七、 材料 II
7.3 引子
Name Sequence (5’→3’) position
HJL21 TTTCCCGGGGGATCCTCGTTACTCAA
CDR1:
-1207~-1190 HJL22 CCCAAGCTTGCATAATTTTTTTCTTTTTGA CCT
CDR1:
+3~-20 HJL61 CATATCGGTCCCCACACAAT
CaNDT80:
+927~+908 HJL238 gTTTTgCTTACTgTggAggAg
CaNDT80:
+1786~+1766 HJL321 CAAACGGAACGACTGAGGAA
CaNDT80:
-558~-539 HJL477 ATTgaattcATGAATCAAACTCTTGTCAGAA
CaNDT80:
+1~ +22 HJL1130
CAACATTTCCAACAACAAATtCACCCTCAATTACACCA C GA
CaNDT80:
+397~+437 HJL1131 TCGTGGTGTAATTGAGGGTGaATTTGTTGTTGGAAATG CaNDT80:
TTG +437~+397 HJL1132
AACATTTCCAACAACAAATGgACCCTCAATTACACCAC GAG
CaNDT80:
+398~+438 HJL1133 CTCGTGGTGTAATTGAGGGTcCATTTGTTGTTGGAAAT
GTT
CaNDT80:
+438~+398 HJL1134 CACCATTTCGGTCACCAAgTTCCAGCCCCCCCTGCTC
CaNDT80:
+529~+565 HJL1135
GAGCAGGGGGGGCTGGAAcTTGGTGACCGAAATGGT G
CaNDT80:
+565~+529 HJL1136
CAGCAGCAACAACAACAACAACATTTGCACCATTTCG GTCAC
CaNDT80:
+499~+543 HJL1137
GTGACCGAAATGGTGCAAATGTTGTTGTTGTTGTTGCT GCTG
CaNDT80:
+543~+499 HJL1362 GGGCCC TCAGGGCGCAAGGGCTGC
Kanr： -333~-316 HJL1363 GGGCCCAATCATGCGAAACGATCCTC
Kanr： +6~-18 HJL1364
GAGCTCGCTTAAGGGAGGAGGTCACCAAGATGGATTG CACGCAGG
Kanr： +11~29 HJL1365 GAGCTC ACTCTTCCTTTTTCAATTCAG
Kanr： +795~+774 HJL1457 CATATGCTTAAGGGAGGAGGTCACCGAGAGAAAAAA
ATCACTGGATATAC
CAT：
+4~+26 HJL1458 CTCGAGTTACGCCCCGCCCTGCCACTC
CAT：
+660~+640 HJL1459
CATATGCTTAAGGGAGGAGGTCACCGAATTGAACAAG ATGGATTGCAC
Kanr： +4~+24
HJL1460 CTCGAGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
Kanr： +795~+775 HJL1461 GAGCATCTGGTCGCATTGGGACACCAGCAAATCGCGC
TGTT
lacI:
+514~+554 HJL1462
AACAGCGCGATTTGCTGGTGTCCCAATGCGACCAGAT GCTC
lacI:
+554~+514 HJL1508 GCCTATATCGCCGACATCAC in LOB137 HJL1509 CGGTGCCTAATGAGTGAGC in LOB137
7.4 藥品詴劑
Amersham Biosciences : rTaq DNA polymerase (Cat. No. 27-0798-06)
BIO-RAD: 50 x TAE (Cat. No. 161-0773)
Difco laboratories :
Bacto agar (Cat. No. 214040), LB agar (Cat. No. 244520), yeast nitrogen base w/o amino acid (Cat. No. 291940), LB broth (Cat. No. 244620), YPD broth (Cat. No. 242820), BHI (Cat. No. 0037-17)
Invitrogen :
Agarose (Cat. No. 15510-027), 1kb plus DNA ladder (Cat. No. 12308-011)
NEB : Calf intestinal(CIP), Restriction Enzymes
Promega : T4 DNA ligase(Cat. No. M-1801)
Sigma Chemical Co. :
Disodium ethylenediamine-tetraacetate (EDTA) (Cat. No. E-5134), Glass – beads (425~600μm) (Cat. No. G9268-500G), Histidine (Cat. No. H-8125), Lithium acetate(CH3COOLi)(Cat. No. L-6883), L-leucine (Cat. No.
