10.1 以 error-prone PCR 進行隨機突變探討
探討蛋白質功能性胺基酸時，在序列上製造隨機突變進行篩選是很有 用的方式。製造隨機突變的方式有：使用在 DNA repair 相關基因的 E. coli 突 變 株 ， 如 XL1-red 、 利 用 UV irradiation 、 或 者 使 用 化 學 方 法 (deamination、alkylation 和核苷酸類似物)，以及 PCR 方法，如 error-prone PCR，其中 error-prone PCR 是目前最廣為使用的方法 (Wong et al., 2006)。
error-prone PCR 基本原理主要是利用 rTaq DNA polymerase 沒有 3’→5’
端 proof-reading 的功能，依據條件的不同約有 10-4~10-5 的突變率，並且 可以透過以下方法增加其突變率：(1) 使用比例不同的 dNTP;(2) 增加 rTaq DNA polymerase 濃 度 ;(3) 增 加 extension 的 時 間 ;(4) 提 高 鎂 離 子 濃 度 (Mg2+);(5) 額外添加 0.5 mM 錳離子 (Mn2+)，以上都有穩定 mismatch base pair 和增加突變率的效果 (Cadwell and Joyce, 1992 and 1994 ; Leung et al.,1989)，透過上述幾點的調整就可以得到適當突變率。但是無論是以任何 一種隨機突變方法，都無法避免 nonsense 和 frameshift mutation 發生，並 且尤其以 XL1-red 產生 deletion 的比率較高 (Rasila et al., 2009)，同時本 實 驗 因 為 在 CaNDT80 活 化 區 隨 機 突 變 library 篩 選 結 果 ， 都 是 得 到 nonsense 和 frameshift mutation，因此想要利用一些策略去除製造隨機突變 library 時不想要的突變。
10.2 篩選質體 LOB295 結果討論
設計篩選質體的概念為利用質體上的抗生素基因，於 ORF 前端，start codon 之後，接入欲篩選之隨機突變 DNA 片段，如果置入前端的隨機突 變 DNA 片段帶有 nonsense 和 frameshift mutation，則會連帶影響後端抗 生素基因之表現，如中斷抗生素基因表現或使抗生素基因 out-frame，故無 法產生正確蛋白質，造成菌落無法在含有抗生素培養基上生長，故只留下 帶有不會影響後端抗生素基因之表現的 missense mutation 片段。實驗室常
用之抗生素有 ampicillin、kanamycin 和 chloramphenical。ampicillin 殺菌 機制為抑制 transpeptidase 活性，抑制 cell wall 合成，造成菌體瓦解。但 ampicillin 抗藥基因為 β-lactamase，是一種穿膜蛋白質，故非常可能因為接 入欲篩選之隨機突變 DNA 片段後，造成無法在細胞膜上有正常折疊而影 響 其 功 能 ， 因 此 不 列 入 篩 選 質 體 之 抗 生 素 考 量 。 kanamycin 和 chloramphenical 作用機制則是分別針對核糖體 30 S 和 50 S 作用，抑制蛋 白質合成。kanamycin 和 chloramphenical 抗藥基因分別為 aminoglycoside phosphotransferase 和 chloramphenical acetyltransferase (CAT)，都是針對標 的抗生素進行修飾，使其失去殺菌活性。
LOB295 是一個利用 kanamycin 進行篩選隨機突變片段的質體 (圖二 十)，改造的質體選用實驗室進行 TA cloning 的 pGEM-T easy vector，並且 利用 kanamycin 本身的啟動子驅動抗藥基因的表現，在啟動子與抗藥基因 之間有約 100 bp 的 multiple cloning site (MCS) 方便後人使用。但是當建 構完成後，發現菌株不能在 kanamycin 培養基上生長，推可能原因有：(1) 從 LOB64 經由 PCR 得到的 kanamycin 啟動子和 ORF 序列不完整，所 以抗藥基因無法正常表現;(2) 因為啟動子與抗藥基因之間有約 100 bp 的 multiple cloning site (MCS) 中斷了某些訊號，影響 kanamycin 啟動子的功 能，無法驅動後端 kanamycin 抗藥基因表現;(3) 有正常表現 kanamycin 基 因，但產生 fusion protein 不正常折疊使其失去功能。為了釐清可能原因，
