活血化瘀中藥對斑馬魚胚胎的影響 -以三稜、莪朮、水蛭為例

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(1)國立臺中教育大學科學教育與應用學系碩士論文. 指導教授：陳麗文博士. 活血化瘀中藥對斑馬魚胚胎的影響 -以三稜、莪朮、水蛭為例 The effect of the Traditional Chinese herbs for promoting blood circulation and eliminating stasis on zebra fish embryo - such as the Zedoaria rhizome, Sparganii rhizome and Hirudo nipponica Whitman. 研究生：周柏肇撰. 中華民國一○四年一月.

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(4) 謝辭. 論文完成了，碩士生涯也將要告一個段落，在這路程中有許多人陪伴，感謝你們。完成這本論文，首先要感謝的指導教授，在研究的過程給予建議及尋找資源，並仔細的審閱論文中的不足。再來，感謝我的口試委員駱明潔老師及林麗娟老師，細心的檢閱我的論文，發現我文章中的不足、給予改進的方向及建議。因為有你們我的論文才能完善。在研究生涯中，感謝所上的所有教師，感謝你們在課堂上的分享及平時的協助，讓我在研究生涯有除研究主題外的其他啟發。還有共同學習夥伴們，桓翊、建偉、鈺惠、怡坊、尚毅、禾弁、仲軒、惟正、紫君、薇棋、家美......等人。在實驗上，感謝實驗室的郁瑄、姿伶、至容、懿萱、韋岑、峻銘、俐心、建偉、鈺惠、建棠……等曾經或現在的夥伴共同維護實驗室的運作，讓實驗能順利進行。也感謝鍾國棟老師、林麗娟老師、王舜德醫師、陳錦章老師、白子易老師.….. 等協助過我解決實驗問題的老師，讓我的實驗能順利進行。研究路程上，還有許多幫助過我的人，無法陳列，由衷的感謝你們。最後感謝我的父母和兄弟，感謝你們在經濟和精神上的支持，有你們的支持，這個學習的路程才能走完，開闊的未來還要繼續走下去。引用陳之藩的話：「因為要感謝的人太多了，那就謝天吧！」謝謝陪我走過這段路的每一個人。. 周柏肇國立台中教育大學. 科學教育與應用學系. 謹誌於. 科學教育碩士班. 中華民國一 O 四年一月.

(5) 摘要. 活血化瘀中藥是妊娠禁忌中藥的一種，其中三稜、莪朮、水蛭被認為有抗早孕的作用。透過文獻探討，我們認為活血化瘀藥妨礙妊娠的原因乃是胚胎受藥物影響而導致死亡或畸形，本研究旨在證明此一假說成立。本研究以斑馬魚胚胎為模式生物，從藥物濃度反應及加藥時間點兩方面分別觀察發育指標：胚胎的孵化率、死亡率及發育狀況。研究結果顯示：（1）雖然加入的水蛭濃度高至 1g/L，但水蛭對於胚胎發育並無影響；（2）在胚胎發育初期（0 小時）給予濃度高於 2.925 g/L 的莪朮則表現出孵化率下降 50%以上，96 小時觀察死亡率 50%以上；（3）在胚胎發育初期（0 小時）給予濃度高於 4.5g/L 的三棱則表現出孵化率下降，死亡率達 50%以上；（4）在發育初期(0 小時)及造血期(24 小時)分別加入莪朮及三稜會增加斑馬魚胚胎死亡的情形；（5）在造血期(24 小時) 分別加入莪朮及三稜也會造成孵化率延遲，且在兩組實驗中皆有發現心包膜膨脹的情形。由上述結果，我們證實三稜、莪朮二味活血化瘀藥妨礙妊娠的原因，乃是胚胎受藥物影響而導致死亡或畸形。這兩種藥導致孵化率降低及死亡的原因可能是影響胚胎血液循環系統的發育。. 關鍵詞：三稜、水蛭、活血化瘀中藥、胚胎發育、斑馬魚、莪朮. I.

(6) Abstract. Traditional Chinese herbs for promoting blood circulation and eliminating stasis are included in contraindicated Chinese Medicine during pregnancy. The Zedoaria rhizome, Sparganii rhizome and Hirudo nipponica Whitman are in this category, and they are regarded as a termination of early pregnancy. According to the literature, we made a hypothesis that the death and the deformity of the embryos are caused by the influence of the traditional Chinese herbs for promoting blood circulation and eliminating stasis. Therefore, the purpose of our research is to prove that our hypothesis is true. We used zebra fish embryo as our animal model and observed three indicators, the hatch rate, the death rate and the development of the embryos respectively by two aspects, the reactions to different concentration of drug and the different time to add drug. The research shows that: (1) though the concentration of Hirudo nipponica has been increased to 1000ppm, it has no effect on the embryos. (2) Add Zedoaria rhizome with the concentration greater than 2925ppm to the embryos at the primary development stage (0 hour after fertilization) can cause the hatch rate decreases over 50% and the 96 hour death rate will be greater than 50%. (3) Add Sparganii rhizome with the concentration greater than 4500ppm to the embryos at the primary development stage (0 hour after fertilization) can cause the hatch rate decrease and the death rate over 50%. (4) Both adding Zedoaria rhizome at the primary development stage (0 hour after fertilization) and adding Sparganii rhizome at hematopoiesis of embryonic phase (24 hours after fertilization) can enhance the situation of zebra fish embryos’ death. (5) Both adding Zedoaria rhizome and adding Sparganii rhizome at hematopoiesis of embryonic phase (24 hours after fertilization) can cause the postponement of hatch, and both of the two groups of experiment have shown. II.

(7) the situation of pericardium expanding. According to the result above, we have proved that the reason that Zedoaria rhizome and Sparganii rhizome can interrupt the process of pregnancy is because the effects on the embryos cause death or deformity. And the reason of both these two Chinese medicines cause the decrease of the hatch rate and cause death may be the influence on the development of embryos’ system of blood circulation.. Key Words: Development, Embryo, Hirudo nipponica Whitman, Sparganii rhizome, Traditional chinese herbs for promoting blood circulation and eliminating stasis, Zedoaria rhizome, Zebrafish. III.