L-8000), Polyethylene Glycol3350 (PEG3350) (Cat. No. P4338), Uridine(Cat. No. U-3003).
E Merck. Germany:
Chloroform (Cat. No. 1.0244511000), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Cat. No.
S26740), Ethanol (Cat. No. K33534874), Ethidium bromide(Cat. No.
K27928515), Glucose (Cat. No. K33069537), N,N-dimethylformamide (Cat.No. K27226853), Potassium chloride (KCl) (Cat. No. K24252236), Isopropanol (Cat. No. K32632434), Sodium carbonate (Na2CO3) (Cat. No.
A375692), Sodium hydroxide (NaOH) (Cat.No.B886298), Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrogen chloride (Tris-HCl)
(Cat.No.8382T006), Sodium chloride (NaCl) (Cat. No. K29779304), Triton X-100 (Cat. No. K23841503)
USB:
Glycerol (Cat.No.US16374), phenol: chloroform: isoamyl alcohol (Cat. No US75831)
7.5 緩衝溶液 (buffers)
10 x TE buffer (pH 7.5 & pH 8.0):
20 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5& 8.0), 8 ml 0.25M EDTA (pH 8.0) 加無菌二 次水至體積 200 ml
50 mM CaCl2
3.68 g CaCl2˙H2O 加無菌二次水至 500 ml
50% PEG3350:
200 g polyethyleneglycol3350 加無菌二次水至體積 400 ml
40% Dextrose:
40 g Dextrose 加無菌二次水至體積 100 ml
10X (1 M) Lithium Acetate (LioAc):
40.8 g Lithium Acetate加無菌二次水至體積400 ml
Breaking buffer:
2 ml 100％ Triton X-100, 10 ml 10％ SDS, 5 ml 2M NaCl, 1 ml 1M Tris – HCl (pH8.0), 0.4 ml 2.5M EDTA 加無菌二次水至體積 100 ml
Z buffer (pH 7.0):
16.1 g Na2HPO4‧7 H2O, 5.5 g NaH2PO4‧H2O, 0.75 g KCl, 0.246 g MgSO4‧7H2O, 2.7 ml β-mercaptoethonol 加無菌二次水水至體積 1000 ml
1.1X TE/LioAc solution (現配現用)
1.1 ml 10 x TE buffer, 1.1 ml 1 M Lithium Acetate 加無菌二次水至體積 10 ml
PEG/LioAc solution (現配現用)
8 ml 50％ PEG3350, 1 ml 10X TE buffer, 1 ml 1M LioAc
X – gal stock (40 mg/ml in DMF)
Z buffer/2ME/X–gal (10 ml/14 μl/84 μl) (現配現用)
7.6 培養液和培養基
DYT
1.6 g Tryptone, 1 g Yeast extract, 0.5 g NaCl 加無菌二次水水至體積 100 ml
BHI broth: (Difco, Cat. No. 0037-17)
33.7% Calf brain infusion solids, 13.5 % Beef heart infusion solids, 27 % Proteose peptone, 5.4 % Glucose, 13.5 % Sodium chloride, 6.7 % Disodium phosphate
