水通道蛋白8aa在斑馬魚仔魚上的功能性研究

全文

(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 水通道蛋白 AQP8aa 在斑馬魚仔魚皮膚上的功能性研究 Functional study of aquaporin 8aa in skin of zebrafish larva. 研究生: 高揚彥 Yang-Yen Kao 指導教授：林豊益博士 Li-Yih Lin. 中華民國一０一年七月 0.

(2) 目錄. 目錄...................................... ...................... ................. ..........................1 摘要.................................................. ........... ................. .........................2 Abstract.......................................... ............... ................. ......................3 前言.................................................. ........... ................. .........................4 實驗目的................................ ............................... ......... .... ..................11 材料與方法....................... ........... ................. ........................................13 實驗設計.................................... ........... .................................................21 結果........................................ ........... ................. ...................................26 討論............................................ ........... ................. ...............................30 參考文獻................................ ........... ................. ...................................39 圖表................................. ........... ................. ..........................................45. 1.

(3) 摘要. 水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一群執行水分子通透的細胞膜蛋白。此外，有些 AQPs 也被發現具有二氧化碳、甘油、氨與尿素的通透性。最近研究將斑馬魚(Danio rerio) aqps 基因表現於蛙卵會增加細胞膜對二氧化碳/NH3 通透性。然而，目前仍沒有活體的實驗證實 AQPs 在動物體內參與二氧化碳(carbon dioxide, CO2)及 NH3 的通透能力。在本篇研究中，在原位雜交反應的結果中發現 aqp8aa 主要表現於斑馬魚仔魚的鰓上及皮膚上，而在利用免疫組織染色搭配原位雜交反應的結果發現 AQP8AA 主要在皮膚上表現於兩型的離子細胞上 (HR cells and NaR cells)。而在高氨馴養(10 mM NH4+)的情況下 aqp8aa 的 mRNA 表現量有顯著提升的情況，而在高碳酸水馴養的情況下卻無此情況產生。利用反義核酸(morpholino oligonucleotides)抑制 aqp8aa 蛋白質的表現後，利用掃描式離子選擇性電極(scanning ion-selective technique, SIET)來分析 H+及 NH4+在斑馬魚仔魚皮膚及離子細胞上的運輸。在 knockdown aqp8aa 表現後，發現仔魚整體的 H+ 及 NH4+的排放量都有下降的情況，而在特定細胞也有相似的結果，而在 CO2 短暫灌流的結果中也發現魚體對於 H+排放量都有下降的情況，在特定細胞也有相似的結果，由此結果推論 AQP8AA 在斑馬魚的仔魚上可能參與著此三物質的運輸。關鍵字:水通道蛋白、氨、二氧化碳、斑馬魚 2.

(4) Abstract. Aquaporins (AQPs) are integral membrane proteins that facilitate water transport across cell membrane. In addition, some type of AQPs was also found to facilitate diffusion of CO2, glycerol, NH3, and urea. Recently, in vitro studies with Xenopus oocytes showed that AQP8 is able to facilitate CO2/NH3 diffusion. However, in vivo study was lacking to support AQP’s function in CO2/NH3 transport. In this study, AQP8AA were identified in the gills and larval skin of zebrafish. Triple in situ hybridization / immunohistochemistry localized AQP8AA in two subtypes of ionocytes (HR cells and NaR cells). The protein and mRNA expressions of AQP8aa were induced by high-ammonia acclimation (10 mM NH4+) but not hypercapnia water acclimation (1% CO2). Using morpholino oligonucleotides to knockdown AQP8AA protein expression and a scanning ion-selective technique (SIET) to analyze carbonic acid (H+) and NH4+ transport at the skin ionocytes of larvae, this study suggests that AQP8AA facilitates CO2/NH3 transport in the skin ionocytes. Keyword : aquaporin, ammonia, CO2 , zebrafish . 3.

(5) 前言魚類的鰓及仔魚皮膚的功能魚類的鰓上特化出來的上皮細胞主要的功能是用來進行離子吸收、酸鹼的調節、含氮廢物的排除以及給予一個氣體交換的主要場所 (Evans et al., 2005; Hwang, 2009) 。鰓部上面主要由鰓絲以及鰓薄板來構成，其上大部分之面積主要由扁平的平鋪細胞(pavement cells, PVCs)平均的分布組成，其表皮細胞面積大且扁平的特性可有利於氣體的交換(Evans et al., 2005) ，因此目前認為魚類在進行氣體交換的功能時，主要利用角質細胞 PVCs 或 keratinocytes (KCs)來進行。在角質細胞之外另有一群卵圓形的離子細胞分布在其上，此類型的細胞因內含有大量的粒線體，因此又被稱為富含粒腺體細胞(mitochondriarich cells; MRCs) ，在過去的研究中發現，斑馬魚鰓上面的離子細胞可以依據其不同的功能以及膜蛋白的表現，歸類出三種亞型，分別是 H+-pump-rich cells (HR cells), Na+-Cl- cotransporter cells (NCC cells), 與 Na+-pump-rich cells (NaR cells) (Hwang, 2009)。這三種的離子細胞主要依賴其細胞膜上之特定運輸蛋白來執行離子吸收、酸鹼調節與含氮廢物排除的功能，但是仍未有離子細胞是否參與著氣體通透(CO2 / NH3)的功能的研究。魚類在胚胎及仔魚時期，由於其鰓部發育尚未完全，其所需之離子吸收、酸鹼調節與含氮廢物排除的功能，皆利用其仔魚隻皮膚來進 4.

(6) 行( Hwang and Lee, 2007; Hwang, 2009)，且在其仔魚時期時，發現其三種離子細胞亦會在其皮膚上面表現，且其功能以及作用機制與在成魚鰓部之功能相同或相似(Hwang, 2009) 。因此可以藉由研究仔魚表皮上面之功能與機制也可以了解其魚鰓的功能與機制。. 水通道蛋白的發現 1988 年 Peter Agre 在分離人類與大鼠隻紅血球細胞膜蛋白質以及大鼠腎臟細胞膜時，分離出一群為分子量為 28 kDa 的未知蛋白質，發現將蛋白質表現在非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵子細胞再將其浸泡於低張的溶液中，發現其蛙卵細胞有腫脹的現象發生，亦即水分藉用此蛋白質來進入細胞所造成之結果，此未知的蛋白質在當時被命名為 CHIP28 (channel-like integral protein of 28 kDa)，該蛋白即為現在被稱為水通道蛋白(aquaporins, AQPs)的第一型 AQP1 (Denker et al., 1988; Preston et al., 1988) ，就其結構上面來看，水通道蛋白為四聚體(tetramer)的結構，每一個單體(monomer)分別由 NPA motif 構成水孔，且具有一次運送四個水分子的管道，除了限制通過物質之大小外，其通道壁部分帶電的特性可以避免帶電分子的進出(Peter Agre, 2006)。. 水通道蛋白在哺乳動物之表現與運輸功能 5.