所以首先將 LOB285 轉形至 BL21 (DE3)，此菌株帶的 DE3 基因為 T7 RNA polymerase ， 故 可 利 用 pGEM-T easy vector 上 的 T7 啟 動 子 來 趨 動 kanamycin 抗藥基因的表現，從此瞭解是否為可能原因 (2) 導致抗藥基因 無法正常表現。結果 LOB295 轉形至 BL21 (DE3) 便能生長在 kanamycin 培養基，表示 MCS 影響了 kanamycin 啟動子的功能。接著 LOB295 放 進五種不同狀況的 CaNDT80 活化區隨機突變 DNA 片段進行測詴 (表 七)，發現五種狀況都會生長，代表質體 LOB295 並無預期篩選功能，列舉 可 能 原 因 有 ： (1) 因 為 原 本 設 計 的 kanamycin 啟 動 子 無 法 驅 動 後 面 kanamycin 抗藥基因表現，而使用 T7 promoter，也許 T7 promoter 驅動抗
藥基因的表現並非從我們所預計的位置，但是透過軟體分析其他可能的 ORF，並沒有發現其他可以讓 kanamycin 抗藥基因 in-frame 者; (2) 因為 插 入 片 段 使 fusion protein 在 kanamycin 之 前 產 生 了 新 的 translation initiation site。
10.3 篩選質體 LOB324 和 LOB325 結果討論
接下來改造質體選用專門用來表現蛋白質的質體 LOB137 (pET-43.1a (+)-Factor Xa)，本身帶有 ampicillin 標記，並以 pusion PCR 去除接入 CaNDT80 活化區隨機突變片段所需之切位 BstE II，將所得質體 LOB323 作 為 之 後 改 造 質 體 使 用 。 分 別 建 構 以 chloramphenical 抗 藥 基 因 (chloramphenicol acetyltransferase, CAT) 和 kanamycin 抗 藥 基 因 (aminoglycoside phosphotransferase) 作 為 篩 選 標 記 的 質 體 LOB324 和 LOB325 (圖二十二)。
以 chloramphenical 作為篩選標記的質體 LOB324 把包含 wild type 序列、missense、frameshift (deletion 與 insertion)，以及 nonsense mutation，
共五種 CaNDT80 活化區插入片段接入後進行測詴 (圖二十五)，結果顯示 在 34 μg/ml chloramphenical 上含有篩選插入片段 wild type 和 missense mutation 有菌落長出，但是與 ampicillin 培養基相比生長狀況並不佳，可 能因為加入了 CaNDT80 活化區片段 (約 500 bp)，使 CAT 功能不如原來 好 ， 也 許 降 低 chloramphenical 濃 度 後 可 讓 菌 長 得 較 好 ， 於 是 將 chloramphenical 濃度減半為 17 μg/ml (圖二十七)，顯示帶有 wild type 和 missense mutation 片段的菌落因抗生素濃度降低而生長情形變好，且帶有 LOB324 空質體者也變好，但是其生長狀況仍比前兩者差一些，故只要調 整適當之抗生素濃度，即可篩選得想要的片段，並去除空質體。但是令人 意外的是 34 μg/ml chloramphenical 加上 0.5 mM IPTG 培養基五種測詴插 入片段都不生長，只有空的質體 LOB324 產生微量零星菌落，並且由於菌 落在單獨只有 0.5 mM IPTG 培養基上生長狀況良好，代表並非 IPTG 所致 之不良影響，重複兩次結果均一致，似乎是當 chloramphenical 和 0.5 mM
