金毛杜鵑DNA甲基化變異與適應性演化

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 金毛杜鵑 DNA 甲基化變異與適應性演化 DNA methylation polymorphism and adaptive evolution of Rhododendron oldhamii. 研究生: 臧明瑄 Ming-Hsuan Tsang 指導教授: 黃士穎博士 Dr. Shih-Ying Hwang. 中華民國一百零一年七月.

(2) 謝誌在我的就讀研究所期間，最感謝我的指導教授黃士穎教授，教授認真不懈的研究精神，是研究生的良好模範。教授傳授演化學領域的知識，並指引我建立研究方向，使我受益良多，在此致上最誠摯的謝意。感謝林讚標教授與王俊能教授，給予論文內容的指導及許多精闢建議，使我更深入去思考我的研究內容。感謝林試所協助採樣及張仲德博士提供氣象資訊分析，皆對於我完成這份研究有很大的幫助。感謝求學過程中師長們的教導，使我在學業及處事上都有所成長。此外，感謝實驗室的嘉瑩學姐、亭亘學姐、延衡學長，指導我實驗方法與技巧，讓之前鮮少操作分生實驗的我能迅速熟練實驗操作，並在我遇到學術上的困難時，總是大方地分享你們所學，給予我建議並一同討論。在實驗後期，進行資料分析及撰寫論文時，尤其感謝小強學長不吝協助我使用分析軟體，並與我討論研究結果。感謝同窗瑾瑜，這兩年來我們一起討論實驗，互相給予支持，終於我們都能如期畢業。感謝好友們給我的加油打氣，讓我能提起精神繼續努力。感謝家人對我的包容與鼓勵，在必要時給予我支持，使我能順利完成碩士學位。臧明瑄謹致於國立臺灣師範大學中華民國 101 年 7 月. I.

(3) 目錄摘要............................................................................................................. 1 壹、前言 .................................................................................................... 3 貳、前人研究 ............................................................................................ 5 一、氣候波動影響植物分布 ............................................................. 5 二、金毛杜鵑相關研究...................................................................... 6 三、表觀遺傳(Epigenetics) ................................................................ 7 四、表觀遺傳變異與環境的關係 ..................................................... 8 參、材料與方法 ...................................................................................... 11 一、研究材料.................................................................................... 11 二、樣本採集.................................................................................... 11 三、植物體基因組 DNA 萃取 ......................................................... 12 四、Methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) ......... 14 五、族群遺傳結構之分析................................................................ 16 六、篩選受天擇選汰的基因座 ....................................................... 19 七、檢測受到天擇選汰的基因座與環境因子之關連 ................... 20 肆、結果 ..................................................................................................22 一、引子的篩選................................................................................ 22 二、引子組合甲基化多型性 ........................................................... 23. II.

(4) 三、遺傳變異.................................................................................... 24 四、族群結構.................................................................................... 25 五、族群環境因子............................................................................ 27 六、天擇選汰基因座及與環境因子之關連 ................................... 27 七、正向天擇基因座連鎖不平衡 ................................................... 29 伍、討論 ..................................................................................................32 一、族群甲基化多型性的分歧 ....................................................... 32 二、族群分歧型天擇與適應性演化 ............................................... 34 陸、結論 ..................................................................................................38 柒、參考文獻 ..........................................................................................39 捌、表附錄 ..............................................................................................46 玖、圖附錄 ..............................................................................................60. III.

(5) 表附錄表一、金毛杜鵑樣本採集分布位置及樣本數 .................................... 46 表二、DNA 甲基化變異的三種型式 ................................................... 15 表三、MSAP 所使用 adapter 與引子之序列 ....................................... 47 表四、EcoRI – MspI digestion solution ................................................ 48 表五、EcoRI – HpaII digestion solution ............................................... 48 表六、Adapter solution .......................................................................... 49 表七、Ligation solution ......................................................................... 49 表八、Pre-selective amplification PCR solution ................................... 49 表九、Pre-selective amplification PCR 條件 ........................................ 50 表十、Selective amplification PCR solution ......................................... 50 表十一、Selective amplification PCR 條件 .......................................... 51 表十二、5 種引子組合篩選出 maker 的甲基化情形及其多型性 ..... 52 表十三、基因座甲基化變異的三種型式於各族群之分布 ................ 53 表十四、金毛杜鵑各族群異質結合度平均值 .................................... 53 表十五、金毛杜鵑各族群間 pairwise FST 值 ....................................... 54 表十六、金毛杜鵑各族群間 pairwise FST 的 P 值 .............................. 55 表十七、金毛杜鵑 AMOVA 分析結果 ................................................ 56 表十八、金毛杜鵑 18 個採樣點的環境因子差異性之 MANOVA 分析結果 ................................................................................ 56 表十九、以 FST 中性檢測方式與 SAM 篩選出受天擇選汰基因座 .... 57 表二十、使用 SAM 檢測出與環境因子有關連的基因座 ................. 58 表二十一、族群受天擇選汰基因座之連鎖不平衡 ............................ 59. IV.

(6) 圖附錄圖一、金毛杜鵑樣本採集分布圖 ........................................................ 60 圖二、各族群甲基化變異的三種型式之 ANOVA 分析 .................... 61 圖三、使用 Structure 檢測金毛杜鵑分群結果(no admixture model)... 62 圖四、使用 Structure 檢測金毛杜鵑分群結果(admixture model) ...... 64 圖五、使用 Mantel test 檢測遺傳距離和地理距離之相關性 ............ 66 圖六、各族群棲地氣象因子漸層圖 .................................................... 67 圖七、以 DFDIST 檢測受天擇選汰基因座 ........................................ 68 圖八、以 BayeScan 檢測受天擇選汰基因座 ...................................... 69 圖九、以 Bayefst 檢測受天擇選汰基因座 .......................................... 69 圖十、基因座的 FST 值之頻率分佈 ..................................................... 70 圖十一、每個 positive outlier 在某一族群相對於其他族群的 mean pariwise FST ................................................................... 71 圖十二、positive outliers 在各族群的基因頻率 .................................. 75 圖十三、影響族群分化的基因座與環境因子之相關性 ..................... 79. V.

(7) 金毛杜鵑 DNA 甲基化變異與適應性演化摘要金毛杜鵑(Rhododendron oldhamii)為廣泛分布的台灣特有種杜鵑，其生長的棲地氣候條件不同，主要開花季節也有差異。已知 DNA 甲基化可調節基因表現，使個體面臨環境變化時，表現型產生變異，以適應環境。本研究欲檢測金毛杜鵑 DNA 甲基化的變異情形，探討在天擇作用之下，DNA 甲基化的多型性與族群適應性演化之關係。利用 Methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP)分子標誌掃描基因組，檢測 18 個族群，共 205 個體，篩選出有甲基化變異的基因座，估算多種族群遺傳參數與分析族群結構，並篩選出受天擇選汰的甲基化基因座。此外，結合氣象因子，檢測受到天擇選汰的基因座是否與環境因子有關連。結果顯示，金毛杜鵑各族群有 DNA 甲基化多型性，可分成 2 個分群；某些族群受天擇選汰基因座有連鎖不平衡的現象，形成分歧型天擇；以 FST 中性檢測方式篩選出 13 個受正向天擇選汰的甲基化基因座，其中 2 個與環境因子平均風速有關連。這些結果皆顯示金毛杜鵑各族群受到不同棲地環境因子的天擇壓力，而有正向天擇作用，造成族群有 DNA 甲基化多型性的分化與適應性演化的現象。. 關鍵字：金毛杜鵑、DNA 甲基化多型性、正向天擇、適應性演化、MSAP 1.

(8) DNA methylation polymorphism and adaptive evolution of Rhododendron oldhamii Abstract Rhododendron oldhamii is an endemic rhododendron species that widespread but discontinuously distributed in Taiwan. Environmental variables among habitats and population flowering times are different. Because epigenetic processes such as DNA methylation may contribute to environmentally induced phenotypic variation by modifying gene expression, individuals can adapt to the changing environment. Therefore, the main purpose of this study is to understand the variations in DNA methylation patterns and the adaptive evolution of R. oldhamii. We used methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) molecular markers to scan the whole genome for 205 individuals from 18 populations. Based on MSAP genotyping data, we can explore the population structure and population adaptive evolution under natural selection. Furthermore, with the environmental variables incorporated, we can detect the association between the environmental variables and the MSAP polymorphisms. The results showed that R. oldhamii have DNA methylation polymorphism. The Bayesian cluster analysis revealed that 18 populations could be assigned to two clusters. We find 13 outliers under positive selection, of which two are associated with environmental variables such as mean wind speed. Moreover, populations had different linkage disequilibrium blocks of outlier loci. These results indicated that R. oldhamii populations were mainly affected by different selection pressures of habitats, resulting in differentiation of DNA methylation polymorphism within and among populations. Therefore, the results suggested that different environmental variables of habitats would promote distinct adaptive evolution and population differentiation in R. oldhamii. Keywords: Rhododendron oldhamii, DNA methylation polymorphism, positive selection, adaptive evolution, methylation-sensitive amplified polymorphism(MSAP) 2.