(8) 目錄. 摘要................................................................................................................................................... I Abstract............................................................................................................................................. II 目錄................................................................................................................................................ IV 圖目錄 .......................................................................................................................................... VII 表目錄 ........................................................................................................................................... IX 第壹章、緒論 ................................................................................................................................. 1 第貳章、文獻探討......................................................................................................................... 3 2.1 活血化瘀中藥 ....................................................................................................................... 3 2.1.1 活血止痛 ....................................................................................................................... 3 2.1.2 活血調經 ........................................................................................................................ 3 2.1.3 活血療傷 ....................................................................................................................... 4 2.1.4 破血消髒 ....................................................................................................................... 4 2.2 莪朮、三稜及水蛭的藥性 .................................................................................................. 6 2.2.1 莪朮 ................................................................................................................................ 6 2.2.2 三稜 ................................................................................................................................ 8 2.2.3 水蛭 ................................................................................................................................ 9. IV.

(9) 2.3 斑馬魚 ..................................................................................................................................10 第參章、實驗材料與方法 ...........................................................................................................12 3.1 動物準備 ..............................................................................................................................12 3.2 藥品配製 ..............................................................................................................................13 3.3 實驗設計 ..............................................................................................................................16 3.3.1 藥物濃度對斑馬魚胚胎的影響..................................................................................16 3.3.2 不同時間點給藥對斑馬魚胚胎發育的影響 .............................................................17 3.4 胚胎反應指標 ......................................................................................................................17 3.5 統計方法 ..............................................................................................................................18 第肆章、結果 ................................................................................................................................19 4.1 藥物濃度對斑馬魚胚胎的影響.........................................................................................19 4.1.1 0 小時加入不同濃度的藥物對於斑馬魚胚胎孵化率的影響 .................................19 4.1.2 在 0 小時加入不同濃度的藥物對於斑馬魚胚胎死亡率的影響 ..........................22 4.2 不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎發育的影響................................................................26 4.2.1 在不同時期加入莪朮對斑馬魚胚胎發育的影響 ....................................................26 4.2.2 三稜在不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎發育的影響 ............................................31 4.2.3 水蛭在不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎發育的影響 ............................................34 4.3 斑馬魚胚胎型態上影響.....................................................................................................39. V.

(10) 第伍章、討論 ................................................................................................................................43 參考文獻 ........................................................................................................................................45. VI.

(11) 圖目錄. 圖 3-1 產卵盒 ................................................................................................................................13 圖 3-2 24 孔盤 ................................................................................................................................13 圖 3-3 不同藥物濃度對斑馬魚胚胎的影響 ..............................................................................16 圖 3-6 給藥時間點與觀察時間點示意 ......................................................................................17 圖 4-1-1 0 小時投予莪朮對斑馬魚胚胎孵化率的影響 .........................................................20 圖 4-1-2 三稜 0 小時加藥對斑馬魚胚胎孵化率的影響 ..........................................................21 圖 4-1-3 水蛭 0 小時加藥對斑馬魚胚胎孵化率的影響 ..........................................................22 圖 4-1-4 莪朮 0 小時加藥對斑馬魚胚胎死亡率的影響 ..........................................................23 圖 4-1-5 三稜 0 小時加藥對斑馬魚胚胎死亡率的影響 ..........................................................24 圖 4-1-6 水蛭 0 小時加藥對斑馬魚胚胎死亡率的影響 ..........................................................25 圖 4-2-1 在不同胚胎發育時期加入 0.975 g/L 莪朮對斑馬魚胚胎孵化率的影響................27 圖 4-2-2 在不同胚胎發育時期加入 1.950g/L 莪朮對斑馬魚胚胎孵化率的影響.................28 圖 4-2-3 在不同胚胎發育時期 2.925g/L 莪朮對斑馬魚胚胎孵化率的影響 .........................29 圖 4-2-4 在不同胚胎發育時期加入 3.900g/L 莪朮對斑馬魚胚胎孵化率的影響.................29 圖 4-2-5 莪朮在不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響 .........................................30 圖 4-2-6 三稜在不同時期加入 1.5g/L 藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響 .............................31. VII.

(12) 圖 4-2-7 三稜在不同時期加入 3.0g/L 藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響 .............................32 圖 4-2-8 三稜在不同時期加入 4.5g/L 藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響 .............................32 圖 4-2-9 三稜在不同時期加入 6.0g/L 藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響 .............................33 圖 4-2-10 三稜在不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響 ........................................34 圖 4-2-11 水蛭在受精後 0 小時不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎孵化率的影響 ..............35 圖 4-2-12 水蛭在受精後 12 小時不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎孵化率的影響 ............36 圖 4-2-13 水蛭在受精後 24 小時不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎孵化率的影響 ............37 圖 4-2-14 水蛭在受精後 48 小時不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎孵化率的影響 ............38 圖 4-2-15 水蛭在不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響 .......................................39 圖 4-3 斑馬魚胚胎受藥物影響後的形態變化 ..........................................................................41. VIII.

(13) 表目錄. 表 2-1 活血化瘀藥的分類 ............................................................................................................. 4 表 2-2 活血化瘀藥的藥理作用 ..................................................................................................... 5 表 2-3 莪朮相關研究 ..................................................................................................................... 7 表 2-4 斑馬魚發育階段 ................................................................................................................10 表 3-1 藥劑濃度與生藥濃度對照...............................................................................................14 表 3-2 以體重標準(mg/kg)和體表面積標準(mg/m2)的比較.....................................................15 表 3-3 斑馬魚與人體用藥劑量轉換表 ......................................................................................15. IX.

