4.1 以 broth microdilution 分析 Candida tropicalis 的 parental strain 和 其抗藥衍生株 (derivated resistant strain) 之間對於 5-flucytosine (5-FC) 的感受性差異
將實驗室同仁柯惠菁從 E-test 藥盤所收集的 Candida tropicalis 的衍 生株 (若取兩個 isolates 編號為 R1 及 R2；只有一株則為 R) 及其 parental strain 為一組，總共 35 組 (102 株菌)，以 broth microdilution 測 minimal inhibition concentration (MIC)，並將 24 小時和 48 小時的讀值整 理於表一。圖一為 48 小時藥盤照片。結果判讀以 48 小時抑制 50％ 菌 量生長的藥物濃度為此菌株之 MIC，如果菌株的 MIC ≦ 4 μg/ml 代表對 5-FC 感 受 性 是 敏 感 的 (susceptible) ， MIC 為 8-16 μg/ml 是 中 間 性 (intermediate)，MIC ≧ 32 μg/ml 是抗藥性的 (resistant)。
雖 然 根 據 broth microdilution 的 結 果 YM020055 、 YM060051 、 YM060071 和 YM060173 這四組衍生株對 5-FC 的感受性歸類為敏感 (MIC ≦ 4 μg/ml)，但是除了 YM060051-R2 和其 parental strain 的 MIC 是 一致之外 (0.125 μg/ml)，其他的組別衍生株與其 parental strain 相較之下都 是更加地不敏感。且在全部 35 組之中，超過 80％ 組別的衍生株已達到 5-FC 抗藥的程度 (MIC ≧ 32 μg/ml)。
為了探討各組 parental strain 與衍生抗藥株之間 MIC 的差異究竟是 否受到基因層次因素的影響，以瞭解產生 5-FC 抗藥性的機制為何，於是 挑選有興趣的組別分析相關基因的序列。挑選標準為：1. 同組的 parental strain 對 5-FC 是敏感的之外，兩個 isolates-R1 及 R2 感受性為中間性和 抗藥性的 YM020438、YM060088、YM060616 這三組；2. 組內 R1 與 R2 在 24 小時的 MIC 都相同，並且 48 小時的 MIC 也很接近，但是和其他 兩 組 相 較 之 下 有 程 度 上 差 異 ( 敏 感 性 及 抗 藥 性 ) 的 YM060173 、 YM020055、YM060369 這三組；3. 組內 R1 與 R2 的 24 小時 MIC 有 差異，但是 48 小時卻都非常一致地達到抗藥程度 (MIC ≧ 64 μg/ml) 的
YM020743、YM020112 這二組；4. 組內 R1 與 R2 的 24 小時 MIC 一 致，但是組別之間有差異，並且於 48 小時卻都具有抗藥性 (MIC≧32 μg/ml) 的 YM020715、YM020347、YM020291 這三組；5. 以及其 parental strain 的 MIC 與其他組相較之下較為抗藥的 YM060800、YM060210 這二組，以上 13 組，總共 38 株菌株將分析以下基因的序列。
4.2 將有興趣組別的 URA3、FUR1、FCY1、FCY2 基因定序分析
URA3、FUR1、FCY1 及 FCY2 是涉及 pyrimidine 生合成途徑的主要 基因，希望透過這四個基因 ORF (open reading frame) 的序列分析找到敏感 性的 parental strain 和其抗藥衍生株之間的差異，來探討 C. tropicalis 對 5-FC 的抗藥機制為何，序列分析結果整理於表二和表三。
URA3 (807 nt, orotidine-5’-phosphate decarboxylase, ODCase) 的序列分 析，只有在 parental strain-YM020112 第 791 個核苷酸是 C/T 的異質合子 型 (heterozygous) ， 兩 個 抗 藥 衍 生 株 都 是 T/T 的 同 質 合 子 型 (homozygous)，造成第 264 個胺基酸由 Thr (ACC) 變成 Ile (ATC) 是有差 異的之外 (圖二 (B))，其他 12 組 parental strain 和抗藥衍生株之間序列並 無差異，在組別之間的差別則是除了 YM020347 和 YM020715 與抗藥衍 生株第 791 個核苷酸是 C/T (圖二 (A))，其他組別則都是 C/C。
