探討 URA3、FUR1、FCY1、FCY2 序列與不同物種間

根據 MIC 結果挑選有興趣的 13 組（38 個菌株，表一編號以紅色底 線標示者），並將挑選原則詳細列於結果 4.1。根據前人研究 pyrimidine de novo pathway 中的基因變異，例如：造成 URA3 的大量表現，或對受質親 和力變佳，會增加 UMP 合成，與 5-FC 的代謝物進行競爭，這是可能的 抗藥機制之一 (Hope et al., 2004; Polak, 1977)。以及 UV 處理 C. albicans (Fasoli and Kerridge, 1988) 和 Saccharomyces cerevisiae (Jund and Lacroute, 1970) 的實驗顯示，發現破壞任何與 pyrimidine salvage pathway 上相關蛋 白 質 或 是 影 響 其 相 關 調 控 會 對 5-FC 產 生 抗 藥 性 ， 所 以 我 們 就 從

pyrimidine de novo pathway 的 URA3 和 salvage pathway 的 FUR1 、 FCY1、FCY2 這四個基因進行序列分析

首先，URA3 (orotidine-5’-phosphate decarboxylase, ODCase) 的結果只有 YM020112 在第 791 個核苷酸是 C/T 的異型合子，其抗藥衍生株 R1 和 R2 都是 T/T 的同型合子，分別在 ODCase 第 264 個胺基酸為 Thr (ACC) 和 Ile (ATC) 是有差異，其他組 parental strain 與抗藥衍生株之間序列一 致，組別之間的差別則是除了 YM020347 和 YM020715 與其抗藥衍生株 第 791 個核苷酸是 C/T 之外，其他組別則都是 C/C。至於核苷酸 791 的 改變是否對於 URA3 功能有影響，故造成對 5-FC 感受性變化，有待更多 的證據。URA3 的相關研究，由 Desnos-Ollivier 等人分析所收集的 C.

tropicalis 臨床菌株時，發現 5-FC 敏感株在 529 nt 的位置不是 A/A 就是 A/G，但是抗藥株則是 G/G (Desnos-Ollivier et al., 2008)，但是本實驗的菌 株無論是敏感株或是抗藥衍生株都是 A/A 的同型合子型，並沒有發現相同 的狀況。

FUR1 (uracil phosphoribosyl transferase, UPRT) 分析結果顯示所有組別 parental strain 和抗藥衍生株之間沒有不同，但是組別之間主要在 21、93、

237、501 和 507 核苷酸位置有 SNP 的差異，但是這些變化不會改變 UPRT 的胺基酸組成，將這些 SNP 差異和分離出菌株的醫院與採集的部位，如血 液、尿液做比較，沒有找到任何關連。UPRT 在 C. tropicalis 目前沒有相 關的研究文獻，但在 S. cerevisiae 中 UPRT 胺基酸 134 被報導過和 5-FC 抗藥性有關連 (Kern et al,. 1991)，在 C. albicans 有研究指出，在同源位置 核苷酸 301 的位置是同型合子型 C/C 對 5-FC 是敏感的，異型合子型 C/T 較不敏感，T/T 則會有抗藥性 (Dodgson et al, 2004)，同年 Hope 等人的研 究也指出在相同位置胺基酸 101 由 Arg (CGT) 被置換成 Cys (TGT) 與 5-FC 抗藥性有關。根據 Toxoplasma gondii 的 UPRT 3D 結晶結構所提供的 訊息 (Schumacher et al., 1998, and 2002)，推測 C. albicans 的 UPRT 胺基 酸 Arg101 可 能 與 Asp36 產 生 鹽 橋 (salt bridge) 後 ， 以 靜 電 力 (electrostatic force) 形成二聚體 (dimer)，再聚合成四聚體 (tetramer)，才使

UPRT 有適當酵素活性，所以如果 Arg101 被取代成 Cys 則無法與 Asp36 產生鹽橋 (Hope et al., 2004)。

FCY1 (cytosine deaminase) 在 38 株菌中的序列完全一致，表示這個基 因是非常保守的。在 Candida lusitaniae 的研究發現 FCY1 核苷酸 26T 置 換為 C，產生 missense mutation 使第 9 個胺基酸由 Met 變成 Thr，會對 5-FC 產生抗藥性 (Florent et al., 2009)，另外，同一個團隊研究 FCY2 突變 也有相同結果，而且當 5-FC 和 fluconaolze 同時存在時，不管 FCY1 或 是 FCY2 的突變都會產生交互抗性 (cross-resistance)，推測可能的機制是在 細 胞 之 外 5-FC 是 fluconaolze 運 送 吸 收 的 競 爭 抑 制 物 (competitive inhibitor) (Chapeland-Leclerc et al., 2005; Papon et al., 2007)，在 C. tropicalis 是否有相同競爭現象需要更進一步研究。