(14) 第壹章、緒論品質不好的胚胎和不好的子宮內膜都是造成懷孕早期胚胎著床失敗的原因(Diedrich, et al., 2007; Evans, et al., 2012; Urman, et al., 2005; Weimar, et al., 2013)。造成流產的原因有胎兒染色體異常、凝血功能異常、免疫機能異常、子宮構造畸形、內分泌異常、發炎感染…… 等其他原因。流產若發生在妊娠期 12 周內，約 85%與胎兒畸型有關；13～20 周妊娠時的流產，可能與母親本身因素如內分泌功能失調、生殖器疾病、母體全身性疾病等有關（毛慧芬，2008）。若是母親在懷孕期間，誤用藥物或是環境毒物的影響，也會引起胚胎發育的問題，因而造成畸胎、死胎或流產。例如沙利竇邁曾經作為抗妊娠反應藥物在歐洲和日本廣泛使用，投入使用後不久，即出現了大量由沙利竇邁造成的海豹肢症（Phocomelia）畸形胎兒。藥物對胎兒的影響程度，主要取決於藥物的性質、劑量、服藥時間長短、毒性的強弱、胎盤的滲透性以及胎兒對藥物的敏感性等因素。許多藥物可通過胎盤進入胎兒體內，有鑑於孕婦用藥的困擾，美國藥物食品管理局(FDA)於 1962 年規定，凡新藥上市前須完成致畸胎試驗；1980 年又規定藥物須標示「使用於孕婦之安全性說明」。除此之外，更將藥品依其對胎兒的安全性分為 A、B、C、D、X 五個等級，並說明其機轉，以提供醫師用藥上的判斷依據。A 級為具良好及足夠的研究顯示對孕婦及胎兒無傷害的藥物； B 級為動物實驗不能證明對胎兒有危險性，但對孕婦尚未充分研究；或是動物實驗對胎兒有不良作用，但對孕婦無法證明有危險性。；C 級為動物實驗顯示對胎兒有危險性，但對孕婦尚未充分研究；或是對動物及婦女均無研究資料，其安全性未知。D 級為有研究顯示對人類孕婦或胎兒有害，但在疾病已危及生命或無法以其他較安全的藥物有效控制嚴重病情時，仍可考慮使用。X 級為確定對孕婦有害或造成胎兒異常，禁止使用(U.S. General Accounting Office, 2008)。在中醫的用藥上，也有所謂的妊娠禁忌用藥。其禁用的原因多為部份的藥材可能會造成流產、懷胎不穩等胎動的情形。但目前其生理病理機轉並不清楚，多以用藥經驗、古籍記錄來判斷用途，且大部分探討母體，鮮少論及胎兒。又因驗方的來源及使用份量等關係，在古籍上會發現對於藥物的使用常有相反的註記，例如半夏在《本草綱目》將它列為禁忌中藥，但《金匱要略》卻記載可治孕吐。活血化瘀藥在中醫的婦科使用時屬於禁用或慎用藥，活血化瘀藥是指有通利血脈、促進血行、消瘀散血效用的藥材(臧堃堂，2005)，此類藥材可以改善血液循環、去除或防止血栓(鄧哲明，2004)。三稜、莪朮及水蛭皆屬於活血化瘀藥中的破血藥，三者常用來治療癥瘕，癥瘕指的是腹部積塊，為產後婦女為子宮殘留物。例如《醫學衷中參西錄》的論女子瘕治法篇章內的醫案中，在治療產後瘕的藥方中就同時使用了三種藥（三稜、莪朮及水蛭）。其中水蛭及三稜在《本草經疏》中皆有提及有墮胎作用，莪朮雖未提及， 1.

(15) 但其常與三稜並用。近年來，也有一些研究三稜、莪朮及水蛭對模式動物胚胎的影響，但其中有部分研究結果不同，例如黃超培等人(2011)的研究發現水蛭素凍乾粉對大鼠胚胎無毒性，但在另一篇研究發現會造成斑馬魚胚胎尾部畸形(Jagadeeswaran, Liu, & Eddy, 1997)，這可能是兩種實驗動物物種不同的影響。也有部分研究報告有劑量不明或不同研究者使用劑量差異很大的現象，例如三稜水溶液對小鼠胚胎的影響，Sun ,Wang,& Wei (2012)試驗的濃度為 500mg/kg 時，發現幼鼠有心臟發育遲緩、鼻腔型態異常、纖維細胞生長因子(Fibrolast growth factor 1, FGF-1)降低等症狀，而苗曉玲等人(2005)所用的濃度為 3~9g/Kg 造成流產率上升，兩者使用差異極大，這可能是因為中藥材的萃取或煎煮方式而造成藥效差異。前述的活血化瘀中藥研究多在哺乳類動物上實驗，其流產原因可能包含母體及胚胎的因素。我們認為活血化瘀藥妨礙姙娠的原因可能為胚胎受藥物影響造成死亡或畸形。為了排除母體的影響，本研究採用無胎盤的動物模式－斑馬魚胚胎。將三稜、莪朮及水蛭三種活血化瘀中藥，委託 GMP 藥廠代為製作品質穩定的中藥，並以相對於人體常用的藥物濃度為基準對斑馬魚胚胎進行試驗，觀察不同濃度及不同時期藥物對斑馬魚胚胎死亡率、孵化率及生理狀況等影響。. 2.

(16) 第貳章、文獻探討本章分別就活血化瘀中藥、莪朮、三稜及水蛭的藥性，以及斑馬魚的特性來探討。. 2.1 活血化瘀中藥活血化瘀藥是指有通利血脈、促進血行、消瘀散血效用的藥材(臧堃堂，2005)，此類藥材可以改善血液循環、去除或防止血栓(鄧哲明，2004)。本類藥多為平性或微寒、微溫之品，味多辛、苦。依其作用程度可分為和血、活血及破血。和血藥為補血、養血的藥，如當歸。活血藥為通行血脈、促進血行的藥，如紅花。破血為消瘀散血藥效較強者，如水蛭。侯家玉與方泰惠(2007)依其功用，將活血化瘀藥分為活血止痛、，活血止痛藥為具有活血、止痛作用的活血調經、活血療傷及破血消髒四類（表 2-1）藥物，如：川芎、延胡索、郁金、薑黃、乳香、沒藥……等；活血調經藥為具有活血、調經作用的藥物，如：丹參、紅花、桃仁、益母草、牛膝……等；活血療傷藥為具有活血、療傷作用的藥物，如：蟅蟲、血竭……等；破血消瘀藥為具有破血逐瘀、攻堅作用的藥物，如：莪朮、水蛭、斑蝥、三稜……等。. 2.1.1 活血止痛本類藥在傳統中醫上常用來活血及止痛，在現代藥理中也發現其中大部分的藥物具有鎮痛及擴張血管的功效。除了這些作用，此類藥各含有部分減緩症狀的功能，例如：川芎、胡延索可以鎮靜；川芎可以促進骨頭造血；胡延索可以抗潰瘍；鬱金可以利膽、降血脂、抑制腫瘤生長；乳香及五靈脂可以增加血管通透性及抗癌；乳香、沒藥、五靈脂可以止痛；末藥可以抗炎等。. 2.1.2 活血調經本類藥是指在用來活血及調經的藥，在現代藥理中其大部分具有增強子宮收縮或 3.