(7) 早期在非洲爪蟾卵細胞表現各型之 AQPs 具有水分通透的能力 (Denker et al., 1988)。且從 AQP1 與 AQP3 knockout mice 證明 AQP1 及 AQP3 缺失造成小鼠尿崩症狀(diabetes insipidus)發生，產生的原因為腎臟無法正常進行水分的再吸收作用，因此排出稀釋且量多的尿液 (Verkman., 2009) ，由此可知 AQPs 參與腎臟水分在吸收的重要性。而在哺乳動物的腎臟中 AQPs 的表現位置主要有 AQP1、AQP2、AQP3、 AQP4、AQP7 與 AQP8，其中 AQP1、AQP7 與 AQP8 位於近端腎小管(proximal tubule)與亨利氏環下降細端(thin descending limb)，從 AQPs 的表現位置及 in vitro 的結果皆證明 AQPs 在腎臟中的水分調節功能。此外在對於不帶電小分子的物質通透能力的研究上，在非洲爪蟾卵細胞上表現 AQP3 除了造成水分通透能力增加外，對於甘油及尿素也有通透增加的結果，且其結果可以受到 AQPs 的抑制劑 Hg2+抑制，使通透能力回復到沒有 AQP3 表現的情形(Ishibashi et al., 1994)。且從 AQP3-knockout mice 的實驗結果中也可以發現AQP3具有甘油的運輸功能，當弱化AQP3的表現後甘油運輸至表皮的能力降低，因此過去的實驗認為AQP3對於水分在皮膚的水合作用(skin hydration) ，甘油的運輸能力似乎比水分的運輸更加重要(Rojek et al., 2008)。. 6.

(8) 除了水分及小分子的物質運輸外，過去也發現部分的 AQPs 具有運輸通透氣體的功能，將 CA( carbonic anhydrase)及 AQP1a 表現於非洲爪蟾卵細胞給於高碳酸水體環境，發現細胞內所測得的 pH 值比未表現卵細胞有顯著降低的情況產生，即藉由 pH 值的變化可以說明其卵細胞細胞膜上的 CA 與 AQP1a 對於二氧化碳的通透能力影響。藉由測量細胞膜上的 pH 值的變化，表現人類 AQP 的蛙卵細胞會增加二氧化碳與氨的通透能力，且其 AQP 對於 CO2 的通透能力高於氨 (Chen et al., 2010)。水通道蛋白在哺乳動物具有13型(AQP0-AQP12)，分別表現於各個組織間，例如血球、呼吸道、腦脊髓膜、腎臟、腸胃道、生殖系統、組織上皮細胞等，依照in vitro功能分三群，第一群為aquaporins (AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5與AQP6)，單純進行水份運送；第二群為aquaammoniaporins (AQP8)，運送水份與氨；第三群為 aquaglyceroporins (AQP3、AQP7、AQP9與AQP10)，除了運送水份與氨，也具有運送甘油與尿素的能力，目前AQP11與AQP12在組織表現與功能相關研究較為缺乏，因此尚未列入分群中(Litman et al., 2009)。. 魚類水通道蛋白的研究. 7.

(9) 體液滲透壓的調節對於生活在水中的魚類如何去維持是依相當重要的議題，因此也是時常被討論研究的主題，在過去對於 AQPs 的研究主要是在討論在不同環境中 AQPs 對於適應其環境的表現量變化，以及在各種不同組織中表現的情形，藉此釐清 AQPs 在調節滲透壓過程中所扮演的腳色。已經被發現主要存在於硬骨上並且被廣泛研究的水通道蛋白主要有 AQP1a, AQP1b, AQP3, AQP4 與 AQPe 等(Tipsmark et al., 2009)。 AQP1 在歐洲鰻(Anguilla anguilla)與海鱸(Dicentrarchus Labrax) 的鰓部都有少量的表現，其表現量亦不受其環境水體鹽度的影響而改變其表現量(Martinez et al., 2005; Giffard-Mena et al., 2007) ；在黑鯛 (Acanthopagrus Schlegeli)鰓部的表現量則會受水體的鹽度改變而改變，在淡水時表現量會高於海水；歐洲鰻、海鱸與金頭鯛(Sparus Sarba) 適應海水時，其腸道中的 AQP1 表現量會有提升的現象，推測應與在海水中的適應方式相關，在腸道中的表現提高可以處進其腸道的水分吸收，以補充不足的水分(Aoki et al., 2003; Martinez et al., 2005; Giffard-Mena et al., 2007; Raldua et al., 2008)。 AQP3 在許多種類的魚類魚鰓組織中大量表現，而在日本鰻、歐洲鰻、海鱸與金頭鯛的研究結果中顯示，在一滴滲透壓的強況下會有一 AQP3 表現量提升的情況產生，因此認為 AQP3 在鰓上面主要是進 8.

(10) 行滲透壓調節的功能(Cutler and Cramb, 2002; Deane and Woo, 2006; Tse et al., 2006; Giffard-Mena et al., 2007)；而在日本鰻的鰓組織中 AQP3 的表現位置主要在角質細胞與離子細胞的底側膜上(Lignot et al., 2002)，而在吳郭魚的研究上則認為其可能參與著滲透壓改變的感測功能(Watanabe et al., 2008) ，而 AQP3 在腸道中的表現主要是被認為與黏液的分泌有關(Cutler et al., 2007)。AQP4 在彩虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)上的研究，主要與其卵子細胞的成熟有相關的功能(Bobe et al., 2006) 。AQPe (related to human AQP10) 在金頭鯛與歐洲鰻的腸道以及腎臟上面皆有所表現，目前認為其功能與吸收水分 (上皮細胞的水分運送)相關(Giffard-Mena et al., 2007; Deane and Woo, 2006)。. 斑馬魚水通道蛋通透氣體之研究在斑馬魚上的研究發現，斑馬魚卵黃囊表皮上的離子細胞與氣囊上皆有 AQP 的表現(Chen et al., 2010) ，將斑馬魚的 aqp 表現在蛙卵細胞上面會增加氨與 CO2 的通透能力，並且發現其通透 CO2 的能力更高於通透氨的能力(Chen et al., 2010)。而在斑馬魚上面的研究，已經發現有 17 型的 AQPs 分布在斑馬魚的各種組織上(生殖器官、腦、眼、鰓、前腸、中腸、後腸、腎臟、肝臟、肌肉與皮膚)，而斑馬魚 AQPs 各型的分布情況不同，普遍存在 9.

(11) 於各組織的有 AQP1, AQP3a 和 AQP12，其他幾型只表現於特定的組織中，在鰓上面有表現的有九型，目前對於鰓上面的研究相當的缺乏，且魚鰓是直接與外界水體接觸器官，在鰓上面表現大量的 AQP，會促進鰓上面對於水分的通透能力，可能會加速海水魚的水分流失，或是淡水魚過的水分流入的情況發生，因此對於其滲透壓的調節以及對於環境的適應極為不利，因此 AQPs 在鰓上是否參與著其他生理功能的機制，是目前研究必須釐清的部分，且由之前的研究中的 in vitro 證據可以得知斑馬魚 aqp 有參與氣體通透的能力，但是在 in vivo 上的研究就相當稀少，無法有足夠的研究來了解水通道蛋白在鰓上面參與的功能。. 10.

