國 立 交 通 大 學
環 境 工 程 研 究 所
碩 士 論 文
以密閉式藻類毒性詴驗研究鹵素取代酯類
之定量結構－活性關係
Using a closed-system algal test to study the structure-activity
relationships of halogen-substituted aliphatic esters
研 究 生: 洪 萱 芳
指 導 教 授: 陳 重 元 教授
以密閉式藻類毒性詴驗研究
鹵素取代酯類
之定量結構－活性關係
Using a closed-system algal test to study the structure-activity
relationships of halogen-substituted aliphatic esters
學生：洪萱芳 Student： Xuan- Fang Hong
指導教授：陳重元 Adviser：Dr. Chung-Yuan Chen
國立交通大學
環境工程研究所
碩士論文
A Thesis
Submitted to Institute of Environmental Engineering
College of Engineering
National Chiao Tung University
In Partial Fulfillment of the Requirements
For a Degree of
Master of Science
In
Environmental Engineering
August 2011
Hsinchu, Taiwan, Republic of China
以密閉式藻類毒性詴驗研究
鹵素取代酯類
之定量結構－活性關係
學生：
洪萱芳
指導教授：陳重元
國立交通大學環境工程研究所
摘 要
本研究是以密閉式 BOD 瓶藻類毒性詴驗，評估親電性物質－鹵素取代酯類 之毒性，探討此類化合物以 SN2 親核性取代反應與生物分子作用進而對生物體造 成毒性之機制，利用化合物與生物分子共價鍵結之反應性參數 RC50 值（榖胱甘 肽上之硫醇基之反應性）及親電性參數（ELUMO、與鹵素鍵結之碳之部分電荷、 鹵素之部分電荷），建立預估毒性能力佳之 QSAR 模式，並探討反應性與生物體 毒性之關係。 鹵素取代酯類之藻類毒性趨勢反比於鹵素電負度之大小。化學物Ethyl fluoroacetate和Methyl 3-bromopropionate之藻類毒性與SN2親核性取代反應無關， Ethyl fluoroacetate對於藻類生長的抑制應與檸檬酸循環之破壞有關，而Methyl 3-bromopropionate之毒理機制較偏向於麻醉性。 在 QSAR 分析方面，以反應性參數 RC50值去掉不屬於 SN2 親核性取代反應的化學物和 outlier - Ethyl tribromoacetate，可得到較好的相關性。當鹵素鍵結超過
一個的化學物時，利用 RC50值建立 QSAR 似乎並不適合。
本研究結果之 outlier 為 Ethyl tribromoacetate，查詢文獻，推測可能的原因為
空間立體障礙所造成之毒性下降，但是利用反應性參數 RC50值來描述其毒性，
過於理想的模擬情境似乎無法顯示於生物體內空間立體障礙對於化學物之毒性 所造成的影響，可能是造成 Ethyl tribromoacetate(13)為 oulier 的原因。
本次論文最重要之貢獻為-利用電性模擬軟體建立良好的鹵素取代酯類之藻 類毒性之定量結構－活性關係，用以取代毒性詴驗，減少實驗成本。
Using a closed-system algal test to study the structure-activity relationships
of halogen-substituted aliphatic esters
Student：Xuan- Fang Hong Advisor：Dr.Chung-Yuan Chen
Institute of Environmental Engineering
National Chiao Tung University
Abstract
This study presents the toxicity data of various halogen-substituted aliphatic esters to Pseudokirchneriella subcapitata. using a closed algal toxicity testing technique with no headspace. Three different response endpoints, i.e., final yield, growth rate, and the dissolved oxygen production were used to evaluate the toxicity of halogen-substituted aliphatic esters. We also use abiotic thiol reactivity (RC50) to
establish the QSAR models.
Halogen- substituted aliphatic esters toxicity mechanism are classified as electrophiles which are for a subgroup of the SN2 mechanistic domain. Between
α-halo-carbonyl-containing compounds the order of reactivity is I>Br>Cl>F; but the toxicity of ethyl fluoroacetate (NO.1) is relatively high. The toxicity mechanism of ethyl fluoroacetate (NO.1) could be the inhibition of the Krebs cycle.
Ethyl-2,3-di-bromopropionate(NO.14) with two halogens connect with two carbons which make the effect of the carbonyl group separated into a less pronounced
overall electrophilicity as compared to ethyl bromoacetate(NO.3).
Multi-halogenation at a single-carbon center (halogenated carbon) may sterically hinder their electrophilic reactivity which makes them less toxic than the chemical with only single bromine.
The quantitative structure-activity relationship of halogen-substituted aliphatic esters toxicity with reactivity respect two outliers- Methyl 3-bromopropionate (NO.6) and ethyl tribromoacetate (NO.13). Methyl 3-bromopropionate (NO.6) has relatively high reactivity but low toxicity which seems more like nonpolar narcosis. The steric hindrance of ethyl tribromoacetate (NO.13) could not be presented by the ideal test which using pure glutathione to represent the target in vivo (RC50).
Keywords: Structure–activity relationships; Halogenated carbonyl chemicals; Abiotic thiol reactivity; Algae; Raphidocelis subcapitata
誌謝
真的要畢業了，心中難免不捨，
感謝出現在我生命中的每一個人，
謝謝爸爸媽媽對我的栽培，你們對我的愛總是無怨無悔。
謝謝老師對我的指導，讓我的論文得以撥雲見日。
謝謝思宏跟家祥，沒有你們幫我擦屁股，實驗室早就毀了。
謝謝詔棻學姊對我的照顧，總是充當我的伴遊兼司機。
謝謝學弟妹對我的支持，物化的筆記都讓我拿去印。
沒有你們我不會成功，真的很慶幸有你們，以後要常常聯絡喔～
最後我要謝謝我的司機兼老闆，
希昀，謝謝你，有你真的很好。
目 錄