(17) 興奮子宮的功能，如：紅花、桃仁及雞血藤。此類藥材中也有其他的作用，如：丹參可以鎮靜、抗菌；紅花可以降血脂；桃仁可以潤腸緩謝、鎮咳、抗炎、抗過敏；雞血藤可以利尿、降壓等。. 2.1.3 活血療傷本類藥是指在醫療上用以活血及療傷的藥。在現代藥理中其具有鎮痛的功能，部分藥有其他功能，如：蟅蟲可以鎮咳、祛痰、抑菌、促進消化；蟅蟲、血蝎可以止痛等。. 2.1.4 破血消髒此類藥是指在醫療上用以破血逐瘀及攻堅功能的藥，攻堅是指削去或破除硬塊。在現代藥理中具有抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗腫瘤的功用，部分藥材被認為有抗早孕的作用，如：莪朮及水蛭。表 2-1. 活血化瘀藥的分類. 活血化瘀藥藥性. 多屬平性或微寒、微溫之品，味多辛、苦，主歸肝、心經，入血分。. 應用. 疏通血脈、祛除瘀血，治療血瘀症。. 種類. 活血止痛. 作用：活血、止痛. 川芎、延胡索、郁金、姜黃、乳香、沒藥. 活血調經. 作用：活血、調經. 丹參、紅花、桃仁、益母草、牛膝. 活血療傷. 作用：活血、療傷. 蟅蟲、血竭. 破血消髒. 作用：破血逐瘀、攻堅. 莪朮、水蛭、斑蝥、三稜. 整理自侯家玉與方泰惠(2007). 由於有些藥的作用跨過上述的分類，因此侯家玉與方泰惠(2007)認為藥物的分類可依藥理來分，例如：活血止痛藥中的延胡索、薑黃、乳香、沒藥及活血療傷藥中的 4.

(18) 蟅蟲、血竭可歸為鎮痛藥。他們將藥物分別依其影響血流動力學、抗血栓、改善微循環及特別作用等一一列表，更能表現不同藥物的特質(表 2-2)。. 表 2-2 活血化瘀藥的藥理作用分類. 活血止痛. 活血調經. 藥物. 血流動力學增加冠脈流量. 擴血管. 抑制血小板改善微聚集和抗血循環栓形成. 川芎. +. +. +. 延胡索. +. +. +. +. 其他作用. 鎮靜、促進骨頭造血鎮靜、鎮痛、抗潰瘍. 郁金. +. 利膽、降血脂、抑制腫瘤生長. 乳香. +. 鎮痛、增加血管通透性. 沒藥. +. 鎮痛、抗炎. 五靈脂. +. +. 鎮痛、增加血管通透性. 丹參. +. +. +. +. 鎮靜、抗菌. 紅花. +. +. +. +. 增加子宮收縮、降血脂. 桃仁. 興奮子宮、潤腸緩謝、鎮咳. 益母草. +. +. +. 雞血藤. +. +. +. 活血療傷. 蟅蟲血竭. +. 破血消髒. 三稜. +. +. 抗炎、抗過敏加強子宮收縮、利尿、降壓. +. 鎮痛、鎮咳、祛痰、抑菌、促進消化鎮痛. +. 抗腫瘤. 莪朮. +. 抗腫瘤、抗早孕、保肝、抗菌. 水蛭. +. +. 抗腫瘤、降血脂、抗早孕. 引自侯家玉與方泰惠(2007) 圖中加號”+”代表藥物具有該項特性，例如：乳香在擴血管處有加號，代表其有擴血管的作用. 5.

(19) 2.2 莪朮、三稜及水蛭的藥性莪朮、三稜、水蛭在活血化瘀藥中屬於藥性較強者，依用途皆為破血消髒藥，常被用以治療癥瘕，且在治療婦科疾病時，常會共同使用，如：《醫學衷中參西錄》的論女子瘕治法篇章中治療產後瘕的藥方，藥材有生黃耆、黨參、白朮、當歸、生山藥、三稜、莪朮、生雞內金、桃仁、紅花、生水蛭、虻蟲、小茴香。這三種藥皆被發現具有抗腫瘤的效果，其中莪朮及水蛭具有抗早孕用途。. 2.2.1 莪朮莪朮英文名為 Zedoaria rhizome，為蓬莪朮、廣西莪朮或溫鬱金枝乾燥根莖。成人每日用量為 6~9 克，相當於 0.1~1.5g/kg（行政院衛生署台灣中藥典編修小組，2013）。藥性為味辛、苦，性溫，歸肝、脾經。主要成分有龍腦（borneol）、大牛兒酮（germacrone）、莪朮醇（curcumol）、莪朮二酮（curdione）、薑黃素（curcumin）等及少量酚性成分和四甲基吡嗪（tetramethjlpjrazine）(侯家玉、方泰惠，2007)。在現代研究中發現莪朮有抗腫瘤、抗血栓形成、鎮痛、興奮胃腸平滑肌、保肝、抗早孕、抗菌、抗炎、抑制血管生成等功用(侯家玉、方泰惠，2007；陳梓樟等，1981；劉賢銘、毛春芹，2000； Zhong, Hoi, Wu, Xu, Tan, Chen, Cui, Wu, & Wang, 2012)(表 2-3)。在抗早孕的研究中，田麗莉、董建勇與黃長江（2010）使用斑馬魚生物模式研究中發現，莪朮醇能明顯降低胚胎孵化率，導致胚胎心跳率降低和魚體彎曲。陳梓樟等人(1981)用莪朮混懸液，相當於原生藥 15g/kg 給小鼠灌胃 4 天，可使抗著床組(妊娠 1~4 天給藥)與抗早孕組(妊娠 6~10 天)動物子宮內膜均無蛻膜化增厚，分泌期被抑制；抗早孕組胚胎發生退化，以致剝脫。侯家玉與方泰惠(2007)提到莪朮醇浸膏及其倍半萜化合物（sesquiterpenes）對大鼠、小鼠有顯著的抗早孕作用，對犬也有一定的抗著床效果，且毒性較小。 6.