最後是 FCY2 (purine-cytosine permease, PCP) 序列分析，在組別之間 ORF 主要在 102、225、273、750 和 756 nt 發現有差異，比較不一樣的是 組 別 YM020112 、 YM020291 、 YM020347 、 YM020743 、 YM060088 和 YM060800 這六組抗藥衍生株和 parental strain 序列比較後，在抗藥衍生株 中發現原本的 SNP 消失，變成同質序列，發生了 Loss of heterozygosity (LOH) 的現象。在 102、225、750 和 756 nt 的 SNP 差異不會造成 PCP 胺 基酸組成改變，但是原本在第 273 個核苷酸是 G/T 的異質合子型的 parental strain，所轉譯的 PCP 在第 91 個胺基酸分別是 Met (ATG) 和 Ile (ATT)，而抗藥衍生株從定序結果顯示只有轉譯為 Ile 的 T 股序列，會不 會是因為 T 股轉譯的 PCP 在第 91 個胺基酸的突變造成功能性的影響，

以致於產生抗藥？另外，也將這六組定序 FCY2 上下游 500 bp 找到各有 5 個和 1 個 SNP，所以也有可能因為 T 股的 promoter 上面的訊號區突 變造成 FCY2 mRNA 的表現量下降，造成其基因產物 PCP 產量不足，使 得 5-FC 無法經由 PCP 運送進入菌體內代謝達到抗菌效果，因此產生抗藥 性。

為了驗證 FCY2 的 LOH 現象與 5-FC 抗藥性有關，挑選抗藥衍生株 與 parental strain 之間 SNP 差異較少的 YM020291 (表四)，以 SAT1

flipper 進行 G 股和 T 股同源重組置換與單股缺陷性突變，得到兩股相同 的同質合子型置換株和單股缺陷突變株，測詴對 5-FC 的感受性。結果如 圖 十 二 所 示 ， 發 現 FCY2 (273G)/ FCY2 (273G) 同 質 置 換 株 和 FCY2(273G)/fcy2△ 單股缺陷突變株比 YM020291 更敏感一點，至於 FCY2 (273T)/FCY2 (273T) 同質置換株和 FCY2 (273T)/fcy2△ 單股缺陷突變株則 是比 YM020291 更加地抗藥 (≧ 64 μg/ml)，故抗藥衍生株不論是在 G 股 發生缺失了包含 FCY2 的部分片段，或者是因為 recombination 將 G 股置 換成 T 股，都能因此得到抗藥性，證實了 FCY2 的 LOH 現象與 5-FC 抗 藥性有關。由於定序同質合子型置換株的上游序列確認置換範圍，結果都 有置換到上游 -69、-224 的 SNP 位置，因此 FCY2 的 LOH 產生抗藥的 原因則有兩種可能：第一，T 股轉譯的 PCP 在第 91 個胺基酸變成 Ile，

可能造成功能性突變，例如：使 PCP 失去運送 5-FC 的能力；第二，T 股 上游的 SNP 為 promoter 訊號區，因為突變造成 FCY2 mRNA 的表現量下 降，使 5-FC 無法經由 PCP 運送進入菌體。因此 FCY2 (273G)/FCY2 (273G) 和 FCY2(273G)/fcy2△會比 YM020291 (FCY2 (273G)/FCY2 (273T)) 更敏感 的原因，可能是他們 FCY2 所產生的 PCP 具有正常功能，或是 FCY2 mRNA 表現量正常。針對 FCY2 上游 -69、-224 的 SNP 位置是否位於可 能的調節序列中，如 TATA box (5’-TATA(A/T)A(A/T)(A/G)-3’) (Basehoar et al., 2004) ， 經 比 對 發 現 -314~-307 有 可 能 是 TATA box ， 序 列 為 5’-TATATATA-3’，但 -69、-224 則不在已知調節序列中。