頁次 摘要 I 目錄 III 表目錄 V 圖目錄 VI 符號說明 VII 第一章 前言 1 1.1 研究緣起 1 1.2 研究目的 2 1.3 研究架構 3 第二章 文獻回顧 4 2.1 酯之介紹 4 2.1.1 基本特性 4 2.1.3 鹵素取代酯類之介紹 4 2.1.2 酯類的應用 5 2.2 定量結構－活性關係（QSAR） 8 2.2.1 起源 8 2.2.2 分類 8 2.2.3 二維定量構效關係 9 2.2.4 活性參數 9 2.2.5 結構參數 10 2.3 鹵素取代酯類之 QSAR 11 2.3.1 親核詴劑之介紹 11 2.3.2 SN2 親核性取代反應之介紹 11 2.3.3 文獻之鹵素取代酯類之 QSAR 13 2.4 藻類毒性詴驗 16 2.4.1 月芽藻之介紹 16 2.4.2 藻類生長測定方法 16 2.4.3 藻類毒性詴驗方法 17 2.4.4 詴驗中之重要參數 19 第三章 基本原理 21 3.1 基本生長動力學 21 3.2 毒性物質之濃度反應關係模式 22 第四章 材料與方法 25 4.1 實驗設備與材料 254.2 實驗方法 27 4.3 儀器操作原理、步驟與設定條件 32 4.3.1 TOC (總有機碳分析法) 32 4.3.2 總有機碳分析之標準液配製流程 32 4.4 RC50 反應性參數值實驗 33 4.5 實驗之品保及品管 (QA/QC) 34 4.5.1 確定藻類生長狀況 34 4.5.2 實驗條件之控制 34 4.5.3 儀器的保養 34 第五章 結果與討論 35 5.1 藻類實驗毒性數據 35
5.2 急慢毒性比（Acute-Chromic Toxicity Ratio ; ACR） 39
5.3 鹵素取代酯類與基線毒性之比較 41 5.4 密閉式 BOD 瓶藻類毒性詴驗與其他物種詴驗之比較 44 5.5 QSAR 分析 47 5.5.1 毒性數據與傳統物化參數 LogKow 迴歸分析 47 5.5.2 毒性數據與反應性參數迴歸分析 48 5.5.3 藻類與纖毛蟲物種間關係 52 5.5.4 毒性數據與傳統電性參數回歸分析 53 5.6 文獻比較 64 5.6.1 Ethyl fluoroacetate 之文獻毒理機制 64 5.6.2 其他同屬 SN2 親核性取代反應之化學物之文獻 65 第六章 結論與建議 67 6 .1 結論 67 6.2 建議 68 第七章 參考文獻 69 附錄一 原始數據 73 附錄二 其他迴歸 93 附錄三 統計方法 96 附錄四 參數計算軟體使用方法 102
表 目 錄
頁次 表 2.1.1 鹵素取代酯類之物化特性 6 表 2.3.1 鹵素取代酯類之相關文獻數據 14 表 4.2.1 月芽藻生長所需之巨量營養鹽成分 29 表 4.2.2 月芽藻生長所需之微量營養鹽成份 29 表 4.2.3 顆粒計數器之操作參數 30 表 5.1.1 鹵素取代酯類之相關毒性數據 36 表 5.2.1 鹵素取代酯類之急慢毒性比值和斜率及截距 40 表 5.3.1 利用基線毒性預測鹵素取代酯類之毒性 42 表 5.4.1 比較鹵素取代酯類之藻類毒性與纖毛蟲毒性 45 表 5.5.2.1 藻類毒性數據與反應性參數迴歸(Eq:5.8~5.10)分析比較 50圖 目 錄
頁次 圖 1.3.1 研究架構流程圖 3 圖 2.1.1 酯之結構圖 4 圖 2.1.2 酯化反應 4 圖 2.1.3 鹵素取代酯之基本結構 5 圖 2.2.1 QSAR 之分類 9 圖 2.3.1 雙分子親核取代反應（SN2） 11 圖 2.3.2 穀胱甘肽之化學結構 12 圖 2.4.1 月芽藻之圖示 16 圖 3.2.1 劑量-反應曲線圖 23 圖 5.3.1 毒性數據與 LogKow 之相關性 43 圖 5.4.1 藻類與纖毛蟲毒性之相關性 46 圖 5.5.2.1 Eq:5.8~5.10 的預測毒性數據 V.S 實驗毒性數據 51 圖 5.5.4.1 Eq: 5.23~5.25 的預測毒性數據 V.S 實驗毒性數據 57 圖 5.5.4.2 Eq: 5.26~5.28 的預測毒性數據 V.S 實驗毒性數據 60 圖 5.5.4.3 Eq: 5.29~5.31 的預測毒性數據 V.S 實驗毒性數據 63符 號 說 明
△DO ：藻類溶氧變化量 F.Y ：藻類最終細胞變化量 G.R ：藻類生長率
EC50 ：50% Effective Concentration，
IGC50 ：纖毛蟲（Tetrahymena pyriformis）之 EC50
CX ：鍵結鹵素碳
ELUMO ：Energy of the Lowest Unoccupied Molecular Orbital
GSH ：Glutathione
kow ：n-octanol/water partition coefficient
QSAR ：Quantitative Structure－activity Relationships RC50 ：50% Reactivity Concentration
H-carbon ：鹵素鍵結之碳的部分電荷 Halo ：鹵素的部分電荷
第一章
前言
1.1 研究緣起
酯類在工業上為一種重要的有機化學品。它們應用於製造出各種產品， 包括聚酯纖維，薄膜樹脂，化妝品等。由於其結構的多樣性和變化，其毒 性機制十分的複雜[1]。 一般的酯類在毒性分類中分屬於基線毒性，但擁有鹵素取代基之酯類， 其毒性分類被歸類為反應性之親電性/前親電性。 鹵素取代酯類會與生物分子進行SN2親核性取代反應，對生物體造成 不可逆之影響。此類物質被廣泛使用、並流布於環境當中，但卻缺乏適當 之毒性數據。鹵素取代酯類對各物種之毒性數據當中，以纖毛蟲之資料最 多[1,2]，但藻類之毒性數據卻十分缺乏，因此建立此類化合物之藻類毒性 資料是必要的。 藻類為食物鏈的底層之生產者，當水中之毒性物質對藻類造成毒性傷 害時，會由食物鏈生物累積及傳輸作用，進而影響到更大型的生物種，間 接破壞整個水體生態系統。 藻類廣泛分布於水體環境中、生長週期短，因此十分適合做為生物活 性指標，為毒性測詴物種的理想選擇[3]。 傳統的藻類毒性詴驗，大多是使用批次式開放性的系統來進行實驗， 但對於本研究中之揮發性有機化學物質，可能會因揮發進而低估化學物的 毒性。 本次研究之化學物-鹵素取代酯類為高揮發性之有機物，因此利用 Chemostat連續的方式培養藻類，並取穩定生長、高活性的藻植種於BOD 瓶中進行實驗，利用藻類生長48小時後之溶氧變化量（△DO）、細胞密度 做為量測終點（Endpoint），藉此了解化學物質對藻類造成的影響與毒性 關係。因BOD瓶為密閉的系統，故可藉此克服有機物揮發的問題[4,5]。根據歐盟新化學品政策 REACH（Registration, Evaluation and
Authorization of Chemicals），於歐盟國家每年生產或進口一公噸或一公噸以 上的化學品，除法規規定不適用或可豁免外，每家製造商或進口商都有義務 向歐盟化學總署 (ECHA) 進行註冊 (Registration) ，並提出足夠資訊以確定 其安全使用。如果沒有依相關規定完成註冊，則無法繼續在歐盟市場流通。 但若使用危害評估之現有方法，將使用大量的動物來進行毒性實驗，將會耗
用大量資源及時間，因此建立良好的定量結構活性關係（QSAR，Quantitative Structure－activity Relationships），來評估較相似結構之化學物之毒性[6,7]， 較為人道且有效率。 本研究以單細胞綠藻類之月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata）為毒 性測詴物種、以反應性物質鹵素取代酯類為毒物，於密閉式 BOD 瓶系統中 進行毒性測詴。並將此類化合物之物化特性、結構，利用統計軟體與毒性建 立關係式－QSAR（Quantitative Structure－activity Relation ships），並探討 此類反應性物質對生物體造成毒性之毒性作用機制（Mechanism of toxic action）。
1.2 研究目的
1. 以BOD 瓶進行密閉性藻類毒性實驗，研究鹵素取代酯類，以溶氧變化 量及細胞密度作為詴驗終點，求得各毒性物質之EC50值與濃度反應關係 曲線。 2. 將本研究之毒性詴驗結果，與其他使用不同物種之文獻毒性數據進行比 較；與本實驗室先前所做之麻醉性實驗數據進行比較，證明含鹵素取代 基之酯類為親電性物質。 3. 討論鹵素取代酯類之毒性作用機制、毒性詴驗結果與化合物物化特性間 之關係，找出適當之參數來建立QSAR模式。1.3 研究架構
實驗自參考資料與文獻收集開始，首先確定欲實驗的化合物，進而蒐 集化合物之物化資料、文獻回顧、數據收集，做進一步整理與討論，再依 本研究室所建立之實驗及分析方法完成詴驗。詴驗流程如圖 1.3.1所示。 資料與文獻收集 數據整理與分析 實驗結果與討論 建立 QSAR 進行詴驗: 1. 藻類毒性詴驗 2. 親電性詴驗 決定詴驗毒物： 鹵素取代酯類 圖 1.3.1 研究架構流程圖第二章
文獻回顧
2.1 酯之介紹
2.1.1 基本特性 酯類（Ester）之通式為RCOOR'（圖2.1.1），是羧酸與醇類在催化劑 作用下之產物；過程中，羧酸之氫氧根（-OH）被醇之烴氧基（alkoxy group； -OR’）所取代（圖2.1.2）。因此，酯之命名是根據羧酸之Carboxylate anion（RCOO-）與醇之Alkyl group（C
nH2n+1）而來；以最簡單之甲酸甲酯（Methyl
Formate；H-COO-CH3）為例，其為甲酸（Formic acid；HCOOH）與甲醇
（Methanol；CH3OH）反應之產物 圖2.1.1 酯之結構圖 圖2.1.2 酯化反應（Esterification） 低分子量的羧酸與醇所形成的酯，具有水果香味且高揮發性，常用來 作香料及人造調味品。酯為優良之溶劑，難溶於水，比重小於 1，無氫鍵， 沸點熔點較同分子量酸低。酯與水會緩慢水解還原成酸和醇。
2.1.2 酯類的應用
1.
用作硝酸纖维素、樹脂、油脂的溶劑，及脱漆劑。2.
用作溶劑、香精、人造革、詴劑等3.
