6.1 Candida albicans 介紹
Candida albicans 是僅次於 Enterobacteriaceae、Staphylococcus aureus 及 Pseudomonas 的院內感染第四大真核生物感染源 (Calderone, 2002)，也 是臨床上的念珠菌感染最主要的病原菌。C. albicans 是雙倍體真菌，目前 只發現以無性生殖繁殖 (Pujol et al., 1993)。約有 80％ 健康人可在口腔、
腸胃道及生殖道發現它的蹤跡，是人類常見伺機性共生真菌，但是當宿主 免疫力低落或缺損，便會造成念珠菌感染症。大約有 70％ 婦女有過念珠 菌屬 (Candida spp.) 所造成的陰道感染經驗，其中有 20％ 深受反覆復發 之苦 (Fidel et al., 1999)。在台灣，台大醫院研究報告指出，於 1994~2000 年 共有 1095 件院內感染念珠菌菌血症 (candidemia) 案例，其中 50.4％ 為 C. albicans 導致 (Chen et al., 2003)。由於目前真菌治療藥物有限，當演變 為傳播性念珠菌感染 (disseminated Candida infection) 致死率 (mortality) 高達 25％~60％ (Gudlaugsson et al., 2003)。
6.2 Azoles 類藥物抗藥分子機制
目前有許多抗真菌藥物在臨床上使用，但是由於藥物大量且重複性使 用造成抗藥性菌株的產生，使得近年來臨床治療失敗的案例增加。所以我 們希望透過研究 C. albicans 抗藥機轉來找尋新的藥物標的，發展新一代抗 真菌藥物 (Berman and Sudbery, 2002)。
其中 azoles 藥物因產生細胞毒性較小，是臨床最常使用的抗真菌藥 物。在 C. albicans 目前已知的 azoles 類抗藥機制有：(1) Ergosterol 生合 成途徑中的酵素發生改變，例如：azoles 藥物標的 ERG11 的大量表現 (overexpression)，或因突變而造成與 azoles 親和力下降;(2) Efflux pump 的 大量表現，將 azoles 類藥物排出菌體外，使藥物無法累積於菌體內，這是 目前認為最主要的 azoles 抗藥機制之一 (Lamp et al., 1999; Sanglard et al., 1998)。這類抗藥 efflux pump 已知有兩大類：major facilitator superfamily
(Multidrug Resistance 1, MDR1) (Sanglard et al., 1995; Franz et al., 1998) 和 ATP-binding cassette transporter family (Candida drug resistance genes, CDRs) (Prasad et al., 1995; Sanglard et al., 1995 and 1997)，其中 MDR1 大量表現主 要造成 fluconazole 抗藥性，然而 CDR1 和 CDR2 則是對 fluconazole、
itraconazole 和 voriconazole 等多種 azoles 產生抗藥有關 (Coste et al., 2006)。MDR1、CDR1 和 CDR2 已有研究指出在 azoles 抗藥菌株會被其 他相關基因正向調節 (upregulation) 而大量表現 (Akins, 2005; Barker and Rogers, 2006)。
6.3 Candida drug resistance gene CDR1 介紹
CDR1 為 ATP-binding cassette (ABC) transporter family 之中最主要 azoles 抗藥幫浦 (Hernáez et al., 1998; Niimi et al., 2004)，由 Prasad et al. 將 CDR1 轉 形 至 Saccharomyces cerevisiae 的 pdr5/pdr5 同 型 缺 陷 突 變 株 中，發現對於 cycloheximide、chloramphenicol、miconazole、oligomycin、
nystatin 和 2,4-dinitrophenol 會發生抗藥現象 (Prasad et al., 1995)。如同 ABC transporter family 的典型結構，Cdr1p (約 170 kDa) 具有兩個高度疏水 性穿膜區域 (transmembrane domains, TMD) 及兩個位於細胞質內側的親水 性核苷酸結合區域 (nucleotide-binding domains, NBD)。每一個 NBD 伴隨 著一個由六個跨膜區段 (transmembrane segments, TMS) 所組成的 TMD，
TMS 決 定 Cdr1p 的 受 質 特 異 性 (substrate specificity) (Prasad et al., 1995) ， Cdr1p 受 質 種 類 廣 泛 ， 包 括 azoles 藥 物 、 脂 質 及 類 固 醇 (Krishnamurthy et al., 1998; Dogra et al., 1999; Saini et al., 2005)。
研究指出在 azoles-resistant 臨床菌株的 CDR1 mRNA 表現量高於 azoles-susceptible 臨 床 菌 株 (White, 1997; Sanglard et al., 1995) ， 並 且 cdr1/cdr1 同型缺陷突變株對 azoles 藥物敏感性增加 (Coste et al., 2004)。
但目前對於 CDR1 的調控及抗藥性產生之間的分子機制與基因調節網絡 瞭解不多，因此透過瞭解 CDR1 如何被 cis- 和 trans-acting factor 所調控 對於探究抗藥性產生是很重要的。
6.4 CDR1 的 cis-和 trans-acting factor 6.4.1 Cis-acting factor
研究指出 CDR1 promoter 不止與多種藥物作用，如：miconazole、