(9) 壹、前言氣候會影響植物的分布，於冰河期，植物會遷移至適於生存的避難所(refugia)，待進入溫暖的間冰期，植物再向外擴張。歷經多次冰期和間冰期交替作用，族群分布範圍、變動歷史、遺傳歧異度與基因多型性皆會受影響。植物在生活史中隨時都面臨天擇壓力，而天擇壓力主要來自生長棲地的環境因子及生物間交互作用，因此，植物為了適應棲地，個體的表現型和基因通常會逐漸演化，且不同族群可能有不同的演化歷程，導致各族群為了適應生長棲地，逐漸出現專一性的適應，即稱為適應性演化(adaptive evolution)，上述開花季節的差異就是各族群表現適應性演化的結果。個體的表現型除了受遺傳控制，DNA 甲基化的修飾可影響基因表現，也造成個體表現型的改變，例如：開花時間的早或晚、花形為兩側對稱或輻射對稱等(Burn et al. 1993; Cubas et al. 1999; Sherman et al. 2002; Trap-Gentil et al. 2011)。此外，DNA 甲基化的多型性，與植株形態的變異、花期及其他生理特性的差異有關(Salmon et al. 2008; Yi et al. 2010)；而生存於不同環境的族群有 DNA 甲基化多型性，意謂著 DNA 甲基化的多型性與族群適應性演化有關(Herrera & Bazaga 2010; Lira-Medeiros et al. 2010)。由於 DNA 甲基化的變異可造成個體 3.

(10) 表現型的改變，以因應環境條件的變異，這可能影響個體的適存度，因此，DNA 甲基化的變異可能是受到天擇作用的結果。台灣特有種金毛杜鵑(Rhododendron oldhamii)很可能也歷經族群變動。已有研究顯示金毛杜鵑的遺傳歧異度相對於其他物種而言較低，由於目前所觀察到生長於不同棲地的金毛杜鵑族群，其主要開花季節有差異，很有可能導致族群間的生殖隔離，使族群間基因交流受阻，分化程度增加，而有適應性演化的現象。因此，DNA甲基化的變異可能和金毛杜鵑各族群開花季節的差異有所關連，且不同族群有 DNA甲基化多型性，可能與天擇有關，而形成族群適應性演化。因此，本研究的假說為：不同地區的金毛杜鵑族群由於受天擇作用，而有 DNA 甲基化多型性，很可能形成族群適應性演化。本研究欲檢測金毛杜鵑 DNA 甲基化的變異情形，探討在天擇作用之下，DNA 甲基化的多型性與族群適應性演化之關係。使用 MSAP 所得基因分型結果轉換的數據，估算各種族群遺傳參數；分析各族群或區域性的遺傳結構，將各族群進行歸群，建立適當的分群數；檢測各族群的每個基因座是否受到天擇的影響，篩選出族群中受天擇作用的甲基化基因座。此外，結合氣象因子，檢測受到天擇作用的基因座是否與環境因子有關連。. 4.

(11) 貳、前人研究一、氣候波動影響植物分布在冰河期，植物會遷移至氣候適合的避難所(refugia)生存，待冰期結束後進入溫暖的間冰期，植物再由避難所向外擴張(Hewitt 1996; Taberlet & Cheddadi 2002)。雖然台灣只有在高山地區有冰河遺跡 (Siame et al. 2007)，但劇烈的氣候波動會影響全島植物族群分布與族群變動(Tsukada 1966)。由孢粉證據顯示，台灣中部在距今6萬~5萬年前的大里冰盛期(The maximal Tali glacial stage)，氣溫較目前低約 8~11℃(Tsukada 1966, 1967)，此時期冷溫帶植物及寒帶植物的族群量大，亞熱帶植物及暖溫帶植物的族群量小；1萬年前至今這段時期溫度漸上升，冷溫帶植物及寒帶植物的族群量逐漸減少，亞熱帶植物及暖溫帶植物的族群量逐漸增多。金毛杜鵑(Rhododendron oldhamii)屬於亞熱帶植物，由孢粉證據可知亞熱帶植物的族群量在過去曾受限縮，於距今約一萬年前，冰河期結束後有比較明顯的擴張，以此可推測金毛杜鵑也於距今約一萬年前，有族群擴張。金毛杜鵑為落葉型木本植物，族群於冰河期會被限縮在避難所內，無法擴張。但是在間冰期，台灣的氣候較冰河期溫暖潮濕(Liew et al. 1998)，適合落葉型木本植物生長。因此，在大里冰盛期及距今約47000~35500年前，受限於避難所內，遭受瓶頸效應、基因漂變而造成遺傳歧異度降低的族. 5.

(12) 群，進入間冰期後會快速擴張。在過去多次冰期和間冰期交替下，族群分布範圍、變動歷史、遺傳歧異度與基因多型性皆會受影響(Hwang et al. 2003; Wu et al. 2006)。. 二、金毛杜鵑相關研究金毛杜鵑為廣泛但不連續分布於全台灣的特有種杜鵑，其生長的棲地氣候條件不同，主要開花季節也有差異，已有研究顯示金毛杜鵑的開花季節和海拔高度、降雨季節皆有關(張，2006；紀，2009)。台灣北部的金毛杜鵑主要開花季於 3、4 月，受東北季風和梅雨影響；中部的金毛杜鵑集中於 8、9 月開花，以及南部的金毛杜鵑全年皆有開花，於 7 月較明顯，皆受西南季風影響。因此，金毛杜鵑可能為了避免乾旱對族群繁衍不利，而使開花時間產生了差異。各族群開花時間的差異，很有可能導致族群間因花粉無法傳播或種子無法萌發，造成生殖隔離，使族群間基因交流受阻，分化程度增加，而有適應性演化的現象發生。此外，由 EST-SSR 的基因分型結果，檢測出全台灣的金毛杜鵑族群間已有分化，可分成北、中、南、東南 4 個歸群，並找到 5 個受到天擇選汰的基因座(Hsieh et al. unpublished)。. 6.

(13) 三、表觀遺傳(Epigenetics) 表觀遺傳是指個體的 DNA 序列沒有改變之情況下，基因表現的改變，而使個體表現型也有所改變。包括 DNA 胞嘧啶的甲基化修飾、組蛋白官能基甲基化或乙醯化的修飾、RNAi 的調控機制等，這些機制都可調節基因的表現程度，都屬於表觀遺傳現象(Kalisz et al. 2004)。DNA 甲基化是最常見，也是目前被研究最多的表觀遺傳修飾， DNA 序列受 DNA methyltransferases 作用，在 5’- CCGG 的胞嘧啶，其第 5 個碳的位置，接上一個甲基。RNAi 的調控機制也可參與 DNA 甲基化的形成(Matzke et al. 2007; Shen et al. 2012)。DNA 甲基化程度高的區域，DNA 與組蛋白纏繞較緊密，會降低基因表現程度，進一步影響表現型。DNA 甲基化發生於啟動子區(promoter region)，甲基化的程度通常與基因表現量呈負相關，當 methyl-CpG-binding protein 與甲基化的啟動子結合，就取代了原本的轉錄因子。若甲基化程度高，將使啟動子無法作用，抑制轉錄作用，進而影響基因表現。欲了解 DNA 甲基化變異的程度，可使用 MSAP 分子標誌，找尋有甲基化變異的基因座，探討 DNA 甲基化的多型性。研究顯示，DNA 甲基化，會影響其基因表現及個體表現型，例如：花期、花形、植株大小、生殖力等(Finnegan et al. 1998; Manning et al. 2006; Marfil et al. 2009)。許多物種已被研究證實有 DNA 甲基化的情形，並會影響其個體表現。. 7.