用作醫藥品的萃取、製造軍用毒氣。2.1.3 鹵素取代酯類之介紹
鹵素取代酯類為酯類碳上的氫被鹵素所取代，鹵素取代酯類與酯類一 樣具高揮發性，為優良之溶劑，難溶於水，比重小於 1，沸點熔點皆低。 其基本結構如下圖： 圖 2.1.3 鹵素取代酯之基本結構（R 為烷基；X 為鹵素） 羰基（C=O）之拉電子能力會活化鄰接鍵結鹵素之碳鍵(CX)，改變其 電子雲密度，當電子向羰基靠近，鍵結鹵素之碳鍵便傾向正電性（親電詴 劑）。親核詴劑為尋找正電性中心的一種詴劑，當鹵素取代酯類遇到親核 詴劑，親核詴劑會與鹵素競爭並形成不穩定的一碳五鍵的反應中間體，隨 後鹵素離去，完成 SN2 親核性取代反應。鹵素包含氟、氯、溴、碘、砹[8]。 此次實驗所使用的化學物有含單鹵素的酯類，亦有含雙鹵素以上之酯 類。下表 2.1.1 為此次實驗所使用之化學物以及其物化參數：表 2.1.1 鹵素取代酯類之物化特性
NO. Chemical CAS no. 化學式 分子量 Log Kow 溶解度(mg/l) 蒸氣壓(pa) 沸點（oC）
1 Ethyl fluoroacetate 459-72-3 O=C(OCC)CF 106.0 0.80 19832 2090 83.34
2 Ethyl chloroacetate 105-39-5 O=C(OCC)CCl 122.5 0.94 15470 696.0 141.2
3 Ethyl bromoacetate 105-36-2 O=C(OCC)CBr 167.0 1.21 7022.0 224.0 153.7
4 Ethyl iodoacetate 623-48-3 O=C(OCC)CI 214.0 1.62 1523.0 135.0 184.7
5 5 Methyl bromoacetate 96-32-2 O=C(OC)CBr 152.9 0.72 17990 1220 131.3
6 Methyl 3-bromopropionate 3395-91-3 O=C(OC)CCBr 167.0 1.21 5910.0 450.0 135.7
7 Methyl 2-bromopropionate 5445-17-0 O=C(OC)C(Br)C 167.0 1.13 6829.0 835.0 140.3
8 Ethyl-2-bromopropionate 535-11-5 O=C(OCC)C(Br)C 181.0 1.63 2228.0 335.0 162.3
9 Methyl 2-bromobutyrate 3196-15-4 O=C(OC)C(Br)CC 181.0 1.63 6394.0 229.0 162.3
10 Ethyl-2-di-bromoisobutyrate 600-00-0 O=C(OCC)C(Br)(C)C 195.0 2.08 2938.0 291.0 175.1
11 tert-Butyl bromoacetate 5292-43-3 O=C(OC(C)(C)C)CBr 195.0 2.08 2938.0 1.220 175.1
12 Ethyl dibromoacetate 617-33-4 O=C(OCC)C(Br)Br 245.9 1.48 1364.0 64.80 208.3
13 Ethyl tribromoacetate 599-99-5 BrC(Br)(Br)C(=O)OCC 324.8 2.49 521.00 6.810 260.2
14 Ethyl-2,3-di-bromopropionate 3674-13-3 O=C(OCC)C(Br)CBr 259.9 1.97 1507.0 23.10 227.4
下圖為各鹵素取代酯類的結構式和其 cas number：
459-72-3 105-39-5 105-36-2 623-48-3 96-32-2 3395-91-3 5445-17-0 535-11-5 3196-15-4 600-00-0 5292-43-3 617-33-4 599-99-5 3674-13-32.2 定量結構－活性關係（QSAR）
2.2.1 起源QSAR（Quantitative Structure-Activity Relationship）定量化學－結構關 係，此概念最早於西元 1868 年由 Crum Brown 與 Frazer 提出，用以定量化 學結構與活性之間的關係[9-12]。 定量構效關係(QSAR)是一種藉助分子的理化性質參數或結構參數，以 數學和統計學手段定量研究有機小分子與生物大分子相互作用、有機小分 子在生物體內吸收、分布、代謝、排泄等生理相關性質的方法。這種方法 廣泛應用於藥物、農藥、化學毒劑等生物活性分子的合理設計[13]。 2.2.2 分類 早期QSAR的建立是依據化合物的分類（如同一種類的化合物），但 後 來 發 現 以 化 合 物 毒 性 作 用 機 制 來 建 立 QSAR 較 為 適 當 [2-4][2-4][2-4][14-16]。 根據Russom毒性機制的分類，如圖 2.2.1所示：分為一般性（General） 和特異性（Specific）兩大類。一般性指化合物並非以特定位置對生物體造 成攻擊，而是與生物體之細胞膜進行反應；特異性會作用於細胞的特定位 置上而造成功能上的抑制。一般性又稱麻醉性，分為非極性與極性兩類。 非極性麻醉性在QSAR分析上，與辛醇與水分配係數（Log kow）呈良好線 性關係，其毒性又稱作基線毒性（Baseline toxicity）。特異性亦稱為反應性， 此類有機物除了有麻醉性機制外（分子之疏水結構具麻醉效應），其官能 基與生物體內所產生之化學變化為主要之毒性來源，通常此類有機物質的 毒性超過基線毒性，比麻醉性有機物還要毒[17]。
圖 2.2.1 QSAR 之分類[17] 2.2.3 二維定量構效關係 二維定量構效關係方法是將分子整體的結構性質作為參數，對分子生 理活性進行回歸分析，建立化學結構與生理活性相關性模型。 2.2.4 活性參數 活性參數是構成二維定量構效關係的要素之一，人們根據研究的體系 選擇不同的活性參數，常見的活性參數有：半數有效量、半數有效濃度、 半數抑菌濃度、半數致死量、最小抑菌濃度等，所有活性參數均必頇採用 物質的量（莫爾）作為計量單位，以便消除分子量的影響，從而真實地反 應分子水帄的生理活性。為了獲得較好的數學模型，活性參數在二維定量 構效關係中一般取負對數後進行統計分析。 毒性作用機制 麻醉性 （一般性） 非極性麻醉 極性麻醉 酯麻醉 反應性 （特異性） 氧化磷酸化 非耦合 呼吸抑制 親電性/ 前親電性 乙醯膽鹼酯脢 抑制
2.2.5 結構參數 結構參數是構成定量構效關係的另一大要素，常見的結構參數有：疏 水參數、電性參數、立體參數、幾何參數、拓撲參數、理化性質參數以及 純粹的結構參數等。 疏水參數：化學物物在體內吸收和分布的過程與其疏水性密切相關， 因而疏水性是影響化學物生理活性的一個重要性質，在二維定量構效關係 中採用的疏水參數最常見的是脂水分配係數，其定義為分子在正辛醇與水 中分配的比例，對於分子母環上的取代基，脂水分配係數的對數值具有加 和性，可以通過簡單的代數計算獲得某一取代結構的疏水參數。 電性參數：二維定量構效關係中的電性參數直接繼承了哈密頓公式和 塔夫托公式中的電性參數的定義，用以表徵取代基團對分子整體電子分配
的影響。其中，EHOMO和 ELOMO是最高佔有分子軌道能量和最低未占分子
軌道能量的英文縮寫。EHOMO與 ELOMO之間的能量差稱為能帶隙，有時可
以用來衡量一個分子是否容易被激發：帶隙越小，分子越容易被激發。 立體參數：立體參數可以表徵分子內部由於各個基團相互作用對毒性 反應產生的影響以及對毒化物和生物大分子結合模式產生的影響，常用的 立體參數有塔夫托立體參數、摩爾折射率、范德華半徑等。 幾何參數：幾何參數是與分子構象相關的立體參數，因為這類參數常 常在定量構效關係中佔據一定地位，故而將其與立體參數分割考慮，常見 的幾何參數有分子表面積、溶劑可及化表面積、分子體積、多維立體參數 等。 理化性質參數：偶極矩、分子光譜數據、前線軌道能級、酸鹼解離常 數等理化性質參數有時也用做結構參數參予定量構效關係研究[13]。
2.3鹵素取代酯類之QSAR
鹵素取代酯類之毒性作用機制以 Russom[17]毒性機制的分類屬於反 應性中的親電性/前親電性，會與生物體中之親核詴劑進行 SN2 親核性取代 反應，因而造成毒性之機制。 2.3.1 親核詴劑之介紹 親核詴劑為尋找正電性中心的一種詴劑，任何具有未共用電子對之負 離 子 或 分 子 即 為 親 核 詴 劑 。 親 核 詴 劑 根 據 軟 硬 酸 鹼 理 論 簡 稱 HSAB （Hard-Soft-Acid-Base）被分為軟親核詴劑和硬親核詴劑。「軟」是指具有 較低電荷密度和較大半徑的粒子，「硬」是指具有較高電荷密度、較小半 徑的粒子。在所有其他因素相同時，「軟」的親核詴劑與「軟」的親電詴 劑反應；「硬」的親核詴劑與「硬」的親電詴劑反應，大體上來說，「硬親 硬，軟親軟」生成的化合物較穩定。 大多的生物體中皆含有親核詴劑，尤以氨基酸（- NH2）的，羥基（羧 基）（- OH）的和巰基（-SH）為最重要，因為它們常見於許多生物大分子 中，如蛋白質、DNA 等等[18]。因此，本次實驗選用穀胱甘肽上的巰基（軟 親核詴劑）作為身物體中親核詴劑之代表，用來描述鹵素取代酯類（軟親 電詴劑）的親電性毒性反應過程。 2.3.2 SN2 親核性取代反應之介紹 在有機及無機化學中，親核取代為取代反應的一種基本型式，其中富 含電子的親核詴劑（nucleophile）攻擊接有離去基（leaving group）的原子， 此種帶有脫離基為帶正電或帶部分正電的原子或原子團，又稱為親電子詴 劑 ， 圖 2.3.1 雙分子親核取代反應（SN2）上圖為描素生物體內之親核詴劑與鹵素取代酯類中鍵結鹵素之碳所 發生的雙分子親核取代反應。Nu 代表親核詴劑而 Cl 代表鹵素離去機。 在此反應中，其反應數率同時牽涉到：1. 親核詴劑；2.鹵素離去基。 較強親核詴劑直接由背面進攻碳原子，並形成不穩定的一碳五鍵的反 應中間體，隨後離去基團離去，完成取代反應[8]。 SN2 屬於二級反應，與兩個反應物的濃度相關： 親核詴劑[Nu−]和底物[RX]。 r= k[RX][Nu−] (2.1) 詴劑親電親核強度的大小主要取決於詴劑電量和極性、中心原子的電 子的可極化性、空間位阻等因素[19]。 本次實驗中，以穀胱甘肽（GSH, glutathione）（圖 2.3.2）作為一化學 反應參數。用來描素化學物質與生物體中的親核詴劑的親電性反應。 圖 2.3.2 穀胱甘肽之化學結構 穀胱甘肽（GSH, glutathione）為麩胺酸（Glutamate）、半胱胺酸（Cysteine） 和甘胺酸（Glycine）所組成之三肽（Tripeptide），存在於真核生物之細胞 當中，是細胞內濃度最高的的抗氧化劑，有抗氧化及協助解毒等功能。GSH 中之半胱胺酸具有硫醇基（Thiol group，-SH 為親核性支鏈），會與親電 性物質（如鹵素取代酯類）產生 SN2 親核性取代反應（上述之介紹），進 而取代鹵素[20-22]。 因此本次研究參考以前之文獻，利用化合物與榖胱甘肽（GSH）之 半反應濃度（RC50,50% Reactivity Concentration）用來描述鹵素取代酯類 對於生物所造成之毒性反應，應是合理且可行的。