IPTG 同時存在時，所造成的非預期結果。實驗中加入 IPTG 進行測詴是 因為 pET Expression System Vector 上的 T7 promoter 由 lac operator 所控 制，所以加入 IPTG 作為 inducer，使 T7 promoter 能夠驅動後面基因之表 現 ， 但 是 LOB324 在 有 抗 生 素 的 狀 況 下 加 入 IPTG ， 反 而 造 成 chloramphenical 抗藥基因 CAT 不能正常表現，也許是在設計上改變了質 體上某些訊號，但是在設計上除了將不必要 tag 去除外 (圖二十二)，找不 到其他可能改變的訊號。另外，在有抗生素之下含有篩選插入片段 wild type 和 missense mutation 者有菌落產生，顯示在沒有 IPTG 之一般狀況下 CAT 的 fusion protein 就有表現，空的質體 LOB324 卻無法生長，但因抗 生素濃度降低使得以上三者生長情形變好，且三者僅在插入片段有差異，
推測可能原因之一是也許 T7 RNA polymerase 傾向於選擇插入片段在 Afl II 切位後的 CaNDT80 之 start codon 開始轉錄，而不選擇預期之 start codon，並且因為插入片段造成 chloramphenical 抗藥基因的 fusion protein 功能受影響，所以才會在 34 μg/ml chloramphenical 生長不佳，降低濃度後 便可獲得改善。但是如果在 chloramphenical 培養基的篩選結果真的是因篩 選質體加入插入片段所造成，那麼 LOB324 將會是一個很好的工具，可篩 選出想要的片段，並且去除 frameshift、nonsense mutation 和空質體 (vector only)。
以 kanamycin 作為篩選標記的質體 LOB325 測詴結果顯示 (圖二十 六)，在 50 μg/ml kanamycin 培養基含有插入片段 wild type、missense mutation 和空質體 LOB325 均有生長，表示 kanamycin 抗藥基因在未加 IPTG 之下即有表現，並且 nonsense 和 insertion mutation 有些微菌落產 生，但明顯長的比前三者差，deletion 則完全不長。將帶有 nonsense 和 insertion mutation 的 kanamycin 抗藥基因以軟體預測是否有其他能讓部分 kanamycin 抗藥基因 in-frame 表現的 ORF，但是沒有發現這樣的 ORF 存 在，也許這些少量的菌體為了存活所以啟動了目前不明的機制，例如：跳 過 stop codon 而表現後面的 kanamycin 抗藥基因所產生，提高 kanamycin 的濃度或許就可以殺死這些菌，於是將 kanamycin 濃度增加 0.5 倍為 75
μg/ml 進行測詴 (圖二十七)，結果顯示帶有 nonsense 和 insertion mutation 片段的菌落的確因抗生素濃度增加而使菌落減少，且帶有 LOB325 空質體 者生長狀況與 LOB324 測詴結果類似，比 wild type 和 missense mutation 片段的菌落來得差，這可能因為插入片段對 kanamycin 抗藥基因之影響。
故以上測詴結果顯示報導質體 LOB324 和 LOB325 只要施用適當之抗生 素濃度，可篩選得想要的片段，並去除空質體，此二質體均具有篩選功能，
可作為日後之應用。
另外，在 50 μg/ml kanamycin 加上 0.5 mM IPTG 培養基上，只有帶有 deletion mutation 片段的不長，其餘均有零星菌落長出，且生長狀況比只有 50 μg/ml kanamycin 培養基上來得差許多，這一點跟 LOB324 相當類似，
兩者都在有抗生素的狀況下加入 IPTG 造成菌落生長不佳，抗藥基因不能 如 預 期 因 為 IPTG 而 大 量 表 現 ， 並 且 LOB325 的 結 果 讓 人 意 外 的 在 kanamycin 培養基原本生長不佳的 nonsense 和 insertion mutation 加入 IPTG 後菌落明顯增加的現象，這與預期不同。推測可能因素有：(1) 改造 的質體 LOB324 和 LOB325 某些表現訊號改變，造成當抗生素與 IPTG 同時存在時生長狀況不如預計;(2) BL21 (DE3) 不適用於本實驗;(3) 菌落的 生長非轉形之質體所致，可能產生了某些變異導致抗藥性，以上原因仍須 更進一步研究來釐清。