利用定量血小板上GPIIB/IIIA接受器結合來探討維生素B6抗血小板凝集機制

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(1)行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告利用定量血小板上 GPIIb/IIIa 接受器結合來探討維生素 B6 抗血小板凝集機制. Study on the antiplatelet aggregation of vitamin B6 by quantifying GPIIb/IIIa receptor binding. 計畫編號：NSC89－2320－B006－144 執行期限：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日主持人：張素瓊國立成功大學生物學系計畫參與人員：陳建文國立成功大學生物學系一、中文摘要. Abstract. 維生素 B6 的輔酉每形式，磷酸比哆醛 (pyridoxal-5-phosphate, PLP)，在體內與體外系統均被發現具有抑制動物或人的血小板凝集作用。本研究室研究發現，PLP 可與血小板膜上 GPIIb/IIIa 接受器結合而抑制纖維蛋白原(fibrinogen)與 GPIIb/IIIa 的結合。然而，PLP 與 GPIIb/IIIa 結合對血小板凝集的影響則未知，因此，本研究利用流式細胞儀來直接定量血小板上 GPIIb/IIIa 接受器與不同濃度之四種維生素 B6 (PN,PL,PLP,PM)結合的動力學，並探討不同濃度、不同型式之維生素 B6 對血小板膜蛋白 GPIIb/IIIa 的結合及其與血小板凝集之關係。結果顯示，四種維生素 B6 (PLP、 PL、PN、 PM)均會與 GPIIb、GPIIIa 或 GPIIb/IIIa 結合。不同濃度 PLP、PL、PN 及 PM 處理下，四種維生素 B6 結合 GPIIb、 GPIIIa、GPIIb/IIIa 與血小板凝集反應均呈負相關(r=-0.83~-0.94，P<0.000001)，顯示隨著維生素 B6 與 GPIIb/IIIa 結合越多，血小板凝集越少。本研究結論，由動力學顯示四種維生素 B6 對 GPIIb 及 GPIIb/GPIIIa 親和力 (Kd)為 PLP ＞PN＞PM ＞ PL，對 GPIIIa 親和力為 PLP＞PN＞PL＞PM。四種維生素 B6 與 GPIIb、GPIIIa、GPIIb/IIIa 接受器結合亦呈現相同結果。由此推測四種維生素 B6 抑制血小板凝集的能力為 PLP＞ PN＞PM＞PL。. VitaminB6, in the coenzyme form of pyriodoxal-5-phosphate (PLP), has been found to inhibit in vitro and in vivo animal and human platelet aggregation. Studies in our laboratory indicated that PLP could bind to GPIIb/IIIa receptor leading to the prevention of fibrinogen binding to GPIIb/IIIa. However, the occupancy of GPIIb/IIIa by PLP in relation to the platelet aggregation is still unknown. Therefore, this study was carried out to quantify GPIIb/IIIa binding in platelets treated with various dose and forms of B6 vitamers (PLP; pyridoxal, PL; pyridoxine, PN; pyridoxamine, PM), using antibody-base assay, by flow cytometry. The antibody-binding was compared with inhibition of platelet aggregation. The results showed that GPIIb, GPIIIa and GPIIb/IIIa complex were occupied by all tested B6 vitamers (PLP, PL, PN, PM). Occupancy of receptors by four B6 vitamers was negatively correlated with the platelet aggregation (r=-0.83~-0.94, P<0.000001) indicating the decreased platelet aggregation resulting from the binding of B6 vitamers to GPIIb/IIIa receptor. In conclusion, the affinity of B6 vitamers for GPIIb, GPIIIa and GPIIb/IIIa complex were PLP>PN>PM>PL, PLP>PN>PL>PM and PLP>PN>PM>PL, respectively. We suggested that the potency of B6 vitamers against platelet aggregation were PLP>PN>PM>PL.. 關鍵詞：GPIIb/IIIa、維生素. B6、親和力、凝. 集反應. Keywords：GPIIb/IIIa,. VitaminB6, affinity, aggregation. 1.