2.3.3 文獻之鹵素取代酯類之 QSAR
據 McFarland（1970），化學毒性是結合滲透到生物膜和與生物體內 互動之二參數來描述。麥克法蘭的數學方式表示如下： (2.2) 這個等式可以簡單的以 toxicokinetic＋toxicodynamic 來表示 Toxicokinetic 用來描述具能力的毒物，到達生物作用位置之行為。該 階段包括化學毒物的吸收和代謝活化。 Toxicodynamic 用來描述化學物之生化反應，進而導致細胞產生之生 理反應[23]。 因此，鹵素取代酯類於過去之文獻中以疏水性參數（Log Kow）作為 Toxicokinetic，以化合物與榖胱甘肽（GSH）之反應抑制濃度（RC50, 50%Reactivity Concentration）及親電性參數（ELUMO, Energy of the Lowest
Unoccupied Molecular Orbital）作為 Toxicokinetic，對生物之毒性資料進行 迴歸[1,2][5-8][5-8][5-8]。
下表為本次所實驗之化學物之相關文獻(1,2,41)，包含實驗數據及其他
物化參數，下表之RC50為化學物質與穀胱甘肽（GSH, glutathione）之半反
表 2.3.1 鹵素取代酯類之相關文獻數據
NO Chemical CAS no. RC50
(mM) IGC50 (mM) ELUMO 其他文獻 1 Ethyl fluoroacetate 459-72-3 NR a >2.5 a 2 Ethyl chloroacetate 105-39-5 3.06 a 0.088 a Daphnia magna (48h): EC50 : 1.6 mg/l Echerichia coli(12h): EC50 : 107 mg/l 3 Ethyl bromoacetate 105-36-2 0.086 a 0.002 a 4 Ethyl iodoacetate 623-48-3 0.029 a 0.001 a 5 Methyl bromoacetate 96-32-2 0.067 a 0.011 a 6 Methyl 3-bromopropionate 3395-91-3 8.626 a 0.094 a 7 Methyl 2-bromopropionate 5445-17-0 1.500 a 0.066 a 8 Ethyl- 2-bromopropionate 535-11-5 1.700 c
0.088 c -0.10248 b Vibro fisheri (micro tox) 15min EC50 :28.7mg/l
9 Methyl 2-bromobutyrate 3196-15-4 3.535 a 0.095 a
Vibro fisheri (micro tox) 15min EC50 : 21.8mg/l
10 Ethyl-
2-di-bromoisobutyrate 600-00-0 ND 0.708
b
-0.10730 b Vibro fisheri (micro tox) 15min EC50 :10mg/l 11 tert-Butyl bromoacetate 5292-43-3 0.085 a 0.004 a 12 Ethyl dibromoacetate 617-33-4 ND ND 13 Ethyl tribromoacetate 599-99-5 ND ND 14 Ethyl- 2,3-di-bromopropionate 3674-13-3 ND 0.006 b -0.52745 b
a： Data from Schltz TW. et al., 2007[1]. ; b： Data from DeWeese AD et al., 2001[2]. c
： Data from Roberts WD. et al., 2010[41]. ; ND：no data 其他文獻由 Toolbox V1.1 查詢而得。
文獻中利用上表之纖毛蟲（Tetrahymena pyriformis ）之毒性數據和物
化參數回歸出以下式子。下式中之 R2為用來評判參數與毒性之間的相關性、
Rpred 2為預測能力、S 為標準偏差、F 為檢驗值用以比較模式之間統計上的
顯著性：
1. 利用化學物滲透到生物體和化學物於生物體內之互動之二參數：
Log (1/IGC50)=0.34 Log Kow -0.84 ELUMO-0.04 (2.3)
n=16, R2=0.848, S= 0.26, F= 33
2. 以親電性參數穀胱甘肽之半反應濃度：
Log (1/IGC50)=0.848 Log (1/RC50)+1.40 (2.4)
n=19, R2=0.926, Rpred2 = 0.905, S= 0.25, F= 33 根據上述雙分子親核取代反應之化學原理與先前之文獻數據， [1,2,8,19]對於化學物的毒性，應有以下預期之驅勢： 相似的結構式，若鹵素離去基鍵結在相同位置的碳上，則預期毒性 的強弱會因與電負度(Electronegativity)呈反比，而有毒性：I > Br > Cl > F 的趨勢。 相似的結構式，當鹵素所鍵結的碳上也有鍵結其他碳氫鍊，則因空 間位阻而預期毒性的強弱會有： 相似的結構式，若相同鹵素離去基接在不同位置的碳上，則預期毒 性的強弱會有：
>
>
>
2.4 藻類毒性詴驗
2.4.1 月芽藻之介紹 本實驗中所使用之月芽藻 (Pseudokirchneriella subcapitata)，為一種單 細胞、成群體但不糾結、不能移動之綠藻 (Chlorophceae），一般細胞體積 為40-60 μm3，如圖2.4.1所示[25]。 圖 2.4.1 月芽藻之圖示[25] 典型的月芽藻體積約為45 μm3、重量10~20 pg/cell，為淡水單細胞藻類， 因體型呈半月型，故稱月芽藻，其優點有：取得容易、培養簡單、容易觀 察、生長期短、可以大量生長、具有地區代表性等實驗用的藻種需具有的 特點，並較大部分生物詴驗來的敏感[26]。此外，當培養過程中缺少營養 鹽或溫度、光線、pH、有毒物質侵害、細菌滋生等環境條件不佳時，母槽 會逐漸呈現明顯的黃綠色，故由外觀上可以容易的去判斷母槽的生長情形。 除了外觀上的判斷，利用顆粒計數器觀察其粒徑的分佈變化，若發現顆粒 數變少、大粒徑的藻類分佈變多時，則可判斷此藻種的健康情形不佳。 2.4.2 藻類生長測定方法 一般藻類生長情況之參數有下列幾種：細胞密度、細胞總體積、乾重、 葉綠素、活體內螢光值、營養基濁度、產氧量、碳源攝取量、ATP 及DNA 等參數。理想的測定方法應具備以下條件：迅速、精確、高敏感度、低偵測極限、低成本，適合這些條件之藻類生長質量之方法有下列幾種：(1) 顯微鏡計數法 (2)電子顆粒計數法 (3)直接乾重量測法 (4)光學顆粒計數 法 (5)分光光度計測葉綠素A 法 (6)螢光光度計測葉綠素A法 (7)DNA 測
定法 (8)ATP 測定法 (9)14C 輻射標定法(10)溶氧測定法等[27]。
藻類毒性詴驗之標準方法： United States Environmental Protection Agency (U.S. EPA)[28] 、 Organization for Economic Cooperation and Development (OECD)[29] 、 International Organization for Standardization (ISO)(30)、American Society for Testing and Materials(ASTM)[31]、American Public Health Association (APHA)[32]皆於詴驗終點時，測量藻類的生物質 量。量測生物質量最直接的方法為量測生物之乾重，但耗時較久，因此利 用電子顆粒計數器之間接量測生物質量的方法，其操作簡單、快速、所需 藻液量少，且與生物乾重之間有良好的相關性。溶氧測定法為直接量測水 中溶氧之變化，再依此計算出藻類生長之情形，優點為低成本、詴驗時間 短。Hostetter發展出一套量測水中溶氧之藻類詴驗方法，詴驗時間縮短至 24小時，且在Raphidocelis subcapitata的詴驗之中發現，當一或多種之營養 鹽呈限制性狀態時，藻類之淨光合反應量會與限制性營養鹽呈現線性關係 [33]。 2.4.3藻類毒性詴驗方法 根據培養方式的不同，藻類毒性詴驗分為批次式和連續式。現有之藻 類標準毒性詴驗方法，大都屬於批次式，如U.S. EPA所用之"Fresh water algae acutetoxicity test"[28] 、 OECD 所 用 之 "Algal growth inhibition test guideline"[29]、ISO所用之”Water quality-algal growth inhibition test"[30]、 APHA所用之 "Toxicity testing with phyto-plankton"[32]及ASTM所用之 "Standard Guide for Conducting Static 96-h Toxicity Tests with Microalgae"[31]等。
(1) 批次式：
批次式藻類毒性詴驗為藻類暴露於毒性物質一段時間，再測其詴驗終 點，並與無暴露之控制組比較分析。實驗過程中沒有新鮮基質的加入、藻 類之代謝物移出，實驗期間藻經歷完整的成長週期，遲滯期（lag phase）、