(20) 由陳梓樟等人(1981)的研究可看出莪朮在小鼠研究中會導致流產，且原因可能為胚胎退化所造成。在哺乳類動物小鼠、大鼠及犬上，其主要成分中的莪朮醇具抗早孕、抗著床的作用，而在斑馬魚胚胎上，發現其會影響孵化率及發育異常(田麗莉、董建勇、黃長江，2010；侯家玉、方泰惠，2007）。由此可看出莪朮醇可能為造成胚胎發育不良的主要因子之一。而在小鼠的研究中雖然判斷為胚胎退化導致剝落，但同時小鼠的子宮內膜也發育不良，故無法確認是子宮內膜影響胚胎或是胚胎受藥物影響而造成退化。所以還需要用胚胎來做試驗確認對胚胎有無影響。. 表 2-3 莪朮相關研究效用. 研究. 出處. 抗血栓形成. 莪朮油對血栓形成的某些階段有影. 侯家玉與方泰. 響，可對抗由 ADP 和腎上腺素所誘導惠(2007) 的血小板聚集時間的延長，並認為此作用係由於薑黃素所引起。莪朮不同炮製品均有較強的抗血小板聚集及抗凝血作用，醋制后活血化瘀作用明顯增強。鎮痛. 採用小鼠扭體法、熱板法對莪朮不同劉賢銘與毛春炮製品進行鎮痛作用研究發現，莪朮芹(2000) 不同炮製品都有一定程度的鎮痛作用. 對胃腸平滑肌的影響. 莪朮對消化道的作用與生薑相似，能侯家玉與方泰直接興奮平滑肌，故可增加胃腸蠕動惠(2007). 保肝. 莪朮醇提物及揮發油對 CCl4 和硫代侯家玉與方泰乙酰胺引起的小鼠血清 ALT 升高有惠(2007) 明顯的降低作用，肝組織病變相應減輕。. 7.

(21) 表 2-3 莪朮相關研究(續) 出處. 效用. 研究. 抗早孕. 莪朮醇浸膏及其倍半萜化合物對大侯家玉與方泰鼠、小鼠有顯著的抗早孕作用，對犬惠(2007) 也有一定的抗著床效果，且毒性較小。莪朮混懸液，相當於原生藥 15g/kg 給陳梓樟等人小鼠灌胃 4 天，可使抗著床與抗早孕 (1981) 組動物子宮內膜均無蛻膜化反應，分泌期被抑制，胚胎發生退化，以致剝脫。. 抗菌、抗炎. 1.溫郁金揮發油試管內能抑制金黃色侯家玉與方泰葡萄球菌、β -溶血性鏈球菌、大腸桿惠(2007) 菌、傷寒桿菌、霍亂弧菌等生長。 2.小鼠灌服溫郁金揮發油 200mg/kg，對醋酸產生的腹膜炎有非常顯著的抑制作用；小鼠腹腔注射溫郁金揮發油 200mg/kg，對燙傷性局部水腫有明顯抑制作用；腹腔注射 100mg/kg，對巴豆油引起的耳部炎癥有明顯抑制作用。使用斑馬魚生物模式研究中發現, 莪田麗莉、董建勇朮醇能明顯降低胚胎孵化率，導致胚與黃長江胎心率降低和魚體彎曲。 (2010). 2.2.2 三稜. 三稜學名為 Sparganii rhizoma，英文名為 Common Burreed Rhizome，為植物黑三稜之乾燥塊莖。成人每日用量為 4.5~9 克，相當於 0.75~1.5g/kg(行政院衛生署台灣中藥典編修小組，2013)。性苦、辛，味平，歸肝、脾經。三稜主要化學成分有黃酮類、皂苷類、苯丙素類、揮發油，胡蘿蔔苷棕櫚酸酯、β -穀固醇棕櫚酸酯、24-亞甲基環阿爾廷醇、6,7,10-三羥基-8-十八烯酸、香草酸、對羥基苯甲醛、α-棕櫚酸單甘油酯、 8.

(22) 5-羥甲基糠醛、β-穀固醇、(8E, 10E)-7, 12-二氧-8, 10-十八碳二烯酸、α-二十一烷酸單甘油酯、正丁酸、大黄素甲醚、香草醛、大黄素、反丁烯二酸、1-O-阿魏酰基-3-O-p香豆酰基甘油、赤藓醇(袁濤、華會明、裴月湖，2005；董學、姚慶強，2005；梁橋麗、孔麗娟、吳啟南、段金廒，2012) 。醫療上具有破血行氣及消瘀止痛的功效，用於癓瘕痞塊、瘀血經閉、食積脹痛(國家藥典委員會，2005)。日華子本草中提到：｢治婦人血脈不調，心腹痛，落腰消惡血，補勞，通月經，治氣脹，消扑損瘀血，產後腹痛血運，并宿血不下。」顯示其為婦科用藥的一種。有研究顯示三稜水煎液會對發育中的胚胎產生影響。Sun, Wang, & Wei(2012)在餵食小鼠懷孕母鼠 0.4g/kg 三稜水溶液的研究中，發現幼鼠有心臟發育遲緩、鼻腔型態異常及脊椎型態異常、纖維細胞生長因子 1 (Fibroblast growth factor 1 ,FGF-1)降低等症狀。另外，苗曉鈴、曹東、母昌敏、代蓉與陳林興(2005)在三稜水煎液餵食母鼠對小鼠早期胚胎影響中發現低、中劑量組(3g/kg, 9g/kg)身長及尾長縮短，高劑量組 (12g/kg)身長、尾長及胎盤重皆增加，且流產率增加。由上述研究可看出三稜水煎液對哺乳類的胚胎發育有影響，但這兩篇研究所使用的藥劑量差異非常大，後者低劑量組(3g/kg)明顯遠高於前者所用藥量(400mg/Kg)，所以還需要進一步確認藥品所需的濃度，以及藥物是否影響母體再影響到胚胎的發育。. 2.2.3 水蛭水蛭學名為 Hirudo nipponica Whitman，英文名為 Leech，為螞蝗、水蛭或柳葉螞蝗之乾燥體。成人每日用量為 1.5~3 克，相當於 0.25~0.5g/kg(行政院衛生署台灣中藥典編修小組，2013)。成分主要有蛋白質、脂肪、醣類、肝素、抗凝血酶等，功效為破血消髒。依本經、別錄及本草衍義中記載，其可逐惡血、瘀血、月閉、破血瘕積聚、利水道、墮胎、治傷折，破血瘕積聚就是去除子宮瘀血、腫瘤等積塊。. 9.

