探討不同中西藥影響兔子動脈粥狀硬化之機轉; Effects of various western and herbal medicines on the

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(1)中國醫藥學院醫學研究所碩士論文. 探討不同中西藥影響兔子動脈粥狀硬化之機轉 Effects of various western and herbal medicines on the study of the rabbit model in atherosclerosis. 指導教授：張文正、吳介信老師研究生：尹寶倫中華民國九十二年七月. 1.

(2) 目. 錄. 封面… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 1. 目錄… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 2-3. 中文摘要… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 4. 英文摘要… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 5. 圖目錄 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 6-8. 表目錄 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 9. 第一章前言… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 10-29. 第二章實驗材料與方法… … … … … … … … … … … … … … … … …. 30-44. 第三章實驗結果第一節總論… … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 45-49. 第二節西方點墨法 Fas-Ligand 結果各論. 50. … … … … … …. 第三節西藥組 … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 51-62. 第四節中藥組－川芎 … … … … … … … … … … … … … … …. 63-74. 第五節中藥組－厚朴 … … … … … … … … … … … … … … …. 75-86. 第六節中藥組－丹參 … … … … … … … … … … … … … … …. 87-98. 第七節中藥組－紅花… … … … … … … … … … … … … … …. 99-110. 2.

(3) 第八節中藥組－石斛 … … … … … … … … … … … … … … …. 111-122. 第四章討論第一節西藥組 probucol… … … … … … … … … … … … … … 123-125 第二節西藥組 lovastatin… … … … … … … … … … … … … … 126-128 第三節中藥組－川芎… … … … … … … … … … … … … …. 129. 第四節中藥組－厚朴… … … … … … … … … … … … … …. 130-131. 第五節中藥組－丹參… … … … … … … … … … … … … …. 132-133. 第六節中藥組－紅花… … … … … … … … … … … … … …. 134. 第七節中藥組－石斛… … … … … … … … … … … … … …. 135. 第五章表. … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 136-146. 第六章參考文獻 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 147-156. 3.

(4) 中文摘要. 心血管疾病與動脈粥狀硬化在現今工業社會中有很高的罹病率與死亡率。動脈粥狀硬化是一種主要侵犯大型與中型動脈的疾病，其典型病徵是細胞內外脂質的堆積，泡沫細胞的形成，血管平滑肌的增生與結締組織的堆積。血漿中脂質與脂蛋白可能在動脈粥狀硬化病變形成時扮演重要的角色，在過去的諸多研究也指出低密度脂蛋白的氧化修飾，可能在動脈粥狀硬化病理變化過程中扮演重要的角色。由於動脈粥狀硬化與血中膽固醇及自由基存在有高度相關性，因此若能降低血中膽固醇、低密度脂蛋白及提高抗氧化能力，則可以有效預防動脈粥狀硬化形成。因此本實驗的目的主要在探討中藥在粥狀動脈硬化之影響機轉及抗氧化作用。本實驗利用含有 0.5﹪膽固醇飼料內加入 1％的各種中藥，餵食紐西蘭白兔共 8 週，分別於不同時間測量血液中膽固醇、低密度脂蛋白、脂質過氧化、自由基含量、及細胞凋亡路徑上游 Fas-ligand 表現量，觀察主動脈脂質沉積的情形、及測量組織內自由基含量。實驗結果顯示使用之中藥對於降低血液中總膽固醇、低密度脂蛋白、肝臟自由基及脂質沉積方面具有良好的作用，證實使用之中藥可提供人體預防粥狀動脈硬化機轉進一步探討之參考。. 4.

(5) 英文摘要 Cardiovascular diseases and atherosclerosis remain the leading cause of mortality and morbidity in industrialized society.Atherosclerosis is a disease which affects large and medium-sized arteries.Typical features of atherosclerosis are accumulation of intra- and extracellular lipids, foam cell formation,proliferation of smooth muscle cells and accumulation of connective tissue.Plasma lipids and lipoproteins play an important role in the formation of atherosclerotic lesions. In the past evidence suggests that oxidation modification of low-density lipoproteins （ LDL） may play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis. The aim of this study was to investigate whether the antioxidant and anti-atherogenic effects of Chinese herb in rabbit model related to atherosclerosis. In this study, we fed New Zealand white rabbits with 0.5% cholesterol and 1% herbal extracts to explore the molecular mechanisms of. Salvia miltiorrhiza、. Ephemerantha lonchophylla、Flos carthami 、Ligusticuum chuanxiong、Magnolia officinalis and western medicine probucol、lovastatin in those antioxidative effects.We measured blood Cholesterol , TG, and LDL as indexes of lipid-lowing. That free radicals from blood and liver are produced in the body, sudan Ⅳ stain exhibits aorta lipid deposition formation,and also extracted proteins from vessels to study the fas-ligand protein expression of vessels cell apoptosis.The result exhibits that plasma levels of total cholesterol、LDL-C、liver free radical and lipid deposition were increased in the cholesterol group compared to the normal group，and decrease in the Chinese herbs group. compared to the cholesterol group.These results suggest. that the antioxidant and hypolipidemic effect of Chinese herbs could be useful in the prevention of atherosclerosis .. 5.

(6) 圖目錄 Fig 1 給予 probucol、lovastatin 治療後其體重在 4、 8 週之結果 Fig 2 給予 probucol、lovastatin 治療後其 cholesterol 在 4, 8 週之結果 Fig 3 給予 probucol、lovastatin 治療後其 GPT 在 4, 8 週之結果 Fig 4 給予 probucol、lovastatin 治療後其 LDL-C 在 4, 8 週之結果 Fig 5 給予 probucol、lovastatin 治療後其 TG 在 4, 8 週之結果 Fig 6 給予 probucol、lovastatin 治療後其 MDA 在 4, 8 週之結果 Fig 7 給予 probucol、lovastatin 治療後其血液過氧化氫自由基，在 4, 8 週之結果 Fig 8 給予 probucol、lovastatin 治療後其血液超氧自由基，在 4, 8 週之結果 Fig 9 給予 probucol、lovastatin 治療後其肝臟自由基之結果 Fig 10 給予 probucol、lovastatin 治療後其主動脈血管染色之結果 Fig 11 給予 probucol、lovastatin 治療後其主動脈血管 Western blot Fas-ligand 之結果 Fig 12 給予 lovastatin、川芎治療後其體重在 4、 8 週之結果 Fig 13 給予 lovastatin、川芎治療後其 cholesterol 在 4, 8 週之結果 Fig 14 給予 lovastatin、川芎治療後其 GPT 在 4, 8 週之結果 Fig 15 給予 lovastatin、川芎治療後其 LDL-C 在 4, 8 週之結果 Fig 16 給予 lovastatin、川芎治療後其 TG 在 4, 8 週之結果 Fig 17 給予 lovastatin、川芎治療後其 MDA 在 4, 8 週之結果 Fig 18 給予 lovastatin、川芎治療後其血液過氧化氫自由基，在 4, 8 週之結果 Fig 19 給予 probucol、川芎治療後其血液超氧自由基，在 4, 8 週之結果 Fig 20 給予 probucol、川芎治療後其肝臟自由基之結果 6.

(7) Fig 21 給予 lovastatin、川芎治療後，其主動脈血管染色之結果 Fig 22 給予 lovastatin、川芎治療後其主動脈血管 Western blot Fas-ligand 之結果 Fig 23 給予 lovastatin、厚朴治療後其體重在 4、 8 週之結果 Fig 24 給予 lovastatin、厚朴治療後其 cholesterol 在 4, 8 週之結果 Fig 25 給予 lovastatin、厚朴治療後其 GPT 在 4, 8 週之結果 Fig 26 給予 lovastatin、厚朴治療後其 LDL-C 在 4, 8 週之結果 Fig 27 給予 lovastatin、厚朴治療後其 TG 在 4, 8 週之結果 Fig 28 給予 lovastatin、厚朴治療後其 MDA 在 4, 8 週之結果 Fig 29 給予 lovastatin、厚朴治療後其血液過氧化氫自由基，在 4, 8 週之結果 Fig 30 給予 lovastatin、厚朴治療後其血液超氧自由基，在 4, 8 週之結果 Fig 31 給予 lovastatin、厚朴治療後其肝臟自由基之結果 Fig 32 給予 lovastatin、厚朴治療後，其主動脈血管染色之結果 Fig 33 給予 lovastatin、厚朴治療後其主動脈血管 Western blot Fas-ligand 之結果 Fig 34 給予 lovastatin、丹參治療後其體重在 4、 8 週之結果 Fig 35 給予 lovastatin、丹參治療後其 cholesterol 在 4, 8 週之結果 Fig 36 給予 lovastatin、丹參治療後其 GPT 在 4, 8 週之結果 Fig 37 給予 lovastatin、丹參治療後其 LDL-C 在 4, 8 週之結果 Fig 38 給予 lovastatin、丹參治療後其 TG 在 4, 8 週之結果 Fig 39 給予 lovastatin、丹參治療後其 MDA 在 4, 8 週之結果 Fig 40 給予 lovastatin、丹參治療後其血液過氧化氫自由基，在 4, 8 週之結果 Fig 41 給予 lovastatin、丹參治療後其血液超氧自由基在 4, 8 週之結果 Fig 42 給予 lovastatin、丹參治療後其肝臟自由基之結果 Fig 43 給予 lovastatin、丹參治療後，其主動脈血管染色之結果 Fig 44 給予 lovastatin、丹參治療後其主動脈血管 Western blot Fas-ligand 之結果 7.