(14) 針對番茄的研究發現，DNA 甲基化程度高，會抑制蕃茄(Solanum lycopersicum)果實成熟(Manning et al. 2006)。馬鈴薯(Solanum ruiz-lealii)的花形不正常、花瓣不正常分離，是由於 DNA 去甲基化 (Marfil et al. 2009)。柳穿魚(Linaria vulgaris)的 Lcyc 基因有大量甲基化情形，胞嘧啶的甲基化發生在 Lcyc 基因的啟動子，抑制轉錄作用，使花形由兩側對稱轉變為輻射對稱(Cubas et al. 1999)。DNA 甲基化的現象於原核和真核生物皆有發生，在類群之間或類群之內皆可有所變異，即 DNA 甲基化多型性。. 四、表觀遺傳變異與環境的關係遺傳變異加上環境誘發形成的表觀遺傳變異，造就同一物種的個體具有多樣化表現型。而在 DNA 序列沒有發生改變時，環境的訊號可誘發 DNA 甲基化變異，調節基因表現，進而使遺傳序列相同的個體面臨環境變化時，表現型產生變異，以適應環境(Bossdorf et al. 2008)。與 DNA 序列的變異不同，DNA 甲基化的變異可較快速地對環境的改變產生回應，可於極短時間內發生，例如：於個體的一個生活史之內發生(Crews et al. 2007)。DNA 甲基化的現象可遺傳，所造成的表現型改變也可遺傳(Holliday and Pugh 1975)。當環境改變時，某些較. 8.

(15) 敏感的基因座產生甲基化變異，並使表現型改變；若改變後的表現型在環境中較具優勢，則這些產生甲基化變異的基因座，就會經天擇作用而被保留，因此其基因頻率在下一世代會增加。在下一世代，視環境條件而定，甲基化變異的基因座可能被天擇保留(可遺傳性)，或不被天擇保留(可回復性)，這種特性使個體表現型的表現有彈性，利於生存在不穩定或高度異質性的環境中(Angers et al. 2010)。棲息於不同環境的個體，可因面臨不同環境因子而有 DNA 甲基化變異。例如：阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、小麥(Triticum aestivum)、甜菜(Beta vulgaris)等物種，其開花時間的早或晚，受到 DNA 甲基化變異的影響。Flowering locus C (FLC)是決定阿拉伯芥開花時間的基因座，春化作用會造成 DNA 甲基化程度降低，抑制 FLC 表現，促使植物較早開花，而沒有經過春化作用則使 DNA 甲基化程度較高，延遲開花時間(Burn et al. 1993; Finnegan et al. 2005)。小麥野生族群可依生長季節，分成春小麥與冬小麥兩種。春小麥於春天播種，不需經春化作用，八、九月即可收成，而冬小麥於九、十月播種，經過春化作用後，DNA 甲基化程度降低，促使開花，隔年四、五月收成(Sherman et al. 2002)。經過春化作用的甜菜，開花基因座 BvFLC 甲基化程度較低，植株較早抽芽，未經過春化作用的甜菜，開花基因座 BvFLC 甲基化程度較高，有延遲抽芽的現象(Trap-Gentil et al.. 9.

(16) 2011)。目前已有研究顯示 DNA 甲基化的多型性與族群結構有關，可造成族群分化以及族群在地適應性演化。研究顯示，氣溫會影響野生的小麥族群甲基化變異情形，導致對開花基因的活化與否，使族群間開花時間有差異，造成族群分化(Sherman et al. 2002)；甘藍菜野生族群 (Brassica oleracea)有高度的甲基化多型性，可解釋植株形態的高度變異，且有族群分化(Salmon et al. 2008)。生長於相同環境的痲瘋樹 (Jatropha curcas L.)族群，花期及其他生理特性有差異，族群間遺傳變異度低，但甲基化變異度高，顯示甲基化多型性造成族群分化(Yi et al. 2010)；甲基化的變異和 Viola cazorlensis 花部性狀有關，造成族群有適應性演化，甲基化的變異和適應性演化有顯著的相關性(Herrera & Bazaga 2010)；Laguncularia racemosa 有生長於鹽沼地與淡水河岸這兩種不同環境因子的棲地之族群，鹽沼地族群的甲基化程度較低，應是逆境促使其要有較高的基因表現量，以克服逆境。此外，生長於鹽沼地與淡水河岸這兩種不同棲地的 Laguncularia racemosa 族群，株高、胸徑、葉形等形態有明顯差異，族群間遺傳變異度低，但甲基化變異度高，顯示甲基化多型性造成族群分化，使族群各自適應該棲地，而有在地適應性演化(local adaptation)的現象(Lira-Medeiros et al. 2010)。. 10.

(17) 參、材料與方法一、研究材料金毛杜鵑 (Rhododendron oldhamii )是台灣特有種，屬於杜鵑花科的常綠灌木或小喬木，株高可達 3 公尺，其葉叢生於枝端，紙質、披針狀長橢圓形至橢圓狀卵形。全株密被黃褐色黏質腺毛，因此得名。花 1～3 朵頂生，花冠紅色，半徑約 4cm。金毛杜鵑是於台灣垂直海拔分布範圍最廣、數量最多的杜鵑花，從地表至海拔高度 3000 公尺均可見其分布(Li 1978)，常見於陽光充足的開闊地、林緣、林道、產業道路兩旁坡路、河谷崖壁及崩塌地等，除此之外，在陽光照射較有限的森林下層亦有發現其蹤跡。不同棲地的金毛杜鵑外觀差異極大，有些棲地的植株葉片表面腺毛長且密，分泌的黏液多，有些植株表面的腺毛則較為稀疏；在棲地較為潮濕的菜公坑，金毛杜鵑植株高度可達四公尺，而在較為乾燥的燦光寮，植株較矮小，不及一公尺。由此可見，金毛杜鵑對環境的適應能力相當強，屬於廣適應性的物種，且不同棲地的外表型有極大的差異。. 二、樣本採集本研究所使用之金毛杜鵑為廣泛分布於台灣的物種，故採樣地點盡量遍及其分布範圍，包括北部：二格山(EGS)9 株、巴陵(BL)15 株、. 11.

(18) 燦光寮(TKL)12 株、菜公坑(TGK)11 株、獅頭山(STS)14 株及五寮尖 (WLJ)6 株；中部：火炎山(HYS) 13 株、武陵(WL)12 株、佳陽(CY)13 株、清境(CJ)12 株、廬山(LS)7 株、霧社(WS)6 株、中橫(CH)10 株及惠蓀(HS)12 株；南部：人倫林道(RL)9 株、樂樂谷(LLK)12 株、延平林道(YP)15 株及霧鹿(WR)17 株，共採集全台灣金毛杜鵑 18 個族群， 205 個樣本(表一、圖一)。每個樣本皆採成熟葉部位，帶回實驗室後將植株充分洗淨，加入乾燥劑，待乾燥後，抽取基因組 DNA。利用 Methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP)分子標誌工具 (Gonzalgo et al. 1997; Ushijima et al. 1997; Reyna-López et al. 1997)，掃描基因組，篩選出有甲基化變異的基因座，進行基因分型 (genotyping)。. 三、植物體基因組 DNA 萃取取約 0.10g 乾燥葉片，以液態氮研磨成葉粉，仿照 Doyle & Doyle (1987)所提出的 CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide)少量 DNA 快速萃取法，萃取植物基因組 DNA。萃取步驟如下: 1. 取適量葉粉，裝入離心管中，加入 650μL 的 CTAB-PVP 緩衝液(2 ％CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH=8，1 ％PVP，0.2％β-mercaptoethenol)，用以去除蛋白質。. 12.

(19) 2. 水浴 65℃，持續 1 小時，期間每 10 分鐘將離心管取出，震盪並倒轉搖晃，使葉粉與 CTAB-PVP 緩衝液充分混勻。 3. 加入 650μL 的 chloroform: isoamyl alcohol=24:1 之混合液，用以去除蛋白質。 4. 將管內物質混勻，以最高轉速 11000rpm，4℃，離心 30 分鐘。 5. 完成離心後，取上清液，盡量避免取到下層液，再加等體積(600μL) 的 chloroform: isoamyl alcohol=24:1 之混合液。 6. 將管內物質混勻，以最高轉速 11000rpm，4℃，離心 30 分鐘。 7. 完成離心後，取上清液 350μL，此時要注意避免吸取到分層處的殘渣。接著加入 isopropanol 300μL，用以沉澱 DNA。將離心管稍微搖晃數次，可見白色絲團出現。 8. 將管內物質混勻，置於-20℃冰箱，2~3 小時。 9. 以最高轉速 11000rpm，4℃，離心 20 分鐘。 10.倒去上清液，留下沉澱物(pallet)，加入 70％酒精 450μL，將離心管倒轉多次，以洗除 isopropanol。 11.以最高轉速 11000rpm，4℃，離心 5 分鐘。 12.吸除酒精，風乾 30~40 分鐘，可見白色絲團逐漸轉為半透明絲團。 13. 加 50μL 的 TE(1mM EDTA，10mM Tris-HCLI，pH=8)回溶 DNA，. 置於 4℃冰箱。. 13.