(23) 侯家玉與方泰惠(2007)提到水蛭煎液 0.5~1.0mL/kg 給妊娠 7~11 天的小鼠灌餵有致畸及墮胎作用。黃超培等人(2011)的研究發現水蛭素凍乾粉對大鼠無生殖毒性。但是 Jagadeeswaran, Liu, & Eddy(1997)發現，若在斑馬魚胚胎造血期(受精後 25 小時)注射水蛭素到卵內，會導致尾部畸形。若在造血期之前或之後注射，則有凝血酶濃度下降，但卻無畸形發生。在臨床研究上，肝素可增加胚胎存活率，但有淤青，出血，血小板減少及過敏性反應等副作用(Akhtar, Sur, Raine-Fenning, Jayaprakasan, Thornton, & Quenby, 2013)。由這些研究發現水蛭對胚胎的影響可能是在特定的時期，在斑馬魚的胚胎，影響的時間為血液循環系統的發育的時期，也是斑馬魚發育中期；而在小鼠的胚胎，影響的時間在妊娠 7~11 天也剛好在胚胎發育的中期。. 2.3 斑馬魚斑馬魚學名為 Danio rerio，原生於東印度，現在為水族館常見的魚種，身上有藍黃相間的條紋，身長為 3~4 公分，體型小可以飼養在有限的空間內，一尺水缸可養 10 隻魚。在研究上，斑馬魚與人類遺傳、生理、藥理反應方面存在高度的相似性，具有與哺乳類動物相似的心血管、造血、神經及代謝等系統(Hung, et al, 2012; Rubinstein, 2003)。實驗方面斑馬魚的胚胎產量大，一天一對魚可產生 100~200 顆胚胎；胚胎透明可直接觀察胚胎發育、心跳節律變化、血液流動……等；發育時間短，72 小時左右發育完成，在 48 小時破卵、72 小時可開始覓食 (表 2-4)。斑馬魚在遺傳學、環境科學領域、毒理學的研究已被使用，特別是藥物篩選的部分(Hung, et al, 2012)。. 10.

(24) 表 2-4 斑馬魚發育階段時期. 受精後 (小時). 敘述. 合子期. 0. 受精卵。. (Zygote) 分裂期. 0.75. 細胞開始分裂。. (Cleavage) 囊胚期. 2.25. 在中胚層轉換(midblastula transition )分裂細胞開始延長特化；開始外包(epiboly ). 原腸胚期. 5.25. (Gastrula) 體分節期. 型態經內捲、融合及延長形成內胚層、中胚層和外胚層；直到外包結束。. 10. 體節、腮弓原及神經原節(neuromeres)形成；主要器官生成；早期活動；尾部出現。. (Blastula). (Segmentation) 咽期 24 (Pharyngula) 孵化 48 (Hatching) 早期幼魚. 72. (Phylotypic-stage embryo); 體軸從附在卵黃上彎曲的狀況拉直; 循環，色素和鰭開始發育。主要器官發育完成；頭部及腹鰭軟骨發育；孵化。膘充氣；尋找食物及主動迴避行為。. (Early larva) 翻譯自 Kimmel, C.B., Ballard,W.W., Kimmel, S.R., Ullmann, B.,& Schilling, T.F.(1995). 11.

(25) 第參章、實驗材料與方法. 本節依序記載使用的動物、材料、檢驗生物指標及統計方法。. 3.1 動物準備本研究所使用的斑馬魚（Zebrafish, Danio rerio)來自臺灣斑馬魚中心中央研究院分支，使用的魚種為訓養種(AB)。斑馬魚飼養在系統缸中，系統缸水溫控制在 26±1℃，循環水經過濾棉、活性碳、硝化菌三道過濾，補充的水均經過七天以上的曝氣，以確保水中無氯的殘留。系統缸中每個 7 L 小水缸放 5 對魚。魚房光照週期為 14 小時白天，10 小時黑夜。餵食時間為早晚各一次，飼料為福壽牌小型魚飼料及豐年蝦。本研究所使用的豐年蝦卵為美國紅牌，孵化方式依照臺灣斑馬魚中心提供的孵化方法進行（附錄一）。水質檢驗每兩周一次，檢驗標準參考經濟合作暨發展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development,OECD)(2013)魚胚胎毒性測試（附錄二），包含硬度 (CaCO3，30~300mg/L)，銨氮濃度（NO3≦48mg/L，NO2-＜0.001mg/L)，NH4+ ＜0.001mg/L)，以及水的酸鹼度維持在 pH 6.5~8.5。收取斑馬魚胚胎的前一天下午，將斑馬魚以公母 1:1 的比例放入裝有注入曝氣水的產卵盒（圖 3-1），產卵盒中有隔板，將公母魚隔開。因為斑馬魚有吃卵的習慣，且卵的特性為沉底不沾黏，所以在產卵槽和下方有一塊篩板，讓產出的卵掉到最底層，與親魚隔開，避免斑馬魚將自己的卵吃掉。第二天光照開始後半小時將隔板抽開，抽完隔板後半小時內，親魚會開始追尾產卵；一小時後收集魚卵，讓魚卵能完全授精。將魚卵由產卵盒取出，以滅菌後的一次水清洗乾淨，挑除未受精卵，再以滅菌後的一次水清洗乾淨。將挑好的魚卵放入 24 孔盤，一格一顆，每盤有 20 個為試藥組； 4 格為控制組（圖 3- 2）。. 12.

(26) 圖 3-1 產卵盒. 圖 3-2 24 孔盤 t 為試藥組，c 為控制組. 3.2 藥品配製本研究使用的中藥有水蛭(Hirudo nipponica Whitman，項目號 5541)、莪朮 (Zedoariae rhizoma，項目號 7720)、及三稜(Sparganii rhizo，項目號 5330)，均來自台灣港香蘭藥廠股份有限公司。因藥源為生藥及浸膏噴粉兩種，故配製時有所不同。(1) 乾粉類的中藥，秤量所需重量以滅菌後的二次水溶解即可，例如 1 克水蛭乾粉以二次水溶解成 1 公升溶液，濃度即為 1000 ppm。(2)莪朮、三稜為浸膏噴粉，其乾粉浸膏比例為 1:1，配置時依浸膏比例配置。例如：莪朮 1000ppm 的 1L 溶液配置，秤量 2g 莪朮藥粉加入 999g 的二次水後，經超音波震盪器將浸膏攜出後，取溶液部分，排除澱粉。本次使用的部分藥品為浸膏噴粉，下列實驗為方便比較換為生藥材的濃度。莪朮 1 克浸膏噴粉為 3.9 克生藥製備、三稜 1 克浸膏噴粉為 6 克生藥製備、水蛭為生藥直接使用不換算，1000ppm 的莪朮、三稜、水蛭換算結果為 3.9g/L, 6g/L, 1 g/L(表 3-1). 13.