(8) Fig 45 給予 lovastatin、紅花治療後其體重在 4、 8 週之結果 Fig 46 給予 lovastatin、紅花治療後其 cholesterol 在 4, 8 週之結果 Fig 47 給予 lovastatin、紅花治療後其 GPT 在 4, 8 週之結果 Fig 48 給予 lovastatin、紅花治療後其 LDL-C 在 4, 8 週之結果 Fig 49 給予 lovastatin、紅花治療後其 TG 在 4, 8 週之結果 Fig 50 給予 lovastatin、紅花治療後其 MDA 在 4, 8 週之結果 Fig 51 給予 lovastatin、紅花治療後其血液過氧化氫自由基，在 4, 8 週之結果 Fig 52 給予 lovastatin、紅花治療後其血液超氧自由基在 4, 8 週之結果 Fig 53 給予 lovastatin、紅花治療後其肝臟自由基之結果 Fig 54 給予 lovastatin、紅花治療後，其主動脈血管染色之結果 Fig 55 給予 lovastatin、紅花治療後其主動脈血管 Western blot Fas-ligand 之結果 Fig 56 給予 lovastatin、石斛治療後其體重在 4、 8 週之結果 Fig 57 給予 lovastatin、石斛治療後其 cholesterol 在 4, 8 週之結果 Fig 58 給予 lovastatin、石斛治療後其 GPT 在 4, 8 週之結果 Fig 59 給予 lovastatin、石斛治療後其 LDL-C 在 4, 8 週之結果 Fig 60 給予 lovastatin、石斛治療後其 GPT 在 4, 8 週之結果 Fig 61 給予 lovastatin、石斛治療後其 MDA 在 4, 8 週之結果 Fig 62 給予 lovastatin、石斛治療後其血液過氧化氫自由基，在 4, 8 週之結果 Fig 63 給予 lovastatin、石斛治療後其血液超氧自由基在 4, 8 週之結果 Fig 64 給予 lovastatin、石斛治療後其肝臟自由基之結果 Fig 65 給予 lovastatin、石斛治療後，其主動脈血管染色之結果 Fig 66 給予 lovastatin、石斛治療後其主動脈血管 Western blot Fas-ligand 之結果. 8.

(9) 表目錄. Table 1. 體重在 4，8 週之變化. Table 2. 血液 cholesterol 在 4，8 週之變化. Table 3. 血液 GPT 在 4， 8 週之變化. Table 4. 血液 LDL 在 4， 8 週之變化. Table 5. 血液 TG 在 4，8 週之變化. Table 6. 血液 MDA 在 4，8 週之變化. Table 7. 血液過氧化氫自由基（以 luminal 測定）在 4，8 週之變化. Table 8. 血液超氧自由基（以 lucigenin 測定）在 4， 8 週之變化. Table 9. 組織自由基（以 luminal 測定）. Table 10. 血管染色. Table 11. 胸主動脈血管 Western blot Fas-ligand 之結果. 9.

(10) 第一章前言第一節. 粥狀動脈硬化(atherosclerosis)之成因. 粥狀動脈硬化為一種漸進性之疾病，由於細胞及分子間一連串複雜的發炎反應所導致而成。其形成的主要原因是血液中膽固醇濃度過高，特別是低密度脂蛋白膽固醇(LDL cho1esterol) 【1,2】。粥狀動脈硬化最常發生在中型以上的血管，其發生的原因可能為： (1)心臟、腦部的缺血：造成脂質過氧化。 (2)高血脂症所產生的氧化態 LDL(oxidized low density lipoprotein ，ox-LDL)造成內皮細胞損傷。 (3)自由基 (freeradical)：因抽煙、高血壓、糖尿病、或先天遺傳性疾病所產生。 (4)脂質代謝的過程異常：因脂蛋白之主體蛋白部分、或是某些酵素、或是脂蛋白接受器，例如 apolipoprotein E 或是 LDL receptor 發生遺傳缺陷，會導致高血脂症(hypercholesterolemia)【3】。. 第二節. 動脈血管壁的基本構造. 動脈血管壁由內而外共可分為下列幾層【 4】 : (1). 血管內皮細胞層(endothelial cells): 為一扁平單層細胞所構成，是主要與血液接觸的細胞層，能接受外界環境的刺激，也容易受到細胞激素 (cytokines) 的刺激而表現粘著因子 (adhesion moleculars) 。在單核球細胞(monocytes)進入血管壁的過程扮演相當重要的調控角色。. 10.

(11) (2). 血管壁內層 (intima): 此層富含膠原纖維與彈性纖維 (internal elastic lamina)，其中的次內皮細胞間隙 (subendothelial matrix)是血管壁中反應最複雜的一層空間。進入血管壁的單核球在此空間內受到細胞激素的刺激而轉形為巨噬細胞。而進入此空間的低密度脂蛋白(LDL)也易受到活化態氧(reactive oxygen species，ROS)攻擊而形成氧化態的低密度脂蛋白。. (3). 血管壁中層 (media): 此層富含平滑肌細胞(smooth muscle cells，SMC)，負責動脈血管的收縮與彈性，血管壁中最所佔體積比例最大的一層。. (4). 血管壁外層 (adventitia): 主要由結締組織 (connective tissue) 所構成，也包含了血管滋養管 (vasa vasorumvi)。. Fig. 1 正常動脈血管壁的構造 (Nature 2000; 407(14): 233). 11.

(12) 粥狀動脈硬化大致可分為四期，最早期是發生於動脈血管之內皮細胞 (endothelium)中（ Fig 2）。. Fig-2 Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis.（The New England Journal of medicine. 1999；340：117）. 當血液中膽固醇濃度過高時，使得動脈內皮細胞對脂蛋白的通透性增加，讓低密度脂蛋白容易進入內皮細胞中，與具有活性的氧分子 (reactive oxygen specles，ROS)結合，形成氧化態的 LDL 。當氧化態的 LDL 形成後會使白血球粘著分子 (1eukocyte adhesion mo1ecules) 及內皮細胞粘著分子 (endothelial adhesion molecules)( 如 ICAM－1 或 VCAM-1)分泌增加，並使得單核球跟著進入動脈管壁中，造成動脈內皮細胞的功能喪失。接下來第二期為泡沫細胞 (foam cells)的形成(Fig 3) 。. Fig-3 Fatty-Streak Formation in Atherosclerosis. （The New England Journal of medicine. 1999；340：118）. 12.

(13) 單核球在細胞激素的作用下，如 monocyte colony stimulating factor 或 granulocyte-macrophagec colony － stimulating factor 等會轉變成巨噬細胞 (macrophages)，大量的巨噬細胞吞噬氧化態的 LDL 後成為泡沫細胞，造成 fatty streak 的形成，這個時期包括平滑肌細胞的遷移到內皮細胞中、T 細胞的活化，血小板的粘著及聚集，以及白血球的堆積。接下來第三期為在血管腔形成纖維蓋 (fibrous cap) (Fig 4) 。. Fig-4 Formation of an Advanced, Complicated Lesion of Atherosclerosis. （The New England Journal of medicine. 1999；340：119）. 當 fatty streak 產生後經一連串複雜的反應後，在血管腔形成纖維蓋，這個纖維蓋將白血球、脂質、巨噬細胞及一些物質包埋在裡面，漸漸的形成一壞死的區域(necrotic core) (Fig 5)，造成壞死致纖維性塊狀物的產生。. 13.

(14) Fig-5 Unstable Fibrous Plaques in Atherosclerosis （The New England Journal of medicine. 1999；340：121）. 最後一個時期為纖維斑 (fibrous plaques)的形成，因為巨噬細胞的持續作用，釋放出一些蛋白質分解酵素，造成纖維蓋變薄形成潰瘍，導致血栓的形成，進而形成粥狀動脈硬化。血管粥狀動脈硬化後會使得血管阻塞閉塞，並改變血管對於一些神經傳導物質或是荷爾蒙的反應，造成血管痙攣(vasospasm)、缺血性心臟病或心血管疾病，世界各國心血管疾病都占十大死因的前茅，因此在醫學上均致力於改善粥狀動脈硬化之研究。. 14.

(15) 第三節、粥狀動脈硬化與自由基之相關性何謂自由基？為一分子或原子，其外圍電子軌域具有不成對電子(unpair electron)。由於價殼軌域 (orbita1)以成對電子存在時較為穩定，因此大多數的自由基很不穩定，也具有較高的反應性，會從容易供給電子的分子中奪取電子，而被拉出電子的分子，又再度成為不安定的自由基。 -. 當細胞中氧分子接受一個外來電子時便還原形成超氧自由基 (．O2 superoxide anion)，接下來所產生的連鎖反應則形成一氧自由基系統，稱為具有活性的氧分子 (Reactive oxygen species，ROS)【6,7】。 ROS 包括有超氧自由基 ( ． O2- ， Superoxide) ，過氧化氫 (H202 ， hydrogen peroxide)，氫氧根自由基 (•OH，hydroxyl radical) 及單一個氧原子 (single oxygen) 【7,8】。在正常情況下，自由基能保護身體免受微生物、細菌等有害物質侵害，但是當自由基過量時，情況就大不一樣。當這些 ROS 反應發生在體內時，構成組織或細胞的成分或與代謝有關的酵素，將會成為超氧自由基連鎖反應的攻擊目標。例如：超氧自由基會（1）攻擊 DNA：使得雙股結構被破壞，造成 DNA 損傷。（ 2 ）細胞膜破壞 : 細胞膜上具有大量的多元不飽和脂肪酸 (polyunsaturated fatty-actd)，當多元不飽和脂肪酸遇到自由基後，會產生過氧化作用，而導致細胞膜脂質雙層功能及結構破壞【9】(3)造成蛋白質退化。(4) 促使 LDL 形成氧化態 LDL：當氧化態 LDL 堆積聚集會被巨噬細胞上 scavenger receptor 吞噬，終而變成泡沫細胞（ foam cells），是粥狀動脈硬化的早期徵兆。 (5)細胞死亡。. 15.

(16) 自由基如何產生？當生物體老化或許多不良環境因子﹐如紫外線､X 光､電磁波､抽煙､致癌物質､藥物､污染物質及負向情緒如生氣､緊張等…，或進行細胞呼吸粒線體電子傳遞鍊進行不順利時，均會產生。自由基會主動自 PMN（ polymorphonuclear neutrophils ）或內皮細胞（ endothelial cells）製造，是導致內皮細胞傷害的關鍵因子【 8】。與人類疾病相關的自由基約可分為五大類： 1、超氧自由基(Superoxide, ．O2－)：．O2－是所有耗氧生物都會產生的型式，當吞噬細胞與外來抗原或與免疫複合物接觸時均會產生。而．O2－為最早產生的自由基，其半衰期非常短暫，且較少直接對生物體造成傷害，但超氧自由基會引發連鎖反應產生其他自由基，進而對生物體造成嚴重傷害【 7】。 2、過氧化氫自由基 (Hydrogen peroxide, H2O2)：過氧化氫與其他自由基不同，為一非常安定物質，若以原狀態存在，並不會造成太大傷害，但過氧化氫容易通過細胞膜，與體內的微量金屬(鐵或銅)離子發生 Fenton 反應，而形成殺菌力非常強的氫氧自由基。雖然過氧化氫安定，但在體內時間過長，分解出的氫氧自由基越多，破壞心臟冠狀動脈或動脈細胞；或產生過氧化脂質，而降低心臟心肌的功能。 3、氫氧自由基(Hydroxyl radical, ．OH)：其主要來源有二：(1) ．O2－與 H2O2 經過鐵離子催化後產生的；(2) H2O 經過其他過渡性金屬離子依賴性的 Fenton reaction 反應而產生的。主要造成脂質過氧會進而破壞細胞，並會與醣類、胺基酸、磷脂質、核糖體等反應，造成嚴重. 16.

