8.1 易誤聚合酶連鎖反應 （error-prone PCR）
此方法用來產生隨機突變的 CaNDT80 活化區 DNA 片段，所使用的 DNA 模版是 LOB280。將下列物質混合於 0.5 ml 之微離心管：總體積為 50 μl 的反應液中加入 5 μl 的 10 X PCR buffer、1 unit rTaq DNA polymerase （5 unit/μl, GE Healthcare, Cat. No. 27-0798-06）、5 μl 的 2.5 mM dNTP、5 ~ 9 mM 的 MgCl2 （依照所要突變的頻率來決定所需濃度，本實 驗的 library 使用的濃度是 7 mM）、50 μM 的 Forward primer– HJL321 和 Reverse primer– HJL61 各 1 μl、5 ng 質體 LOB280、無菌二次水。反應步 驟為：（1）95℃, 5 分鐘 （2）95℃, 1 分鐘 （3）50℃, 1 分鐘 （4）72℃, 5 分鐘 （5）重複（2）~（4）步驟 35 次 （6）72℃, 8 分鐘 （7）4℃停 止反應。
8.2 E. coli 轉形反應－電穿孔法 （electroporation） library scale
CaNDT80 活化區的隨機突變 library 使用的是 Lucigen 的轉形細胞 E. cloni 10G SUPREME DUOs （Cat. No. 60080-1），並依照說明書操作電穿 孔轉形反應後，將菌液均勻塗於含 Ampicillin 的培養基上，放到 37℃培養 箱至隔天，將長出的菌落以細胞刮刀刮下溶於 30 ml 含 Ampicillin 的 LB Broth，取其中 5 ml 菌液存凍管，剩餘的菌液養在 500 ml 含 Ampicillin 的 LB Broth 以 37℃ 培養 4 小時後，使用 Qiagen Inc 的產品 QIAGEN Plasmid Mega Kits （Cat. No. 12183），並依照說明書純化取得 CaNDT80 活 化區的隨機突變 DNA library 質體。
8.3 啤酒酵母轉形反應－LioAc method
8.3.1 製備啤酒酵母轉形細胞 （「」 內體積或質量是 library-scale 轉形方 法）
將啤酒酵母養在 3 ml YPD medium 中，於 30℃ 以 150 rpm 震盪培
養 8 ~ 12 小時後，取 5 μl 菌液轉養到 50 ml YPD medium 中，於 30℃ 以 230 ~ 250 rpm 震盪培養 16 ~ 20 小時後 （OD600約 0.15 ~ 0.3），室溫下以 轉速 3000 rpm 離心 5 分鐘，「去除上清液，以 100 ml YPD 將細胞重新懸 浮，震盪培養於 30℃ 3 小時後 （最後 OD600約 0.4 ~ 0.5），離心 5 分鐘」，
去除上清液以 50 ml 無菌二次水清洗細胞，再離心 5 分鐘去除上清液，以 3 ml 1.1X TE/LiOAc 使細胞懸浮，分裝在兩個 1.5 ml 微離心管中，以轉速 13000 rpm 離心 1 分鐘，去除上清液後各加入 600μl 1.1X TE/LiOAc 混合 均勻，製備好的啤酒酵母轉形細胞在室溫下備用。
8.3.2 轉形反應
將 1.5 ml 「15 ml」 的離心管放在冰上預冷，加入 0.1 – 1 μg 「1 – 10 μg」 欲轉形的 DNA、事先以 100℃ 加熱 5 分鐘然後移至冰上急速冷卻 的 5 μl 「20 μl」 Herring Testes Carrier DNA （10 μg/ml），以及 50 μl 「600 μl」 轉形細胞輕輕的混合後，再加入 0.5 ml 「2.5 ml」 PEG/ LiOAc solution 均勻混合，於 30℃ 培養箱慢速旋轉 30 分鐘 「45 分鐘」，然後加入 20 μl DMSO 混合，接著在 42℃ 水浴槽，進行 15 分鐘 「20 分鐘」 熱休克
（Heat shock） 反應，過程中每 5 分鐘 「10 分鐘」 輕輕上下翻轉，結 束後以轉速 13000 rpm 離心 1 分鐘 「5 分鐘」 去除上清液後，「加入 3 ml YPD 在 30℃ 震盪培養 90 分鐘後以轉速 13000 rpm 離心 5 分鐘，去除 上清液」，加入 200 μl 無菌二次水使細胞懸浮，取適量菌液均勻塗於適量 的 100 mm 「150 mm」 篩選 SD 培養基，於 30℃ 培養 2 ~ 3 天，直到 菌落長成適當大小。
8.4 β–galactosidase Colony Lift Filter Assay
將啤酒酵母培養在營養篩選的 SD 培養基上，在 30℃ 培養箱中培養 2–3 天後，把啤酒酵母複印到有濾紙的新培養基上，於 30℃ 培養至隔天。
將長有菌落的濾紙邊緣以鉛筆做記號方便辨認方位，之後浸入液態氮中 10 秒後 （有菌落那一面朝上），於室溫下回溫，此步驟重複兩次確保破菌完
全。在回溫的空檔以 Z buffer/2ME/X–gal 浸潤新濾紙 （需浸潤完全，但溶 液不會到處流動狀態），接著小心地將長有菌落的濾紙疊放在已經含有 Z buffer/2ME/X–gal 的濾紙上，兩張濾紙間若有氣泡可用鎳子趕走，最後放 到 30℃ 培養箱中進行反應，每隔 15 ~ 20 分鐘 觀察呈色反應。
8.5 從啤酒酵母中萃取質體 DNA 並轉形到 E. coli
將啤酒酵母培養在 5 ml 篩選性的培養液中，在 30℃ 培養箱中以 150 rpm 震盪培養 2 天後，取 1.5 ml 的菌液以轉速 13000 rpm 離心 1 分鐘，
去除上清液，加入 0.2 ml Breaking Buffer、0.2 ml phenol–chloroform–isoamyl alcohol （25：24：1） 和 0.3 g acid-washed glass beads，在室溫下以最大 速度震盪以上混合物 10 分鐘，接著以轉速 13000 rpm 離心 5 分鐘，將含 有質體 DNA 的水層移至乾淨的 1.5 ml 微離心管，取 5 μl 進行 E. coli 的 轉形反應，所使用的轉形細胞為 RBC Bioscience 的 Value 108 HIT–DH5α
（Cat. No. RH617）。