(27) 表 3-1 藥劑濃度與生藥濃度對照試藥濃度(ppm). 1000. 750. 500. 250. 莪朮. 3.900. 2.925. 1.950. 0.975. 三稜. 6.0. 4.5. 3.0. 1.5. 水蛭. 1.00. 0.75. 0.50. 0.25. 生藥濃度(g/L). 本實驗利用動物體表面積換算出斑馬魚與人類用藥劑量關係。斑馬魚與哺乳類小鼠的體表面積與體重比例較為相近，故本實驗採用小鼠標準換算藥物使用量，藥物劑量換算參考(Xu, et al., 2013) (表 3-2)。以體表面積劑量為標準換算的結果為斑馬魚的用藥量(mg/kg)約等於 12.3 倍的人體用藥量(mg/kg)。因為本實驗胚胎為浸在藥劑中，所以本研究使用的藥劑濃度為換算後的斑馬魚的用藥量(mg/kg)。例如：莪朮一般的用藥量上限為 9 克，人體用藥量(mg/kg)等於 9000 毫克(mg)除以 60 公斤(kg)，斑馬魚的用藥量(mg/kg)為 12.3 倍的人體用藥量(mg/kg)，所以藥劑的濃度為 1845ppm。. A 動物劑量(mg/m2) = 人的劑量(mg/kg) × （人的因子∕A 動物的因子）. 14.

(28) 表 3-2 以體重標準(mg/kg)和體表面積標準(mg/m2)的比較物種. 體重(kg). 體表面積. 因子. 2. (m ) 小鼠大鼠猴狗人. 0.02 0.15 3.00 8.00 60.00 修改自(Xu et al., 2013). 0.0066 0.0250 0.2400 0.4000 1.6000. 3 6 12 16 37. 劑量. 劑量. (mg/kg). (mg/m2). 100 100 100 100 100. 300 600 1200 1600 3700. 劑量(mg/m2) = 劑量(mg/kg) × 因子. 本研究所用的最高劑量為死亡率超過 90%的劑量。因為莪朮、三稜在浸膏濃度 1000ppm 時死亡率皆達到 90%以上，故以此為標準。換為生藥濃度，莪朮的劑量 3.900g/L, 2.925g/L, 1.950g/L, 0.975g/L, 0g/L；三稜的劑量為 6.0g/L, 4.5g/L, 3.0g/L, 1.5g/L, 0g/L；水蛭的劑量為 1.00g/L, 0.75g/L, 0.50g/L, 0.25g/L, 0g/L(表 3-1)，本實驗用濃度皆有部分在人體用量換算為斑馬魚用量的範圍內，莪朮組 0.975g/L 低於人體換算用量的 1.845g/L；三稜組 1.5g/L 低於人體換算用量的 1.845g/L；水蛭組 0.50g/L, 0.25g/L 低於人體換算用量的 0.615g/L。為與其他研究作比較，本實驗表示法採生藥藥劑量作表示(表 3-3)。. 表 3-3 斑馬魚與人體用藥劑量轉換表草藥. 人體用量(g). 斑馬魚胚胎藥劑濃度(g/L). 莪朮. 6~9. 1.230~1.845. 三稜. 4.5~9. 0.9225~1.845. 0.3075~0.615 1.5~3 人體重(kg)=60kg 斑馬魚胚胎藥劑濃度(ppm)=人體用量(g)×1000÷人體重(kg)×12.3 水蛭. 15.

(29) 3.3 實驗設計. 3.3.1 藥物濃度對斑馬魚胚胎的影響每組 20 顆卵，在魚卵出生 2 小時內加藥，莪朮加藥濃度為 3.900g/L, 2.925g/L, 1.950g/L, 0.975g/L, 0g/L；三稜加藥濃度為 6.0g/L, 4.5g/L, 3.0g/L, 1.5g/L, 0g/L；水蛭加藥濃度為 1.00g/L, 0.75g/L, 0.50g/L, 0.25g/L, 0g/L（圖 3-3）。作 96 小時每 12 小時一次的連續觀察，每次觀察孵化率、死亡率及型態上的變化，記錄並攝影。觀察同一種藥物影響的時間及器官發育。. 在 96 小時內，每 12 小觀察一次紀錄孵化率、死亡率及型態上的變化. 三稜. 莪朮. 濃度：. 濃度：. 6.0g/L, 4.5g/L, 3.0g/L, 1.5g/L, 0g/L. 3.900g/L, 2.925g/L, 1.950g/L, 0.975g/L, 0g/L. 水蛭濃度： 1.00g/L, 0.75g/L, 0.50g/L, 0.25g/L, 0g/L. .圖 3-3 不同藥物濃度對斑馬魚胚胎的影響. 16.

(30) 3.3.2 不同時間點給藥對斑馬魚胚胎發育的影響. 依上述濃度，同一種藥分別在 0 小時、12 小時、24 小時及 48 小時分別給予不同組別，並於 96 小時內，每 12 小時一次觀察，每次記錄並攝影觀察其孵化率、死亡率及型態上的變化。. A. 0hr. B. C. 12hr. 24hr. D. 36hr. 48hr. 60hr. 72hr. 84hr. 96hr. 圖 3-6 給藥時間點與觀察時間點示意 (1)加藥濃度：莪朮加藥濃度為 3.900g/L, 2.925g/L, 1.950g/L, 0.975g/L, 0g/L；三稜加藥濃度為 6.0g/L, 4.5g/L, 3.0g/L, 1.5g/L, 0g/L；水蛭加藥濃度為 1.00g/L, 0.75g/L, 0.50g/L, 0.25g/L, 0g/L。(2)分四組，A 在 0 小時加藥，B 在 12 小時加藥，C 在 24 小時加藥， D 在 48 小時加藥。(3) 96 小時每 12 小時一次的連續觀察。(4)每次觀察孵化率、死亡率及型態上的變化。. 3.4 胚胎反應指標. 本研究的觀察向度有半致死劑量(LC50)、孵化率及死亡率。受精後兩小時，將胚胎分為控制組及實驗組，實驗組又分別加入上述不同濃度的藥品，每隔 12 小時定時觀察，共觀察 96 小時，並記錄各個不同濃度組在每個觀察時間點的死亡率。以藥物濃度對死亡率作圖，找出藥物對斑馬魚的半致死量。計算方式參考中華民國行政院環境保護署環境檢驗所(2013)的生物急毒性檢測方法－羅漢魚靜水式法(附錄三) 17.