(17) 傷害。特別也會和 DNA 中的 purine 及 pyrimide 作用，造成細胞突變或死亡【10】。 4、單態氧（singlet oxygen）：當接受紫外線照射時體內氧分子被激發成不穩定狀態，使電子逆轉而極易與氫反應，造成脂質過氧化以及其他自由基的形成。 5、過氧化脂質(Lipid peroxide)：此種為最多自由基反應物。當不飽和脂肪酸被自由基氧化後，會造成一連串反映並產生極多的自由基。而過氧化脂質可在斷裂為其他自由基，形成有害的醛類，如脂質的代謝物 malondialdehyde (MDA)等。細胞構造為脂質雙層，若細胞膜上不飽和脂肪酸遭受到氧化，則可能導致細胞膜失去功用。而過氧化脂質也會直接影響蛋白質或核酸，進而造成細胞變性及死亡的情形【11-13】。而當體內 ROS 上升時，加上血液中的膽固醇含量增加時，體內 LDL 含量濃度也會明顯上升， LDL 即會遭受到 ROS 的攻擊，形成 ox-LDL。太多的 ox-LDL 堆積時則會造成不可逆的傷害，研究指出【 14】此種氧化態的 LDL 會促使與血管內皮的黏著因子分泌增加，並促使 macrophage 進行吞噬作用，進而形成泡沫細胞，造成許多黏著因子、 ox-LDL、白血球、單核球堆積，進而產生粥狀動脈斑塊及粥狀動脈硬化。. 17.

(18) 第四節、粥狀動脈硬化與體內抗氧化系統之相關性一般生物抗氧化機制含有酵素及非酵素二大防禦機轉，以減低活性氧分子造成的傷害。人體中的酵素性抗氧化物 primary antioxidant enzymes 主要有三種：分別為 (1)Superoxide dismutase(SOD)、(2)catalase(CAT)及(3)glutathioneperoxidase (GPx)【8】；人體中的非酵素性抗氧化物則以 glutathione reductive form (GSH) 為代表。抗氧化劑分為兩類 (1)預防性抗氧化劑，它可以減低連鎖反應引發階段的速率。 (2)斷鏈性抗氧化劑，它會干擾連鎖反應之傳播階段。預防性抗氧化劑包括過氧化氫酵素(catalase)和其他的過氧化酵素，它們可分解 ROOH。斷鏈性抗氧化劑通常指酚類(pheno1s)或芳香胺類 (aromatic amines)。在活體內，主要的斷鏈性抗氧化物有超氧化物歧化 ? (superoxide dismutase， SOD) 、麩胱甘 ? 過氧化 ? (glutathione peroxidase)、過氧化氫? catalase 等（Fig6 ）。. Fig. 6 自由基及抗氧化酵素之關係（Robbin’s pathologic basis of disease.6th edition） 18.

(19) Superoxide dismutase(SOD)是唯一以． O2 －為受質的酵素，主要作用是用於催化超氧自由基之 dismutation 反應，捕捉．O2－，以形成 02 及 H202，使免受超氧化物的潛在性毒害。為生物體抗氧化防禦機轉之第一道防線【15】。．O2－+． O2－+2H+－－－－－－－－－－ >. H202+02. 此酵素存在於細胞內幾個不同部位中，依存在的部位的不同可分三類 1)細胞質內的超氧化雙效酵素(Cu2n－SOD)，由兩個相似的次單位所組成，各帶有一當量的 Cu2+和 Zn2+. 2)而粒線體中的超氧化雙效酵素(Mn-SOD)，均帶 Mn2+ 3)在細胞外的超氧化雙效酵素 (EC－SOD)，由四個相似的次單位所組成，各帶有兩當量的 Cu2+和 Zn2+。. G1utathione peroxidase (GSH-Px)可以將還原態的 Glutathione(GSH)氧化成氧化態的 G1utathione(GSSH) ，並且將一個過氧化氫，還原成兩個水分子，因此 G1utathione peroxidase(GSH-Px)也可以做為清除自由基之酵素，為生物體抗氧化防禦機轉之第二道防線【 15】。. catalase：由血質素（ heme）與四個相同次單元所構成，其分子量約 60kDa，可不被任何濃度的 H202 所飽和為極有效率之酵素，因可將 H202 轉化成氧，而維持細胞內氧濃度以對抗氧化壓力。. 19.

(20) glutathione reductive form(GSH):為非酵素性抗氧化物，帶有－SH 基的 triple peptide，是人體內主要的可溶性抗氧化物質，富含於細胞質、核仁、粒線體之中，在肝細胞中負責執行許多解毒的功能。並可作為 glutathione peroxidase 的受質，對過氧化氫進行分解作用，而且可與 vitamin E 協同保護細胞膜避免受自由基的傷害。有研究指出【 16】當體內抗氧化酵素增加時，可以有效減少自由基或脂質氧化產物，如：可抑制 MDA 產生，減少 LDL 受到自由基破壞，使 ox-LDL 減少，進而改善粥狀動脈硬化之情形。. 第五節、粥狀動脈硬化與細胞凋亡之相關性何謂細胞凋亡？在胚胎發育的過程、免疫的調節、以及生物體恆定的維持中，細胞凋亡扮演著重要的角色。其生理意義而言，生物個體可藉細胞凋亡可以主動去除那些受傷、老化或不要的細胞，以維持生物體的發育、細胞恆定。又稱為計劃性的細胞死亡（programmed cell death）或 cell suicide【10,17,18】。. 細胞凋亡的特徵：染色質濃縮 (chromatin condensation)、DNA 斷裂成片段 (DNA fragmentation)、胞器重建、核型態改變、細胞萎縮(cell shrinkage)、形成許多的凋亡小體 (apoptotic bodies) 這些凋亡小體仍具有胞膜【10,17,18】。. 有研究指出【 19 】，脂蛋白的氧化造成細胞死亡其機制可能是經由細胞凋亡 (apoptosis) 或細胞壞死 (necrosis)，或是細胞本體之毒素 (toxin) 所引起的傷害。 20.

(21) 增生、增殖(Proliferation) 和細胞凋亡 (apoptosis)是血管平滑肌細胞 (VSMCs)造成粥狀動脈硬化的重要因素【19】。在細胞凋亡過程中確有一些基因的表現發生了改變，另一些基因則對凋亡起調控作用。以下即一些相關的基因: 1、細胞凋亡的啟動者：Caspase 家族 Caspase (cysteinyl aspartate-specific proteases)【19】。此家族目前至少己找到十個成員，為一群能分解各重要結構如 DNA 與細胞結構體(cytoskeleton)之水解酉每總稱，目前被認為是起始程序死亡者。在正常的狀態下，它們是以無活性的原脢（proenzymes）形式存在。當它接收到凋亡訊息時，半胱天冬脢前體 ( procaspase ) 之特異性 Asp 殘基處會被剪切成為大、小兩個片段(20kb 和 10kb) 並釋放 N-端前構區域形成 heterodimer，兩個 heterodimer 結合形成一個含有四條蛋白質片段的聚合物時才具有活性。而 Caspase 本身是一些半胱氨酸蛋白脢，其剪切位點是在特異的天冬氨酸 (Asp) 殘基，一些上游的 Caspase 就能循序地激活其它下游的 Caspase，形成 Caspase 的連鎖反應，將其所接收的凋亡訊號一一傳遞下去，以完成細胞凋亡【19-22】。而在此連鎖反應中，第一個出現不是 caspase 而被分解的蛋白質是 PARP(poly ADP －ribose po1ymerase)，具 DNA 修補及遭逢壓力下檢查基因體功能【 23,24】，接下來被分解蛋白質中有一類被稱為 DNA 裂解因子 (DFF)， DFF 受到 caspase － 3 剪切後成為活化態，進而攻擊 nucleosome 間之 DNA，造成典型的梯形【25】。 caspase-1 與 caspase-3 分別代表此類酉每的兩大次集團【 21】。前者是在凋亡決定點的上游，在人類為 caspase-1,4,5；後者則在此決定點之下游作為執行處決者，在人類為 caspase－2,3,6,7,8,10。有強烈證據支持這兩大事件的故事主要發生在粒線體上【 22】。而生與死兩歸途的掌握，在哺乳類動物則在 bcl－ 2 家族上【26】。 21.

(22) Fig 7 caspase 與 apoptosis 關係圖（Nature Reviews Drug Discovery 2002；1： 111-121） 2、與免疫系統之互動： Fas/Fas-L Fas 又稱 Apo-1 或 CD95，屬於(Tumor necrosis factor receptor， TNF-R)家族的一個成員【 30】，主要表現的細胞種類包括 T 細胞、 B 細胞、肝細胞及一些腫瘤細胞。 Fas ligand(FasL) 為一種Ⅱ型穿膜蛋白，屬於腫瘤壞死因子 (Tumor necrosis factor， TNF)家族的一個成員【 28】。 FasL 主要表現在 T 細胞、自然殺手細胞(NK Cell)和一些免疫系統無法到達之地方的細胞例如眼睛、腦及睪丸【 29】。當膜表面的 Fas 蛋白與其配體 FasL 相結合後，可啟動細胞內一系列導致凋亡的事件進行，對免疫反應的向下調控及 T 細胞毒殺作用扮演樞紐的角色。目前認為 Fas/FasL 系統主要的生理功能包括 T 細胞的抑制調節作用 (down-regulation)及細胞的毒殺作用。實驗證據顯示有些癌細胞能逃過免疫細胞毒殺作用，也是藉由表現 FasL 而造成。當粥狀動脈斑塊形成時，體內 FasL 會大量表現【30】。而 FasL 與 Fas 結合後，會進入細胞膜而活化 pro-caspase-8， pro-caspase-8 一般是不具活性，當受到活化後，會轉變成活性 caspase-8，進而刺激 pro-caspase-3 變成 caspase-3，隨即進入細胞核促使細胞進行凋亡【21】。. 22.