LB (Lucia-Bertni) broth: (Difco, Cat. No. 244620) 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl
LB/ ampicillin broth:
1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 100 μg/ml ampicillin
LB/ kanamycin broth:
1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 50 μg/ml kanamycin
LB/ Chloramphenicol broth:
1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 34 μg/ml Chloramphenicol
SD broth: (Difco, Cat. No. 291940)
0.67% Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acid, 2 % dextrose
YPD borth: (Difco, Cat. No. 242820)
2% Bacto-peptone, 1% yeast extract, 2% dextrose
YPD agar
2 % Bacto-peptone, 1% yeast extract, 2% dextrose
SD (Synthetic Dextrose) agar: Non-selective agar
0.67% Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acid, 2% dextrose, 2% agar 配製含有營養缺陷菌株所需之 SD 培養基時，需外加下述濃度之胺基酸 L-Histidine-HCl (Sigma H-9511) 20 mg/L
Uridine (Sigma U- 3003) 80 mg/L
7.7 濾紙：(β-gal colony-lift filter assay 實驗所需)
濾紙 for cololny growth for assay 90 mm Whatman # 50
（Cat. No. 1450 090）
Whatman # 3
（Cat. No. 1003 090）
150 mm Schleicher & Schuel #
（Cat. No. RPN137E）
Whatman # 3
（Cat. No. 1003 150）
八、方 法 II
8.1 易誤聚合酶連鎖反應 （error-prone PCR）
此方法用來產生隨機突變的 CaNDT80 活化區 DNA 片段，所使用的 DNA 模版是 LOB280。將下列物質混合於 0.5 ml 之微離心管：總體積為 50 μl 的反應液中加入 5 μl 的 10 X PCR buffer、1 unit rTaq DNA polymerase （5 unit/μl, GE Healthcare, Cat. No. 27-0798-06）、5 μl 的 2.5 mM dNTP、5 ~ 9 mM 的 MgCl2 （依照所要突變的頻率來決定所需濃度，本實 驗的 library 使用的濃度是 7 mM）、50 μM 的 Forward primer– HJL321 和 Reverse primer– HJL61 各 1 μl、5 ng 質體 LOB280、無菌二次水。反應步 驟為：（1）95℃, 5 分鐘 （2）95℃, 1 分鐘 （3）50℃, 1 分鐘 （4）72℃, 5 分鐘 （5）重複（2）~（4）步驟 35 次 （6）72℃, 8 分鐘 （7）4℃停 止反應。
8.2 E. coli 轉形反應－電穿孔法 （electroporation） library scale
CaNDT80 活化區的隨機突變 library 使用的是 Lucigen 的轉形細胞 E. cloni 10G SUPREME DUOs （Cat. No. 60080-1），並依照說明書操作電穿 孔轉形反應後，將菌液均勻塗於含 Ampicillin 的培養基上，放到 37℃培養 箱至隔天，將長出的菌落以細胞刮刀刮下溶於 30 ml 含 Ampicillin 的 LB Broth，取其中 5 ml 菌液存凍管，剩餘的菌液養在 500 ml 含 Ampicillin 的 LB Broth 以 37℃ 培養 4 小時後，使用 Qiagen Inc 的產品 QIAGEN Plasmid Mega Kits （Cat. No. 12183），並依照說明書純化取得 CaNDT80 活 化區的隨機突變 DNA library 質體。