本實驗序列分析之 13 個 parental strains 將 URA3、FUR1、FCY1 及 FCY2 序列的 SNP 位置差異與菌株分離的來源區域進行統整比較，沒有發 現兩者之關連性。另外，挑選在 E-test 對 5-FC 非常敏感並且 72 小時抑 菌 圈 沒 有 長 出 抗 藥 衍 生 株 的 YM020367 、 YM020649 、 YM060302 和 YM060559 定序 FCY2 ORF 做為對照，發現他們都是在 273 為 G/G 同質 合子型。所以推測這些菌株對 5-FC 如此敏感的可能原因，也許是因為在 藥物篩選下即使 LOH 機制啟動，但因他們只有 G 股，沒有 T 股可作為 置換模版，因此無法產生抗藥衍生株。

5.3 Loss of heterozygosity (LOH) 發生機制探究與抗藥性產生的關係

最早在某些癌症高危險群中發現他們在癌症相關基因為異型合子型 (heterozygosity)，例如 tumor suppressor，原本一股 (wild type allele) 有正常 功能，但另一股 (non-functional allele) 因突變失去功能，可能在 wild type allele 發 生 了 chromosome loss 或 缺 失 了 部 分 片 段 ， 也 可 能 因 為 recombination 將 wild type allele 置換成 non-functional allele，於是細胞不 正常增生，故導致癌症發生，以上的基因變化，稱為 Loss of heterozygosity (LOH) (Cavenee et al., 1983; Carr and Gottschling, 2008)。在 C. albicans 有研 究指出 LOH 與 azloe 抗藥性有關。Azole 類藥物 efflux pump-CDR1、

CDR2 的 轉 錄 因 子 Tac1 ， 因 為 LOH 讓 兩 股 變 成 hyperactive mutated alleles，使 CDR1 和 CDR2 大量表現，或者是 LOH 發生在同樣的位於 chromosome 5 上的 azole 標的基因 ERG11 導致兩股為 mutant allele，使 藥 物 無 法 與 其 結 合 作 用 (Coste et al., 2007) ， 以 及 在 另 一 個 efflux pump-MDR1 的轉錄因子 MRR1 也發生 LOH 造成 azole 抗藥 (Dunkel et al., 2008)。

LOH 發 生 的 原 因 可 能 是 gene conversion 、 allelic recombination/

break-induced replication，或者是 chromosome loss 和 reduplication 所導致 (Coste et al., 2007)，這些過程與 DNA repair 相關。Legrand et al. 將 C.

albican 中與 mismatch repair (MMR) (MEH1、PMS1) 和 double-strand break repair (DSBR) (MRE11、RAD50、RAD52、YKU80) 的相關基因剔除，研究 指出 MMR mutant (msh2△/msh2△、pms1△/ pms1△) 和 DSBR mutant (rad50△/ rad50△) 在 fluconazole 的 E-test 抑菌圈產生抗藥菌落的頻率 增加，Legrand et al. 研究顯示 DNA repair pathway、genome instability 與藥 物抗藥性是彼此連結的 (Legrand et al., 2007)。因此在本實驗於 FCY2 發現 有 LOH 現象之菌株也許在 DNA repair 的機制有缺陷，故造成 genome 的不穩定，使得 LOH 發生，這可做為未來研究的方向之一。

5.4 Purine-cytosine permease (PCP) 在不同物種間對於抗藥性的相關研究 和蛋白質相似度

Purine-cytosine permease (PCP) 可 運 送 adenine 、 hypoxanthine 和 cytosine，以 proton gradient 作為運送物質能量 (Vanden Bossche et al., 1987)，5-FC 則是 cytosine 類似物 (fluorinated analogue)，也可被 PCP 所 運送，是 cytosine 的 competitive antagonist (Polak and Grenson, 1973)。在 S.

cerevisiae 中已有研究指出 FCY2 發生突變會造成 5-FC 抗藥性 (Jund and Lacroute, 1970; Chevallier et al., 1975)，並且 Paluszynski et al. 發現 FCY2 突變株只在 5-FC 濃度低時有抗藥性，濃度高還是會抑制生長，表示可能 還有其他 5-FC 吸收途徑存在，於是找到同樣位於 chromosome 5 的同源 基因 FCY21 和 FCY22。他們分別與 FCY2 有 89％ 和 85％ 相似度 (Wagner et al., 2001; Paluszynski et al., 2006)，以基因剔除研究，發現同時失 去三個基因，對 5-FC 抗藥性比起任何一個基因單一突變效果更好。除此 之外，作者也提出 TPN1、FUR4 和 yOR071c (Stolz and Vielreicher, 2003;