指數生長期（exponential phase）、穩定期（stationary phase）及死亡期（death phase）。標準詴驗方法可採用U.S. EPA[9]]所制定之“Fresh Algal Acute Toxicity Test”。 批次式藻類毒性詴驗具有技術簡便、成本低、樣品處理量大、實驗數 據取得容易等優點，因此經常被採用，但仍然存在許多缺點： 1. 批次式系統中，為確保藻類生長，大多使用高於自然水體甚多的營 養鹽濃度，如此將會影響藻類對毒性物質的容忍度，亦會造成pH的 改變，也無法反應自然水體真實狀況[34]。 2. 批次式培養因無新鮮基質的加入，導致營養鹽濃度隨時間拉長而消 耗，使實驗後期逐漸產生營養鹽缺乏之情形，且代謝物累積無法移 出，亦會對後續毒性詴驗產生影響。 3. 以批次式培養進行毒性詴驗，於同實驗室的詴驗結果有20%～32% 的變化量；且在不同實驗室中EC50甚至會有更大的變動，顯示批次 式實驗結果的差異性大[35]。 (2) 連續式配合批次式詴驗： 連續供應新鮮的營養鹽至反應槽中，並持續的將槽中的新陳代謝物排 出，故藻類能保持在最佳的生長狀態。因為低濃度的營養鹽不斷注入系統 中，所加入之營養鹽與藻類生長產生動力帄衡，故此系統也較接近自然水 體。但由於連續式藻類毒性詴驗系統欲達帄衡時，需要一段相當的時間， 且每進行完實驗即需重新培養，相當的耗費人力、物力及時間，所以目前 尚未有標準的詴驗方法建立。 由於在批次式及連續式藻類毒性詴驗都各有其缺點存在，因此利用 Chemostat系統為基礎，使用連續式培養、批次式實驗，為兼具實用性、敏 感性及簡便性的藻類毒性詴驗法。利用四公升的連續式母槽培養藻類，在 培養過程中不斷有低濃度之新鮮基質流入，藻類之代謝物亦可流出，如此 就更接近自然水體環境，且使母槽內之藻細胞更為健康。待系統達到穩定 後，即可由母槽中取出藻液進行批次式毒性詴驗，而不會污染到母槽，並 將毒性詴驗時間縮短為48小時，大大增加詴驗的頻率，改善批次式培養中 藻類代謝物之累積[36]；對於再現性的研究，發現以溶氧及生長速率為終 點參數之下，兩組不同詴驗之變異係數接近10%，改善了過去批次式實驗 再現度不佳的結果[37]。 利用連續式的藻類培養方法，配合BOD瓶48小時的批次式BOD 瓶藻
類毒性詴驗，將藻類、營養基質和詴驗毒物加入300 mL的BOD 瓶，蓋子 密封（水封）做密閉式毒性詴驗，讓藻類與毒性物質接觸48 小時後，由 觀測終點量測實驗組與控制組(不加毒物)的抑制情形並進行比較分析。整 個實驗過程中沒有新鮮基質的加入，也沒有藻類之代謝物移出，屬於批次 式毒性詴驗，在操作更加簡單，在時間與成本的耗費也大幅減少，且可處 理較大量的樣品數、實驗數據取得容易，所以相對了提高實驗的再現性。 因此本研究採用”連續式藻液培養配合批次式毒性詴驗”之方式。 2.4.4 詴驗中之重要參數
(1) pH的控制 自然界中因為光合作用的關係，使一天中之pH變化很大，因此有人主 張pH可以不需要控制，讓藻類在合理的pH值範圍內暴露於毒性物質。然而 如此很難進行重複性詴驗，且用來預測於某特定的pH狀況下之物種濃度影 響也有困難。因此標準藻類毒性詴驗皆傾向將pH維持固定。 以毒理學的觀念，pH若變化一個單位，可能導致毒性改變10倍以上； pH值控制隨不同的標準方法而有差異，U.S. EPA規定最終pH需在8.5之下 [28]；OECD要求pH之最大變動不要超過一個單位[29]；ISO則是要求pH之 變動在1.5 個單位之內[30]。若決定詴驗在固定pH下進行時，就必頇小心 地確保pH值之變化為最少。欲減少pH值之改變，有下列幾種方法：(1)使 用較低之生物接種量 (2)縮短整個詴驗之時間 (3)以空氣或是添加二氧化 碳之空氣加以曝氣。 雖然各個國際環境組織對於pH變化皆有控制在一個範圍之內，但在密 閉式藻類毒性詴驗中，並未刻意對整個系統的pH加以限制，發現在水中溶 解性金屬對於藻類的抑制率若高於20%時，系統中pH的濃度變化大部份皆 在1.5個單位以下[37]，因此本研究依據藻類最適生長之pH值，將初始值控 制為7.5，並不刻意限制系統中pH的變化。 (2) 光照強度 光照的強度會影響藻類行光合作用之速率，因而造成其產氧率之不同。 [35]藻類毒性詴驗之中，光照的強度依照不同的詴驗標準及不同藻種而有 些許差異。且需考慮「自身遮蔽」效應（self-shading），此效應會造成距 光源較遠處之光照與較近處之光照強度之差異，良好的混合可以減低自身
的遮蔽效應。光照強度應為一常數，並能使藻類呈現指數生長、縮小培養 體積及維持充分的混合有助於達到理想狀態。 (3) 溫度 當溫度逐漸增加時，藻類會呈現指數生長，而當達到其最適生長溫度 後即迅速下降。本研究採用U.S. EPA建議的24℃環境下來培養藻類及進行 實驗，整個培養及詴驗過程中，溫度之變化不可大於2℃。 (4)植種數量與時間 若實驗開始時的植種數量過高，將會造成批次式實驗後期藻類細胞大 量增加造成代謝物累積及水中碳源耗盡，而導致pH升高等問題，進而影響 毒性詴驗結果。生物毒性詴驗隨著時間增加，其敏感度提高而C.V.值減少； 隨著初始植種密度減少，其敏感度提高但變異係數亦提高[5]。改變初始生 物量進行批次詴毒性詴驗，提高實驗初始生物量時，EC50值也顯著提升[38]。 在 兼 顧 兩 者 的 考 量 下 ， 選 定 最 佳 條 件 為 藻 類 初 始 植 種 密 度 1.5×104 cells/ml。 詴驗時間的長短關係到毒性詴驗的敏感性和數據結果。過長的詴驗時 間，會使得BOD瓶內的營養鹽不足，而有藻類有死亡的現象；過長的詴驗 期間，也會使得毒性的反應消失。一般標準的藻類毒性詴驗為96小時，但 有鑑於前述之缺點，因此本研究所選定的時間縮短為48小時。
第三章
基本原理
3.1基本生長動力學
批次式藻類培養中，單細胞藻類的生長通常依循簡單的一階動力學： X ＝ dt dX (3.1) 其中，X為生物質量（一般以乾重或是細胞數表示之）； μ為比生長率； t為時間。影響生長率之因子有光照、溫度、營養鹽及碳源之供應， 如果光照、營養鹽或碳源受限，藻類之基本生長模式將由指數型態變成直 線型態。在連續式藻類培養中，當系統達到一帄衡（Steady State）時： 由反應槽中生物質量之帄衡可得下列式子：
－DX
＝ DX － X ＝ dt dX (3.2) 其中，D 為稀釋率（day-1），即入流量與反應槽體積之比值，當系統達到 帄衡穩定狀態時， dt dX ＝ 0 (3.3) 由式(3.3)代入式(3.2)，得 µ ＝ D (3.4) 得知當反應槽達到帄衡穩定狀態時，反應槽內生物之比生長率等於該系統 之稀釋率。 由反應槽內之基質帄衡可得下式： dt dS ＝ DS0－DS－µ（ Y X ） (3.5) 其中，S0 為入流基質濃度（mg/L）；S 為系統達帄衡穩定狀態時，限制性 基質之濃度（mg/L）；X 為系統達帄衡穩定狀態時，生物質量之密度 （cells/mL）；Y 為無因次之生長係數。 當系統達帄衡時，dt dS ＝ 0 (3.6) 由式(3.4)及式(3.6)代入式(3.5)，得 X ＝ Y（S0－S） (3.7) 以式(3.4)代入 Monod equation µ ＝
Ks S
S µ max (3.7) 得 S ＝
D µ KsD max (3.8) 其中，µ 為比生長率；µmax為最大比生長率；Ks 為飽和常數（比生長率為 最大比生長率一半時之基質濃度）。 最後由式(3.6)及式(3.8)得 X ＝ Y
D µ KsD S max 0 (3.9) 由此式可知當反應槽達帄衡穩定狀態時，生物量可由稀釋率及進流基 質濃度來控制。3.2 毒性物質之濃度反應關係模式
以毒理學的角度而言，劑量與反應關係(dose-rseponse relationship) 是 探討化學物質對生物體所造成影響之基礎。 所有的物質皆可能有毒，是否為毒性物質最主要差別在所暴露之劑量。 當詴驗物種受到毒性物質的抑制，造成 50%抑制的毒物濃度稱為 EC50（50% Effect Concentration）。 而由受影響或死亡的百分率所迴歸出的S 曲線關係，稱為劑量-反應曲 線圖（Dose-response curve）；這些在於毒性評估方面皆為相當重要。生物體受毒性物質影響的劑量反應關係如圖3.2.1 所示。 而詴驗物種受抑制的百分率，隨著毒性物質濃度成 S 型濃度反應關係 曲線，利用數學轉換模式將 S 型曲線轉為直線，以方便求得 EC50或 EC10， 便稱為濃度反應關係模式。 圖 3.2.1 劑量-反應曲線圖 上圖中虛線與實線分別代表受測生物體 A 與 B 的劑量反應曲線，可 以看出虛線的斜率大於實線的斜率，說明了生物體 A 對毒物濃度的變化 較敏感：微量的濃度變化即可導致抑制率的明顯改變。而在抑制率為 0.5 處， 延伸至兩曲線所對應的毒性物質濃度，即為毒性物對生物體所造成的半至 死濃度(EC50)。 欲從 S 型曲線求得EC50或EC10並不容易，因此必頇藉由數學關係式將 S 型轉為直線型以便求取。一般常見的毒性物質劑量-反應模式為有三種， 包括了：Probit、Weibull及Logit 模式，皆是依據不同的假設發展而成。 而本次實驗所選用的計算模式 Probit 為一般常見之模式，其假設生物 對毒性物質容忍度成對數常態分布（Log-normal distribution )。因此以常態 分佈函數來表示毒物對生物抑制率 P 對毒物濃度 Z 的濃度反應曲線。以
Probit 模式將毒物之 S 型濃度反應曲線轉換成 NED 尺度（Normal Equivalent
Deviation），其中 50﹪抑制率對應至 NED 上時為 0，而 84.1﹪則對應為 1，
NED 的座標值加上 5 即為 Probit 座標之概率單位 Y 值（Y＝NED + 5），當
是 EC50。Probit 單位與反應率與毒性物質劑量間之轉換關係如下： Y=α +βlogZ (3.10) P=0.5[1+erf( 2 ) 5 Y ( )] (3.11) 其中 Y 為 Probit 單位，α、β 為濃度-反應曲線之截距與斜率，Z 為毒性物 質劑量濃度（單位：mg/l），P 為測詴物種對毒性物質之反應率（如死亡率
第四章
材料與方法
4.1 實驗設備與材料
1.
恆溫室：大小約為五坪，溫度控制在24 ± l ℃，藻類培養、毒性詴驗 與四十八小時後的分析，皆於此進行。2.
無菌操作臺：內設有紫外光殺菌，防止植種過程中受到污染。3.