8.3 啤酒酵母轉形反應－LioAc method
8.3.1 製備啤酒酵母轉形細胞 （「」 內體積或質量是 library-scale 轉形方 法）
將啤酒酵母養在 3 ml YPD medium 中，於 30℃ 以 150 rpm 震盪培
養 8 ~ 12 小時後，取 5 μl 菌液轉養到 50 ml YPD medium 中，於 30℃ 以 230 ~ 250 rpm 震盪培養 16 ~ 20 小時後 （OD600約 0.15 ~ 0.3），室溫下以 轉速 3000 rpm 離心 5 分鐘，「去除上清液，以 100 ml YPD 將細胞重新懸 浮，震盪培養於 30℃ 3 小時後 （最後 OD600約 0.4 ~ 0.5），離心 5 分鐘」，
去除上清液以 50 ml 無菌二次水清洗細胞，再離心 5 分鐘去除上清液，以 3 ml 1.1X TE/LiOAc 使細胞懸浮，分裝在兩個 1.5 ml 微離心管中，以轉速 13000 rpm 離心 1 分鐘，去除上清液後各加入 600μl 1.1X TE/LiOAc 混合 均勻，製備好的啤酒酵母轉形細胞在室溫下備用。
8.3.2 轉形反應
將 1.5 ml 「15 ml」 的離心管放在冰上預冷，加入 0.1 – 1 μg 「1 – 10 μg」 欲轉形的 DNA、事先以 100℃ 加熱 5 分鐘然後移至冰上急速冷卻 的 5 μl 「20 μl」 Herring Testes Carrier DNA （10 μg/ml），以及 50 μl 「600 μl」 轉形細胞輕輕的混合後，再加入 0.5 ml 「2.5 ml」 PEG/ LiOAc solution 均勻混合，於 30℃ 培養箱慢速旋轉 30 分鐘 「45 分鐘」，然後加入 20 μl DMSO 混合，接著在 42℃ 水浴槽，進行 15 分鐘 「20 分鐘」 熱休克
（Heat shock） 反應，過程中每 5 分鐘 「10 分鐘」 輕輕上下翻轉，結 束後以轉速 13000 rpm 離心 1 分鐘 「5 分鐘」 去除上清液後，「加入 3 ml YPD 在 30℃ 震盪培養 90 分鐘後以轉速 13000 rpm 離心 5 分鐘，去除 上清液」，加入 200 μl 無菌二次水使細胞懸浮，取適量菌液均勻塗於適量 的 100 mm 「150 mm」 篩選 SD 培養基，於 30℃ 培養 2 ~ 3 天，直到 菌落長成適當大小。
8.4 β–galactosidase Colony Lift Filter Assay
將啤酒酵母培養在營養篩選的 SD 培養基上，在 30℃ 培養箱中培養 2–3 天後，把啤酒酵母複印到有濾紙的新培養基上，於 30℃ 培養至隔天。
將長有菌落的濾紙邊緣以鉛筆做記號方便辨認方位，之後浸入液態氮中 10 秒後 （有菌落那一面朝上），於室溫下回溫，此步驟重複兩次確保破菌完
全。在回溫的空檔以 Z buffer/2ME/X–gal 浸潤新濾紙 （需浸潤完全，但溶 液不會到處流動狀態），接著小心地將長有菌落的濾紙疊放在已經含有 Z buffer/2ME/X–gal 的濾紙上，兩張濾紙間若有氣泡可用鎳子趕走，最後放 到 30℃ 培養箱中進行反應，每隔 15 ~ 20 分鐘 觀察呈色反應。
8.5 從啤酒酵母中萃取質體 DNA 並轉形到 E. coli
將啤酒酵母培養在 5 ml 篩選性的培養液中，在 30℃ 培養箱中以 150 rpm 震盪培養 2 天後，取 1.5 ml 的菌液以轉速 13000 rpm 離心 1 分鐘，
去除上清液，加入 0.2 ml Breaking Buffer、0.2 ml phenol–chloroform–isoamyl alcohol （25：24：1） 和 0.3 g acid-washed glass beads，在室溫下以最大 速度震盪以上混合物 10 分鐘，接著以轉速 13000 rpm 離心 5 分鐘，將含 有質體 DNA 的水層移至乾淨的 1.5 ml 微離心管，取 5 μl 進行 E. coli 的 轉形反應，所使用的轉形細胞為 RBC Bioscience 的 Value 108 HIT–DH5α