分析 FUR1 (657 nt, uracil phosphoribosyl transferase, UPRT) 的結果整 理於表二，所有組別 parental strain 和抗藥衍生株沒有不同，但是組別之間 會有序列上的差異，主要在 21、93、237、501 和 507 nt 有單一核苷酸多 型性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 發生，不過這些變化都不會改變 UPRT 的胺基酸組成。FCY1 (363 nt, cytosine deaminase) 在所有組別 parental strain 和抗藥衍生株序列並沒有不同，並且所分析的 38 株菌株序 列都一致，代表 FCY1 是序列相當保守的基因。
表三為 FCY2 (1317 nt, purine-cytosine permease, PCP) 定序整理，在組 別之間主要 102、225、273、750 和 756 nt 也有單一核苷酸多型性的情形，
但是特別的是 YM020112、YM020291、YM020347、YM00743、YM060088
和 YM060800 這六組抗藥衍生株和 parental strain 序列比較後發現在抗藥 衍生株中全為同質序列，其中 parental strain 在第 273 個核苷酸是 G/T 的 異質合子型，兩股所轉譯的 PCP 在第 91 個胺基酸分別是 Met (ATG) 和 Ile (ATT) (圖三)，但抗藥衍生株從定序結果顯示失去了能轉譯出第 91 個胺 基酸為 Met 的 G 股，只留下轉譯為 Ile 的 T 股，會不會是因為這個位 置 loss of heterozygosity (LOH) 的發生造成了抗藥性的產生？為了驗證這 個假設，利用實驗室已經建立好的 SAT1 flipper 技術進行 G 股和 T 股的 置換與缺 陷性突變，得到 兩股相同的同質 合子型置換株 (homozygous recombination strain) 和單股缺陷突變株 (single allele mutation strain)，並測 詴其對於 5-FC 的感受性是否發生改變。
4.3 挑選對 5-FC 非常敏感菌株定序 FCY2 ORF 作為對照組
將在 E-test 中對 5-FC 非常敏感並且 72 小時抑菌圈沒有長出抗藥衍 生株的 YM020367、YM020649、YM060302 和 YM060559 定序 FCY2 ORF，結果整理於圖四，這四個菌株都在 273 nt 為 G/G 同質合子型。
4.4 建構 SAT1 flipper 所需質體 LOB319、LOB320、LOB321 及 LOB322 根據 FCY2 ORF 定序，用來進行 SAT1 flipper 挑選的是 parental strain 與抗藥衍生株之間 SNP 較少的 YM020291。建構同源重組 (homologous recombination) 和基因補救 (gene rescue)質體 LOB319 與 LOB320 ，以 YM020291 的 genomic DNA 為模板，分別用引子 HJL1420 和 HJL1424 夾出包含 FCY2 ORF 和上下游約 500 bp 的 A 與 B 區域，以及引子 HJL1422 和 HJL1423 夾出下游 B 區域，定序區別 G 股與 T 股後，FCY2 ORF 包含 A、B 區域利用限制酵素切位 Kpn I 和 Xho I，以及 B 區域利 用 Sac II 和 Sac I 接入 pSFS2A，如圖五所示，質體 LOB319 為 G 股序 列，質體 LOB320 為 T 股序列。質體定序只列出質體 LOB319 的部分結 果，因為 LOB319 在 FCY2 ORF 第 1143 個核苷酸從 T 突變成 G，密碼 子 GGT 變成 GGC，但是並不會改變胺基酸的組成仍為 Gly (圖六)。最後
以限制酵素圖譜確認質體建構整體上是否正確，結果於圖七 (A)，片段大小 都符合預計。