(2) 二、緣由與目的. 即鄰近血小板上 GPIIb/IIIa 接受器交叉結合所造成的凝集現象在接受器被非 Fibrinogen 物質結合<30﹪至 50﹪時不會受影響（13），當接受器被非 Fibrinogen 物質結合超過 80﹪時，縱然仍有未結合的接合受器存在，凝集現象可能完全被抑制 (14) 。研究顯示，不同的 agonists 造成 GPIIb/IIIa 活化的動力學不同，使得 GPIIb/IIIa 與 fibrinogen 的結合率也不同，因此可能使得 GPIIb/IIIa 在強的 agonist (如 thrombin)活化下，即使有 GPIIb/IIIa 拮抗劑存在，也會使 GPIIb/IIIa 與 fibrinogen 結合，造成拮抗劑抑制血小板凝集效果不顯著 (15)。此外，一些 GPIIb/IIIa 的拮抗劑並不會抑制血小板的活化作用，反而有增強的分子層次上，PLP 會抑制 GPIIb 的基因表效果，推測不同的機制調節血小板的活化現（4）。在血小板受不同 agonists 刺激引 (16)。口服抗血小板凝集抑制劑目前尚在研起的反應中，以 ADP 誘發性反應在血液恆發階段，希望可利用 GPIIb/IIIa 拮抗劑來長定與血栓症最為重要（5, 6）。本研究室一期治療冠狀動脈疾病(17)，然而，這些口服系列對維生素 B6 抗血小板凝集機制的探討的 GPIIb/IIIa 拮抗劑 ( 如 xemilofiban, 發現， PLP 可能透過抑制血栓素 sibrafiban 及 orbofiban)長時間使用可能會 (Thronboxane A2)的生成(2)，降低胞內鈣離造成死亡率增加及心肌梗塞的危險子濃度（7），與增加胞內 c-AMP 濃度（8） (18,19)，此外，長時間使用口服 GPIIb/IIIa 的途徑來抑制血小板凝集；也可能透過抑拮抗劑會使得出血性併發症的危險率增加制血小板膜蛋白 GPⅡb 啟動子活性（4），兩倍，其中包括顱內出血等，在短期治療降低 GPⅡb 在血小板表面的表現，因而抑或許不會引發出血，但長期的給藥會增加制凝集。本研究室最近的研究發現，PLP 出血的危險性(20)。因此，本研究利用流式可與血小板上四個膜蛋白結合，其中 123 細胞儀直接定量不同濃度，不同型式維生 kDa 蛋白可能是 GPIIb，105 kDa 蛋白可能素 B (PN， PL，PM 與 PLP)對血小板 6 是 GPIIIa，此外，PLP 與 GPIIb/IIIa 作用會 GPIIb/IIIa 接受器的結合，並探討 GPIIb/IIIa 抑制纖維蛋白原(Fibrinogen)與 GPIIb/IIIa 接受器結合與血小板凝集之關係，以瞭解的結合（9），而 GPIIb/IIIa 是血小板膜上將維生素 B 當作 GPIIb/IIIa 拮抗劑，應用 6 引起血小板凝集的主要接受器 (10)，當於預防或治療血小板血栓症的可行性。 Fibrinogen 結合到 GPIIb/IIIa 上會導致血小板凝集(11, 12)。因此， PLP 結合到血小板三、結果與討論未經四種維生素 B6 處理之血小板，膜蛋白 GPIIb/IIIa 上，會阻礙 Fibrinogen 交叉結合 (cross-linking) 鄰近的血小板膜上抗體所標定到的 GPIIb、GPIIIa、GPIIb/IIIa 血小板系統與血液凝固系統在血管血栓症的病理上佔著重要的角色，而血小板血栓症常併發心臟、腦血管疾病或腎臟疾病，糖尿病亦會併發血管血栓症，因此，安全的抗血小板物質之研究與開發是非常重要的。維生素 B6 以磷酸口比哆醛 (pyridoxal-5-phosphate, PLP)型式，在體外與體內系統均被發現具有抑制動物或人的血小板凝集作用，因此被建議可用來當作抗血栓物質（1）。本研究室先前的研究發現，PLP 生理上可抑制多種致凝物所引發的血小板凝集及延緩血液凝固（2）；細胞學上，PLP 可改變血小板膜上引起凝集的主要醣蛋白 GPIIb/IIIa 的構形變化（3）；. 接受器分別約為 6~8、4~5、12~14 萬個。 PLP、PL、PN、PM 與 GPIIb 結合的解離常數(Kd, dissociation constant)分別為 1.44±. GPIIb/IIIa，而抑制血小板凝集。然而，血小板凝集現象在其接受器被非 Fibrinogen 物質結合很高或很低情況下變得不敏感， 2.