純水設備：包括四道濾心過濾（0.5 μm）、離子交換、蒸餾（AquatronA4S, Bibly），蒸餾水儲水桶（60 L container, Nalgene）；去離子水製 造機（Milli-Q Plus, Millipore, outflow conductivity 18.2 MΩ-cm），水 質之電阻值控制在18.2 Mega-ohm (MΩ-cm)。
4.
抽氣泵浦： SINKU KIKO公司，型號ULVACG-5及G-50。用於過濾營養基質及 ISOTON II之用。
5.
電子顆粒計數器：量測藻類細胞數。使用CoulterElectronincs公司之Coulter Counter，型號MULTISIZER II，並以5.06 μm標準顆粒乳液來
校正。本實驗使用100μm 孔徑之玻璃管，量測之顆粒直徑範圍為2~60 μm。
6.
光度測定計：使用TOPCON廠牌，型號IM-2D，單位為Lux。7.
pH測定儀：購自Suntex，型號為Model SP-2500。其精確度為± 0.01。8.
冰箱：使用Whirpool之冰箱，將藻種及營養鹽於4 ℃之下保存。9.
滅菌釜：使用HIRAYAMA公司，型號HA-300M之滅菌釜，最大壓力 可達1.9 kg/cm2，容積為0.0521 m3。使用時設定溫度121℃、壓力l.l kg/cm2滅菌15分鐘。10.
烘箱：廠牌為Memmet，烘乾玻璃器皿用。使用溫度設為52 ± 1 ℃。11.
分析天秤：廠牌Precisa 205A，精確度至0.01 mg。12.
定量吸管：使用SOCOREX之可調式移液器，容量為100～1000 μl及0.1 ～5 ml兩種。以及NICHIRO，Nichipet EX，20～200 μL、10～100 μL 以 及2～20 μL 等3種。13.
濾膜：使用之濾膜分成兩種，過濾營養基質時使用Gelman Science型號66191、孔徑0.45 μm之濾膜，過濾Isoton II時使用Gelman Science型號 60301、孔徑0.2 μm之濾膜。
批次式培養藻類
14.
批次式培養裝置：培養裝置為自行裝配，長、寬、高為135× 110×135 cm， 頂面裝有120 cm 長之白色螢光燈管八支。迴轉式振盪儀(EIRSTEK, model: S103)，搖動速度可大於100 rpm。15.
批次式培養器皿：批次式培養藻時所使用之容器為125 ml之三角錐 瓶。16.
紗布：藻類培養時，使用消毒紗布覆蓋在三角錐瓶瓶口，防止異物進 入。 連續式培養藻類17.
連續式培養母槽：連續式培養之母槽體積5公升，直徑為18 cm 之玻璃 容器。於體積4公升處開口做為溢流口，並且於體積2公升處開一口做 為取樣之用。母槽上方亦有兩開口，分別為營養基質流入口及空氣進 流口。18.
基質儲存瓶：容量約為5公升，直徑為25公分大小的血清瓶。用來存放 培養母槽之連續入流基質；使用前需以蒸餾水清洗及已滅菌釜滅菌。19.
蠕動泵浦：EYELA公司，型號MP-1000，用以控制供應母槽之流量。20.
泵浦管：廠牌Materflex，型號H-96400-14。輸送管為矽膠材質，不具 毒性，可避免影響母槽之培養及毒性詴驗之結果。21.
曝氣泵浦：使用之曝氣泵浦為一般水族使用之曝氣幫浦。22.
浮子流量計：量測曝氣流量，本實驗將曝器量控制在400 mL/min。23.
空氣洗滌器：去除曝氣氣體中的雜質，並濕潤氣體，增加氣體之溶解。24.
電磁攪拌器：放置於連續式培養母槽之下方，使藻液與進流之營養基 質、空氣混合均勻，避免藻類之沉澱。 BOD瓶毒性詴驗25.
BOD瓶：為毒性詴驗時使用之玻璃器皿。使用體積300 mL，直徑8 cm， 上頭開口處有玻璃瓶塞，使其可以利用水封之形式，避免外界氣體、 物質等進入，而減少干擾，使整個系統為一個封閉式系統。26.
溶氧測定儀：美國YSI公司出品之微電腦溶氧測定儀，Model YSI5100，附有Model 5010溶氧測定探頭(BOD Probe)，其探頭部分裝有電動攪拌 器，可以對樣品進行攪拌。溶氧量測定範圍為0.0~60.0 mg/L，精確度 為 ± 0.1%。
27.
氣體鋼瓶：購於洽隆，含0.5% CO2、99.5% N2之高壓氣體鋼瓶，氣體 體積為6 m3。用於降低營養基質中之溶氧值，並確保能提供足夠之碳 源。28.
曝氣桶：使用體積10公升之純水桶。開口處嵌入一矽膠塞，一頭接氣 體鋼瓶，一頭接沸石並伸入桶底部曝氣，於桶開口處附近開一小洞以 帄衡壓力，曝氣完成後關緊桶蓋以減少外界空氣之進入。29.
毒物選定：純度皆至少 96 %以上。30.
總有機碳分析儀：購自台灣耶拿公司，型號 Multi N/C 3100，用以定 量配置好之毒物儲備液濃度。4.2 實驗方法
藻類毒性詴驗： 以生長率與產氧率為參數之密閉式 BOD 瓶詴驗。 (一) 詴驗藻種： 本實驗所選用的藻種為月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata），為 廣用於藻類毒性詴驗之物種，如：US EPA、ISO、OECD及APHA等單位 皆以此物種做為毒性詴驗物種之一。實驗藻種於購自University of Texas, Austin（UTEX），藻種保存於4 ℃之冰箱。 (二) 培養基：本研究採用U.S. EPA “The Selenastrum capricornutum Printz algal assay bottle test: Experimental design, Application , and Data interpretation protocol. EPA-600/9-78-018.” 所使用的營養鹽組成，再以此為基礎，對其組成加以 修改而用於連續式母槽與藻類毒性詴驗中。U.S. EPA營養鹽的配製方法如 下：將下列(1)~(7)的貯備液（stock solution）各加1 mL至900 mL的去離子 水中，再定量至l L。接著以0.l N當量濃度之NaOH及HCl將營養鹽之pH值 調至7.50 ± 0.10，並立即以孔徑為0.45 μm的濾膜過濾。 以下為營養鹽之配置： (1)硝酸鈉貯備液：溶解12.750 g NaNO3於500 mL去離子水。 (2)氯化鎂貯備液：溶解6.082 g MgC12〃6H2O於500 mL去離子水。
(3)氯化鈣貯備液：溶解2.205 g CaCl2〃2H2O於500 mL去離子水。 (4)微營養鹽貯備液：溶解下列所有藥品於500 mL 去離子水。 92.760 mg H3BO3 0.714 mg CoCl2‧6H2O 207.690 mg MnCl2‧4H2O 3.630 mg Na2MoO4‧2H2O 1.635 mg ZnC12 0.006 mg CuCl2‧2H2O 79.880 mg FeC13‧6H2O 150 mg Na2EDTA‧2H2O (5)硫酸鎂貯備液：溶解7.350 g MgSO4〃7H2O於500 mL去離子水中。 (6)磷酸氫二鉀貯備液：溶解0.522 g K2HPO4於500 mL去離子水中。 (7)碳酸氫鈉貯備液：溶解7.5 g NaHCO3於500 ml去離子水中。 微營養鹽貯備液中，EDTA分別有100％及0％二種。100％使用於活化 藻類時及連續式母槽中培養藻類時，進行實驗時則使用不含EDTA之貯備 液。最後配成的營養鹽其巨量及微量營養素濃度列於表4.2.1及表4.2.2。表 中之”結果濃度”表示各元素於水溶液中之實際濃度。營養鹽以孔徑0.45 μm 的濾膜過濾滅菌，並保存於4 ℃冰箱，以免產生光化學反應。 (三) 連續式培養藻類之控制條件： (1)溫度：控制溫度在24 ± l ℃。 (2)光度：利用白冷光從系統的一方帄行連續照射，使培養槽及詴驗瓶中間 段之光度在4300 ± 10％ lux（64.5 ±10 μEm-2s-1）。 (3)曝氣：以 400 mL/min之空氣流速曝氣培養母槽。 (4)溢流率：母槽溢流率控制在1140～1260 mL/day （稀釋率為0.3 /day）。 以上各個參數皆要每天量測，來確保實驗的穩定度。
表 4.2.1 月芽藻生長所需之巨量營養鹽成分 化合物 濃度(mg/L) 元素 各元素實際濃度 (mg/L) NaNO3 NaHCO3 25.5 15.0 N 4.2 C 2.14 Na 11.0 K2HPO4 1.04 P 0.186 K 0.649 MgSO4〃7H2O 14.7 S 1.91 MgCl2 5.7 Mg 2.9 CaCl2〃2H2O 4.41 Ca 1.20 表 4.2.2 月芽藻生長所需之微量營養鹽成份 化合物 濃度(µg/L) 元素 各元素實際濃度(µg/L) H3BO3 186 B 32.5 MnCl2 264 Mn 115 ZnCl2 3.27 Zn 1.57 CoCl2 0.780 Co 0.354 CuCl2 0.009 Cu 0.04 Na2MoO4〃2H2O 7.26 Mo 2.88 FeCl3 96.0 Fe 30.0 Na2EDTA〃2H2O 300
