CLSI broth microdilution method

M27A 說明書操作。實驗操作前須先配製適量 RPMI 1640 broth （pH7.0, Gibco BRL, Cat. No. 31800022）、無菌 0.85% NaCl，放置於 1 liter 的血清 瓶中，並裝上分注吸管後置於 4℃ 冰箱中備用。配好 2 倍濃度梯度之抗 藥性詴驗培養盤 （避光），放置於 -80℃ 冰箱中備用。

第一天

1. 自 -80℃ 冰櫃中取出標示有編號的單一菌株存菌管，用竹棒挖取少許菌 液，放到含有 1.0 ml BHI （Cat. No. 237500）的 24-well plate。置於 35℃

培養箱培養。

2. 取出所需數量的 12×75 ㎜ 玻璃詴管，以標示筆標示待測菌株編號，置於 鐵架，以鋁箔紙覆蓋後，利用高壓滅菌鍋進行滅菌，滅菌後取出備用。

3.取無菌離心管，標示待測菌株編號後，放置於鐵架上備用。

第二天

1. 至 -80℃ 冰櫃中取出適量已配製好的 2 倍濃度梯度之抗藥性詴驗培養 盤，放置於室溫下，回溫備用。

2. 取出經 24 小時 35℃ 培養的 24-well plate，利用 Pipet 混合均勻，吸 取 100 μl 菌液，加入含有 2 ml 0.85% NaCl 的玻璃詴管，以震盪器充分 混合均勻。

3. 利用 colorimeter 調整使菌液約為 0.5 McFarland （1~5×10⁶ CFU/ml）， 過高或偏低可透過加入適量 0.85% NaCl 或菌液來調整。

4. 以震盪器充分混合均勻後, 依序以 0.85% NaCl 十倍稀釋，再二十倍稀 釋，最後以 RPMI 1640 broth 十倍稀釋。

5. 將已回溫的抗藥性詴驗培養盤標示檢體編號，將稀釋好的 RPMI 1640 broth 菌液混合均勻後，倒入無菌藥品槽，利用 12 爪 Pipet 裝上 11 支

tips，吸取 100 μl 菌液，同時加入 A 列 1~11 行 的培養盤中，第 12 行 不加菌液，為無菌操作的對照組 （注意 tip 不要沾到藥盤裡的 RPMI）。 6. 更換 tips，重複步驟 4 跟 5，依序將檢體分別加入 B~H 列。

7. 添加完畢後，蓋上抗藥性詴驗培養盤蓋子，放入 35℃ 培養箱中培養。

第三天

讀取培養盤菌液生長濃度

1. 開啟 Biotrack II plate reader 電源，於主畫面中進入 select method 中選 YEAST 後，機器會進入 YEAST 模式。

2. 啟動電腦。在桌面上點選 Bio DC 程式捷徑，開啟視窗後，點選 run，

在點選 new data 後即可讀取培養盤讀值

3. 取出已經 35℃ 培養 24 小時 的抗藥性詴驗培養盤，放在具有 96-well plate 專用承載盤的震盪器上，調整震盪速度於 2~3 之間，震盪時間約 1 分鐘。

4. 震盪均勻後，將培養盤蓋子移開，將培養盤放置於 Biotrack II plate reader 的讀取槽內。在 Biotrack II plate reader 上輸入該培養盤的編號後，接著 選點 run，則培養盤會進入機器內部，先進行 5 sec 的 pre-mix 後，再 接著讀取吸光值。讀取完畢後培養盤會退出，且在電腦程式中顯示出 96- well 的 OD 數值。

5. 將培養盤取出，並將培養盤蓋子蓋上，重複操作步驟 3、4、5 直到全部 的培養盤都讀取完成後，於 Bio DC 點選 finish 將結果匯出到 Excel 並存檔，培養盤放回 35℃ 培養箱繼續培養 24 小時。

分析結果，判讀 MIC 數值。

1. 開啟存有 OD 讀值的 Excel 檔，將所有資料轉貼到新的 Excel，再利用 Excel 的運算功能，先進行歸零減除 Blank 的運算，再運算每一 well 與 Postive (growth) control 的百分比數值。

2. 利用 Excel 中 If 函數的功能 〔if(value <=50,”R”,mic conc.)〕，在 Flucytocine 若百分比數值 >50，則顯示 R，若百分比數值 <=50 則顯示 該 well 的詴藥濃度。

3. 讀取 MIC 數值，將結果輸入資料庫中。

第四天

讀取 48 小時培養盤黴菌生長濃度，重複第三天的操作方式，讀取 MIC 數值，並將結果輸入資料庫中。Flucytocine 的 MIC 數值判讀為以 48 小 時時菌量混濁度為不加藥的正對照組的百分之五十的藥物濃度。