fluconazole、nystatin 以及 vinblastine，也會被人類的類固醇與其他環境因 素所刺激 (Krishnamurthy et al., 1998)。經由 CDR1 promoter 連續刪除分析 (serial deletion analysis)，發現 promoter 近端區域 (-345/+1) 包含多個藥物 調控區域，而由 miconazole 所作用的 AP-1 site (TGACCCA) 則位於遠端 區域 (-857/-1147) (Puri et al., 1999)。Micheli et al. 找到了 CDR1 promoter 內 的 drug response element (DRE) 序 列 位 於 -460~-440 ， 序 列 為 5’-ACGG(A/T)TATCGGATATTTTTTT-3’，為正向調控 CDR 1 所必需，另 外，也發現了一個位於 -860~-810 的 basal response element (BRE) (de Micheli et al., 2002)。Karnani et al 則找到可被類固醇所調控的 steroid response element (SRE) ， 經 由 刪 除 分 析 研 究 更 進 一 步 發 現 了 只 與 progesterone 作用的 SRE1 (-667~-648) 與對 β-oestradiol 及 progesterone 兩者皆有反應的 SRE2 (-628~-598) 序列，它們對類固醇有極高的專一性，
不受其他藥物影響 (Karnani et al., 2004)。Gaur et al 找到了一個位於 -272~-265 負向調控因子 (negative regulatory element, NRE)，並且純化了一 個能與 NRE 結合的核蛋白，此蛋白可能參與了調控 CDR 1 的表現 (Gaur et al., 2004)。
6.4.2 Trans-acting factor
下列為已知的 CDR1 trans-acting factor (i) Tac1p：
為 CDR1 及 CDR2 的 轉 錄 因 子 (transcriptional factor) ， 具 有 Zn(2)-Cys(6) motif 的鋅指狀蛋白 (Coste et al., 2004)。實驗發現 Tac1p 可以 與 CDR1 promoter 上 的 drug response element (DRE) 結合，因為 DRE 上 有兩個 CGG 序列為典型 Zn(2)-Cys(6) motif 的轉錄因子 DNA 結合區域
(DNA-binding domain)。tac1/tac1 同型缺陷突變株於 fluphenazine 誘導下便 無法正向調控 CDR1 表現，且此菌株對於 fluphenazine、fluconazole 及 tarbinafine 敏感性提高，但在置入單套 TAC1 基因的 tac1/tac1::TAC1 補救 株此現象可以被彌補回來。將 azole-resistant 臨床菌株的 TAC1 hyperactive allele 置入 tac1/tac1 同型缺陷突變株中發現造成 CDR1 及 CDR2 持續高 表 現 量 。 以 上 結 果 可 知 Tac1p 為 CDR1 和 CDR2 轉 錄 活 化 因 子 (transcriptional activator) (Coste et al., 2004 and 2006)。
(ii) CaNdt80p：
為 S. cerevisiae 在減數分裂中出現的轉錄因子 ScNdt80p 的同源蛋白 (Chu et al., 1998) 。 由 Chen et al. 在 S. cerevisiae 中 ， 以 CDR1 promoter-lacZ 為報導系統篩選 C. albicans genomic library 所得之假定轉 錄因子。於 C. albicans 將 CaNDT80 剔除後的同型缺陷突變株會提高對 azoles 藥物 fluconazole、voriconazle 和 miconazole 敏感性，並且 Real-time PCR 實驗中，在 miconazole 誘導下 CDR1 表現量降低，僅剩原來的 15
％ 左右 (Chen et al., 2004)。以上結果顯示，CaNdt80p 為 CDR1 正向轉錄 因子。
(iii) Cka2p：
此蛋白與真核動物 serine/threonine 蛋白激酶 (protein kinase) CK2 具 有催化能力的 α-subunit 有相當程度的相似度，尤其以 S. cerevisiae 的 Cka2p 最相近，相似性高達 65％。研究指出 cka2/cka2 同型缺陷突變株對 fluconazole 敏感性降低。於 northerm blotting 實驗發現，cka2/cka2 同型缺 陷突變株的 CDR1 和 CDR2 表現量提高了 3~5 倍。由以上結果作者推論 Cka2p 可 能 為 CDR1 和 CDR2 之 負 向 調 控 因 子 (negative regulator) (Bruno and Mitchell, 2005)。
6.5 論文研究目的 II
先前實驗室為了篩選出白色念珠菌抗藥幫浦 CDR1 的調控者，於 S.
cerevisiae 中利用 CDR1 promoter–lacZ 作為報導系統進行 C. albicans genomic library screening，發現 CaNDT80 可以正向調控 CDR1 的表現。
將 C. albicans 的 CaNnt80p (672 aa) 與 S. cerevisiae 的 ScNnt80p (592 aa) 進行序列比對後，發現具有同源性。其中 CaNnt80p 的 DNA 結合區 (DNA-binding domain) 胺基酸序列 221~592 與 ScNnt80p 的 DNA 結合 區 胺 基 酸 序 列 1~330 有 35% 一 致 性 (identity) 和 53% 相 似 度 (similarity)。有趣的是 CaNnt80p N 端的 活化區 (activation domain) 和 ScNnt80p C 端的活化區沒有任何相似性，這是一段全新的序列沒有人研究 過它的功能 (Chen et al, 2004; Wang et al., 2006)。故本實驗目的為：
(1) 在 CaNnt80p 活化區製造 random mutation 建構成一個 library，於 S.
cerevisiae 中利用 CDR1 promoter–lacZ 作為報導系統進行篩選，要找出 CaNnt80p 活化區哪些胺基酸對於正向調控 CDR1 的表現扮演重要的 角色。
(2) 建構具有篩選性的質體，除去 random mutation DNA 片段中帶有不要想 要 的突 變，如 ： nonsense 及 frameshift mutation ， 以便於 後續篩 選 CaNnt80p 活化區重要胺基酸的研究。