(23) Fig 8 Fas 及 FasL 機轉圖 (Arteriosclerosis, Thrombosis ＆ Vascular Biology 2000；20: 306). 第六節藥物簡介丹參（ Salvia miltiorrhiza）【 31】學名 :川丹參中藥分類：活血祛瘀類化學成分：含丹參酮｡]tanshinone｡^｢ｹ｡B｢ｺ A、｢ｺ B，異丹參酮（ isotanshinone）｢ｹ｡B｢ｺ｡A 隱丹參酮（cryptotanshinone）、異隱丹參酮（isocryptotanshinone）、羥基丹參酮（hydroxytanshinone）｢ｺ A、丹參新酮（miltirone）、左旋二氫丹參酮（dihydrotanshinone）｢ｹ｡B丹參酚（ salviol）等。. 對心血管系統的藥理作用: (1) 對心臟及冠狀血管的影響：丹參注射液能增加狗冠狀血流量 60％，降低冠狀循環阻力。丹參素對離體豬冠狀動脈有擴張並增加血流的作用，心肌收縮力先抑制後增強，心率有一定程度減慢。但丹參酮ⅡA 磺酸鈉，原兒茶醛顯著收縮豬冠狀動脈。丹參可減輕缺血再灌注的心肌損傷，並增加 SOD 及. 23.

(24) GSH-Px 的活性有效清除缺血再灌注產生的氧自由基。 (2)對心肌缺血及心肌梗塞的影響：丹參酮能明顯抑制心肌壞死導致的嗜中性白血球溶小體釋放、吞噬和黏附，減少血清及心肌 MDA，升高心肌 SOD 的活性，抑制白血球向心肌缺血區的浸潤及心肌中 PGE2 的合成。由此可知，丹參酮有防治心肌梗塞的作用。用丹參治療心肌梗塞的狗，可見到梗塞區壞死心肌清除較快，巨噬細胞活躍，纖維母細胞分化和膠原纖維形成較明顯，肉芽形成較成熟，說明丹參調節組織的修復與再生。 (3) 對血流變性的影響：丹參注射液有增加紅血球電泳率、降低血小板黏附性、抑制血小板凝集、抑制血栓形成等作用。降低冠心病患者的血漿粘滯性作用。丹參對老年大鼠能降低全血比粘度纖維蛋白源及增加紅血球電泳時間。 (4) 改善微循環作用：丹參有加快微循環血流速度，增加毛細血管網而改善冠心病病人的微循環。 (5) 降血脂及抗動脈粥樣硬化，提高耐缺氧：對動脈粥狀硬化的家兔，可降低血和肝中的三酸甘油酯。在細胞模型中丹參素具有降低細胞內膽固醇合成及抗脂蛋白氧化作用，氧化脂蛋白中的 MDA 明顯減少，氧化脂蛋白對細胞的毒性作用明顯減弱。 (6) 丹參注射液及其多種水溶成分（原兒茶醛、丹參素、 Sod A 等），顯著抑制肝臟脂質過氧化。其機制可能為透過自由基的清除作用。. 石斛 ( Ephemerantha lonchophylla ) 【31】學名 :大爪石斛中藥分類：補虛類化學成分：denbinobin，3-ethoxy-5-hydroxy-7-methoxy -1,4-phenanthraquinone， 3-methylgigantol，ephemeranthone. 24.

(25) 對心血管系統的藥理作用: (1) 心臟抑制作用石斛流浸膏對離体蟾蜍心臟不論濃度高低均有抑制作用。 (2) 擴張血管作用石斛具有擴張血管作用，能明顯對抗苯腎上腺素收縮大鼠腸系膜動脈血管的作用，降低苯腎上腺素、 5-HT 灌流壓的作用。紅花 ( Flos carthami ) 【 31】學名:川紅花中藥分類：活血祛瘀類化學成份 :黃酮類化合物 , 脂肪酸 , 紅花黃色素 A(safflor yellow A) 、娠烯酮（ 15a，20β-dihydroxy-Δ 4-pregnen-3-one）、多? 類 ( polyacetylenes ) 對心血管系統的藥理作用 : (1) 增加冠狀血流，抗心肌缺血 (2) 抗血液凝集，防止血栓 ( 紅花黃色素，紅花? ? 可抑制 ADP 和膠原誘導的血小板凝集 ) 川芎 ( Ligusticuum chuanxiong ) 【 31】中藥分類：活血祛瘀類化學成份 :四甲基口比 ? （tetramethyl pyrazine）、阿魏酸（ferulic acid）、川芎口朵等。. 25.

(26) 厚朴 ( Magnolia officinalis ) 【 31】學名:川厚朴中藥分類：芳香化濕類化學成分：主要成分為厚朴酚、異厚朴酚、四氫厚朴酚。另有一種水溶性生物鹼，稱厚朴鹼對心血管系統的藥理作用 : (1) 腸厚朴鹼和厚朴花有降壓作用。高膽固醇的人可能會因為平滑肌細胞受到改變或傷害促使平滑肌增生，這些不正常的情形皆被認為與脂質的過氧化有關，而氧化還原最主要的場所是在粒線體。有研究指出 magnolol 及 honokiol（厚朴成分中兩種最主要的抗氧化成分）能保護大白鼠心臟的粒線體以防止脂質過氧化，抑制缺血再灌注引起的心室心律不整並增加一氧化氮合成，對於 Mac-1 及 neutrophil 附著也有抑制作用，這些都可能和 magnolol 的抗氧化作用有關。 (2) 對心率和血壓的作用厚朴煎液對蟾蜍離体心臟有抑制作用，低于肌鬆劑量的厚朴鹼注射給藥即有明顯降壓作用，這一作用不能被抗組織胺藥物所對抗。說明並非由於組織胺釋放引起，靜脈注射降壓約維持 10-15 分鐘，肌肉注射可維持 1 小時以上，麻醉兔、貓靜注或肌注厚朴花的酊劑水溶物都具降壓作用，並使心率加快。 (3) 對血小板聚集的抑制作用厚朴酚抑制膠原和花生四烯酸誘導的兔富血小板血漿的聚集和 ATP 釋放，洗過的血小板比富血小板血漿的聚集更明顯被抑制。全血的聚集較少被這抑制劑影響。厚朴酚在各种情況下抑制血栓烷 B2 形成，由花生四烯酸或膠原引起的細胞內 Ca2+升高也被抑制。厚朴酚的抗血小板作用是由於對血栓烷 B2 和細胞內 Ca2+ 流動的抑制。. 26.

(27) 第七節西藥之藥理作用與臨床應用一. Probucol. Fig 9 Probucol 之結構式【藥物化學 p.43 生合成出版社】為一抗高血脂藥物(Antihyperlipidemic Drugs)，而其藥理機轉除了減少血中之低密度脂蛋白(Low density lipoprotein ; LDL)【33】之外，亦有抗氧化 (anti-oxidant) 之機制以防止心血管中之動脈血管再狹窄 (restenosis) 【34】，及抑制動脈粥狀硬化生成時，血管內膜(intimal)之損傷及惡化【35】。及抑制 macrophage 吞噬 OX-LDL 進而形成 foam cell【36】。並能在體內選擇性的抑制損傷區域 LDL 分解(degradation)與避免內皮細胞所造成的血管舒張【37】。. 二. Lovastatin. Fig 10. Lovastatin 之結構式【dwb.unl.edu/teacher/NSF/C10/C10 content html】. 27.

(28) Lovastatin 之抗血脂機制主要是由於抑制了膽固醇生合成時速率決定步驟 (rate-limiting step)酵素 HMG-CoA reductase（3-hydroxy-3-met hyl-glutarylcoenzyme A）之活性，進而減少了血中膽固醇之濃度【 38,39】。研究指出【 40】 Lovastatin 能有效降低兔子因高膽固醇餵飼所造成的之脂質過氧化情形，且能維持血中 SOD(superoxide dismutase)的含量。而 Lovastatin 也能顯著降低主動脈損傷的情形【41】。. Fig 11. Lovastatin 之作用機轉【簡明圖解藥理學 p. 280 藝軒出版社】. 28.

(29) 三、並沒食子酸（ ellagic acid）其化學結構：4,4’,5,5’,6,6’-hexahydroxydiphenic acid2,6,2’,6’-dilactone【42,43】。因為這些存在自然界中的多酚類化合物（polyphenolic compound），具有抗氧化（antioxidants）、抗突變 (antimutagens)、抗致癌物(anticarcinogens)的功能。. Fig 12. ellagic acid 之結構式【www2.famille.ne.jp/˜ horio/topics3/fig ellagic acid gif 】. 並沒食子酸存在自然界中的蔬菜、水果，尤其以草莓、藍莓及堅果類含量尤豐。並沒食子酸具有化學保護(chemoprotective)的特性。有研究顯示【 42,43】Ellagic acid 能降低在老鼠中由 N-2－fluorenyl－ acetamined 所引起肝細胞癌（ hepatocarcinogeneis ）及由 N-nitrosomethylbenzylamine. (NMBA). 在老鼠中所引起喉癌（esophageal tumors）。研究指出 Ellagic acid 可保護小老鼠對抗由 3-methylcholanthrene 所引起的皮膚癌(skin tumor)。而 Ellagic acid 能降低腫瘤產生的一種重要機轉就是 Ellagic acid 能降低肝中 Cytochrome P450 酵素的含量。. 29.

(30) 第二章實驗材料與方法. 第一節誘導高血脂症兔子之動物模式本實驗所使用之動物為購買自台灣省家畜衛生試驗所動物用藥品檢定分所之純種紐西蘭白兔 (New Zealand white rabbit, NZW rabbit)。NZW rabbit 皆為 4-6 週大，體重約為 1.5 公斤。飼養於動物中心，給予 12 小時照明 12 小時黑暗環境，室內溫度約維持於 25 ± 2℃。每天餵食 100 g 的飼料，飲水則不予控制，共飼養 8 週。於第 0 週開始餵食含有膽固醇飼料，以此種方式誘導正常兔子產生高膽固醇血症，最後形成粥狀動脈硬化的動物模式。. A 藥物膽固醇 (SIGMA, ST.Louis, MO,USA) probucol (WEIDAR,Taichung, Taiwan) ， 250 mg/tab lovastatin (井田, Taichung,Taiwan) ， 20 mg/tab 玉米油 (台糖,Kaohsiung,Taiwan) 川芎 ( Rhizoma chuanxiong,欣隆,Taichung,Taiwan) 丹蔘 ( Salvia miltiorrhiza,欣隆 ,Taichung,Taiwan) 厚朴 ( Magnolia officinalis,欣隆,Taichung,Taiwan) 石斛 ( Ephemerantha lonchophylla,欣隆 ,Taichung,Taiwan) 紅花 ( Flos carthami, 欣隆 ,Taichung,Taiwan). 30.