(20) 14.隔天可測 DNA 濃度。將萃取出的 DNA 取 1μL 以 Nano drop 1000 (Thermo Fisher Scientific)測定濃度，再取適量原液和 TE buffer 稀釋成 20ng/μL 共 50μL，保存於-20℃冰箱備用。. 四、Methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) MSAP 是改良自擴增片段長度多型性(AFLP)的分子標誌工具，又稱為 msAFLP，用於篩選出有甲基化變異的基因座。相較於其他顯性分子標誌工具，此方法操作簡易且所獲得的條帶產物再現性高，可以在不了解此物種序列資訊的情況下，廣泛的檢測整個基因組，找尋有甲基化變異的基因座。因此，MSAP 目前普遍使用於非模式物種的全基因組掃描，檢測該物種是否受到天擇作用力影響，並提供族群內、族群間的遺傳分化評估。實驗需使用 2 組限制酶 EcoRI – MspI 和 EcoRI – HpaII 分別去切割基因組 DNA，限制酶 MspI 和 HpaII 皆可辨識 5’- CCGG。依照 5’- CCGG 的胞嘧啶甲基化情形之差異，使限制酶 MspI 與 HpaII 對此序列有不同的活性，而切割出多型性的 DNA 片段，經過基因分型，所得的條帶呈現出 non-methylation、 full-methylation、hemi-methylation 等 3 種情形(表二)。. 14.

(21) 表二、DNA 甲基化變異的三種型式 EcoRI – MspI. EcoRI – HpaII. 5’-CCGG C＊＃CGG GGC＊＃C. Non-methylation. Full-methylation. +. +. –. +. C＃5mCGG GGC＊C C＃5mCGG GGC5m＃C 5m. C＊5mCGG GGC＊C. Hemi-methylation. –. + 5m. C＊CGG GGC＊C. 註 : MspI 切割位置以＃表示，HpaII 切割位置以＊表示。. MSAP 實驗流程分為 4 個步驟。首先進行 digestion，分別使用 EcoRI – MspI 和 EcoRI – HpaII 這 2 組限制酶去辨識、切割基因組 DNA，切割後會形成不平整的雙股片段。接著進行 ligation，分別設計與 EcoRI 及 HpaII – MspI 辨識序列互補的 adapter。先將 EcoRI adapter F 與 EcoRI adapter R 以 94℃加熱 5 分鐘，使兩股黏合，而 HpaII – MspI adapter F 與 HpaII – MspI adapter R 也以相同方法製備，完成黏合的 EcoRI adapter 與 HpaII – MspI adapter 皆加入 digestion 產物中，使其與 digestion 產物之相對應鹼基黏合，形成平整的雙股。第三步驟為 pre-selective amplification PCR，將 ligation 產物以二次水稀釋 2 倍，以 5’端 EcoRI pre-selective primer 與 5’端 HpaII–MspI 15.

(22) pre-selective primer(表三)，篩選、擴增出欲選取片段。最後，進行第二次 PCR，即 selective amplification PCR，將第一次 PCR 的產物以二次水稀釋 4 倍，為了避免篩選出過多的片段，將篩選條件訂定更嚴格，使用增加 2~3 個鹼基的 5’端 EcoRI selective primer 與 5’端 HpaII–MspI selective primer(表三)，篩選、擴增出欲選取片段。產物以自動定序儀進一步進行基因分型(genotyping)。為了追蹤 PCR 產物，在進行 selective amplification PCR 時，使用 Fam 及 Hex 這 2 種螢光去標記 5’端 EcoRI 各個引子，不同的螢光發出的波長不同，以利自動定序儀偵測，可增加基因分型的效率，並幫助片段大小的判讀。PCR 產物稀釋後以酒精沉澱 DNA，使用毛細管電泳來分離片段。自動定序儀為 ABI 3730XL DNA Analyzer，自動定序儀所得到的一個 peak 即代表一個片段，由 peak 的位置就可得知片段長度。基因分型的結果用軟體 GeneMarker 來判讀，以螢光 marker 各片段的位置當標準，去比對出螢光 PCR 產物中各片段的長度，此軟體可顯示螢光訊號的強弱與 DNA 片段的長度。. 五、族群遺傳結構之分析以基因分型結果轉換的數據，估算各種遺傳參數：基因座的甲基. 16.

(23) 化多型性(polymorphism)、遺傳歧異度(heterozygosity)、及遺傳分化值 (FST)。使用軟體 Arlequin 3.5(Excoffier et al. 2010)來估算兩兩族群間的 pairwise FST 值與遺傳歧異度，進行 50000 次 permutation test，使用 conventional F-statistics，信賴區間為 95％，所得結果再經由 Bonferroni correction 以確認 pairwise FST 值是否具有顯著性。待篩選出受天擇選汰基因座(outlier)之後，使用 Arlequin 3.5 以相同設定值，估算每個 positive outlier 在某一族群相對於其他族群的平均 pairwsie FST。此外，使用 Arlequin 3.5 估算每個基因座的對偶基因頻率(allele frequency)。使用軟體 STRUCTURE2.3 (Pritchard et al. 2000; Falush et al. 2007; Hubisz et al. 2009)來分析各族群或區域性的遺傳結構，將各族群進行歸群。利用軟體 STRUCTURE2.3 來分析 MSAP 之數據，可建立適當的分群數，此軟體假設所有樣本共來自於 K 個歸群，接著對這些樣本其每一基因座的對偶基因頻率均加以定義，再以貝氏分群方法 (Bayesian clustering approach)將所有樣本分成 K 個歸群 (Pritchard et al. 2000)，並由Δ L(K)的校正結果來判斷出最適當的歸群數(Evanno et al. 2005)。使用 STRUCTURE2.3 可以對所研究族群重新建立適當的歸群。本研究針對金毛杜鵑族群結構 K 值的設定，由 K=1 至 K=19，重複次數設定為 100 萬次 iteration 與 10 萬次 burn-in iteration，使用. 17.

(24) no admixture model 及 admixture model 分別進行分析。為了量化不同階層的族群結構對於遺傳變異的貢獻程度，可使用軟體 Arlequin 3.5 進行 AMOVA(analysis of molecular variance)，執行 50000 次 permutation test，分析分群間(among groups)、分群內族群間 (among populations within groups)、族群內(within populations)等不同階層的遺傳結構。欲檢測族群間遺傳分化程度與地理距離的相關性，可使用 Mantel test 來檢測，若有相關，代表族群間有 isolation by distance 的情形。我們使用 http://ibdws.sdsu.edu/~ibdws/此網頁所提供的 Isolation By Distance 檢測功能，遺傳距離採用兩兩族群間 pairwise FST 值，地理距離採用兩點間的實際地理距離，進行 30000 次 randomizations，並使用 reduced major axis(RMA) regression 做相關性的校正，檢測各族群間是否有 isolation by distance 的情形。為了瞭解天擇是否作用於基因組之內，可以檢測基因組內是否有連鎖不平衡的現象。位於同一條染色體的基因座若有連鎖不平衡，將會互相影響 allele frequency。使用 Arlequin 3.5 檢測各族群內所有基因座是否有顯著的連鎖不平衡，設定 No. of steps in Markov chain =10000，No. of Dememorisation Steps =10000，信賴區間為 95％。. 18.

(25) 六、篩選受天擇選汰的基因座可藉由 DFDIST、Bayesfst (Beaumont & Balding 2004)和 BayeScan (Foll & Gaggiotti 2008)等 FST 中性檢測方式，來檢測各族群的每個基因座是否受到天擇的影響。FST 為族群分化值，FST 中性檢測方式是透過比較兩兩族群間的 FST 值，找出可能受選汰壓力影響、偏離中性的基因座(outlier loci)。使用 BayeScan 估算 Bayes factor (BF)值，利用 Bayes factor (Bayes factor=L(受到天擇作用的後機率值)/L(符合中性假說的後機率值)來判定受天擇選汰的基因座。BF 值取 log 後，若數值≧2，表示此基因座很可能受到天擇，即為 outlier，例如：當某基因座 BF 值為 100 (log10=2)時，後驗機率為 0.99，代表此基因座受到天擇作用力比中性演化的力量強 100 倍，即受到強烈的天擇作用。由 BF 值與 FST 值可進一步檢驗出基因座是受何種天擇作用力，若其 FST 值偏高，表示受到 positive selection，可能產生適應性演化；若其 FST 值偏低，表示受到 balancing selection。為了避免檢測結果產生偽陽性，我們另外使用 Mcheza 此整合型工作平台(Antao et al. 2011)中的軟體 DFDIST，以及程式 Bayesfst，來篩選族群中受到天擇作用的基因座。Bayesfst 是以轉換後的 P-value 來判定 outlier，經由 Bonferroni correction，去除可能為逢機出現的 outlier。使用多種軟體去篩選受天擇選汰的基因座，所得到的結果較為準確。. 19.