(12) 實驗目的目前在斑馬魚上的研究，已經發現到 AQPs 可能會參與水分子或不帶電小分子的運輸，但是在這幾年氣體通道蛋白的研究中，AQPs 可能也會參與著 CO2 和 NH3 的運輸，在斑馬魚及人類的研究中將斑馬魚的 AQPs 表現於蛙卵細胞上的研究中，發現部分的 AQPs 參與著通透氣體(CO2 或 NH3)的功能，然而目前在活體動物中直接證明其運輸功能的證據仍然不足。在斑馬魚的 CO2 的排放過程中，主要是以排放氣體 CO2 的方式是以 CO2 排出體外與水分子形成碳酸，部分解離出碳酸氫根離子與氫離子(CO2 + H2O ←→ H2CO3 ←→ HCO3- + H+)，因此在斑馬魚身上排出 CO2 也是維持體內酸鹼平衡的重要機制。而在斑馬魚的研究中，發現在斑馬魚排出酸的過程中造成會在體表累積成微環境，而進行酸捕捉(acid-trapping)促進 NH4+的排出，因此 CO2 的排出也許會和 NH4+的排出相關。而在目前斑馬魚體內發現的 17 型 AQPs 基因已經全部選殖完成，在目前的研究中得知在分類中 aqp8 是唯一被分類在單純會參與排氨的 aquaammoniaporins 中(Tingaud-Sequeira et al., 2010)，而在實驗室中未發表結果中發現 aqp8 在斑馬魚上有 aqp8ab 和 aqp8aa 兩型存在，而只有 aqp8aa 這型在鰓上有大量表現，且在斑馬魚的鰓上相對表現量高，僅次於 aqp3a，在哺乳類鰓上的研究中發現，腎臟中的 aqp8 的表現會和排酸相關(soria et al., 2001)，在 11.

(13) 小鼠的呼吸道上亦有其分佈在呼吸到表皮細胞的底側膜上(Neilsen et al., 2001)。因此，本篇以 SIET 測量魚體內排出的 NH4+的濃度，及測量由碳酸所解離出的氫離子濃度梯度的變化，進行活體上 aqp8aa 的功能分析，及斑馬魚子魚皮膚上特定細胞的功能。以分子技術標定 AQP8AA 與離子細胞亞型，同時也利用 morpholino knockdown 的技術弱化 AQP8AA 的蛋白質表現，以分析此蛋白質的功能。本篇實驗的重點在釐清 aqp8aa 在斑馬魚仔魚上的表現，在斑馬魚皮膚上的分布位置，以及位於何型離子細胞上，並分析 AQP8AA 是否參與著魚體及特定離子細胞的 CO2 及 NH4+的排放，藉以建立斑馬魚皮膚的 CO2 及 NH4+的通透模式，除了作為 AQPs 在活體上可能會進行氣體通透的證據外，也可以對於魚類鰓上皮組織及皮膚組織多樣且複雜的離子、氣體交換的功能能有進一步的了解。. 12.

(14) 材料與方法實驗動物與來源 AB 種系的斑馬魚因基因解序完整，因此經常被使用於遺傳及胚胎發育等方面之研究的模式動物，在飼養的方式，給予光週期 14 小時暗週期 10 小時的環境，並且維持全天候 27°C 的環境溫度，可每日進行交配產卵，取得實驗所需之受精卵，取得之卵子培育在人工淡水中，每日換水，依實驗不同可置換至不同馴養隻水體，受精卵會在受精後三天孵化，孵化後即可進行試驗。. 馴養條件正常馴養情況所使用之人工水(正常水, normal water, NW) ，以超純水(dH2O)配置成含有 0.4 mM NaCl, 0.2 mM MgSO4, 0.08 mM K2HPO4, 0.005 mM KH2PO4, and 0.2 mM CaSO4 (pH 6.9)與自然界淡水相符合之人工水。進行 1% CO2 填充(1 % CO2 loading, pH6.3) (Perry et al., 2010)環境處理實驗時，以上述之 NW 持續以二氧化碳鋼瓶以打氣方式提供水中 CO2 濃度，由之前的研究得知，將水體 pH 值降低 0.6Ph 值時相當水中含有 1% CO2 濃度(Nawata et al., 2010)。監控水體 pH 值變化與溫度恆定(27 ℃)。仔魚長期馴養須每日更換兩次已配置好之 1 % CO2 填充水體以維持水中 CO2 濃度條件，並隨時監控水中 pH 值變化以維持水體中 CO2 濃度。 13.

(15) RNA 萃取與即時定量 PCR (real-time quantitive PCR, qPCR) 斑馬魚胚胎授精後給予 1 % CO2 填充環境馴養或給與 10mM 高氨水體的馴養，以及一組正常水馴養之控制組，每日置換水體，於 72 hpf 犧牲並取用整隻魚體進行分析。以 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)進行 RNA 萃取與均質後以 DEPC 水回溶。純化 RNA 的過程以 DNase Ⅰ solution (5μl RNase-free DNaseⅠ與 200 μl DNase buffer)降解 DNA，並以 MPC protein Precipitation Reagent 移除蛋白質。RNA 的定量以 NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific)分析，以每管濃度 5μg 比例計算所需的量，再利用反轉錄酵素 SuperScript III (Invitrogen)將 RNA 反轉錄為 cDNA。以 Roche LightCycler 480 (Roche Applied Science)系統作為 mRNA 表現量的分析。各基因所使用之專一性引子如表 1。cDNA 以 1：200 稀釋。將上述樣本加入專一性引子(50 nM)與 LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche)後，以 standard template 的條件進行 PCR (50℃/2 min 與 95℃/10 min 1 循環; 95℃/15 min 與 60℃/1 min 40 循環)。 Internal control gene 為核糖體蛋白 RPL13a (ribosomal protein L13a)。. 斑馬魚蛋白質萃取與蛋白質定量 14.

(16) 斑馬魚胚胎授精後給予 1 % CO2 填充環境馴養或給與 10 mM 高氨水體的馴養，以及一組正常水馴養之控制組，每日置換水體，於 72 hpf 犧牲並取用整隻魚體進行分析。以 homogenizing buffer (Tris-HCL 0.344g, EDTA 0.8556g, surcrose 0.74g, Na Deoxycholate 0.4g ) 。. 及 proteinase inhibitor 進行均質，後離心取上清液保存於-20 Ｃ備用。以 TANON VE-180 及 MAJOR SCIENCE MP-250N 進行蛋白質電泳以及蛋白質轉漬，並以 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Subsreate 進行冷光呈色，再以 ImageQuantTM LAS 4000 mini 進行影像的攝取及分析。. 斑馬魚 aqp8aa clonging 與 RNA probe 合成設計提供轉殖之aqp8aa專一性引子(表2)。將PCR產物轉入 pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, WI)。以BLASTx program (National Center for Biotechnology Information)進行定序分析。 Aqp8aa基因片段藉由PCR取得並植入pGEM-T Easy vector，以T7 與SP6引子PCR放大，其產物作為SP6與T7 RNA polymerase (Roche, Penzberg, Germany)轉錄之模板。Digoxigenin (DIG)-labeled RNA probes跑膠分析品質並定量。. 15.

(17) 原位雜交法(in situ hybridization)與細胞免疫組織染色 (Immunocytochemistry) 分別將不同發育時期之斑馬魚胚胎以固定液(4 % paraformadehyde, 4℃)進行固定，時間為隔夜時間，並保存於甲醇中。樣品以濃度梯度置換至 PBST (PBST: 0.2 % Tween-20, 1.4 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.1 mM Na2HPO4, and 0.002 mM KH2PO4; pH 7.4)，並配置 HyB 溶液(HyB: hybridization buffer,成分為：60 % formamide, 5x SSC, 0.1 % Tween-20)。用前置雜交方式(prehybridization)處理樣品：在環境溫度為 65℃，把樣品放在 HyB+溶液中 3 至 5 小時(HyB+: HyB 溶液加上 500 μg/ml yeast tRNA, 50 μg/ml heparin，藥品訂購自 Sigma, St. Louse, MO, USA)。接著進行雜交處理，把樣品培養在有 100 ng RNA prbe /200μL HyB+溶液中，環境溫度為 65℃，放置隔夜。接著在 65℃環境下，以濃度梯度置換 HyB 溶液至 2x SSC 溶液，接著在 70℃ 環境下用 0.2x SSC 溶液處理樣品 30 分鐘共兩次。室溫下，將樣品從 0.2x SSC 溶液以濃度梯度置換至 PBST 溶液中，接著將樣品培養在 Blocking Solution 中 3 至 5 個小時(Blocking Solution: 5% sheep serum+2mg/ml BSA 溶在 PBST 溶劑中)。將樣品培養在 1：5000 倍抗體的 Blocking Solution，環境溫度 4℃放置隔夜。接著以 PBST 溶液清洗，並換至染劑緩衝溶液中準備進行染色處理，加入 NBT 與 BCIP 16.