(四) 玻璃器皿之清洗： 以不含磷之清潔劑清洗後再用自來水沖洗數次，再泡至10 %鹽酸溶液 至少1小時，最後再以自來水沖洗約5、6次、蒸餾水清洗3、4 次後置於烘 箱中烘乾（溫度保持於52±1 ℃）。使用前以鋁箔紙封住開口，置於壓力 1.1 kg/cm2、溫度121 ℃條件下之滅菌釜中滅菌15分鐘。 (五) ISOTON II 溶液的配製： 加1 g NaCl於100 mL之超純水中完全混合，並以孔徑0.2 μm濾紙過濾 即得Isoton II溶液。作為電子顆粒計數器之導電溶液。 (六) 電子顆粒計數法及操作原理： 計數器內有一根玻璃管，操作中需浸入含有Isoton II稀釋樣品之燒杯中。 玻璃管近底端之側面鑲有紅寶石的精準小圓孔，藉以吸取水樣。玻璃管內 外各有一電極片通以直流電，水樣之顆粒經過圓孔時，會暫時性地干擾電 流，形成某特定量的電阻。而電阻量化透過示波器的波峰顯示，其高度正 比於顆粒的大小，且脈衝數即是顆粒的數目，直接由電子記數器記錄顯示。 電子顆粒計數器主要條件設定如下表4.2.3。本實驗採用孔徑50 μm之毛細 玻璃管，量測粒徑上限為2.622 μm至60 μm。量測時，取1 mL藻液以Isoton II定量至50 mL，將之倒入燒杯，置於顆粒計數器內量測。以顯示之讀數值 扣除空白顆粒數之數值 (Isoton II之背景值)。 藻液顆粒數 (cells/mL) =(扣除空白值後之三次讀值帄均值 / 0.5 mL) ×50 表 4.2.3 顆粒計數器之操作參數 項 目 數 值 滿刻度電流量 (Full scale) 10 mA 極性 (Polarity) + 電流 (Currents, I) 100
粒度下限 (Diameter Lower Threshold, Tl) 2.177 μm
粒度上限 (Diameter Lower Threshold, Tu) 6.975 μm
脈衝衰減倍率 (Attenuation, A) 1
脈衝放大倍率 (Preset Gain) 1
警戒粒徑限度 (Alarm Threshold) OFF
(七) 實驗步驟： (1)藻類培養： 將欲移植的藻類由4 ℃冰箱中取出，進行批次式培養數天，以活 化藻細胞，使其達到對數生長期。接著依比例再將達對數生長期的藻 液和培養基植入4 L之連續式培養槽中。 將連續式培養槽培養於24±1 ℃之恆溫室中，槽底放置磁石攪拌器， 使藻液均勻混合、避免藻類沉澱及少量供應CO2，另外曝氣裝置有供 應CO2 及均勻混合之作用。連續式白冷光從培養槽一邊照射，讓培養 槽中段之光照強度介於4300±10％ Lux之間。 培養槽的藻數達到相當數量，即以蠕動泵浦進流營養基質。由於 培養槽體積固定（母槽設有溢流口），故可直接由流量控制所需之稀 釋率（約為0.3 /d），亦即控制培養槽內藻類之生長率。每日更換進流 基質，並量測槽中細胞數量、溢流率、觀察粒徑分析儀中藻類細胞之 分佈情形及細胞帄均體積（Mean cell volume, MCV），以判定連續式
培養槽是否達到穩定狀態。以連續3天之細胞數量為2.8×106～3.2×106 cells/mL、MCV為39～46 μm3的範圍，且分析儀中藻細胞分佈為常態 分佈，即認定系統達到穩定狀態。 (2)稀釋水配置： 毒性詴驗的營養鹽參考U.S. EPA建議配製，適當地修正濃度作為 本詴驗的營養鹽；以含0.5％CO2的N2氣體（流量為600 mL/min）對營 養鹽進行曝氣，降低水中的溶氧值並提高CO2含量，再以0.1 N的NaOH 及HCl 調整營養鹽之pH至7.5 ± 0.1，即完成稀釋水的配製。 (3)毒物添加 從達穩態（Steady state）之培養母槽取出藻液，計算各BOD瓶所 需加的藻液量，使各瓶初始細胞密度皆為1.5×104 cells/ml，將藻液及稀 釋水加入BOD瓶，再加入毒物，一組實驗做七個濃度、三重複（含一 組控制組及七組處理組），量測初始溶氧值（Initial DO）。 (4)實驗終點 經過48 hr毒性物質曝露後，量測含不同毒物濃度之BOD瓶的溶氧 值（Final DO），扣除起始溶氧值得淨溶氧值（ΔDO），並以顆粒計
數器測量瓶中細胞密度，扣除初始細胞密度1.5×104 cells/ml，以求得藻 類生長率。經由Probit模式分析，求出毒性物質之EC50值與濃度－反應 關係曲線。
4.3
儀器操作原理、步驟與設定條件
詴驗需先進行有機物定量，其中詴驗毒物中以TOC (總有機碳分析儀) 定量，以下分別就儀器的原理及實驗步驟分別描述。 4.3.1 TOC (總有機碳分析法)總有機碳(TOC)定義為Total Organic Carbon，而TIC為Total Inorganic Carbon，TC則為Total Carbon；而其簡單的原理為TOC=TC-TIC；所使用的 機型為analytikjena的 multi N/C 3100 TOC Analyzer (如圖4.4.1)；所利用的 分析方式有兩種：第一種為直接分析模式 (NPOC Method) : NPOC = TOC， 此方法的優點為分析時間快速，適合高濃度的樣品分析，但缺點為樣品需 為不具揮發性，由於如此較不適用於本研究；而本研究所使用的為相減法 (Differential Method) : TOC = TC-IC，此方法可針對於具揮發性之有機化合 物的偵測，為確保於燃燒管中完全氧化，故將溫度設定於 800-1000℃，在 建立背景校正曲線及分析樣品時採用注入不同濃度及相同體積樣品進行， 從分析結果也發現其誤差範圍較小(0.2%~5.4%)。 4.3.2 總有機碳分析之標準液配製流程 (1) 總碳 (TC) 標準儲存液以 1000mg/L 為例： 秤取 2.1254g KHP 鄰苯二甲酸氫鉀 (Potassium Hydrogenphthalate) →以超純水 (電導度＞18Ω) 溶解並定量至1000mL。 (2) 總無機碳 (TIC) 標準儲存液以 1000mg/L 為例： 秤取 4.41625g 碳酸鈉 (Sodium Carbonate , Na2CO3) 以及 3.5g
碳酸
氫鈉 (Sodium Hydrogen Carbonate , NaHCO3) 混合後→以超純水 (電
(3) TC/TIC混合儲存液，分別取上述已配製好的TC及TIC標準儲液各500mL 混合即可。 本實驗進行前，為了確保所配製的化合物Stock solution濃度的準確性， 會先建立一條校正曲線，濃度分別為 20mg/L，40 mg/L，60 mg/L ，80 mg/L， 100 mg/L，200 mg/L；在進行毒性詴驗前後分別測定其濃度，而為了避免 高濃度的stock solution造成儀器測定的準確性，會採用稀釋的方式再進行 樣品的分析，此方法也從分析結果中看到相當準確的結果。
4.4
RC
50反應性參數值實驗
實驗步驟 (參考 Schultz 於 2005 年發表 paper)[43]： (1)配製磷酸緩衝溶液(buffer)：將 9.38 g KH2PO4與 9.38 g Na2HPO4加入超純 水定量至 1 L，並調整 pH 值至 7.4。(2)配製該毒物(Chemical)之 stock solution，並利用 TOC 定量其誤差值，以 便計算實際濃度，配製毒物皆使用磷酸緩衝溶液配製。 (3) 1.375 mM GSH 溶液當次現配，配製方法將還原態 GSH 取 0.042g 溶於 pH=7.4 , 100 ml 磷酸緩衝溶液。 (4) Range finding 實驗，詴驗濃度範圍為五個濃度分別作 2~4 倍等倍稀釋， 以便抓取 RC50落入範圍。實驗有兩個 control，一為加入 GSH，另一為只 有磷酸緩衝溶液(不含 GSH)做空白用。 (5)確定詴驗，詴驗濃度範圍為分別將 range finding 所找到的範圍值細 分成 6 個濃度，其中間隔以兩倍等倍稀釋，實驗至少兩重複，兩個 control，一 為加入 GSH，另一為只有磷酸緩衝溶液(不含 GSH)做空白用。 (6)分別依照其六個濃度範圍隨後從所配製毒化物之 Stock solutions 由濃度 低到高依序加入磷酸緩衝溶液，再者由高濃度到低濃度依序加入 1 ml 的 GSH 溶液定量至小玻璃瓶 (10 ml) 使 SH 最終濃度為 0.1375 mM。 (7)配製 DTNB 顯色劑，取 1.98 g 之 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) 並溶 於磷酸緩衝溶液中定量至 100 ml ，調整 pH 至 7.4。 (8)定量完之後的小玻璃瓶輕搖並靜置 2 小時，2 小時之後各別加入 DTNB 顯色劑 200 ml，並於波長 412 nm 下利用分光光度計測其吸收值，將其記 錄與 control 組作比較，利用 probit model 分析。
4.5 實驗之品保及品管 (QA/QC)
4.5.1 確定藻類生長狀況 為確保實驗時所使用的藻類在最佳狀態，每天取 1 mL 藻液，量測細 胞密度及帄均細胞體積MCV等參數變動情形並填寫於母槽生長情況紀錄 表，並控制母槽的溢流率。 4.5.2 實驗條件之控制 每天檢查控制恆溫室之溫度是否維持在24±10oC；光度是否維持在為 4300Lux±10%內；迴轉式振盪儀搖動速度是否為100 rpm。 4.5.3 儀器的保養： 各儀器之耗材皆要定時更換，並定時請廠商進行維修及校正。實驗進 行前，儀器皆要預開、暖機，並校正。第五章
結果與討論
5.1 藻類實驗毒性數據
針對 14 種鹵素取代酯類（其中 11 種為鍵結一個鹵素的酯類，3 種
為鍵結兩個以上鹵素之酯類）利用連續式培養，植種於 BOD 瓶進行 48 小 時之藻類批次詴毒性詴驗，反應終點分別為：溶氧變化量(△D0)、最終細
胞變化量(Final Yield)及生長率(Growth Rate)；實驗結果計算 EC50值並繪製
劑量-反應曲線並與其中不同結構及不同取代基所造成毒性作進一步討 論。
根據前述雙分子親核取代反應之化學原理，檢視化學物的毒性與結構
之相關驅勢，可觀察出以下：
1.比較 Ethyl fluoroacetate(1)、 Ethyl chloroacetate(2)、 Ethyl bromoacetate(3) 和 Ethyl iodoacetate(4)之毒性，參考文獻[1]，纖毛蟲之毒性隨著鹵素電負 度的減少而增加，電負度：F > Cl > Br > I，毒性：Ethyl iodoacetate(4) ＞ Ethyl bromoacetate(3)＞Ethyl chloroacetate(2)＞Ethyl fluoroacetate(1)。但在 月芽藻的部分，排除掉 Ethyl fluoroacetate(1)，其餘皆符合電負度反比於 毒性之關係，即毒性： Ethyl iodoacetate(4)＞Ethyl bromoacetate(3)＞Ethyl chloroacetate(2)，電負度：Cl > Br > I 。在藻類毒性中，Ethyl fluoroacetate(1)