(26) 七、檢測受到天擇選汰的基因座與環境因子之關連為了瞭解族群適應性演化的差異是否與環境因子有關連，可以結合氣象因子，使用程式 Spatial analysis method (SAM) (Joost et al. 2007, 2008)來檢測各個基因座是否與環境因子有關連，並檢測由 DFDIST、 BayeScan、 Bayesfst 等軟體所篩選出的受天擇選汰基因座是否與環境因子有關連。收集各採樣點的海拔高度與 11 個環境因子，環境因子是由中央氣象局 390 個氣象站於 1990~2011 年所記錄的 11 個氣象參數，由於採樣地點可能並非氣象站所在位置，故使用採樣地點鄰近氣象站所觀測到氣象資訊，以 ArcGIS 9.3 的空間分析模組的內差法去估算出各採樣點的氣象資訊，包括：月平均溫度(℃)，月平均最高溫度(℃)，月平均最低溫度(℃)，月平均降雨量(mm/月)，每月降雨超過 0.1 毫米的天數，每月最高氣溫高於 30℃的天數，每月最低氣溫低於 10℃的天數，年日照時間(小時)，月平均相對濕度(％)，月平均雲量 (1-10)和月平均風速(米/秒)等，於離地面 1.3 公尺處觀測。月均溫與海拔、經度、緯度呈線性迴歸，合併其他 10 個氣象參數，使用 Ordinary Kriging method 與空間分析模組繪出漸層圖。此外，並使用多變量變異數分析(MANOVA, multivariate analysis of variance)，檢測金毛杜鵑 18 個採樣點的環境因子是否有顯著差異。使用程式 SAM 來檢測受到天擇選汰的基因座是否與上述環境因. 20.

(27) 子有關連，SAM 是使用多變值邏輯迴歸(multiple univariate logistic regression)，去檢測各基因座的基因頻率與各環境變數之間有無顯著的相關性。而為了檢驗此相關性是否具有統計上的顯著性，則需藉由 likelihood ratio G test 及 Wald test 這兩種統計方式來評估，並採取 Bonferroni correction 以排除統計結果的顯著性是來自於逢機出現。. 21.

(28) 肆、結果一、引子的篩選經由前測，針對 205 個樣本總共篩選 10 組引子組合，其中有五組再現性較高、錯誤率(error rate)較低的引子組合用於所有樣本的甲基化多型性的實驗(表三)。五組 MSAP 引子組合對金毛杜鵑 18 個族群共 205 個樣本，依據基因分型所測得條帶的有或無，記錄為 1 或 0。利用 GeneMarker 來判讀條帶，選取大小範圍 85~600bp，波峰強度 50 RFU 以上的條帶。在建立各引子組合的條帶 reference 時，選取不同族群的個體共 12 株，重複進行 MSAP 共 3 次，只有能重複出現 2 次以上的條帶才被保留，刪除不穩定、錯誤率高的條帶，維持平均錯誤率低於 5%，以確保所建立出各組合 reference 皆是穩定出現的 marker，而非逢機出現的。各引子組合的錯誤率計算方法為：所有個體重複進行 MSAP 共 3 次，某基因座預期出現條帶而未出現條帶的次數 / 該引子組合篩選出的 marker 總數 × 3 × 個體總數，即為該引子組合的錯誤率。若有些基因座於重複實驗時，出現條帶的情形並不穩定，就會造成該引子組合的錯誤率升高，故這樣基因座不能算是一個穩定的 marker，要刪除它。本研究使用 5 組引子組合，共篩選出 207 個 marker，所得的條帶. 22.

(29) 呈現出 non-methylation、full-methylation、hemi-methylation 等 3 種 DNA 甲基化多型性，以及兩種限制酶 MspI 與 HpaII 都沒有切出條帶的 missing 情形。由於 missing data 可能造成後續使用軟體估算時有所誤差，而無法忠實呈現甲基化多型性的實驗結果，因此，排除 missing data 達 50％以上的 marker，最後共得到 120 個 marker，長度集中於 110~400bp，使用這些 marker 進行後續的分析。. 二、引子組合甲基化多型性由於每個基因座於每個個體所呈現出的甲基化情形可能不同，欲判斷此基因座是屬於「非甲基化基因座」或「甲基化基因座」，我們參考 Herrera & Bazaga(2010)的計算方式，先算出 MSAP 實驗中限制酶的總錯誤率(HpaII 的錯誤率+ MspI 的錯誤率– 2 × HpaII 的錯誤率 × MspI 的錯誤率)當作臨界值，再計算每個基因座的｜HpaII 所切出條帶數目－MspI 所切出條帶數目｜/ 個體總數，若此數值大於臨界值，則此基因座即為甲基化基因座；若此數值小於臨界值，則此基因座即為非甲基化基因座。120 個 marker 之中，非甲基化基因座共 65 個，占 54.17％；甲基化基因座共 55 個，占 45.83％。基因座有出現 1 種以上甲基化型式(non-methylation、full-methylation、 hemi-methylation)即為有甲基化多型性(polymorphism)，結果顯示有甲. 23.

(30) 基化多型性基因座達 100％(表十二)。基因座甲基化變異的三種型式於各族群之分布情形如表十三，各族群所篩選出的基因座，non-methylation、full-methylation、 hemi-methylation 這三種型式皆有，有 16 個族群皆是 non-methylation 所占比例最高，full-methylation 次之，hemi-methylation 所占比例最低。使用 ANOVA 分析結果顯示，各族群間的 non-methylation (F=28.337, P=5.33E-82)、full-methylation (F=16.585, P=1.22E-46)及 hemi-methylation (F=11.094, P=1.53E-29)情形皆有顯著差異(圖二)。經過 LSD 事後檢定(Fisher 1935)，族群 WL 的 full-methylation 情形與其他 16 個族群有極顯著差異，這與其他族群的情形明顯不同。. 三、遺傳變異使用 Arlequin 3.5 估算遺傳歧異度。異質結合度代表族群中異型合子的多寡，異質結合度高代表族群中異型合子多，異質結合度低代表族群中同型合子多。估算結果顯示，金毛杜鵑各族群的異質結合度 (heterozygosity)介於 0~0.428，平均異質結合度為 0.2251(表十四)。族群 WR 的異質結合度在所有族群中為最高，達 0.428；族群 BL 與 LS 的異質結合度為最低，皆為 0；族群 YP 的異質結合度也極低，為 0.03。. 24.

(31) 四、族群結構使用 Arlequin 3.5 估算兩兩族群間的遺傳分化值(pairwise FST)，估算結果，pairwise FST 值介於 0.170~0.669，平均 pairwise FST=0.357，經由 Bonferroni correction 後，76.47％的 pairwise FST 值達顯著 (P<0.0003268 )(表十五、表十六)。族群 BL 對其餘族群的 mean pairwise FST 值為最高，達 0.669，其次分別是族群 YP 對其餘族群的 mean pairwise FST 值，達 0.599，族群 LS 其餘族群的 mean pairwise FST 值為 0.588，而族群 WR 對其餘族群的 mean pairwise FST 值最低，為 0.17。利用軟體 STRUCTURE2.3 來分析由 MSAP 所得基因分型結果轉換的數據，將金毛杜鵑族群建立適當的分群數。使用 no admixture model 及 admixture model 分別進行分析，結果顯示這兩種 model 皆於 K=2 時有最高的Δ L(K)值，於 K=3 時有次高的Δ L(K)值。圖三是假設族群間無雜交(no admixture)的分析結果，相似的族群結構以同一種顏色來表示，Δ L(K)值在 K=2 時約為 1127，為最高，顯示分 2 群的機率最高，族群 TGK、STS、WLJ、WL、CY、WS、部分 CJ，以及部份 CH，可歸為同一群；族群 EGS、BL、TKL、HYS、LS、HS、RL、 LLK、YP、WR、部分 CJ，及部份 CH，歸為另一群。而在 K=3 時， Δ L(K)值約為 737，為次高，族群 TGK、STS、WLJ、WL、CY、WS、部份 CJ，以及部份 CH，仍可歸為同一群，其餘族群可再分成 2 群族. 25.