(18) 至染色緩衝液中配製呈色劑，並將樣品放入進行呈色反應，在染色過程中，當訊號達到所要強度時，置換 PBS 溶液(PBS: 1.4 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.1m M Na2HPO4, and 0.002 mM KH2PO4; pH 7.4)終止染色反應。將標定 RNA probe 標定的樣本進一步以免疫組織染色進行雙重染色。仔魚先置換於 PBS 溶液，再至換於 Blocking Solution 一個小時，分別給予 NKA 一級抗體(mouse monoclonal anti-α5, PBS 1:1000 稀釋)， HA 一級抗體(polyclonal antibody against the A subunit of killiﬁsh H+-ATPase, PBS 1:1000 稀釋) 4℃搖晃整晚。以 PBS 清洗，並分別給予帶有螢光之二級抗體，NKA (anti-mouse IgG conjugated with Alexa 488, PBS 1:500 稀釋)，HA (goat anti-rabbit IgG conjugated with Alexa 568, PBS 1:500 稀釋)室溫搖晃兩個小時，以 PBS 清洗，於螢光顯微鏡下觀察取得影像(Olympus BX60, Japan)。. 掃描離子電極技術(Scanning Ion-Selective Electrode Technique, SIET) SIET以專一針對單一離子之電極進行離子濃度差或細胞流量的檢測。以拉針器將直徑1.5 mm的毛細玻璃管拉製成口徑約3-4 µm的微電極，放置120℃烘箱中去除水氣。微玻璃電極內部須填充能專一通透離子的選擇性離子交換膜(liquid ion exchanger cocktail；LIX)以及欲 17.

(19) 測離子的電解液(H+: 40 mM KH2PO4和15 mM K2HPO4)，即成為能專一通透特定離子的選擇性離子微電極。本實驗中以H+ LIX製作電極以測定H+離子。將此微電極接上前極放大器，再接到訊號放大器，放大後的訊號(1000倍)再經由類比數位轉換器(A/D converter)後由電腦讀取與軟體分析。微電極的位置控制及掃描移動則是靠電腦驅動步進馬達來控制，做三度空間移動時，可測量到固定距離間單一種類的離子濃度差，進而計算出所測量該離子在細胞表面的流量與方向(吸收或排放)。同時，在正立顯微鏡上接上CCD攝影系統，將所有電極與胚胎影像傳送至電腦中，以進行電極操控與分析。利用標準溶液(H+： pH7、8、9)，透過log [H+]所得到的電壓輸出值，經由線性迴歸產生該離子的涅斯特斜率(Nernstian slope) (H+：54.3 ± 0.9, n=7)，即可將其測量樣本的電壓值換算成該離子所相對應的濃度。SIET具有即時、高空間解析度與非侵入性的特性，已被應用於多種領域之研究測量 (Smith et al., 1999; McLamore et al., 2009)。. 體表整體值離子濃度測定 SIET所使用之樣本取用受精後三天斑馬魚仔魚，馴養於NW環境。麻醉劑配置為2 ml的測量麻醉劑配製為淡水中加入300 μM tricine緩衝溶液(Sigma-Aldrich)和0.3 mg/l ethyl 3-aminobenzoate 18.

(20) methanesulfonate (MS222, Sigma- Aldrich)，再利用1N NaOH和1N HCl 滴定至實驗設計的pH值。量測胚胎時，先將胚胎麻醉置於載臺中央，遠離體表約1 cm處測量背景值，再將微電極移動至靠近體表10-20 μm 測量離子累積的電位值。測量環境溫度維持26-28℃。. 細胞離子濃度測定經由DIC光學顯微鏡載搭配數位相機的即時影像(LiveView)，將觀察畫面傳送至電腦螢幕，以操控離子微電極的移動和辨別表皮細胞。細胞流量的測量，操作步進馬達使離子電極移動至距離欲測量的離子細胞頂端細胞膜上2 μm的位置，進行10 μm的電極擺動測量，以得兩點之間的電位差值。分別在離子細胞與角質細胞表面各重複數次擺動測量，取中位數計算後，即可記錄表皮細胞所排放或吸收的濃度。計算離子流量的方法，參考前人已發表的研究(Donini and O'Donnell, 2005; Shih et al., 2006; Smith et al., 2009)。經由ASET軟體獲得電位差值，進而利用下列方程式轉換成濃度： ΔC = C b x 10(ΔV/S) – C b; (1)ΔC (μmole l-1 cm-3)為兩點的濃度梯度；C b (μmole l-1)為背景值的濃度；ΔV為電位梯度；S為涅斯特斜率。. 19.

(21) 反義核酸(antisense morpholino oligonucleotides)與微量注射法 (microinjection) 反義核酸自國外原廠(Gene Tools, LLC, Philomath, OR, USA)訂購，由國內柏森生物科技公司代理進口。其方法參照前人所發表 (Horng et al., 2007)。針對 aqp8aa 所設計之反義核酸(表 3)處理作為對照組的核酸片段為美國原廠所提供的標準核酸，不具有特定的目標也沒有任何的生物活性。反義核酸以蒸餾水稀釋，溶液包含 0.1 %的酚紅(phenol red)當作注射位置指示劑並以玻璃電極及微量注射系統 (Narishige IM 300 microinjector system, Narishigi Scientific Instrument Lab., Tokyo, Japan)分別將 MO 2ng 與 4ng 注射至 1 到 4 個細胞時期的斑馬魚胚胎。. 統計分析進行統計分析使用 MiniTab 軟體。實驗結果為平均值±標準機差 (SEM)。比較兩組平均值以 Student’s t-test (two-tailed)進行分析。三組以上數值以 one-way ANOVA 與 Tukey’s post-hoc test 分析。達到統計上的顯著差異為 p value 小於 0.05 (p < 0.05)。. 20.

(22) 實驗設計實驗一、測量 aqp8aa 在 1pdf 到 4dpf 仔魚的基因表現量. 實驗二、測量 aqp8aa 在高氨及高碳酸馴養下的基因表現量. 實驗三、測量 aqp8aa 在高氨及高碳酸馴養下的蛋白質表現量. 實驗四、標定 aqp8aa 在斑馬魚仔魚上的分布及細胞上的分布. 實驗五、測量 aqp8aa 在抑制離子細胞生成後基因的表現量. 實驗六、測量 aqp8aa MO 各濃度之蛋白質表現量. 實驗七、測量 aqp8aa knockdown 對於整體的 Δ[H+]及 Δ[NH4+]的影響. 實驗八、測量 aqp8aa knockdown 1% CO2 填充對仔魚整體 Δ[H+]影響. 實驗九、測量 aqp8aa knockdown 1 % CO2 填充對特定細胞 Δ[H+]影響. 實驗十、測量 aqp8aa knockdown 對特定細胞 Δ[NH4+]影響. 21.