（Cat. No. RH617）。
九、結 果 II
9.1 建構 CDR1348 promoter 驅動 lacZ 為報導基因的啤酒酵母 SLO121 建 構 CDR1 promoter 驅 動 lacZ 為 報 導 基 因 的 啤 酒 酵 母 來 篩 選 CaNDT80 活 化 區 隨 機 突 變 library ， 但 為 了 避 免 篩 選 library 時 β-galactosidase filter assay 的背景值太高，因此選用 CDR1 基礎表現量較低 的臨床菌株 YM990348，利用其 CDR1 promoter 來驅動 lacZ 表現。建構 方式是以 YM990348 的 genomic DNA 為模版，用引子 HJL21 和 HJL22 夾出 CDR1348 promoter (1.2 Kb)，利用引子上設計好的切位 Hind III 和 Xma I 接進 YIP363，再將用限制酵素 Xma I 從 LOB238 切下啤酒酵母 ade3 部分序列 (1.62 Kb) 接入。圖十四 (A) 為質體建構示意圖，並以限制 酵素圖譜確認結構，如圖十四 (B) 所示菌落 #2 片段大小符合預期，將此 質體命名為 LOB285。接下來如同圖十五 (A) 所表示，LOB285 以 Xho I 切開成為線性 DNA 後，轉形至啤酒酵母 10560-2B，利用 ade3 部分同源 序列與染色體上的 ADE3 進行同源重組，再以營養篩選挑選出 CDR1348
promoter-lacZ 片 段 進 入 ADE3 locus 的 菌 株 ， 將 所 得 的 菌 株 命 名 為 SLO121。為了測詴 SLO121 是否能夠因轉形的質體而有不同 β-galactosidase 活性，所以分別轉形 B2803 (空質體)、LOB45 （B2803 含 CaNDT80 基因 全長） 和 LOB280 （B2803 含 CaNDT80 基因全長，並且在 start codon 前 另加限制酵素切位 Afl II，請參照附錄二），各挑五個轉形株 (transformant) 以 β-galactosidase filter assay 比 較 其 呈 色 結 果 (圖 十 五 (B)) ， 菌 株 CaNDT80/CDR1p-YEP363 作為正對照組。由圖十五 (B) 得知 LOB45 和 LOB280 的轉形株與正對照組的呈色沒有太大差異，都偏藍色，反過來 B2803 的轉形株呈色則是 偏白色。所以將分別轉形 B2803、LOB45 和 LOB280 的轉形株各挑兩株命名編號如圖十五 (B) 所示，作為之後篩選 library 的正、負對照組。
9.2 以 site-directed mutagenesis 進行前人所篩選 CaNDT80 活化區的可 能重要胺基酸突變，並以 β-galactosidase filter assay 測詴
前 人 篩 選 到 四 個 CaNDT80 活 化 區 的 可 能 重 要 胺 基 酸 分 別 為 Met139、His140、Ile183 和 Gln174，以 LOB280 為模版利用 site-directed mutagenesis 依序將這四個位置改變成 Met139_Ile、His140_Asp、Ile183_Val 和 Gln174_del (deletion)，以定序確定是否突變成想要的胺基酸，定序結果 整理於圖十六。將以上突變成功之質體，轉形至 SLO121，各挑五個轉形株，
進行 β-galactosidase filter assay 確認這四個突變在 CaNDT80 活化區是否 重要，使其活化 CDR1 啟動子功能受影響。如圖十七所示，此四個突變轉 形至 SLO121 的轉形株，在 β-galactosidase filter assay 呈色反應與正對照 組 (LOB45 和 LOB280 的轉形株) 並無太大的差異，代表這四個位置不是 CaNDT80 活化區的可能重要胺基酸。
9.3 測詴 error-prone PCR 在不同鎂離子濃度下合成錯誤率
在鎂離子濃度－4、5、6、7、8、9、10 和 11.5 mM 的 error-prone PCR 條件下，以 LOB45 為模板利用引子 HJL477 和 HJL238 夾出約 1700 bp 片段，送定序後計算 CaNDT80 ORF +50~+700 這區段突變的核苷酸數目，
將統計結果製成圖十八。10 和 11.5 mM 因為突變的位子太多無法計數，