(32) 群：HYS、EGS、TKL、LS、部份 YP、部份 WR、部份 BL 及部份 CH，歸為一群；LLK、HS、部份 YP、部份 WR、部份 BL 及部份 RL，歸為一群。圖四是假設族群間有雜交(admixture)的分析結果，Δ L(K)值在 K=2 時約為 898，為最高，顯示分 2 群的機率最高，而在 K=3 時，Δ L(K)值約為 167，為次高，admixture 與 no admixture 分析結果的各分群其族群組成皆相似。使用 Arlequin 3.5 進行 AMOVA 分析，檢測金毛杜鵑所有族群不分群以及分 2 群時，分群之間、分群之內各族群間、族群內的遺傳變異是否顯著。依 Structure 結果將族群分 2 群做分析：族群 TGK、STS、 WLJ、WL、CY、WS、CJ、CH 等，歸為同一群；族群 EGS、BL、 TKL、HYS、LS、HS、RL、LLK、YP、WR 等，歸為另一群。AMOVA 分析結果顯示，所有族群不分群時，族群間的遺傳變異佔總變異的 19.06%，族群內的遺傳變異佔總變異的 80.94%，族群間的遺傳分化值Φ ST=0.19058 (P<0.001)，顯示族群間有顯著的遺傳變異。而在將族群分 2 群時，分群內的族群間之遺傳變異佔總變異 19%，遺傳分化值 Φ SC=0.19021 (P<0.001)；族群內的遺傳變異佔總變異的 80.91%，族群間的遺傳分化值Φ ST= 0.19093 (P<0.001)。分析結果顯示，金毛杜鵑各族群間、族群內皆有遺傳變異，族群間、分群內族群間、分群之間皆有顯著分化(表十七)。. 26.

(33) 使用軟體 IBDWS vers. 3.23 檢測族群間遺傳分化程度與地理距離的相關性，IBDWS 使用 mantel test 和 RMA 迴歸分析，可檢測族群間遺傳距離與地理距離的相關性，並判斷顯著性。結果顯示族群間遺傳距離與地理距離並沒有相關性(Z = 5717975.5850, r = -0.0617, one sided P = 0.6378)(圖五)。. 五、族群環境因子使用 MANOVA 檢測金毛杜鵑 18 個採樣點 1990~2011 的 11 環境因子平均值之差異性，結果顯示 11 環境因子之中，除了月平均降雨量，其餘 10 個環境因子皆有顯著差異(P <0.05)(表十八、圖六)。因此，可將環境因子視為天擇作用力，去檢驗環境因子是否與受天擇選汰基因座有關。. 六、天擇選汰基因座及與環境因子之關連本研究共使用 3 種 FST 中性檢測方式，來檢測各族群的每個基因座是否受到天擇的影響。使用 DFDIST 共篩選出 9 個受天擇選汰的基因座，其中 5 個受到 positive selection 作用，分別是 P2-216、P19-317、 P22-134、P24-181 及 P24-198；另 4 個受到 balancing selection 作用的基因座為 P2-160、P21-205、P22-275 及 P24-244 (圖七)。BayeScan 檢. 27.

(34) 測出 2 個受天擇選汰的基因座，皆受到 positive selection 作用，為 P2-216 和 P2-180(圖八)。Bayesfst 檢測出 7 個受天擇選汰的基因座 P2-216、P2-180、P21-200、P19-317、P21-257、P22-134 及 P19-123(P<0.025)，此七個基因座皆受到 positive selection 作用(圖九)。另外，SAM 則檢測出 6 個偏離中性演化的基因座，為 P2-135、 P2-177、P2-180、P2-216、P21-223 及 P21-236，分別與平均雲量、平均風速、日照時數、最高溫大於 30℃的天數及降雨日數等環境因子有關連。受天擇選汰的基因座之中，基因座 P2-216 是使用 DFDIST、 BayeScan 及 Bayesfst 共同篩選出的 positive outlier。進一步使用 SAM 檢測此基因座是否與環境因子有關連，結果顯示基因座 P2-216 與一月平均風速、四月平均風速、年平均風速有關連；BayeScan 及 Bayesfst 共同篩選出 1 個 positive outlier P2-180，結合 SAM 檢測後顯示，基因座 P2-180 與平均風速 1 月、平均風速 12 月有關連(Wald test 及 Bonferroni correction 均達顯著)。綜合上述受天擇選汰基因座的檢測結果，本研究以 5 組引子組合篩選出的 120 個 marker 中，檢測出 13 個 positive outlier，4 個 balancing outlier (表十九、表二十)。. 28.

(35) 七、正向天擇基因座連鎖不平衡個體產生配子的過程中，隨著染色體重組互換，染色體上的基因座也會有重組互換，若兩個基因座在染色體上的距離近，重組的機率小於 50％，即為這兩個基因座有連鎖不平衡的現象，連鎖不平衡將使位於同一條染色體的基因座互相影響 allele frequency。為了瞭解天擇是否作用於基因組之內，使用 Arlequin 3.5 檢測各族群內所有基因座是否有顯著的連鎖不平衡，結果顯示，金毛杜鵑 18 個族群中，族群 EGS、BL、STS、WL、CH、HS、LLK，族群內某些受天擇選汰基因座有連鎖不平衡的現象，達顯著(P<0.05)。其中，經 Bonferroni 校正後，BL、WL、LLK 等族群內某些受天擇選汰基因座有連鎖不平衡的現象，達顯著(P<0.0025)。此外，18 個族群中，EGS、BL、TKL、 STS、WLJ、HYS、WL、CH、HS、RL、LLK、YP 等，12 個族群內皆有受天擇選汰基因座與中性基因座連鎖的現象。同時，出現受天擇選汰基因座互相連鎖的族群，也有較多受天擇選汰基因座與中性基因座連鎖的現象(表二十一)。除了連鎖不平衡的檢測，也可用基因座 FST 值之頻率分布來探討天擇是否作用於基因組的不同區域。使用 Bayesfst 及 BayeScan 檢測所有基因座，得到其 FST 值，並統計各 FST 值出現的頻率，所繪出基因座的 FST 值之頻率分布為偏離 L 型，表示甲基化多型性的型式在族. 29.

(36) 群間有差異(圖九)。連鎖不平衡以及基因座 FST 值之頻率分布的檢測結果，皆顯示不同族群的確受天擇作用於基因組的不同區域。將 13 個 positive outlier 做族群間兩兩比較(pairwise FST )，並計算出每個 outlier 在某一族群相對於其他族群的平均 pairwise FST(圖十) 。結果顯示，outlier P21-200、P21-257 及 P19-123 於族群 BL 的相對於其他族群之平均 FST 值(mean pairwise FST )明顯較高，對照 outlier 的 allele frequency 得知，outlier P21-200 和 P21-257 於族群 BL 的 allele frequency 皆為 0，明顯低於在其他族群的出現頻率；然而 P19-123 於族群 BL 則有明顯高於在其他族群的頻率(allele frequency 為 0.818)。另外，outlier P19-123 於族群 EGS 的相對於其他族群之平均 FST 值明顯較高，outlier P2-177 於族群 CY 的相對於其他族群之平均 FST 值明顯較高，P2-180 於族群 WL 的相對於其他族群之平均 FST 值明顯較高，顯示族群 EGS、CY、WL 與其他族群亦有甲基化多型性分化的現象。Outlier 在族群 TKL、TGK、STS、WLJ、HYS、CJ、 LS、WS、CH、HS、RL、LLK、YP 和 WR 的族群間 mean pairwise FST 值則是沒有明顯較高或較低的情形。這部分的檢測顯示，族群 BL、 EGS、CY、WL 有高度的甲基化多型性分化，有 5 個 outlier 對族群分化有影響。在檢驗 outlier 的連鎖不平衡現象時，結果顯示 BL、WL、LLK. 30.

(37) 這三個族群內某些受天擇選汰基因座有連鎖不平衡的現象，與其他族群已有分化現象。而檢測 outlier 在某族群相對於其他族群的 mean pairwise FST，發現 BL、EGS、CY、WL 與其他族群有甲基化多型性分化的現象，故兩種檢測結果有部分互相支持，都檢測到族群 BL 與 WL 有顯著的甲基化多型性分化。進一步檢測這 5 個對族群分化有影響的 outlier，其基因頻率與族群棲地緯度及環境因子的相關性，迴歸分析的結果顯示，有 2 個 outlier 與族群棲地緯度及環境因子有顯著相關。OutlierP21-200 基因頻率與族群棲地緯度有顯著正相關(R2= 0.2956, P=0.024)，在愈北部的族群，基因頻率愈高，此外，outlierP21-200 基因頻率與相對濕度有顯著正相關(R2=0.2836, P=0.027)，與年日照時數有顯著負相關(R2=0.2784, P=0.029)。OutlierP19-123 基因頻率與族群棲地緯度亦呈顯著正相關 (R2=0.2422, P=0.044)，與平均風速有顯著負相關(R2=0.2374, P=0.047)(圖十一)。. 31.