(23) 實驗一、aqp8aa 在 1pdf 到 4dpf 仔魚的基因表現量仔魚自受精後開始分別馴養至 1dpf、2dpf、3dpf、4dpf 犧牲抽取 RNA，針對 aqp8aa 基因進行即時定量 QPCR 試驗，分析樣品的 mRNA 相對表現量，各組樣本數為 6，利用 RPL13a 為 internal control gene。. 實驗二、aqp8aa 在高氨及高碳酸馴養下的基因表現量斑馬魚仔魚自受精後分別進行 NW、1% CO2 填充 PH5 馴養及 5mM NH4+環境馴養至 3 dpf 後犧牲抽取 RNA。每日換水並監控水體酸鹼值變化與溫度恆定，針對 aqp8aa 基因以即時定量 PCR 定量其 mRNA 表現情形，以說明 CO2 及高氨環境對於基因表現量的調節情形。各組樣本數為 6。rpl13a 為 internal control gene。. 實驗三、aqp8aa 在高氨及高碳酸馴養下的蛋白質表現量斑馬魚仔魚自受精後分別進行 NW、1%CO2 填充及 5mM NH4+ 環境馴養至 3 dpf 後犧牲抽取蛋白質。日換水並監控水體酸鹼值變化與溫度恆定，針對 aqp8aa 蛋白質以 western blot 定量其蛋白質表現情形，以說明 CO2 及高氨環境對於蛋白質表現量的調節情形。RPL13a 為 internal control 。實驗四、aqp8aa 在斑馬魚仔魚上的分布及細胞上的分布. 22.

(24) 將斑馬魚仔魚受精後 3 天進行固定，置換於 PBS 並進行原位雜交法仔魚體表表皮細胞以分別以 aqp8aa anti-sense RNA 探針與 aqp8aa sense RNA 探針進行標定，並將已標定 aqp8aa 的仔魚進一步以免疫螢光染色法，分別以 HR cell 的 marker (HA), NaR cell 的 marker (NKA)與 NCC cell 的 marker (NCC)進行標定，以驗證 aqp8aa 表現在仔魚表皮細胞的何處，且表現於何型離子細胞上。. 實驗五、aqp8aa 在抑制離子細胞生成後基因的表現量利用抑制離子細胞生成之 foxi3a 及 foix3b MO 和抑制 HRC 生成之 gcm2MO 抑制離子細胞生成後，將利用此兩組 MO 處理過之仔魚在 3dpf 時犧牲抽取 RNA，每日換水並監控水體酸鹼值變化與溫度恆定，針對 aqp8aa 基因以即時定量 PCR 定量其 mRNA 表現情形，以說明在沒有離子細胞生成之魚體對於 aqp8aa 基因表現量的影響，來驗證 aqp8aa 是否分布於兩型離子細胞上。各組樣本數為 6。rpl13a 為 internal control gene。. 實驗六、aqp8aa MO 各濃度之蛋白質表現量利用 aqp8aa MO 分別注以下三種濃度組別 0 ng/egg、2 ng/egg、4 ng/egg，馴養至 3 dpf 後犧牲抽取蛋白質。每日換水並監控水體酸鹼值變化與溫度恆定，針對 AQP8AA 蛋白質以 western blot 定量其蛋白 23.

(25) 質表現情形，以說明 aqp8aa MO 確實能夠有效抑制其蛋白質生成且其抗體之專一性。rpl13a 為 internal control 。. 實驗七、aqp8aa knockdown 對於整體的 Δ[H+]及 Δ[NH4+]的影響利用 SIET 技術針對 aqp8aa knockdown 後 3 dpf 之斑馬魚仔魚進行，卵黃囊外整體體表氫離子濃度及氨離子濃度梯度測量，驗證弱化 AQP8AA 蛋白質生成之後，對於斑馬魚仔魚排出氫離子及氨離子的差異，以證明 AQP8AA 是否參與著這兩種物質的通透作用。各組樣本數為 6。. 實驗八、aqp8aa knockdown 1% CO2 填充對仔魚整體 Δ[H+]影響 CO2 與水結合形成碳酸，部分解離出碳酸氫根與氫離子(CO2+ H2O→ H2CO3→ HCO3- + H+)，因此可以藉由測量氫離子濃度推測 CO2 或碳酸的通透程度。本實驗中利用給予 1 % CO2 填充環境造成細胞內 CO2 累積，再於 NW 環境測量，說明由 CO2 所引起氫離子濃度梯度變化，推測 CO2 的通透情形。在實驗之前先檢視給予 1 % CO2 填充環境的仔魚是否出現畸形率或死亡率的增加情形，以說明斑馬魚仔魚能夠在正常生理條件下進行 CO2 調節作用。利用 SIET 技術針對 aqp8aa knockdown 後 3 dpf 之斑馬魚仔魚進行，卵黃囊外整體體表氫離子濃度梯度測量，驗證弱化 AQP8AA 蛋白質生成之後，對於斑馬魚仔魚 24.

(26) 排出氫離子的差異，以證明 AQP8AA 可能參與著 CO2 通透作用。各組樣本數為 6。. 實驗九、aqp8aa knockdown 1% CO2 填充對仔魚整體 Δ[H+]影響從水鏡下我們可以藉由型態的差異清楚的分辨離子細胞與PVC，而將離子細胞利用外觀分為HRC及Non-HRC 兩型。再利用SIET技術分別進行測量其細胞之氫離子濃度梯度，並拍照紀錄細胞位置再將仔魚進行1 % CO2填充水體浸泡10分鐘後，在NW環境下以SIET測量同一顆細胞氫離子濃度梯度，比較同一個細胞在NW與1 % CO2填充後，氫離子濃度梯度差異。以推測其細胞上AQP8AA蛋白質弱化後是否對於其CO2的排放會造成差異，加以驗證AQP8AA可能參與著CO2的排放作用。各組樣本數為6。. 實驗十、aqp8aa knockdown 對特定細胞 Δ[NH4+]影響利用 SIET 技術針對 aqp8aa knockdown 後 3 dpf 之斑馬魚仔魚進行兩型離子細胞之氨離子濃度梯度測量，驗證弱化 AQP8AA 蛋白質生成之後，對於斑馬魚仔魚排出氨離子的差異，以證明 AQP8AA 是否參與著氨的通透作用。各組樣本數為 6。. 25.

(27) 實驗結果實驗一、斑馬魚仔魚受精後 aqp8aa mRNA 表現量針對已知有在斑馬魚鰓上表現之 aqp8aa 基因，以 real-time qPCR 進行基因表現量分析，由結果中發現仔魚受精後一天即有 aqp8aa mRNA 的表現，且隨著發育時間的增加表現量跟著增加(圖 1). 實驗二、高碳酸、高氨及酸性水體馴養對 aqp8aa mRNA 表現的影響將仔魚分別馴養在高碳酸水、高氨及酸性水中，於受精後三天將仔魚犧牲，抽取其 mRNA 進行 real-time qPCR 進行基因表現量比較，而在高氨水體馴養後，aqp8aa 表現量較控制組來的顯著提升(圖 4Ａ) 發現仔魚在高碳酸水體馴養後，aqp8aa 表現量有顯著提升之情況(圖 4Ｂ)，在酸性水體馴養的過程中也有此表現量顯著提升之情況的產生。. 實驗三、高碳酸及高氨水體馴養對 AQP8AA 蛋白質表現的影響將仔魚分別馴養在高碳酸水及高氨水中，於受精後三天將仔魚犧牲，抽取其蛋白質進行 western blot 進行蛋白質表現量比較，從結果中發現仔魚在高氨水體馴養後，AQP8AA 表現量有顯著提升之情況 (圖 4A)，而在高碳酸水體馴養後，AQP8AA 表現量較控制組無的顯著提升(圖 4B)。 26.