(31) B 步驟將兔子隨機分成 9 組，每組 3-4 隻，給予不同飼料，敘述如下： 1：餵食 normal diet（對照組） 2：餵食 10﹪玉米油加 0.5﹪ cholesterol 3：餵食 10﹪玉米油加 0.5﹪ cholesterol＋ 200mg/kg Probucol 4：餵食 10﹪玉米油加 0.5﹪ cholesterol＋ 6 mg/kg lovastatin 5：餵食 10﹪玉米油加 0.5﹪ cholesterol＋ 1 ﹪川芎 6：餵食 10﹪玉米油加 0.5﹪ cholesterol＋ 1 ﹪厚朴 7：餵食 10﹪玉米油加 0.5﹪ cholesterol＋ 1 ﹪丹蔘 8：餵食 10﹪玉米油加 0.5﹪ cholesterol＋ 1 ﹪紅花 9：餵食 10﹪玉米油加 0.5﹪ cholesterol＋ 1 ﹪石斛. 第二節、中藥製備 A 儀器：Rotary vacumn evaporator N-11（EYELA,Tokyo,Japan）. B 試劑： 99.98﹪Methanol（ TEDIA,Fairfield,Ohio,USA）. 紅花 10 kg；厚朴、丹蔘、川芎、石斛生藥 20 kg，以 HPLC 級 99.98﹪甲醇（CH3OH）當溶媒，於溫浸槽溫浸 60℃ 3 天，再至 Rotary vacumn evaporator N-11（減壓濃縮機） 45℃ 650-660 ㎜ Hg 至穩定無突沸後，調高至 670-700 ㎜ Hg，得到中藥之總抽出物石斛 2 kg、紅花 3 kg，厚朴、丹蔘、川芎各 4-5 kg。. 31.

(32) 第三節、飼料配置： A 試劑：95﹪Ethanol（公賣局,Taichung,Taiwan） B 飼料：實驗兔飼料（福壽 ,Shalu,Taichung,Taiwan）. 0.5 % 膽固醇飼料配置方式： 95﹪ ethanol 或二次水均勻淋在 100g 一般兔子飼料，60℃烘箱 4 小時烘乾使其 ethanol 揮發，利用小火將 10 ml 玉米油燒熱後，加入 0.5g 膽固醇，使其完全溶解於玉米油中，再加入已烘乾 100g 一般兔子飼料充分攪拌均勻即可。. 加藥飼料配置方式：利用 95﹪ethanol 或二次水當溶媒，去溶解中藥總抽出物、西藥粉末，均勻淋在 100g 一般兔子飼料，60℃烘箱 4 小時烘乾使其 ethanol 揮發。小火將 10 ml 玉米油加熱完全溶解後，關火待冷卻至約 60℃，再加入已烘乾扮勻藥物之 100g 兔子飼料再充分攪拌均勻即可。. 32.

(33) 第四節、測量兔子血液中之 cholesterol、triglycerides、GOT、GPT、HDL、 LDL 的含量 A 儀器全自動生化分析儀 Cobas Mira plus（ ROCHE,Basel,switzerland）. B 試劑 Cholesterol reagent. ( RANDOX,San Diego,California,USA). Triglycerides reagent ( RAICHEM, San Diego,California,USA) GOT/ Aspartate aminotransferase reagent( RAICHEM, San Diego,California,USA) GPT/ Alanine aminotransferase reagent ( RAICHEM, San Diego,California ,USA) Auto HDL Cholesterol reagent set R1＆R2 (RANDOX, San Diego,California,USA) Auto LDL Cholesterol reagent set R1＆ R2 (RANDOX,San Diego,California,USA) Reagent 泡置： GOT、GPT 、TG reagent 各加 20 ml 二次水 HDL、LDL calibration 各加 1 ml 二次水. C 步驟抽血前兔子需禁食約 12 小時。利用 10 ml 23G 注射針筒由兔子耳動脈採血，置 3 ml 含 heparin 抗凝劑試管，以 3000 rpm 離心 10 分鐘，取得血漿。取 700µl 血漿放入生化分析儀，並放入膽固醇試劑 (Cholesterol reagent)、三酸甘油酯試劑(Triglycerides reagent)、麩胺酸草酸轉胺酉每試劑(GOT/AST reagent)、丙胺酸丙酮酸轉胺酉每試劑 (GPT/ALT reagent)、 HDL Cholesterol、LDL Cholesterol reagent，即可測得 cholesterol、Triglycerides、GOT 、GPT、HDL-C、LDL-C 。. 33.

(34) 第五節、測量兔子血液中之超氧自由基含量 A 儀器自由基分析儀 Chemiluminescence CLD-110 (TOHOKU, Kawasaki, Japan) B 試劑 —1X PBS KH2PO4 0.2586g（ MERCK,Darmstadt, Germany） K2HPO4 1.8487g（ MERCK,Darmstadt, Germany） NaCl. 8.0647g（ MERCK,Darmstadt, Germany）. KCl. 0.2013g（ SCHARLAU,Barcelona,spain ） Add doubly distilled water to 1 L. — 1000µM Luminol (SIGMA, ST.Louis, MO,USA) — 25µM Lucigenin (SIGMA, ST.Louis, MO,USA) — Zymosan (SIGMA, ST.Louis, MO,USA) C 步驟採全血 3 ml 放入含 Heparin tube 以錫箔紙包好並冰浴。測量空白值：取兔子全血 200µl 及 100µl PBS 放入自由基分析儀中，利用波長激發，每 10 秒鐘記錄一次血中光子數目，持續 1020 秒。測量過氧化氫自由基含量：取兔子全血 200µl 及 100µl PBS 放入自由基分析儀中，每 10 秒鐘記錄至 200 秒時加入 1000µM Luminol 1 ml，持續測量到 600 秒時加入 Zymosan 200µl，測量過氧化氫自由基至 1020 秒。測量超氧自由基含量：取兔子全血 200µl 及 100µl PBS 放入自由基分析儀中，每 10 秒鐘記錄至 200 秒時加入 25µM Lucigenin 1 ml，持續測量到 600 秒時加入 Zymosan 200µl，測量超氧自由基至 1020 秒。數值分析方法是將自由基值減空白值後除以全血中白血球數目，即可得到自由基相對值。. 34.

(35) 第六節、WBC 測量 A 儀器全自動血球計數儀 SYSMEXS KX 21（SYSMEXS,Kobe, Japan）. B 試劑 Cell pack (SYSMEXS, Kobe, Japan) Stromatolyser-WH (SYSMEXS, Kobe, Japan) Cell clean (SYSMEXS, Kobe, Japan) C 步驟 EDTA 抗凝管輕微 mix，取全血 1ml 放入 SYSMEXS KX 21 全自動血球計數儀偵測，即可得 WBC 的量。. 第七節、測量兔子肝臟中之超氧自由基含量 A 儀器自由基分析儀 Chemiluminescence CLD-110 (TOHOKU, Kawasaki, Japan) 均質機 Polytron PT 3100 (POLYTRON, Luzernerstrasse, Switzerland) B 試劑 — Tris-sucrose buffer Tris-Base. 3.152 g （ USB,Ohio,USA）. Sucrose. 85.575 g（ USB,Ohio,USA）. EDTA (ethylenediaminetetra-acetic acid) 0.37224 g（USB,Ohio,USA） Add doubly distilled water to 1 L. 35.

(36) — Luminol (SIGMA, ST.Louis, MO,USA) 0.0025 g in 500 ml doubly distilled water (pH: 7.4) — TBHP （t-Butyl hydroperoxide） (SIGMA, ST.Louis, MO,USA) C 步驟取 2g 組織加入 Tris-sucrose buffer 1.5 ml，利用均質機於 4℃均質，將均質液離心 4000g 於 4℃中 30 分鐘，取出上清液，此時需避光冰浴。取上清液 0.4 ml 加入 Luminol 0.2ml 於 37℃培養 10 分鐘。利用自由基分析儀，將儀器設定為每 10 秒讀取一次，將培養液放入儀器中，先跑 100 秒，再加入 TBHP 0.1ml，跑至 1000 秒即可。數值分析方法是將自由基值除以每克蛋白質含量，即可得到自由基相對值。. 第八節、測量 MDA（malondialdehyde） A 儀器水浴槽 Water bath (TKS,Taipei,Taiwan ) ELISA reader（ANTHOS-2020, Salzbrug, Austria） B 試劑 — MDA 標準品（ Malonaldehyde bis） (SIGMA, ST.Louis, MO,USA) — 60mMCuSO4 （ USB,Ohio,USA） — 0.67﹪TBA（Thiobarbituric acid）(SIGMA, ST.Louis, MO,USA)：（ 1） 0.2g NaOH 加 100 ml H2O 得 0.05 N NaOH（ WAKO, Osaka, Japan）（ 2） 0.67gTBA 溶於 100 ml 0.05 N NaOH — 20﹪TCA（ Trichloroacetic acid） (SIGMA, ST.Louis, MO,USA)： 20 ml 100﹪TCA 加 80 ml H2O. 36.

(37) C 步驟離心 3000 rpm 10 分鐘以獲得 plasma，取 25μl plasma 加 2.5μ l 60mM CuSO4 加 22.5μ lH2 O 使得總體積達 50μ l，而 Cu2+之最佳濃度為 2-3 mM。置於 37 ℃ water bath 4 小時，後加 0.35 ml 20﹪ TCA 及 0.35 ml 0.67﹪ TBA，於 67-70 ℃ water bath 30 分鐘，使得產生脂質氧化反應。再離心 10000 rpm 2.5 分鐘，取上清液 200μl 放入 96 well plate，以 ELISA reader 540nm 波長測量吸光值。利用不同濃度的之 MDA 標準品去求得線性方程式，代入線性方程式 ( y = ax + b ; a,b 為常數，y 為檢品之吸光值，而 x 即為欲求出之 MDA 濃度 ) ，即可求得 MDA 濃度。. 第九節、 Sudan IV 染色法 A 儀器 Vortex-genie 2 (SCIENTIFIC INDUSTRIES,NY,USA) B 試劑 — Methanol（TEDIA,Fairfield,Ohio,USA） — Sudan IV（SIGMA, ST.Louis, MO,USA）. 0.2 g. Add 10 ml Methanol — 1X PBS (PH 7.4) KH2PO4 0.2586 g（ MERCK,Darmstadt, Germany） K2HPO4 1.8487g（ MERCK,Darmstadt, Germany） NaCl. 8.0647g（ MERCK,Darmstadt, Germany）. KCl. 0.2013g（SCHARLAU,Barcelona,spain） Add doubly distilled water to 1 L. 37.