(38) 伍、討論一、族群甲基化多型性的分歧使用軟體 Arlequin 3.5 估算兩兩族群間的遺傳分化值(pairwise FST)，結果顯示，有 76.47％的 pairwise FST 值達顯著(P<0.0003268 )，表示多數族群間甲基化多型性有顯著的分化。族群 BL 及 LS 對其餘族群的 pairwise FST 值分別為最高及次之，族群 WR 對其餘族群的 pairwise FST 值為最低，表示族群 BL、LS 皆與其餘族群有高度的分化，族群 WR 則與其餘族群的分化不明顯。對照各族群異質結合度檢測結果，族群 BL 與 LS 的異質結合度為最低，而族群 WR 的異質結合度在所有族群中為最高，兩項結果互相支持，皆顯示 BL、LS 與其他族群的基因交流少，與其他族群產生甲基化多型性分化。 Structure 分析結果顯示分 2 群的機率最高，族群 TGK、STS、 WLJ、WL、CY、WS、CJ 的一部分，以及 CH 的一部份，可歸為同一群，其餘歸為另一群，此結果與先前 SSR 的檢測結果稍有不同。由於 Structure 分析結果分 3 群的機率為次高，所以也可對分 3 群的情形進行討論。由 Structure 分析結果的圖可看出，不論是分 2 群或 3 群，其中有一些族群是明顯只有一種 pattern，但是也有一些族群有不同的 paterrns 並存。這個結果說明可能有一些族群受到相類似的環境因子的影響，而有相類似的甲基化多型性 pattern，但族群 EGS、BL、. 32.

(39) TKL、HYS、LS、HS、RL、LLK、YP、WR、部分 CJ，及部份 CH 等，有不同程度的甲基化多型性 patterns 並存，故在不同尺度下，這些族群有不同的分群情形。k=2 時，這些族群皆歸於同一群，k=3 時，這些族群分成 2 個歸群，HYS、EGS、TKL、LS、部份 YP、部份 WR、部份 BL 及部份 CH，歸為一群；LLK、HS、部份 YP、部份 WR、部份 BL 及部份 RL，歸為一群。這可能是環境因子作為天擇力量的大小不同，而產生不同程度的甲基化 patterns。 AMOVA 分析結果顯示，金毛杜鵑不論是所有個體不分群以及分 2 群時，遺傳變異皆是主要存在於族群內，可能是環境因子在各個族群內都有不同程度的作用，使族群內各個體彼此產生甲基化多型性的分化，然而族群間甲基化多型性的分化也如同 pairwise FST 的結果一樣，有顯著分化的情形。 IBD 的檢測顯示族群間遺傳距離與地理距離沒有相關性，此結果與 AMOVA 分析結果互相支持，因每個族群彼此都有所差異，所以族群間遺傳距離與地理距離沒有相關性。推測可能各族群於各棲地面臨不同的環境壓力，各自適應該棲地，產生甲基化多型性，有適應性演化。而此結果與先期 EST-SSR 的研究結果不同(Hsieh et al, unpublished)，EST-SSR 的研究結果顯示族群間遺傳距離與地理距離呈正相關，由於 EST-SSR 是針對有功能的基因座來研究，而 MSAP. 33.

(40) 是針對有調控基因表現的基因座來研究，因此，環境因子的差異對於基因調控層次的影響是有別於基因的序列的影響(Angers et al. 2010; Paun et al. 2010)。. 二、族群分歧型天擇與適應性演化研究指出 DNA 甲基化多型性可與環境因子有關連(Paun et al. 2010)，本研究使用 SAM 檢測結果顯示，金毛杜鵑各族群 DNA 甲基化多型性的確與環境因子有關連，檢測出 6 個偏離中性演化的基因座，分別與平均雲量、平均風速、日照時數、最高溫大於 30℃的天數及降雨日數等環境因子有關連。檢驗各族群連鎖不平衡的情況，發現 BL、WL、LLK 等族群內某些受天擇選汰基因座有顯著連鎖不平衡的現象。相互連鎖的基因座在不同的族群有不同的 linkage block，代表不同族群的棲地環境相異而造成天擇作用在基因組的不同區域，最終造成同一物種的各個族群在基因組的不同區域有分歧型天擇(divergent selection)，甚至有可能造成種化。因此，金毛杜鵑 BL、WL、LLK 這三個族群的連鎖不平衡檢測結果顯示，在不同環境因子的天擇壓力作用下，受到分歧型天擇，產生了不同的適應性演化。其他族群未檢測到有連鎖不平衡的情形，可能因為 marker 數量不夠多而沒有檢測到。此外，有 12 個族群，皆有受天擇選汰基因座與中性基因座連鎖 34.

(41) 的現象。同時，出現受天擇選汰基因座互相連鎖的族群，也有較多受天擇選汰基因座與中性基因座連鎖的現象，這些中性基因座可能因 selective sweep，有 genome hitchhiking 的現象，而與受天擇選汰基因座連鎖(Nadeau et al. 2012)。雖然這些基因座目前在族群中尚未被檢測出受天擇影響或對於受到天擇篩選的性狀有何貢獻，但很可能這些基因座屬於微效基因(polygene)，只是控制某一性狀的眾多基因中的一個，其性狀效應很微小，但可能經過長時間的天擇壓力作用之後，這些微效基因的功能會逐漸累積增加，成為受天擇選汰基因座 (Villanueva et al. 2004)。檢測每個 positive outlier 在某一族群相對於其他族群的平均 pairwise FST，發現族群間甲基化多型性以 BL 族群的 outlier P21-200、 P21-257 及 P19-123 基因頻率的多寡之對照最為明顯。其中，outlier P19-123 在族群 BL 有相對於其他族群高的基因頻率，而 P21-200、 P21-257 之基因頻率為 0。此結果顯示，族群 BL 相較於其他族群有相當不同的天擇壓力，或感受天擇壓力的敏感度不同，造成甲基化多型性的明顯差異，而可能與在地適應性有關。天擇的壓力作用於 outlier P19-123 非常明顯，也對族群 BL 的甲基化多型性分化有主要貢獻。此外，outlier P19-123 於族群 EGS 相對於其他族群之平均 FST 值亦明顯較高，outlier P2-177 於族群 CY 的相對於其他族群之平均 FST. 35.

(42) 值明顯較高，P2-180 於族群 WL 的相對於其他族群之平均 FST 值明顯較高。上述結果顯示天擇壓力作用於這些 outlier 非常明顯，outlier P21-200、P21-257 及 P19-123 對族群 BL、outlier P19-123 對族群 EGS、 outlier P2-177 對族群 CY 以及 outlier P2-180 對族群 WL 的甲基化多型性分化有主要貢獻。這部分的檢測顯示，族群 BL、EGS、CY、 WL 有高度的甲基化多型性分化，有 5 個 outlier 對族群分化有影響。其餘大部份的 outliers 在族群間的甲基化多型性並沒有明顯分化，可能是因為相似的環境因子造成相類似甲基化多型性。與連鎖不平衡的檢測結果相對照，發現許多族群有 balancing outlier 和中性基因座的連鎖不平衡，也顯示了相類似的環境因子在各個族群都有作用。檢視各族群甲基化多型性，發現族群 WL 的 full-methylation 情形與其他 16 個族群有極顯著差異，這與其他族群的情形明顯不同。這部分的結果、連鎖不平衡檢測及 outlier 在某一族群相對於其他族群的平均 pairwise FST 的檢測結果，皆顯示族群 WL 與其他族群有高度的甲基化多型性分化現象。進一步針對對於族群分化有影響的 5 個 outlier ，即 P21-200、 P21-257、P19-123、P2-177 及 P2-180，分別檢測其基因頻率與族群棲地緯度及環境因子的相關性，結果顯示，outlierP21-200 基因頻率與族群棲地緯度有顯著正相關，在愈北部的族群，基因頻率愈高，愈北. 36.