(28) 實驗四、aqp8aa 在仔魚體表的表現位置以 aqp8aa RNA probe 進行免疫原位雜交染色，結果顯示出 aqp8aa 基因訊號主要表現在仔魚卵黃囊表皮細胞(圖 2A)，並且在仔魚細胞鰓上也有訊號表現。將已經完成免疫原位雜交反應之仔魚樣本進行免疫螢光染色以進行離子細胞的標定，各分別以 NKA 為 NaRCs 的 marker，另以 HA 為 HRCs 的 marker(圖 2B)，顯示兩型離子細胞在仔魚與體表上的分布情形。從免疫原位雜交反應與免疫組織染色的雙重染色結果中指出，aqp8aa 基因的表現位子主要表現在仔魚體表上的 HRCs 和 NaRCs 上(圖 2C)。. 實驗五、foi3a/foxi3b MO 及 gcm2 MO 對於 aqp8aa 的 mRNA 表現影響將利用抑制 gcm2 及同時抑制 foxi3a 和 foxi3b 兩種離子細胞分型的基因，來抑制離子細胞的形成，以 real-time qPCR 進行 aqp8aa 基因表現量分析來觀察對於 aqp8aa 基因的表現量的影響。由結果指出在兩組處理組的表現量都顯著低於控制組織 aqp8aa 基因之表現量(圖 3)。. 實驗六、三種 aqp8aa MO 濃度對於斑馬魚仔魚蛋白質表現量的影響. 27.

(29) 將魚胚胎內注射 0 ng/egg， 2 ng/egg 和 4 ng/egg 三種濃度注射 aqp8aa MO 抽取其蛋白質進行 western blot 進行蛋白質表現量比較，在 0 ng/2gg 及 2 ng/egg 無顯著差異，在 4 ng/egg 的處理組別中表現量有顯著降低的情況產生(圖 6)。. 實驗七、aqp8aa MO 仔魚體表卵黃整體 Δ[H+]和 Δ[NH4+]之影響利用 SIET 分析控制組與 aqp8aa MO 仔魚魚體卵黃囊表面 Δ[H+] 和 Δ[NH4+]情況，在 Δ[H+]的分析中由結果中發現 aqp8aa MO 的排放量較控制組有顯著的下降情況(圖 7A) ，而在 Δ[NH4+]結果中發現 aqp8aa MO 的排放量也有較控制組有顯著的下降情況(圖 7B)產生。. 實驗八、二氧化碳填充對 aqp8aa MO 仔魚卵黃體表 Δ[H+]之影響為檢仔魚排出體內累積的 CO2 能力，將魚浸泡在 1% CO2 填充之水體 10 分鐘後，再利用 SEIT 測量其 Δ[H+]排放量，將仔魚浸泡在 1 % CO2 填充的環境 10 分鐘後，仔魚活動能力並無異常或死亡發生。將測其排放 CO2 的能力的結果顯示，給予 CO2 水體短期浸泡後，可測得仔魚卵黃體表氫離子濃度梯度比正常水組有顯著增加情形，產生酸化的結果，而在 aqp8aa MO 的組別中亦較正常水組有顯著增加的情況(圖 8)，但增加的量只有控制組的 64.8%。. 實驗九、二氧化碳填充對仔魚體表特定細胞 Δ[H+]之影響 28.

(30) Aqp8aa 已知分布在 HRC 及 Non-HRC 兩型離子細胞上，藉由二氧化碳填充的方式進行 SEIT 的試驗，測量 aqp8aa 在兩型離子細胞上對於 CO2 排放能力的試驗，在 Non-HRC 的細胞上測控制組之仔魚在 CO2 填充後其 Δ[H+]有顯著上升的情況，而在 aqp8aa MO 的組別中也有此情形，但其提升的程度僅有控制組的 42.1%(圖 9A) ，在 HRC 的細胞上測控制組之仔魚在 CO2 填充後其 Δ[H+]有顯著上升的情況，而在 aqp8aa MO 的組別中也有此情形，但其提升的程度僅有控制組的 22.6%(圖 9B)。. 實驗十、aqp8aa MO 仔魚體表特定細胞 Δ[NH4+]之影響在 HRC 及 NaRC 上皆有 aqp8aa 的分布，利用 SIET 測量其兩型離子細胞的 Δ[NH4+]，在結果中發現到 Non-HRC 的 Δ[NH4+]有較控制組顯著下降的情況產生(圖 10A) ，而在 HRC 的結果中其 Δ[NH4+]的數據也有較控制組顯著下降的情況產生。. 29.

(31) 討論分析斑馬魚 AQPs 基因及蛋白質表現之關係從即時定量 PCR 分析 aqp8aa 在斑馬魚中的表現量，可以發現在受精後一天的斑馬魚胚胎中就有 aqp8aa 的表現，在受精後一天到受精後四天中隨著斑馬魚的發育 aqp8aa 的表現量亦隨之提升，。將斑馬魚馴養在 1% CO2 高碳酸水中三天後，發現其?基因表現量有顯著提升，而在高氨水中馴養三天的仔魚 aqp8aa 的表現量也有顯著的提升，顯示 aqp8aa 可能參與 CO2 與 NH3 的通透功能。而在蛋白質的表現量中也有相似於基因表現量的結果，在高氨水體馴養的情況下的蛋白質表現量有提升的表現，但在 CO2 填充的環境中的蛋白質表現量沒有差異產生，其結果與上列 aqp8aa 的基因表現量結果不符，這樣的結果也許因為 aqp8aa 的基因表現量提升，而其提升的量不足以產生蛋白質表量的差異，由以上結果高氨及高碳酸和酸性水的馴養中表現量的提升，可以推測 aqp8aa 的功能可能與這些物質的運輸相關。. aqp8aa 在仔魚皮膚及離子細胞表現的情形 aqp8aa 在魚類上的研究很少，主要的研究都是在哺乳動物上進行，目前在哺乳類上的研究，在哺乳動物腎臟中的 AQP8 位於腎小管上面表現，且在腎小管上的細胞表現於粒線體上的內膜上(Raúl 30.

(32) Alberto Marinelli et al., 2012)，其主要功能被認為是在粒線體的內膜上參與氨的運輸功能(Raúl Alberto Marinelli et al., 2012)，而在哺乳動物的呼吸道中也有 AQP8 的參與，主要是在呼吸道表皮細胞的底側膜上表現。目前尚未有 AQP8 在魚類上表現的研究，本篇實驗中以原位雜交染色來標定 aqp8aa 的表現，而在結果中可以觀察到 aqp8aa 主要表現在仔魚卵黃囊上，再利用免疫組織染色進行離子細胞亞型的標定，標定兩型的離子細胞分別為 HRC 及 NaRC 兩行離子細胞，而兩種試驗的綜合結果中可以發現，在斑馬魚仔魚上的 aqp8aa 主要表現在 HRC 及 NaRC 上。對於 aqp8aa 在仔魚皮膚的離子細胞的分型已經釐清，但是在 aqp8aa 在細胞的底側膜或是頂膜或是在粒線體上，則是需要進一步利用抗體染色進行辨識，因本實驗由廠商生產之抗體僅能進行 western blot 試驗，無法進行免疫組織染色。再進一步的利用調控離子細胞生成的 foxi3a 和 foxi3b 的 MO 及調控 HRC 生成的 gcm2 MO 組別的仔魚，進行即時定量 PCR 觀察其 AQP8AA 的表現量，發現在兩種組別中的仔魚，在離子細胞量減少後其 AQP8AA 的表現量，亦有下降的情況產生，此結過重複驗證了我們在染色上獲得的結果，支持斑馬魚仔魚上的 AQP8AA 主要分布於此兩型離子細胞上。. 利用 SIET 技術測量 aqp8aa MO 仔魚對於 H+及 NH4+的排放能力 31.