(38) C 步驟將餵食 8 週後的兔子犧牲，取出主動脈至胸主動脈之血管，清除血管周圍外膜及脂肪組織，將處理過後的血管以縱向方式切開。將切開的血管放入 2﹪ Sudan IV ，染色約 3 分鐘，再放入 100%、90%、 80%、70%、 60% Methanol 及 H2O 去染後攤平於培養皿上，滴 PBS 以保濕再以 paraffin 封口照相。Sudan IV 為一種嗜脂性之染料，會與脂肪結合而產生粉紅色斑塊，再利用電腦 Image pro plus（Media Cybernetics,Maryland,USA）軟體分析，其粉紅色動脈硬化斑塊與血管總面積之比值，依此評估主動脈血管管壁脂質沉積情形。. 第十節、血管蛋白質之萃取 A 儀器均質機 Polytron PT 3100 (POLYTRON ,Luzernerstrasse,Switzerland) 超音波震盪器 Sonicater (MISONIX,Farmingdale,NY ,USA) B 試劑 — Sheer′s buffer 50 mM Hepes (pH 7.5)（GERBU,Am Kirchwald, Germany）. 50 ml. 150 mM NaCl（MERCK,Darmstadt, Germany）. 75 ml. 1 mM EDTA （USB,Ohio,USA）. 1ml. 2.5mM EGTA（SIGMA, ST.Louis, MO,USA）. 2.5 ml. Tween 20（USB,Ohio,USA）. 0.5 ml. Glycerol（ MERCK,Darmstadt, Germany）. 50 ml. Add doubly distilled water to 0.5 L. 38.

(39) C 步驟取胸主動脈血管約 1×1 cm，加入 500 µl sheer′s buffer 剪碎，利用均質機將血管組織均質（4℃冰浴），用 sonicater 來回三次將細胞震破，利用 13000 g 在 4℃時離心 5 分鐘，取上清液。. 第十一節、血管蛋白質之定量 A 儀器 ELISA reader（ANTHOS-2020,Salzbrug,Austria） B 試劑 — Bradford reagent (BIO-RAD, Hercules,California,USA) — BSA（Bovine serum albumin）（SIGMA, ST.Louis,MO,USA）. C 步驟先將 ELISA reader 暖機 30 分鐘後，分別做出濃度依序為 0,5,10,15,20,25 µg /ml 的 standard protein (doubly distilled water, Bradford, albumin )靜置 5 分鐘,取 200µl 放入 96well plate 利用 590nm 波長測定吸光值，製作趨近於 1 之標準曲線後；再將血管蛋白質萃取液取 1µl 加入 Bradford 200µl 及二次水 799µl 中混合均勻，靜置 5 分鐘後，取 200 µl 放入 ELISA reader 利用 590 nm 波長測量吸光值，代入檢量線公式( y = ax + b ; a . b 為常數 , y 為檢品之吸光值 , 而 x 即為欲求出之蛋白質濃度 ) ，即可求得蛋白質濃度。. 39.

(40) 第十二節、蛋白質電泳 (SDS-PAGE) A 儀器 Power supply OWL OSP-135 (HOEFER,San Francisco, USA) Power supply PS 500 XT DC ( HOEFER,San Francisco,USA) Hoefer mini VE （AMERSHAM BIOSCIENCES,piscataway,NJ,USA）. B 試劑 — 1.5M Tris-HCl (pH 8.8 )（PHARMACIA BIOTECH,Uppsala,Swedan） Tris. 9.086 g Add doubly distilled water to 50 ml Adjust pH to 8.8 with 12N HCl. — 1.5M Tris-HCl (pH 6.8)（PHARMACIA BIOTECH,Uppsala,Swedan） Tris. 6.057 g Add doubly distilled water to 50 ml Adjust pH to 6.8 with 12N HCl. — 10% SDS（ USB,Ohio,USA） SDS. 4g Add doubly distilled water to 40 ml. — 12% SDS PAGE 內含. Doubly distilled water 10% SDS（USB,Ohio,USA） 30% Acrylamide /Bis solution (BIO-RAD, Hercules,California,USA) 1.5M Tris-HCl (pH 6.8)（PHARMACIA BIOTECH,Uppsala,Swedan） 10% APS（USB,Ohio,USA）. 40.

(41) TEMED （PHARMACIA BIOTECH,Uppsala,Swedan） —4×dye Glycerol（MERCK,Darmstadt, Germany）. 2 ml. 2-Mercaptoethanol（SIGMA, ST.Louis, MO,USA）. 1ml. 20﹪ SDS（USB,Ohio,USA）. 3ml. 1M Tris-HCl（pH 6.8）（USB,Ohio,USA）. 2.5 ml. Doubly distilled water. 1.5 ml. Total. 10 ml Add 0.01﹪ Bromophenol blue 有顏色即可. — Running Buffer Tris（ PHARMACIA BIOTECH,Uppsala,Swedan） Glycine（ USB,Ohio,USA） SDS. 12 g. 57.6 g. （USB,Ohio,USA）. 4g. Add doubly distilled water to 4 L — Transfer Buffer Glycine（USB,Ohio,USA）. 86.4 g. Tris（PHARMACIA BIOTECH,Uppsala,Swedan） Methanol（ TEDIA,Fairfield,Ohio,USA）. 18.2 g. 1200 ml. Add doubly distilled water to 6 L — PBST. Add 0.1% Tween 20（USB,Ohio,USA）to 1X PBS — 5% fat free Milk Fat free milk （ ANCHOR,Wellington,Newzealand） Tween 20（USB,Ohio,USA）. 50µl 41. 2.5 g.

(42) Add 1X PBS to 50 ml — Rainbow Marker (BIO-RAD,Hercules,California,USA) — 0.1% Commassie blue Coomassie brillant bule（ USB,Ohio,USA）. 0.25g. Methanol（ TEDIA,Fairfield,Ohio,USA）. 45 ml. Glyaceial acetic acid（MERCK,Darmstadt,Germany）. 10 ml. Add doubly distilled water to 100 ml — Destain buffer Methanol（ TEDIA,Fairfield ,Ohio,USA） Acetic acid （MERCK,Darmstadt ,Germany）. 10 ml 10 ml. Add doubly distilled water to 100 ml — Dry buffer Methanol（ TEDIA,Fairfield,Ohio,USA） Glycerol（MERCK, Darmstadt , Germany）. 20 ml 0.6 ml. Add doubly distilled water to 100 ml C 步驟 SDS-PAGE 是由 stacking gel 及 separating gel 所構成。採用 12% SDSPAGE，取含有 80 µg 蛋白質萃取液與 4X dye 及 Running Buffer 混合使其總量為 20 µl，先離心數秒，於 95℃下加熱 5 分鐘。放置冰上急速冷卻 1 分鐘，再離心數秒。取反應後之蛋白質，分別加入膠中，以 Running Buffer 將所有 well 中的體積補為一致 , 如此以便於蛋白質在 gel 中壓縮的很齊 , 並加入 protein marker 7µl，利用 100V 跑電泳約 2 小時。 2 小時後取下膠，進行轉漬，如下節所述。將轉漬後的膠以 0.1% Commassie blue 染色約 20 分鐘，後以 destain buffer 脫色，利用 dry buffer 及玻璃紙將脫色完畢的膠 42.

(43) 風乾保存。. 第十三節、西方點墨法 (Western Blot) A 儀器 Power supply OWL OSP-135 (HOEFER,San Francisco, USA) Power supply PS500 XT DC (HOEFER, San Francisco,USA) B 試劑 — PVDF Membrane (HYBOND-P, Uppsala , Sweden) — 3M papers（3M,ST. Paul Minnesota , USA） — Rainbow markers (BIO-RAD, Hercules ,California ,USA) — First Ab： Fas-ligand (BD PHARMINGEN ,California ,USA) — Second Ab ：Sheep anti-mouse (BD PHARMINGEN ,California ,USA) — X-ray flim (FUJIFILM,Kanagawa ,Japan) — Developer (KODAK,Rochester, NY, USA) — Fixer (KODAK,Rochester, NY ,USA) — Methanol（ MERCK,Darmstadt ,Germany） — ECL（PIERCE,Rockford ,Illinois ,USA）內含（1） supersignal west pico stable peroxide solution （2） supersignal west pico luminol/enhancer solution C 步驟將跑完的 SDS-PAGE 的膠取下，進行轉漬（ Transfer），取轉漬夾，海綿撲於最底層，3M paper 以 Transfer buffer 潤濕後，鋪平於海綿上，再舖上膠，取 PVDF membrane 先以 Methanol 潤濕後，再覆蓋於膠上，再蓋上 3M paper 及海綿，夾好轉漬夾，放入注滿 Transfer buffer 之 Transfer tank 中，利用 50V 於 4℃冰箱進行 2 小時 30 分的轉漬步驟。將轉漬好的 membrane 以 5% fat free 43.

(44) milk 加 0.1﹪ PBST 於 37℃下 blocking 一小時後，再以 0.1﹪PBST 清洗 membrane 清洗 5 分鐘共 3 次，將 membrane 放入含 1：1000 稀釋濃度之一級抗體 Fas-ligand 夾鏈袋中，趕走氣泡封口，於 4℃反應隔夜。取反應完的 membrane 以 0.1﹪ PBST 清洗 20 分鐘共 3 次，再將 membrane 放入含 1：5000 稀釋濃度二級抗體 Sheep anti-mouse 之夾鏈袋中，於 37℃下反應 1 小時。再以 0.1﹪PBST 清洗 5 分鐘共 3 次。最後於暗房中 , 將 membrane 加入 ECL （ 1）（2）各 0.5 ml 以反應出螢光，片夾內置入 X-ray flim 與 membrane 進行壓片，再取出 X-ray flim ，進行顯影及定影。Protein band 含量採 Kodak digital science 1D (ver.2.03)（Kodak,Rochester,NY, USA）軟體分析。. 第十四節、統計分析法實驗結果以 SPSS(ver.10)（SPSS INC,Chicago, Illinois,USA）統計軟體 ONE WAY ANOVA 統計比較， mean ± SE 表示各項結果平均值± 標準誤，圖與表中 *表示與 cholesterol 組相比 P < 0.05；＃表示與 normal 組相比 P< 0.05；在統計學上具有明顯差異。. 44.

