2. 利用 Excel 中 If 函數的功能 〔if(value <=50,”R”,mic conc.)〕，在 Flucytocine 若百分比數值 >50，則顯示 R，若百分比數值 <=50 則顯示 該 well 的詴藥濃度。

3. 讀取 MIC 數值，將結果輸入資料庫中。

第四天

讀取 48 小時培養盤黴菌生長濃度，重複第三天的操作方式，讀取 MIC 數值，並將結果輸入資料庫中。Flucytocine 的 MIC 數值判讀為以 48 小 時時菌量混濁度為不加藥的正對照組的百分之五十的藥物濃度。

四、結 果 I

4.1 以 broth microdilution 分析 Candida tropicalis 的 parental strain 和 其抗藥衍生株 (derivated resistant strain) 之間對於 5-flucytosine (5-FC) 的感受性差異

將實驗室同仁柯惠菁從 E-test 藥盤所收集的 Candida tropicalis 的衍 生株 (若取兩個 isolates 編號為 R1 及 R2；只有一株則為 R) 及其 parental strain 為一組，總共 35 組 (102 株菌)，以 broth microdilution 測 minimal inhibition concentration (MIC)，並將 24 小時和 48 小時的讀值整 理於表一。圖一為 48 小時藥盤照片。結果判讀以 48 小時抑制 50％ 菌 量生長的藥物濃度為此菌株之 MIC，如果菌株的 MIC ≦ 4 μg/ml 代表對 5-FC 感 受 性 是 敏 感 的 (susceptible) ， MIC 為 8-16 μg/ml 是 中 間 性 (intermediate)，MIC ≧ 32 μg/ml 是抗藥性的 (resistant)。

雖 然 根 據 broth microdilution 的 結 果 YM020055 、 YM060051 、 YM060071 和 YM060173 這四組衍生株對 5-FC 的感受性歸類為敏感 (MIC ≦ 4 μg/ml)，但是除了 YM060051-R2 和其 parental strain 的 MIC 是 一致之外 (0.125 μg/ml)，其他的組別衍生株與其 parental strain 相較之下都 是更加地不敏感。且在全部 35 組之中，超過 80％ 組別的衍生株已達到 5-FC 抗藥的程度 (MIC ≧ 32 μg/ml)。

為了探討各組 parental strain 與衍生抗藥株之間 MIC 的差異究竟是

為了探討各組 parental strain 與衍生抗藥株之間 MIC 的差異究竟是

在文檔中 熱帶念珠菌失去異質合子性導致5-Flucytosine抗藥性及鑑別CaNDT80活化區重要胺基酸之研究 (頁 19-0)