(43) 部的棲地，相對濕度愈高且年日照時數愈少，outlierP21-200 基因頻率愈高。而 outlierP19-123 基因頻率與族群棲地緯度亦呈顯著正相關，與平均風速有顯著負相關，在愈北部的族群，P19-123 基因頻率愈高。此部分結果顯示，金毛杜鵑族群的甲基化多型性分化與環境因子有相關，產生了在地適應性演化。使用 Bayesfst 及 BayeScan 檢測基因座，得到 FST 值，並統計各 FST 值出現的頻率，發現基因座的 FST 值頻率分布圖為偏離 L 型，表示甲基化多型性的型式在族群間有差異。前人研究指出， speciation-with-gene-flow 頇經歷四個階段，依序為：direct selection → divergence hitchhiking → genome hitchhiking → post-speciation divergence (Feder et al. 2012)。我們可由這個結果推測，目前金毛杜鵑處於 speciation-with-gene-flow 的四個階段中的第二階段(divergence hitchhiking)與第三階段(genome hitchhiking)之間，可能是族群棲地環境因子的差異，使基因組上的某些基因座受到正向天擇作用形成多處 linkage block，阻礙了基因交流，使族群受到分歧型天擇(Nosil et al. 2009)，造成族群間甲基化多型性的分化。連鎖不平衡以及基因座 FST 值之頻率分布的檢測結果互相支持，皆顯示不同族群的確受天擇作用於基因組的不同區域。目前已有研究顯示 DNA 甲基化的多型性與族群結構有關(Yi et. 37.

(44) al. 2010)，而 DNA 甲基化變異的可遺傳性有助於物種長期的演化，可造成族群分化，並適應生存棲地，形成在地適應性，甚至種化 (Angers et al. 2010)。本研究結果顯示金毛杜鵑各族群的確存在 DNA 甲基化多型性，可能與在地適應性演化有關。造成族群甲基化多型性分化之原因，可能也會影響金毛杜鵑各族群開花時間的不同，若持續有各族群開花時間不同的情形，即族群間有生殖隔離，再加上各族群地理位置的隔離，將使各族群間花粉傳遞受阻，基因交流甚低，經過長期演化之後，可能逐漸步上種化的過程。. 陸、結論本研究顯示，金毛杜鵑各族群 DNA 甲基化多型性的確與環境因子有關連。當環境改變時，可能某些較敏感的基因座產生甲基化變異，調控基因表現；若改變後的基因表現在環境中較具優勢，則這些產生甲基化變異的基因座，就會經天擇作用而被保留。Epigenetic 變異可解釋在自然環境下，個體表現型的多種變異，以及在環境因子改變時，個體表現型的改變情形。Epigenetic 變異也可造成族群微演化。 Epigenetics 可解釋自然界中缺乏遺傳變異的個體，為何有可遺傳的表型變異，也可能造成表型可塑性。對於無法用 DNA 序列變異去解釋的生物現象，DNA 甲基化變異提供了另一個角度的觀點。. 38.

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(52) 捌、表附錄表一、金毛杜鵑樣本採集分布位置及樣本數族群名稱. 分布位置(經度/緯度). 1.二格山(EGS). E121.37°/ N24.58°. 413. 9. 2.巴陵(BL). E121.22°/ N24.40°. 620. 15. 3.燦光寮(TKL). E121.51°/ N25.03°. 136. 12. 4.菜公坑(TGK). E121.31°/ N25.11°. 864. 11. 5.獅頭山(STS). E121.28°/ N24.53°. 545. 14. 6.五寮尖(WLJ). E121.21°/ N24.52°. 281. 6. 7.火炎山(HYS). E120.43°/ N24.22°. 337. 13. 8.武陵(WL). E121.18°/ N24.20°. 1868. 12. 9.佳陽(CY). E121.12°/ N24.15°. 1546. 13. 10.清境(CJ). E121.09°/ N24.03°. 1562. 12. 11.廬山(LS). E121.11°/ N24.01°. 1419. 7. 12.霧社(WS). E121.06°/ N24.01°. 1049. 6. 13.中橫(CH). E121.08°/ N24.01°. 1221. 10. 14.惠蓀(HS). E120.59°/ N24.04°. 859. 12. 15.人倫林道(RL). E120.54°/ N23.43°. 1060. 9. 16.樂樂谷(LLK). E120.55°/ N23.33°. 1830. 12. 17.延平林道(YP). E121.01°/ N22.55°. 1571. 15. 18.霧鹿(WR). E121.02°/ N23.10°. 606. 17. 46. 海拔(公尺) 樣本數(株).

(53) 表三、MSAP 所使用 adapter 與引子之序列 EcoRI. HpaII /MspI. Restriction. 5’-G↓AATTC-3’. 5’-C↓CGG-3’. sites. 3’-CTTAA↑G-5’. 3’-GGC↑C-5’. Adapter F. 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’. 5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’. Adapter R. 5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’. 5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’. Pre-selective. E00. HpaII/MspI+0. PCR primers. 5’-GACTGCGTACCAATTC-3’. 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3’. Selective. E00+AAC1. HM+TC. PCR primers. 5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’. 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTC-3’. E00+AAC1. HM+AG. 5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’. 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGAG-3’. E00+AC2. HM+AG. 5’-GACTGCGTACCAATTCAC-3’ 1. 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGAG-3’. E00+AGT. HM+TC. 5’-GACTGCGTACCAATTCAGT-3’. 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTC-3’. E00+CTA2. HM+AG. 5’-GACTGCGTACCAATTCCTA-3’. 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGAG-3’. 限制酶 HpaII 和 MspI 的辨識序列相同，但限制酶依此序列甲基化情形之差異，有不同的活性，而切割出多型性的 DNA 片段。 1. 是以螢光 Fam 標記的引子，2 是以螢光 Hex 標記的引子。. 47.

(54) 表四、EcoRI – MspI digestion solution 試劑. 濃度. 劑量(μL). EcoRI. 20U/μL. 0.25. MspI. 20U/μL. 0.25. 10X NE Buffer 4. 2. BSA. 10μg/ml. 0.2. DNA. 20ng/μL. 10. ddH2O. 7.3. Total. 20. NE Buffer 4: 50mM potassium acetate、20mM Tris-acetate、10mM magnesium acetate、1mM dithiothreitol, pH=7.9. 表五、EcoRI – HpaII digestion solution 試劑. 濃度. 劑量(μL). EcoRI. 20U/μL. 0.25. HpaII. 10U/μL. 0.5 2. 10X NE Buffer 1 BSA. 10μg/ml. 0.2. DNA. 20ng/μL. 10. ddH2O. 7.05. Total. 20. NE Buffer 1: 10mM Bis Tris Propane-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT, pH=7.0. 48.

(55) 表六、Adapter solution 試劑. 濃度. 劑量(μL). EcoRI adapter F. 100μM. 25. EcoRI adapter R. 100μM. 25. ddH2O. 450. Total. 500. HpaII – MspI adapter F. 100μM. 250. HpaII – MspI adapter R. 100μM. 250. Total. 500. 表七、Ligation solution 試劑. 濃度. 劑量(μL). EcoRI adapter. 5μM. 1. HpaII – MspI adapter. 5μM. 1. Ligase. 3U/μL. 0.3. Buffer A. 3. Buffer B. 1. ddH2O. 3.7. Total. 10. Buffer A: 0.4M Tris-HCl(pH7.5), 50mM KCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 50％ glycerol. Buffer B: contains enhancer which can increase ligation efficiency.. 表八、Pre-selective amplification PCR solution 試劑. 濃度. U-taq Buffer. 劑量(μL) 1. Bernardo scientific U-taq. 5U/μL. 0.2. dNTP. 2.5mM. 0.8. E00. 10μM. 0.75. HM00. 10μM. 0.75. 1/2X ligated DNA. 1.5. ddH2O. 5. Total. 10. 49.

(56) 表九、Pre-selective amplification PCR 條件步驟. 溫度(℃). 作用時間. 1. 72. 2 分鐘. 2. 94. 3 分鐘. 3. 94. 30 秒. 4. 56. 30 秒. 5. 72. 1 分鐘. 重複步驟 3，持續 25 次循環 6. 72. 5 分鐘. 7. 10. End. 表十、Selective amplification PCR solution 試劑. 濃度. U-taq Buffer. 劑量(μL) 1. Bernardo scientific U-taq. 5U/μL. 0.2. dNTP. 2.5mM. 0.8. E00+___. 10μM. 0.35. HM+___. 10μM. 0.35. 1/4X pre-selective DNA. 1.5. product ddH2O. 5.8. Total. 10. 50.

(57) 表十一、Selective amplification PCR 條件步驟. 溫度(℃). 作用時間. 1. 94. 3 分鐘. 2. 94. 30 秒. 3. T*. 30 秒. 4. 72. 1 分鐘. 重複步驟 2，持續 36 次循環，其中第 1~13 次循環的 T*從 65℃開始每個循環降 0.7℃，第 14~36 次循環的 T*維持在 56℃ 5. 72. 5 分鐘. 6. 10. End. 51.