(33) 本實驗已 morpholino oligonucleotide 專一的抑制 aqp8aa 的基因表現，藉由蛋白質弱化表現以測量仔魚排出的 H+及 NH4+是否由 aqp8aa 參與。在本試驗之前，先利用 morpholino oligonucleotide 處理 0 ng/egg、2 ng/egg 及 4 ng/egg 的劑量處理，再利用 western blot 來測量其 AQP8AA 的蛋白質含量，在結果中可以發現在 0 ng/egg 及 2 ng/egg 的情況下 AQP8AA 蛋白質含量差異不大，而在 4 ng/egg 的結果中則發現 aqp8aa 的表現量明顯減少，此結果證明了我們的 morpholino oligonucleotide 可以有效的降低 AQP8AA 的表現量，也可以證明我們試驗中所使用的抗體是有效果的。在本試驗中 AQP8AA 的弱化的仔魚中，極少數的魚會產生捲尾與發育不全之畸型，這些魚難以觀察到體表離子細胞，本篇推測所給予的 MO 劑量並不會對於離子細胞的表現造成影響，雖然 AQP8AA 的弱化可能造成部分水分運輸功能的喪失，進一步影響細胞功能，但是表現在仔魚體表的各型 AQPs 皆可以進行水份通透，推測可以補償 AQP8AA 造成之水分通透不足。從整體上的 SIET 測量的結果得知，aqp8aa MO 的仔魚的體表氫離子的離子的濃度梯度顯著低於控制組的仔魚，由此可知 aqp8aa MO 降低體表酸化之效力，而在氨離子濃度梯度的結果中發現，在 aqp8aa MO 的仔魚整體體表的氨離子濃度也顯著低於控制組的仔魚，由此可知 aqp8aa 可能參與酸和氨的通透功能。為了進一步分析 aqp8aa MO 32.

(34) 的仔魚的酸濃度梯度的降低是否來自於碳酸所造成的差異，因此即時給予仔魚 1 %的 CO2 填充後，測量其體表的氫離子濃度梯度的差異，主要是藉由短暫時間且即時的填充 CO2 擴散，使得體表產生累積 CO2 的情形，因此可以在正常水體側得 CO2 或氫離子排出的造成的細胞酸化的現象(CO2-induced acidification) ，而在結果中可以發現到在短期處理後可以測得在控制組及 aqp8aa MO 的組別都有顯著提升的情況，但在 aqp8aa MO 的組別提升的情況只有控制組的 68%，說明了在 AQP8AA 蛋白質弱化後，環境中的 CO2 可能無法經由 AQP8AA 通透至細胞內或是藉由 AQP8AA 由細胞中通透至細胞外，或是因為 aqp8aa 在粒線體中失去功效影響其排放 CO2 的能力，進而影響細胞外氫離子濃度梯度差異。. 利用 SIET 測量 aqp8aa MO 仔魚離子細胞對於 CO2 及的排放能力當給予仔魚 CO2 填充後，在 Non-HRC 的離子細胞的結果圖中可以發現到在 aqp8aa MO 的組別中其經過 CO2 填充後，氫離子濃度梯度所提升的量只有控制組的 42.1%，而在 HRC 的離子細胞的結果中則可以看到控制組在經過 CO2 填充後其氫離子濃度梯度有一顯著提升的情況產生，aqp8aa MO 的組別中在 CO2 填充後其氫離子濃度梯度則無顯著提升之情況，由此結果中可以發現到 AQP8AA 蛋白質弱化後，環境中的 CO2 可能無法輕易經由 AQP8AA 的協助或是體內累 33.

(35) 積之 CO2 無法經由 AQP8AA 排出體外，由此驗證了 AQP8AA 在兩種離子細胞中參與 CO2 通透的功能。. 利用 SIET 技術測量 aqp8aa MO 仔魚離子細胞對於 NH4+及的排放能力利用 SIET 測量 Non-HRC 及 HRC 兩種離子細胞的對於 NH4+的排放能力，在 aqp8aa MO 的組別中可以發現到在此兩種離子細胞的排放量都有較其控制組顯著下降的情況產生，此結果說明了 AQP8AA 蛋白質弱化後，環境中的氨可能無法輕易經由 AQP8AA 通透制細胞內亦或是體內累積之氨無法經由 AQP8AA 排出體外所致，由此驗證了 aqp8aa 在 Non-HRCs 與 HRC 參與氨的通透功能。. Aqp8aa 對於斑馬魚生理功能之重要性魚鰓及仔魚皮膚是魚類直接與外界水體環境接觸的組織，因此水通道蛋白表現在這些組織上面，可能會造成水分過多的流失或是吸收的情況產生，對於魚體在滲透壓的調節上是相當不利的，但是我們發現水通到蛋白在這些組織間有大量的表現，因此推測水通到蛋白對魚類鰓上應具有特別重要之生理功能，就本篇實驗中發現 aqp8aa 主要表現於離子細胞上，因此推測除了細胞需要調節在進行離子運送的過程中所造成的滲透壓劇烈變化中可以藉由其來進行水分的調節之外， 34.

(36) 由結果也可以得知 AQP8AA 在仔魚表皮細胞另會參與 CO2 及 NH4+ 的通透功能，這樣的功能應為離子細胞內因有大量的粒線體作用，所產生的大量代謝廢物如 CO2 及氨，可以藉由離子細胞上的 aqp8aa 的蛋白協助其排出至細胞外。因此 AQP8AA 對於魚體可能的功能應不僅有水分及滲透壓的調節上，另應有助於 CO2 及氨此類代謝廢物的排除都有生理功能上的貢獻。. 與哺乳動物 Aqp8 之比較在氣體的運輸方面，目前在哺乳動物上對於 aqp8 之氣體通道研究甚為稀少，是否參與著二氧化碳的排除仍為未知，但有可能參與著氣態氨(NH3)的排除，在目前的研究中仍尚未釐清 AQP8 參與排放的是 NH3 或是 NH4+的排放；而在魚類上面的研究對於 AQP8 對於氣體運輸之研究更是稀少，就目前本篇的研究中可以發現，AQP8AA 的有無對於斑馬魚仔魚對於 CO2 的排放能力確實有影響，但作用方式及路徑為何仍須有進一步之研究證實，而在對於氨的排放上亦可由結果中發現 AQP8AA 在其中亦有所貢獻。而在對於排放氨的部分，將哺乳動物 aqp8 基因表現魚蛙卵的實驗或是老鼠腎臟上的實驗，都證明 aqp8 在哺乳動物上主要在排出細胞內或是粒線體內的氨，由本篇實驗中的結果也可以看到類似的現象，在抑制 AQP8AA 的蛋白質表現後，可以發現在整體的斑馬魚仔魚上看到排氨量的降低，在 AQP8AA 主要分 35.