Seron et al., 1999; Enjo et al., 1997) 也可能是參與 5-FC 運送的 permease (Paluszynski et al., 2006)。在 C. albicans 中則有四個可能的 PCP 同源基 因：FCY21、FCY22、FCY23 和 FCY24，根據 PCP 輻射系統發生樹分析，

C. albicans 的 FCY21 和 FCY22 與 S. cerevisiae 運送 cytosine 的 FCY2 比較接近 (Schmidt et al., 1984; Weber et al., 1990)，FCY23 和 FCY24 則是 與 負責 運送維 他命 B6 的 Tpn1 親 源關 係較近 (Stolz and Vielreicher, 2003)，所以 FCY21 和 FCY22 可能是運送 5-FC 的 PCP 基因，另外，有 臨床分離抗藥性菌株在這兩個基因上發現胺基酸取代現象，但是目前仍需 要相關文獻提出有力的證據證實是否相關 (Hope et al., 2004)。在本研究 中，證實了 C. tropicalis 的 FCY2 基因的 LOH 現象與 5-FC 抗藥性產生 有關，其中一個可能的原因為 PCP 的第 91 個胺基酸可能扮演重要功能。

把 C. tropicalis 的 FCY2 蛋白質序列與 S. cerevisiae 的 FCY2、FCY21、 FCY22 和 C. albicans 的 FCY21 和 FCY22，以及另一個 C. tropicalis 可能 的 PCP-CTRG00460 進行蛋白質序列比對，結果整理於圖十三。目前 PCP

蛋白質結構功能在 S. cerevisiae 研究比較透徹，在親水性片段 371-377 (I-A-N-N-I-P-N) 功 能 為 產 生 正 確 的 3D 結 構 ， 其 中 Pro376 在 translocation 的 過 程 中 形 成 二 級 β-turn motif ， 扮 演 一 個 動 態 的 角 色 (Ferreira et al., 1997; 1998, and 1999)，另外，Ser272 則是在牽涉 translocation 過程的親水性孔洞的一部份 (Ferreira et al., 1999)，但是 C. tropicalis 的 PCP 第 91 個胺基酸都不在這幾個位置，比對結果顯示也非保守的胺基 酸，所以這個位置可能是 C. tropicalis 的 PCP 重要功能胺基酸。至於 C.

tropicalis 另一個可能的 PCP 是 CTRG00460 與自己的 FCY2 比對後只 有 48％ 的相同度 (identity)，但和 C. albicans 的 FCY22 有 75％ 的相同 度；反過來，FCY2 與 C. albicans 的 FCY21 比對則有高達 85％ 的相同 度，也許代表著雖然他們都是 PCP，但是在細胞中在運送物質上扮演的不 同的角色。

5.5 其他可能牽涉 5-FC 抗藥機制討論

在這 13 組 (38 株菌) 的序列分析中只有 6 組(18 株菌)找到 FCY2 基因的 LOH 現象與 5-FC 抗藥性產生有關，代表 C. tropicalis 仍然有其 他的機制涉及 5-FC 抗藥，有待研究。底下推測可能其他的機制：第一，

另一個可能的 PCP 是 CTRG00460 序列突變造成的抗藥性，有待序列的 分析；第二，由於 C. tropicalis 的 genome database 尚未建構完成，所以可 能還有其他 PCP 參與 5-FC 運送至菌體內的過程；第三，除了 URA3 之 外的 pyrimidine 生合成的 de novo pathway 基因發生序列變化，或基因表 現量改變，或者是還有其他的途徑共同參與，以上都有可能是發生抗藥性

另一個可能的 PCP 是 CTRG00460 序列突變造成的抗藥性，有待序列的 分析；第二，由於 C. tropicalis 的 genome database 尚未建構完成，所以可 能還有其他 PCP 參與 5-FC 運送至菌體內的過程；第三，除了 URA3 之 外的 pyrimidine 生合成的 de novo pathway 基因發生序列變化，或基因表 現量改變，或者是還有其他的途徑共同參與，以上都有可能是發生抗藥性