(45) 第三章結果第一節總論在體重方面，兔子在飼養 8 週期間，其體重約為 3-4 kg，經 ONE WAY ANOVA 統計分析後其 P > 0.05，無明顯統計差異（ Table 1）。. 在血液膽固醇方面，4 週時在膽固醇組約為 17mmol/L；使用藥物治療後使血液膽固醇明顯降低的有 probucol 組（4.4 mmol/L）、 lovastatin 組（7.3 mmol/L）與中藥之紅花組（10.3 mmol/L）、川芎組（7.6 mmol/L）、丹蔘組（ 10.7 mmol/L）及厚朴組（ 1.2 mmol/L）等組別，所降低之值與膽固醇組相比較 P < 0.05，在統計學上有明顯差異。但石斛組無明顯統計差異。而在 8 週時血液膽固醇在膽固醇組上升至 29.5 mmol/L , 而持續藥物治療後與膽固醇組相比較都有明顯降低之情形；其血液膽固醇明顯降低的有 probucol 組（8.4 mmol/L）、lovastatin 組（ 13.5 mmol/L）與中藥之紅花組（ 16 mmol/L）、厚朴組（ 7.1mmol/L）。經統計分析後，所降低之值與膽固醇組相比較 P <0.05，在統計學上有明顯差異。但丹蔘組、川芎組及石斛組無明顯統計差異（ Table 2）。. 血液 GPT 方面，4 週時在膽固醇組為 94 U/ml 左右；而給予藥物治療後與膽固醇組相比較都有明顯降低之情形。在血液 GPT 有明顯降低的有 probucol 組（34 mmol/L）與中藥之川芎組（ 14mmol/L）、厚朴組（39.1mmol/L）、紅花（ 28.4 45.

(46) mmol/L）、石斛組（ 24.8 mmol/L）及丹蔘組（ 35.5 mmol/L），所降低之值與膽固醇組相比較 P <0.05，在統計學上有明顯差異。但 lovastatin 組無明顯統計差異。而在 8 週時血液 GPT 與 4 週之結果做為比較，其結果差距不大，持續給予藥物治療後與膽固醇組相比較有明顯降低之情形，在血液 GPT 明顯降低的有 probucol 組與中藥之川芎組、厚朴組、紅花組及石斛組，所降低之值與膽固醇組相比較 P <0.05，在統計學上有明顯差異。但 lovastatin 組、丹蔘組無明顯統計差異（Table 3）。. 血液 LDL-C 方面，4 週時在膽固醇組約 24 mmol/L ，藥物治療後與膽固醇組相比較都有降低之情形；血液 LDL-C 明顯降低的有 probucol 組（ 7.4 mmol/L）、 lovastatin 組（5.7 mmol/L）與中藥之紅花組（11.3 mmol/L）、川芎組（6.2 mmol/L）、丹蔘組（ 12.7 mmol/L）及厚朴組（ 3.5 mmol/L）等組別，所降低之值與膽固醇組相比較 P <0.05，在統計學上有明顯差異；但石斛組無明顯統計差異。而在 8 週時血液 LDL-C 在膽固醇組上升至 32.3 mmol/L 左右，持續藥物治療後與膽固醇組相比較都有明顯降低之情形；其血液 LDL-C 明顯降低的有 probucol 組（ 8.7 mmol/L）、lovastatin 組（13.7 mmol/L）與中藥之厚朴組（6.6 mmol/L）等組別，所降低之值與膽固醇組相比較 P value <0.05，在統計學上有明顯差異。但丹蔘組、紅花組、石斛組、川芎組無明顯統計差異（Table 4）。. 46.

(47) 血液 Triglyceride 方面，4 週時含量在膽固醇組之值為 2.6 mmol/L 左右；而給予藥物治療後，與膽固醇組相比較都有明顯降低之情形。其血液 TG 有明顯下降之組別有 lovastatin 組（0.5 mmol/L）與中藥之石斛組（ 0.3 mmol/L）、紅花組（ 0.6 mmol/L）、川芎組（ 0.4 mmol/L）及丹蔘組（ 0.5 mmol/L），所降低之值與膽固醇組相比較 P <0.05，在統計學上有明顯差異。而在 probucol 組與厚朴組中，雖有下降之趨勢，但無明顯統計差異。而在 8 週時血液 Triglyceride 在膽固醇組上升為 3.3 mmol/L 左右；持續藥物治療後，與膽固醇組相比較都有明顯降低之情形；其血液 TG 有明顯下降之組別有 probucol 組（ 2.2 mmol/L）、 lovastatin 組（0.8 mmol/L）與中藥之紅花組（ 0.85 mmol/L）、厚朴組（ 0.88 mmol/L），所降低之值與膽固醇組相比較 P <0.05，在統計學上有明顯差異。但川芎組、丹蔘組、石斛組無明顯統計差異（ Table 5）。. 血液 MDA（ malondialdehyde）方面在 4 週時在膽固醇組濃度約為 37.6 nmol/ml 左右，而各組其 MDA 濃度約分佈在 6.4 ~ 18 nmol/ml 左右，若與膽固醇組相比較都有明顯降低，P <0.05;在統計學上有明顯差異。而在 8 週時血液 MDA 在膽固醇組濃度約為 57 nmol/ml 左右，而持續藥物治療後各組其血液 MDA 濃度約分佈在 6.8 ~ 22 nmol/ml 左右，與膽固醇組相比都有明顯降低其血液 MDA，所降低之值與膽固醇組相比 P<0.05；在統計學有明顯差異(Table 6)。. 47.

(48) 在血液中自由基方面，主要利用 luminol 及 lucigenin 來測量血液中白血球釋放自由基能力，觀察過氧化氫及超氧自由基含量之變化。 4 週時過氧化氫自由基在膽固醇組約為 1.6count/WBC，其他各組約在 0.1-1.6 count/WBC 之間，超氧自由基在膽固醇組約為 1.4count/WBC，其他各組約在 0.3-1.4count/WBC 之間。 4 週時血液中自由基變化各組所降低之值與膽固醇組相比較 P ＞0.05，在統計學上無明顯差異。而在 8 週時血液中無論是超氧自由基及過氧化氫自由基變化，持續藥物治療後各組若與膽固醇組相比，都有明顯降低其血液自由基，所降低之值與膽固醇組相比較 P <0.05；在統計學上有明顯差異（ Table 7,8）。. 於第 8 週將兔子犧牲後，利用肝臟觀察其組織自由基變化情形。其組織自由基在膽固醇組約為 509 count，其他各組約為 100-300 count。持續藥物治療後各組與膽固醇組相比，都有明顯降低其組織自由基效果，所降低之值與膽固醇組相比較 P < 0.05，在統計學上有明顯差異（ Table 9）。. 於第 8 週將兔子犧牲後，以 Sudan IV 作胸主動脈染色，主要觀察粥狀動脈斑塊堆積之情形，測量其粉紅色脂質斑塊佔血管總面積的百分比。，正常組其主動脈血管之粥狀動脈斑塊形成情形幾乎沒有。但在膽固醇組其粥狀動脈斑塊堆積約為 43 ﹪，但在持續藥物治療後各組其粥狀動脈斑塊堆積介於 1-8 ﹪，幾乎是很低或近乎沒有粥狀動脈斑塊堆積情形產生；所降低之值與膽固醇組相比較 P < 0.05，在統計學上有明顯差異（Table 10）。 48.

(49) 於第 8 週將兔子犧牲後，以西方點墨法（ Western blot）觀察在胸主動脈血管 Fas-Ligand 表現量多寡。膽固醇組之表現量是有多於 probucol 組與中藥組之厚朴組、丹蔘組、紅花組之趨勢，持續藥物治療 8 週後各組與膽固醇組相比，其所降低之值與膽固醇組相比較 P > 0.05，在統計學上無明顯差異（Table 11）。. 49.

(50) 第二節西方點墨法 Fas-Ligand 結果各論西藥之 probucol 組與膽固醇組相比為降低（806502.00±105737.00 vs. 936578.50±48613.50），而 lovastatin 組與膽固醇組相比為升高（ 1078995.00± 4912.00 vs. 936578.50±48613.50），但其所降低或升高之值與膽固醇組相比 P > 0.05，在統計學上無明顯差異（Fig 11）。中藥之川芎組與膽固醇組相比為升高（ 1019713.50±15693.50 vs. 936578.50 ± 48613.50），所升高之值與膽固醇組相比 P > 0.05，在統計學上無明顯差異（ Fig 22）。厚朴組與膽固醇組相比為降低（ 730199.50±115916.50 vs. 936578.50 ± 48613.50），所降低之值與膽固醇組相比 P > 0.05，在統計學上無明顯差異（ Fig 33）。丹蔘組與膽固醇組相比為降低（ 506225.50±41837.50 vs. 936578.50 ± 48613.50），所降低之值與膽固醇組相比 P > 0.05，在統計學上無明顯差異（ Fig 44）。紅花組與膽固醇組相比為降低（ 840806.50±244423.50 vs. 936578.50 ± 48613.50），所降低之值與膽固醇組相比 P > 0.05，在統計學上無明顯差異（ Fig 55）。石斛組與膽固醇組相比為升高（ 1157058.00±55882.00 vs. 936578.50 ± 48613 .50），所升高之值與膽固醇組相比 P > 0.05，在統計學上無明顯差異（ Fig 66）。. 50.

(51) 第三節西藥組（probucol，lovastatin） 1、體重 Body weight 4.5 4 3.5 3. kg. normal 2.5. cho probucol. 2. lovastatin. 1.5 1 0.5 0 4 week. 8 week. time. Fig 1. 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後在 4、8 週分別測量其體重。數值為平均數 ±標準誤（ n = 3），西藥組無統計學上明顯差異。. Body weight versus time in rabbits fed various diets on 4th and 8th week. All values are the means± SE(n = 3) .In the normal group were fed rabbit chow; the control group were fed rabbit chow plus 10﹪corn oil and 0.5﹪ cholesterol; and the western-medicine groups were fed the same diet as control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin,respectively. There was no significant difference between control（ n =3）and the western-medicine（ n =3）groups.. 51.