所以結果沒有列出。在測詴的結果和 CaNDT80 的活化區長度有 660 bp 的 考量之下，在 7 mM 鎂離子濃度條件下的 error-prone PCR 約產生 1~2 核 苷酸突變最為恰當，所以以此條件進行製備 CaNDT80 活化區隨機突變 library。
製備 CaNDT80 活化區隨機突變 library 時，是以 LOB280 為模板利 用引子 HJL321 和 HJL61 夾出約 1200 bp 片段，然後用限制酵素 Afl II 和 BstE II 切下中間約 500 bp 活化區隨機突變的片段，置換回 LOB280 並轉形到 DH5α，即得 CaNDT80 活化區隨機突變 library，估計約有兩萬 個菌落。挑選其中 10 菌落將所攜帶的質體送定序，來檢視 Library 歧異 度 (diversity) 和突變率，結果為表五。在這 10 菌落的定序結果中有 55
％ 帶有突變的質體，突變的數目約在 1~3 個核苷酸之間，並且也有 frameshift mutation 產生。
9.4 以 β-galactosidase filter assay 來篩選 library
將 CaNDT80 活化區隨機突變 library DNA 轉形至 SLO121，把所有 經過營養篩選產生的菌落進行第一次 β-galactosidase filter assay，挑得 150 個呈色偏白的菌株。接下來將這些可能因為攜帶的質體上在 CaNDT80 活 化 區 有 重 要 突 變 而 影 響 其 功 能 的 菌 株 劃 出 單 一 菌 落 ， 並 進 行 第 二 次 β-galactosidase filter assay，排除與正、負對照組比較後呈色偏藍者，得到 144 個菌株，再將這些菌株挑起做第三次 β-galactosidase filter assay 的確認 （圖 十九），最後得到 142 個菌株。純化其中 93 個菌株所攜帶的質體並定序
CaNDT80 活化區做比對，定序比對結果整理於表六，結果發現篩選所得的
質體在 CaNDT80 活化區的突變，不是 frameshift mutation，就是 nonsense mutation，所以造成 CaNDT80 失去功能，因此才會經由 β-galactosidase filter assay 篩選出來。
9.5 建構篩選質體 LOB295 並測詴
為 了要 排除 CaNDT80 活化 區隨 機突變 library 中 帶 有 frameshift mutation 和 nonsense mutation 者，因此想要建構一個篩選質體。本實驗改 造的質體選用 pGEM-T easy vector，並使用 kanamycin resistant gene 作為 隨機突變片段的篩選標記 (selective marker)，細部設計如圖二十 (A) 所 示 。 建 構 方 式 以 質 體 LOB64 (pCRII-TOPO-EFG1) 為 模 板 ， 利 用 引 子 HJL1362 和 HJL1363 進行聚合酶連鎖反應夾出 kanamycin resistant gene 啟動子，以及引子 HJL1364 和 HJL1365 夾出 ORF，並以定序確認序列正 確。設計引子 HJL1362 和 HJL1363 時在 5’ 端加上限制酵素切位 Apa I 以便將啟動子接進 pGEM-T easy vector 上，同樣地引子 HJL1364 和
為 了要 排除 CaNDT80 活化 區隨 機突變 library 中 帶 有 frameshift mutation 和 nonsense mutation 者，因此想要建構一個篩選質體。本實驗改 造的質體選用 pGEM-T easy vector，並使用 kanamycin resistant gene 作為 隨機突變片段的篩選標記 (selective marker)，細部設計如圖二十 (A) 所 示 。 建 構 方 式 以 質 體 LOB64 (pCRII-TOPO-EFG1) 為 模 板 ， 利 用 引 子 HJL1362 和 HJL1363 進行聚合酶連鎖反應夾出 kanamycin resistant gene 啟動子，以及引子 HJL1364 和 HJL1365 夾出 ORF，並以定序確認序列正 確。設計引子 HJL1362 和 HJL1363 時在 5’ 端加上限制酵素切位 Apa I 以便將啟動子接進 pGEM-T easy vector 上，同樣地引子 HJL1364 和