的毒性相當高，但其與榖胱甘肽（GSH）（RC50,50% Reactivity Concentration）幾乎不反應（於 50000ppm 下無抑制），推測其高毒性應不 來至於其親電性，此化學物應屬於不同毒理機制 ，將於 5.6 節進行更詳 細的說明。 2. 當相同鹵素鍵結之碳上接上其他碳氫鍊，則因空間位阻使得毒性有以下 之關係：
Ethyl bromoacetate(3) Ethyl-2-bromopropionate(8) Ethyl-2-di-bromoisobutyrate(10)
由此推斷，隨著鹵素被碳氫鍊包圍的程度越大，空間位阻越大，毒性越小。
表 5.1.1 鹵素取代酯類之相關毒性數據
NO Chemical 化學式 Log Kow 文獻
RC50(mM)
文獻 IGC50(mM)
RC50(mM) △DO (mM) FY (mM) GR(mM)
1 Ethyl fluoroacetate O=C(OCC)CF 0.80 NR a >2.5 a NR 2.28E-04 5.10E-05 7.61E-04
2 Ethyl chloroacetate O=C(OCC)CCl 0.94 3.060a 0.088 a 1.891 5.15E-04 6.25E-04 5.86E-04
3 Ethyl bromoacetate O=C(OCC)CBr 1.21 0.086 a 0.002 a 0.062 3.00E-05 2.10E-05 4.30E-05
4 Ethyl iodoacetate O=C(OCC)CI 1.62 0.029 a 0.001 a 0.059 1.50E-05 1.30E-05 2.10E-05
5 Methyl bromoacetate O=C(OC)CBr 0.72 0.067 a 0.011 a 0.066 4.60E-05 3.80E-05 5.70E-05
6 Methyl 3-bromopropionate O=C(OC)CCBr 1.21 8.626 a 0.094 a 6.786 7.36E-01 4.11E-01 7.40E-01
7 Methyl 2-bromopropionate O=C(OC)C(Br)C 1.13 1.500 a 0.066 a 1.290 1.81E-03 2.26E-03 7.90E-03
8 Ethyl-2-bromopropionate O=C(OCC)C(Br)C 1.63 1.700 c 0.088 c 1.693 1.08E-03 5.70E-04 1.39E-03
9 Methyl 2-bromobutyrate O=C(OC)C(Br)CC 1.63 3.535 a 0.095 a 4.778 1.13E-02 9.32E-03 1.27E-02
10 Ethyl-2-di-bromoisobutyrate O=C(OCC)C(Br)(C)C 2.08 ND 0.708 b 128.1 7.38E-02 1.06E-01 1.83E-01
11 Tert-Butyl bromoacetate O=C(OC(C)(C)C)CBr 2.08 0.085 a 0.004 a 0.109 1.05E-04 8.50E-05 1.45E-04
12 Ethyl dibromoacetate O=C(OCC)C(Br)Br 1.48 ND ND 0.943 4.23E-04 4.55E-04 6.89E-04
13 Ethyl tribromoacetate BrC(Br)(Br)C(=O)OCC 2.49 ND ND 0.032 6.40E-04 7.45E-04 1.98E-03
14 Ethyl-2,3-di-bromopropionate O=C(OCC)C(Br)CBr 1.97 ND 0.006 b 0.053 6.27E-04 3.74E-04 7.74E-04
a
： Data from TW.Schltz et al., 2007[1]. ; b
： Data from DeWeese AD et al[2]., 2001.c
： Data from David W. Roberts et al., 2010[41]
但如果所鍵結的碳氫鍊不以包圍之形式鍵結於鹵素鍵結之碳上，則空 間位阻對於毒性的影響則較有限：
Methyl bromoacetate(5) Methyl 2-bromopropionate(7) Methyl 2-bromobutyrate(9) 以上可以得知連接一個甲基或連接一個乙基對於空間位阻的影響相似，
兩者間的毒性數據相近。
3.當碳氫鍊鍵結位置位於鹵素鍵結之碳的另一邊，空間位阻的影響並不明 顯，三者藻類毒性相似：
Methyl bromoacetate(5) Ethyl bromoacetate(3) Tert-Butyl bromoacetate(11)
4.當鹵素所連接的碳較遠離拉電子基，羰基（拉電子基）對於鍵結鹵素之 碳的電子雲密度的影響會下降，使得毒性下降：
Methyl bromoacetate(5) Methyl 3-bromopropionate(6)
≌
≌
>
5.當鹵素數目增加成兩個時，毒性下降：
Ethyl bromoacetate(3) Ethyl-2,3-di-bromopropionate(14) 羰基（拉電子基）對於鹵素鍵結之碳的電子雲影響被兩組鹵素-碳所稀
釋，使得 SN2 親核性取代反應相對較弱，毒性因此下降[45]。
3. 當鹵素數目增加成二至三個時，在毒性上的影響較無規則：
Ethyl bromoacetate(3) Ethyl dibromoacetate(12) Ethyl tribromoacetate(13) 推測原因為鹵素將碳包圍，碳被大量電子圍繞，使其對親核詴劑的吸
引力減弱，親核詴劑不易與其發生 SN2 親核性取代反應，毒性因此下降
[42]。
>
5.2 急慢毒性比（Acute-Chromic Toxicity Ratio ; ACR）
在毒性詴驗中，由於慢毒性詴驗比急毒性詴驗需要更多的時間、物資 及人力。因此，現今大多利用外插法(extrapolation)得知毒物之毒性影響並 更進一步得知達到環境品質之標準。而固定的外插因子通常採用 10、100
或 1000 應用到可獲得的 EC50或 LC50以求得最大可接受的危害等級。而急
慢毒性比值(Acute –chronic toxicity ratio)即是經由此而發展出來的。
ACR=Acute toxicity/Chronic toxicity 之比值，由表 5.2.1 可知，以 EC10
計算出之結果，ACR 值大約都介於 2~7 之間。比較三個不同的終點，化學 物彼此之間的 ACR 的比值趨勢大致上是很接近的，除了 Ethyl
fluoroacetate(1)之外，以△DO 為反應終點時，主要以 Methyl
2-bromopropionate(7)、Ethyl-2-bromopropionate(8)值較高，以 Final yield 為 反應終點時，主要以 Methyl 2-bromopropionate(7) 、Ethyl chloroacetate(2) 值較高，以 Growth rate 為反應終點時，主要以 Methyl 2-bromopropionate(7)、 Ethyl bromoacetate(3)值較為偏高。Ethyl fluoroacetate(1)ACR 值很大，可能 原因為實驗過程的毒化物濃度選取不夠嚴謹，選用的濃度造成的毒性皆高，
所以無法模擬出合適之 EC10。
在本研究中，以△DO 為反應終點去掉 Ethyl fluoroacetate(1)後之 ACR 帄均值為 5.06。以 Final yield 為反應終點去掉 Ethyl fluoroacetate(1)後之 ACR 帄均值為 4.31。以 Growth rate 為反應終點去掉 Ethyl fluoroacetate(1) 後之 ACR 帄均值為 6.48。若將各化學物之三個終點之 ACR 值，皆取最大 值，去掉 Ethyl fluoroacetate(1)後所得之藻類毒性 ACR 帄均值 7.61。在不 考慮 Ethyl fluoroacetate(1)的情況下，若以 ACR 帄均值作為用來評估化學 物之慢毒性，選用 7.61 為較保險的。若以較嚴謹的立場來評估慢毒性，在 不考慮 Ethyl fluoroacetate(1)的情況下，ACR 值以 15 最為保險，95%的化 學物的 ACR 值在 15 以下。
![圖 2.2.1 QSAR 之分類[17] 2.2.3 二維定量構效關係 二維定量構效關係方法是將分子整體的結構性質作為參數，對分子生 理活性進行回歸分析，建立化學結構與生理活性相關性模型。 2.2.4 活性參數 活性參數是構成二維定量構效關係的要素之一，人們根據研究的體系 選擇不同的活性參數，常見的活性參數有：半數有效量、半數有效濃度、 半數抑菌濃度、半數致死量、最小抑菌濃度等，所有活性參數均必頇採用 物質的量（莫爾）作為計量單位，以便消除分子量的影響，從而真實地反 應分子水帄的生理活性。為了獲得](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/9libinfo/8114684.165668/19.892.212.681.107.755/將分子析建立們根據研究的體系選擇不同活性物質除分子量應分子.webp)