(52) 2、血液生化值 Cholesterol 35. # 30. mmol /L. 25 20. normal. #. *. cho probucol. 15. *. lovastatin. *. 10. * 5 0 4 week. 8 week time. Fig 2 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後，分別在 4、 8 週以 Cobas Mira plus（ Roche）測量血液中膽固醇含量，數值為平均數 ± 標準誤（ n = 3）。＃表示與 normal 組相比 P ＜0.05；＊代表與 cholesterol 組相比 P ＜0.05，西藥組具有統計學上明顯差異。 Plasma cholesterol levels versus time in rabbits fed various diets 4th and 8th week. All values are the means± SE(n = 3) .In the normal group were fed rabbit chow; the control group were fed rabbit chow plus 10﹪ corn oil and 0.5﹪cholesterol; and the western-medicine groups were fed the same diet as control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin,respectively. *P＜ 0.05,vs control group.# P＜0.05,vs normal group.. 52.

(53) GPT 120. #. #. 100. U/ml. 80. normal cho. 60. probucol. * *. 40. *. lovastatin. 20 0 4 week. 8 week. time. Fig 3 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後，分別在 4、 8 週以 Cobas Mira plus（ Roche）測量血液中 GPT 含量，數值為平均數± 標準誤（ n = 3）。＃表示與 normal 組相比 P＜ 0.05；＊代表與 cholesterol 組相比 P ＜0.05，西藥組之 probucol 具有統計學上明顯差異。. Plasma GPT levels versus time in rabbits fed various diets on 4th and 8th week. All values are the means± SE(n = 3) .In the normal group were fed rabbit chow; the control group were fed rabbit chow plus 10﹪corn oil and 0.5﹪ cholesterol; and the western-medicine groups were fed the same diet as control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin,respectively. *P ＜0.05,vs control group. # P ＜0.05,vs normal group.. 53.

(54) LDL-C 40. #. 35. mmol /L. 30. #. 25. normal. 20. * *. 15. *. 10. cho probucol lovastatin. *. 5 0 4 week. 8 week time. Fig 4 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後，分別在 4、 8 週以 Cobas Mira plus（Roche）測量血液中低密度脂蛋白含量，數值為平均數 ± 標準誤（n = 3）。＃表示與 normal 組相比 P＜0.05；＊代表與 cholesterol 組相比 P ＜0.05，西藥組具有統計學上明顯差異。. Plasma LDL-C levels versus time in rabbits fed various diets on 4th and 8th week. All values are the means± SE(n = 3) .In the normal group were fed rabbit chow; the control group were fed rabbit chow plus 10﹪corn oil and 0.5﹪cholesterol; and the western-medicine groups were fed the same diet as control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin,respectively. *P ＜ 0.05,vs control group. # P＜0.05,vs normal group.. 54.

(55) Triglyceride 4.5. #. 4 3.5. mmol /L. 3. *. normal. 2.5. cho probucol. 2. lovastatin 1.5 1. *. *. 0.5 0 4 week. 8 week time. Fig 5 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後，分別在 4、 8 週以 Cobas Mira plus（Roche）測量血液中三酸甘油酯含量，數值為平均數 ±標準誤（ n = 3）。＃表示與 normal 組相比 P＜ 0.05；＊代表與 cholesterol 組相比 P＜ 0.05，8 週時西藥組具有統計學上明顯差異。. Plasma TG levels versus time in rabbits fed various diets on 4th and 8th week. All values are the means± SE(n = 3) .In the normal group were fed rabbit chow; the control group were fed rabbit chow plus 10﹪corn oil and 0.5﹪ cholesterol; and the western-medicine groups were fed the same diet as control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin,respectively. *P ＜0.05,vs control group. # P ＜0.05,vs normal group.. 55.

(56) 3、MDA MDA 70. # 60. nmol/ ml. 50 40. #. normal cho probucol. 30. lovastatin. *. 20. * *. 10. *. 0 4 week. 8 week time. Fig 6 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後，分別在 4、 8 週以 CuSO4 誘導血液中脂質過氧化，以 thiobarbituric acide-reactive substances(TBARS)之含量評估脂質過氧化程度。數值為平均數 ±標準誤（ n = 3）。＃表示與 normal 組相比 P ＜0.05；＊代表與 cholesterol 組相比 P ＜ 0.05，西藥組具有統計學上明顯差異。. Plasma MDA levels versus time in rabbits fed various diets on 4th and 8th week. All values are the means± SE(n = 3) .In the normal group were fed rabbit chow; the control group were fed rabbit chow plus 10﹪corn oil and 0.5﹪ cholesterol; and the western-medicine groups were fed the same diet as control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin,respectively. *P ＜0.05,vs control group.# P＜ 0.05,vs normal group.. 56.

(57) 4、血液自由基 blood free radical-luminol 4. #. 3.5. count /WBC. 3 2.5. normal cho. 2. probucol 1.5. lovastatin. 1 0.5. *. *. 0 4 week. 8 week. time. Fig 7 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後，分別在 4、8 週以 chemiluminescence CLD-110（ Tohoku），利用 luminol 測量其血液中過氧化氫自由基，數值為平均數 ± 標準誤（ n = 3）。＃表示與 normal 組相比 P ＜0.05；＊代表與 cholesterol 組相比 P＜0.05，8 週時西藥組具有統計學上明顯差異。. Whole blood luminol-CL counts of rabbits fed various diets on 4th and 8th week. All values are the means± SE (n =3) . In the normal group were fed rabbit chow； the control group were fed rabbit chow plus 10% corn oil and 0.5% cholesterol ; and the western-medicine groups rabbits were fed the same diet as the control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin, respectively. *P<0.05, vs control group. # P＜0.05,vs normal group.. 57.

(58) blood free radical-lucigenin 8. #. 7. count / WBC. 6 normal. 5. cho. 4. probucol. 3. lovastatin. *. 2. *. 1 0 4 week. 8 week. time. Fig 8 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後，分別在 4、8 週以 chemiluminescence CLD-110（Tohoku），利用 lucigenin 測量其血液中超氧自由基，數值為平均數± 標準誤（ n = 3）。＃表示與 normal 組相比 P＜ 0.05；＊代表與 cholesterol 組相比 P＜ 0.05，8 週時西藥組具有統計學上明顯差異。. Whole blood lucigenin-CL counts of rabbits fed various diets on 4th and 8th week. All values are the means± SE (n =3) . In the normal group were fed rabbit chow； the control group were fed rabbit chow plus 10% corn oil and 0.5% cholesterol ; and the western-medicine groups rabbits were fed the same diet as the control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin, respectively. *P<0.05, vs control group. # P＜0.05,vs normal group.. 58.

(59) 5、組織自由基 tissue free radical 600. #. count/ protein (g). 500 400 300 200. * *. 100 0 normal. cho. probucol. lovastatin. time. Fig 9 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後，在 8 週時以 chemiluminescence CLD-110（ Tohoku），利用 luminol 測量其肝臟中超氧自由基，數值為平均數 ±標準誤（ n = 3）。＃表示與 normal 組相比 P ＜0.05；＊代表與 cholesterol 組相比 P ＜0.05，西藥組具有統計學上明顯差異。. Liver tissues luminol-CL counts of rabbits fed various diets on 8th week. All values are the means± SE (n =3) . In the normal group were fed rabbit chow；the control group were fed rabbit chow plus 10% corn oil and 0.5% cholesterol ; and the western-medicine groups rabbits were fed the same diet as the control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin, respectively. *P<0.05, vs control group. # P＜0.05,vs normal group.. 59.

(60) 6、 Sudan IV 染色（A）. normal. cholesterol. probucol. lovastatin. 1 cm. （ B） vessel stain 50. #. % surface lipid lesions. 45 40 35 30 25 20 15 10 5. *. *. probucol. lovastatin. 0 normal. cho group. Fig 10 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後，在 8 週時以 Sudan IV 作胸主動脈血管染色，觀察其血管脂質斑塊堆積之情形，數值為平均數 ±標準誤（ n = 3）。＃表示與 normal 組相比 P ＜0.05；＊代表與 cholesterol 組相比 P ＜0.05，西藥組具有統計學上明顯差異。. 60.

(61) The extent of the development of lipid lesions on 8th week. (A) (double magnification 2 x , one of three) and densitometric analysis of the relative area of lipid lesions. (B) in the aorta after feeding with the experimental diet. Results are expressed as the means± SE(n = 3). In the normal group were fed rabbit chow; the control group were fed rabbit chow plus 10% corn oil and 0.5﹪ cholesterol ; and the western-medicine groups rabbits were fed the same diet as the control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin, respectively. *P<0.05, vs control group, # P<0.05, vs normal group.. 61.

(62) 7、 Western blot Fas-ligand. N. C. P. L. 1500000 1000000 500000 0 N. C. P. L. Fig 11 兔子給予 200mg/kg probucol 或 6 mg/kg lovastatin 治療後，以 Western blot 分析其主動脈血管 Fas-ligand 之表現情形。數值為平均數 ±標準誤（n = 3）。西藥組無統計學上明顯差異。 normal（ N）組 cholesterol（ C）組 probucol（P ）組 lovastatin（L）組 In the normal group were fed rabbit chow; the control group were fed rabbit chow plus 10﹪ corn oil and 0.5﹪cholesterol; and the western-medicine groups were fed the same diet as control group plus 200mg/kg probucol or 6 mg/kg lovastatin , respectively.Results of an density analysis（ Fas-ligand） performed on rabbits 0.5 ﹪cholesterol（as control）and the western-medicines groups after 8 weeks. Error is expressed as standard error of the mean.There was no significant difference between control（n =3） and the western-medicine（n =3） groups. 62.

(63) 第四節、中藥組－川芎 1、體重 Body weight 4.5 4 3.5 3 normal 2.5. kg. cho lovastatin. 2. 川芎. 1.5 1 0.5 0 4 week. 8 week. time. Fig 12 兔子給予 6 mg/kg lovastatin 、1﹪川芎治療後，在 4、8 週分別測量其體重，數值為平均數 ±標準誤（ n = 3）。川芎組無統計學上明顯差異。. Body weight versus time in rabbits fed various diets on 4th and 8th week. All values are the means± SE(n = 3) .In the normal group were fed rabbit chow; the control group were fed rabbit chow plus 10﹪corn oil and 0.5﹪ cholesterol; the lovastatin group were fed the same diet as the control group plus 6 mg/kg lovastatin, and the herbal-medicine groups were fed the same diet as control group plus 1﹪ Ligusticuum chuanxiong, respectively. There was no significant difference between control（n =3）and Ligusticuum chuanxiong（ n =3）groups.. 63.