建構基因剔除 (gene knockout) 質體 LOB321 與 LOB322，則是分別 用引子 HJL1420 和 HJL1421 夾出包含 FCY2 上游約 500 bp 的 A 區 域，以及引子 HJL1422 和 HJL1423 夾出下游 B 區域，定序區別 G 股與 T 股後，A 區域利用限制酵素切位 Kpn I 和 Xho I，以及 B 區域利用 Sac II 和 Sac I 接入 pSFS2A，如圖五所示，質體 LOB321 為 G 股序列，質 體 LOB322 為 T 股序列。最後以限制酵素圖譜確認質體結構，結果於圖 七 (B)，片段大小都符合預計。
由於建構質體過程中，定序發現 FCY2 不只有 ORF 有 SNP，上游 -69、-224 和下游 201 nt 也有 SNP 位置，於是定序其抗藥衍生株上下游 片段，確認是否也是 LOH 範圍，並與其他五組的定序結果一起整理於表 四，結果顯示這六組 LOH 的區域涵蓋了 FCY2 ORF 及其上下游。
4.5 建構 FCY2 (273G)/FCY2 (273G) 和 FCY2 (273T)/FCY2 (273T) 的同 質合子 (homozygous) 置換菌株
將 LOB319、LOB320 以 Kpn I 和 Sac I 切下包含 FCY2 序列和 SAT1 cassette 的片段，純化後轉形至 YM020291 進行置換，如圖八所示。
經由 nourseothricin 篩選所得之菌株以 SAT1 cassette 上的引子 HJL814 和 B 區域更下游的 HJL1477 確認 SAT1 cassette 是否進入正確的位子後 (圖十 (A))，利用引子 HJL1207 和 HJL1210 夾出 FCY2 ORF，再以限制 酵素 Bbs I 確認 (辨認序列為 GAAGAC) 是否在第 273 核苷酸是否置換 成 G/G 或 T/T 的同質合子型 (圖十 (B))，將所得之 FCY2 (273G)/FCY2 (273G) 菌株命名為 YLO415 和 YLO416，FCY2 (273T)/FCY2 (273T) 命名 為 YLO417 和 YLO418。之後定序確認上游 -69、-224 的 SNP 位置是否 置換，結果為圖十一，此四個菌株都有置換到上游這兩個 SNP 位置。
4.6 建構 FCY2 (273G)/fcy2△ 和 FCY2 (273T)/fcy2△ 的單股缺陷突變株 將 LOB321、LOB322 以 Kpn I 和 Sac I 切下包含 FCY2 上下游和 SAT1 cassette 的片段，純化後並轉形至 YM020291 進行 FCY2 基因剔除，
如圖九所示。經由 nourseothricin 篩選所得之菌株以 SAT1 cassette 上的引 子 HJL814 和 B 區域更下游的 HJL1477 確認 SAT1 cassette 是否進入正 確的位子後 (圖十 (A))，利用引子 HJL1207 和 HJL1210 夾出剩下那一股 FCY2 ORF ，再以限制酵素 Bbs I 確認被剔除的是 G 股還是 T 股後 (圖 十 (B)) ， 將 所 得 之 FCY2 (273G)/fcy2△ 菌 株 命 名 為 YLO420 ， FCY2 (273T)/fcy2△ 命名為 YLO419 和 YLO421。
4.7 以 Broth microdilution 分析 YM020291、同質置換菌株和單股缺陷突 變株之間對 5-flucytosine 的感受性差異
將以上所得之 FCY2 (273G)/FCY2 (273G) 和 FCY2 (273T)/FCY2 (273T) 的同質置換株、FCY2 (273G)/fcy2△ 和 FCY2 (273T)/fcy2△ 的單股缺陷突 變株，以及 parental strain YM020291、抗藥株 YM020291-R1 和
YM020291-R2 以 Broth microdilution 分析 MIC 藥盤照片和 MIC 值整理 於圖十二。FCY2 (273G)/FCY2 (273G)的 YLO415、YLO416，和
FCY2(273G)/fcy2△ 的 YLO420 的 MIC 讀值雖然與 YM020291 一致為 0.5 μg/ml，但是可從圖十二發現 YLO415、YLO416 和 YLO420 在第三行 長的菌量比 YM020291 少，代表此三菌株對於 5-FC 比 parental strain 更 敏感。另外 FCY2 (273T)/FCY2 (273T) 的 YLO417、YLO418，和 FCY2 (273G)/fcy2△ 的 YLO419、YLO421 的 MIC 和抗藥株 YM020291-R1、
YM020291-R2 不是大於 64 μg/ml，就是等於 64 μg/ml，對於 5-FC 都具 有抗藥性的。