(37) 布的兩型離子細胞上也可以看到相同的結果。對於水分的運輸，在將哺乳動物的 AQP8 表現於蛙卵細胞上，發現在有表現 AQP8 的蛙卵對於水分運輸的能力有所提高，但在小鼠上分離出來的肝臟粒線體細胞無論 aqp8 表現的高低，在抑制劑的使用後的結果無顯著差異(calamita et al., 2012) ，代表其在粒線體上的 AQP8 並非主要進行水分的運輸作用，在本篇實驗的過程中，利用 morpholino 抑制 AQP8AA 表現後，在魚體整體上無明顯腫脹情況產生，此結果推測在斑馬魚仔魚上的 AQP8AA 非主要作為運輸水分為主的功能。. 細胞內分布位置在哺乳動物中，發現其會分布在粒線體的內膜上(Calamita et al., 2012)，而在呼吸道中也有分佈，分佈於支氣管的上皮細胞的底側膜上，而在斑馬魚上的位置仍為未知，須進行組織免疫染色才能分辨，但已知斑馬魚是分佈在離子細胞，離子細胞內富含大量粒線體，卻又為氣體進出的細胞之一，因此其分部位只雖然未知，但可以推測其可能位於底側膜或是在細胞內的粒腺體上。. 總結本篇釐清了(1) AQP8AA 在魚體受精後一天即有表現，且其在仔魚魚體上主要表現在卵黃囊上之離子細胞 NaRC 及 HRC。(2)在基因 36.

(38) 表現量的結果中可以發現到在斑馬魚經過高氨、高碳酸以及酸性水體的詢樣後表現量都有顯著提升的情況，因此推次其功能可能與這三種物質的排放相關。 (3)經由 loss of function 的試驗中可以發現在弱化 aqp8aa 蛋白質表現後可以看到在對於斑馬魚仔魚整體及細胞上的酸、 CO2 的排放及氨的排放上都有顯著的降低，說明 AQP8AA 在斑馬魚上對於此三種物質的排放有一定的貢獻，則作用方式則需進一步使用抗體染色標定出位置才能完整了解。. 37.

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(45) 圖表表1. 各型基因進行real-time quantitative PCR之專一引子。. 44.

(46) 表2. 合成in situ hybridization probe之專一引子。. Aqp8aa Forward reverse. sequence 5’ATCGATAATCAAAAATGACCTCGGCAGAGTC 3’ 5’ CTCGAGCCATCATTTGAAATAACACGGCC 3’. 45.

(47) 表 3. 合成之反義核酸序列。 Name Aqp8aa Radom. sequence CATTTTTGATTTCTGCCCGGAGCTT ATCCATCTTGTGTGTTAGAAAACTG. 46.

(48) 圖 1. 分析仔魚(1dpf-4dpf) aqp8aa 的 mRNA 表現量。mRNA 表現量以 RPL13a 標準化。aqp8aa 的 mRNA 表現量 1dpf 到 4dpf 時期中有顯著增加。結果為 means ± SEs (每組樣本數標示於圖中)。不同之英文字母表示顯著差異(One-way ANOVA, Tukey’s comparison, p＜0.05)。. 47.

(49) 48.

(50) 圖2. 分析aqp8aa的斑馬魚鰓部mRNA表現量在NW與高氨、高碳酸填充環境及高酸性環境中之比較。mRNA表現量以rpl13a標準化。aqp8aa 的mRNA表現量在高氨、高碳酸填充環境及高酸性環境中馴養三天後有顯著的增加。＊代表NW與與處理組兩組間有顯著差異。(Student’s t-test, p＜0.05)。. 49.

(51) C. D. 50.

(52) 圖3. A: 分析AQP8AA在NW與高氨水體馴養下仔魚(3 dpf)之蛋白質表現情形。B:分析AQP8AA在NW與高碳酸水體馴養下仔魚(3 dpf)之蛋白質表現情形。 AQP8AA分子量為28 kDa， ß-actin分子量為45 kDa 。C: 將圖A蛋白質量化後的圖表，在高氨馴養組蛋白質表現量有顯著提升的現象。Ｄ: 將圖Ｂ蛋白質量化後的圖表，在高碳酸馴養組蛋白質表現量無顯著差異。＊代表NW與與處理組兩組間有顯著差異。(Student’s t-test, p＜0.05)。. 51.

(53) 52.

(54) 圖 4. A: aqp8aa 在仔魚(4-dpf) 卵黃 in situ hybridization 表現情形。B: NKA(綠色), HA(紅色)免疫螢光染色。A 與 B 重疊於圖 C。箭號指出訊號在特定離子細胞表現。. 53.

(55) 圖 5. A: 分析 aqp8aa 在 WT 與 foxi3a 和 foxi3b MO 仔魚(3dpf)之 mRNA 表現情形。B:分析 aqp8aa 在 WT 與 gcm2 MO 仔魚(3 dpf)之 mRNA 表現情形。mRNA 表現量以 RPL13a 標準化。aqp8aa 的 mRNA 表現量在兩種 MO 處理組皆有顯著增加。結果為 means ± SE (每組樣本數標示於圖中) ＊代表兩組間有顯著差異。(Student’s t-test, p＜0.05) 54.

(56) 圖 6. 分析 aqp8aa 在 wild type (control)，2 ng/egg 和 4 ng/egg MO knockdown 處理後仔魚(3 dpf)之蛋白質表現情形。 AQP8AA 分子量為 28kDa， ß-actin 分子量為 45 kDa 。. 55.

(57) 圖 7. A: Wild type(WT)與 aqp8aa MO(MO)的仔魚(3 dpf) 在正常水卵黃囊體表 H+濃度梯度變化。B: Wild type(WT)與 aqp8aa MO(MO)的仔魚(3 dpf) 在正常水卵黃囊體表 NH4+濃度梯度變化。結果為 means ± SEs (每組樣本數標示於圖中) ＊代表 WT 與 MO 處理的兩組間有顯著差異。(Student’s t-test, p＜0.05). 56.

(58) 圖 8. A: Wild type(WT)與 aqp8aa MO(MO)的仔魚 3 dpf 分別在正常水 (NW)與 CO2 處理 (1 % CO2 , pH 6.2) 後卵黃囊體表 H+濃度梯度變化。結果為 means ± SEs (每組樣本數標示於圖中)。不同之英文字母表示顯著差異(One-way ANOVA, Tukey’s comparison, p＜0.05). 57.

(59) 圖 9. wild type (WT)與 aqp8aa MO (MO)仔魚(3 dpf)分別在正常水(NW) 與 CO2 處理 (1% CO2)，卵黃囊表皮的(A) Non-HRC 與(B)HRC H+濃度梯度變化。結果為 means ± SEs (每組細胞數量標示於圖中)。不同之英文字母表示顯著差異(One-way ANOVA, Tukey’s comparison, p＜ 0.05) 58.

(60) 圖 10. Wild type (WT)與 aqp8aa MO (MO)仔魚(3 dpf)分別在正常水 (NW) ，卵黃囊表皮的(A) Non-HRC 與(B)HRC NH4+濃度梯度變化。。結果為 means ± SEs (每組樣本數標示於圖中) ＊代表 WT 與 MO 處理的兩組間有顯著差異。(Student’s t-test, p＜0.05). 59.

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