(3) 於醛基附近，能在質子轉移的同時提供及接受質子，增加 å-胺基和醛基間 Schiff base 的形成，因此其反應比 PL 快(22)。至於 PN 與 PM 可能非經由形成 Schiff base 與 GPIIb/IIIa 鍵結。PN 苯環上(C−4’)的羊巠基 (OH)與 GPIIb/IIIa 接受器上胺基酸的羧酸 (COOH)可能形成共價鍵而鍵結，PM 苯環上(C−4’)的胺基(NH2)則可能與胺基酸上的羧酸(COOH)形成醯胺基(amides)，具有強的氫鍵結合力。這些不同的鍵結能力可能造成對 GPIIb/IIIa 接受器親和力的不同，需進一步實驗加以證實。另外，維生素 B6 與 GPIIb/IIIa 分子間的作用也與接受器構型所形成胺基酸袋( binding pocket)有關。因此推測維生素 B6 與 GPIIb/IIIa 的結合可能與 GPIIb/IIIa 四級結構之構型有關(23,24)。維生素 B6 結合 GPIIb/IIIa 與血小板凝集呈現負相關，顯示隨著維生素 B6 結合 GPIIb/IIIa 越多，血小板凝集越下降。PLP ≦0.6 mM、PL≦3 mM、PN≦1.8 mM、PM 在≦3 mM 時，與 GPIIb、GPIIIa 及 GPIIb/IIIa 的結合均＜30 %，與血小板凝集對照發現凝集不受影響，此結果與前人研究結果相似(13)。PLP≧3 mM、PL 30 mM、PM≧3 mM 時與 GPIIb、GPIIIa 及 GPIIb/IIIa 的結合及 PN 在 6 mM 與 GPIIIa 的結合均接近或＞80 %，而血小板凝集減少均接近或＞ 70 %，顯示有大量減少血小板凝集之作用，此結果雖與前人發現接受器被結合＞ 80%時，縱然仍有未結合之接受器存在，血小板凝集則完全被抑制(14)的結果不盡相同，但仍顯示接受器被大量結合時，血小板凝集也下降許多。. 0.45、31.82±17.39、3.27±1.55、10.67± 2.30 mM，與 GPIIIa 分別為 1.36±0.61、4.47 ±2.58、2.85±1.43、6.02±2.36 mM，與 GPIIb/IIIa 分別為 1.83 ± 1.15 、 19.43 ± 7.86、3.63±1.67、10.89±2.93 mM。PLP 與 GPIIb 的結合在≧0.6 mM 為劑量依賴性（ dose-dependent ）； IC50 ﹦ 1.59 ± 0.24 mM，且在 3 mM 時達最大結合。PLP 與 GPIIIa 及 GPIIb/IIIa complex 的結合在 1.8 mM 時有閾值限制。PL 與 GPIIb、GPIIb/IIIa complex 的結合在≧6 mM 時為劑量依賴性；IC50 分別為 11.76±0.50 mM 及 5.85± 0.20 mM，且在 30 mM 時達最大結合。PL 與 GPIIIa 的結合在 1.8 mM 時有閾值限制。 PN 與 GPIIb 、 GPIIIa 及 GPIIb/IIIa complex 的結合在 3 mM 時有閾值限制。PM 與 GPIIb、GPIIb/IIIa complex 的結合為劑量依賴性；IC50 分別為 28.14 ±15.84 mM 及 28.94 ±3.36 mM，且在 30 mM 時達最大結合。但對 GPIIIa 結合 6 mM 時有閾值限制。不同濃度 PLP、PL、PN 及 PM 處理下，四種維生素 B6 結合 GPIIb 、 GPIIIa 、 GPIIb/IIIa 與血小板凝集反應均呈負相關 (r=-0.83~-0.94，P<0.000001)，顯示隨著維生素 B6 與 GPIIb/IIIa 結合越多，血小板凝集越少。動力學顯示四種維生素 B6 對 GPIIb 及 GPIIb/GPIIIa 親和力(Kd)為 PLP＞PN＞ PM＞PL，對 GPIIIa 親和力為 PLP＞PN＞ PL＞PM。GPIIb 與 GPIIIa 須形成 complex 才能與 fibrinogen 結合，具有生理活性，因此推測維生素 B6 與 GPIIb/IIIa 結合的能力為 PLP＞PN＞PM＞PL。維生素 B6 與 GPIIb/IIIa 結合能力的不同可能是 PLP、PL、PM、PN 結構不同所造成。以 PLP 及 PL 比較(21)，PL 因自身容易形成半縮醛（hemiacetal），不易與受質形成 Schiff base，而由於磷酸基團可當作質子的提供者及受質，所以不論結合態或游離態的磷酸系統皆能提高 Schiff base 的形成，其中 PLP 上的醛基，由於磷酸根位. 四、計畫成果自評. 部分研究成果發表於下列相關學術會議： 1. 張素瓊、陳建文、張佐維，第十六屆生物醫學聯合學術年會， Abstract book:159。五、參考文獻 3.

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