(31) 孵化率指的是孵化的數目除以總數的百分比。孵化的定義為完全脫離軟殼的幼魚。死亡率指的是死亡數除總數。死亡的判定為心臟停止跳動、卵黃完全白化、脊節未成形或尾部未分離。半致死劑量(LC50)為胚胎發育至 96 小時造成半數胚胎死亡的濃度。. 3.5 統計方法. 水蛭實驗作三次重複，藥物濃度對胚胎的影響及加藥時間對斑馬魚胚胎的作用是用單因子變異數分析(one-way ANOVA)檢驗，並用 tukey 做事後比較。. 18.

(32) 第肆章、. 結果. 4.1 藥物濃度對斑馬魚胚胎的影響. 本小節探討在受精後 0 小時，即加入不同濃度的單一藥物對於斑馬魚胚胎的影響。我們就其孵化率及死亡率分別來看莪朮、三稜及水蛭的藥效。. 4.1.1 0 小時加入不同濃度的藥物對於斑馬魚胚胎孵化率的影響. 在 0 小時加藥，60 小時觀察，可以看出加入莪朮濃度 2.925g/L 及 3.900g/L 的組，其孵化率均為對照組的 50 %以下；在濃度 1.950g/L 組，則較對照組的胚胎孵化約有 10%的延遲情形；在濃度 0.975g/L 組，雖然濃度在人體用藥範圍內，但孵化率能低於對照組 15%（圖 4-1-1）。. 19.

(33) 圖 4-1-1 0 小時投予莪朮對斑馬魚胚胎孵化率的影響 (1)加藥濃度 1.950g/L 時有 10 %延遲孵化。(2)加藥濃度 2.925g/L 及 3.900g/L 孵化率降低 50 %以上。(3) 加藥濃度 0.975g/L 孵化率降低 15%。. 0 小時加入三稜，60 小時觀察，可發現 3.000g/L 的組約有 10 %較對照組晚了 24 小時孵化；然而濃度 4.5g/L 及 6.0g/L 組其孵化率則各有 10%及 17%下降(圖 2-1-2)。人體用藥範圍內的 1.5ppm 組無影響。. 20.

(34) 圖 4-1-2 三稜 0 小時加藥對斑馬魚胚胎孵化率的影響 (1) 加藥濃度 3.0g/L 時有 10%延遲孵化。(2) )加藥濃度 4.5g/L 及 6.0g/L 孵化率降低。. 在本次試驗中，水蛭高濃度組(1.000g/L, 0.750g/L)平均孵化率有延遲，但在 72 小時各組孵化率之間並無顯著差異(p>.05)(圖 2-1-3)。. 21.

(35) 圖 4-1-3 水蛭 0 小時加藥對斑馬魚胚胎孵化率的影響水蛭不同加藥濃度間並無顯著影響。. 在 0 小時加入藥物時，我們發現莪朮 1.950g/L ppm 組及三稜 3.0g/L 組會有孵化延遲的現象，而水蛭沒有明顯影響。. 4.1.2 在 0 小時加入不同濃度的藥物對於斑馬魚胚胎死亡率的影響. 胚胎受精後 0 小時用藥，96 小時統計，莪朮組的死亡率大致隨濃度上升而上升；莪朮組濃度 2.925g/L 以上死亡率超過 80%，96 小時半致死率為 2.065 g/L(圖 4-1-4)。. 22.

(36) 圖 4-1-4 莪朮 0 小時加藥對斑馬魚胚胎死亡率的影響 (1)在加藥濃度 2.925g/L 以上死亡率超過 50 % (2)96 小時半致死率為 2.065g/L. 胚胎受精後 0 小時用藥，96 小時統計，三稜組在濃度 3.0g/L 以上死亡率達 90 %，半致死濃度在 2.246g/L (圖 4-1-5)。. 23.

(37) 圖 4-1-5 三稜 0 小時加藥對斑馬魚胚胎死亡率的影響 (1)在加藥濃度 3.0g/L 時死亡率達 90 %以上(2)96 小時半致死濃度 2.246g/L. 胚胎受精後 0 小時用藥，96 小時統計，水蛭各組的死亡率皆低於 20 %，且在各濃度間無差異(圖 4-1-6)。. 24.

(38) 圖 4-1-6 水蛭 0 小時加藥對斑馬魚胚胎死亡率的影響各濃度死亡率皆在 20%以下，之間無顯著差異。. 從死亡率來看，高濃度的莪朮和三稜都會導致死亡率上升，莪朮組 2.925g/L 以上及三稜 3.0g/L 以上，死亡率皆高於 80 %，而在水蛭組死亡率沒有因濃度有明顯的變化。從以上結果，可看到莪朮和三稜對發育初期的胚胎有孵化率及死亡率的影響，而在水蛭則沒有明顯影響。莪朮在藥物濃度 0.975g/L 以上造成胚胎孵化率下降及在藥物濃度 2.925g/L 以上造成 80%以上胚胎死亡。三稜在藥物濃度 4.5g/L 以上造成胚胎孵化率下降及在藥物濃度 3.0g/L 以上造成 90 %以上胚胎死亡。水蛭各濃度的死亡率及孵化率皆沒有影響。活血化瘀中藥在中醫裡列為禁忌中藥，但其影響妊娠的原因在之前並不清楚，妨礙妊娠的原因可分為胚胎及母體兩部分，胚胎或母體其中一方受到影響皆有可能造成流產(毛慧芬，2008)。在莪朮、三稜及水蛭對小鼠的研究中，皆有發生胚胎畸形或流 25.

(39) 產的狀況(苗曉玲等，2005；黃超培等，2011；陳梓樟等，1981)。因為小鼠屬於哺乳類動物具有胎盤，無法確認造成妊娠不順的原因是胚胎發育不良抑或母體受到影響所造成的，故本實驗選用斑馬魚胚胎作為模式動物，觀察這三種活血化瘀藥對胚胎的影響。因為在水蛭的藥性成分之一水蛭素的研究中發現其會對斑馬魚的特定時期造成影響(Jagadeeswaran, 1997)，所以本研究加入了藥物對不同時期胚胎的影響並觀察其形態上有無變化。. 4.2 不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎發育的影響. 本小節探討在受精後的 0 小時、12 小時、24 小時及 48 小分別加入相同濃度的單一藥物，就其孵化率及死亡率分別來看莪朮、三棱及水蛭對於斑馬魚胚胎的影響。. 4.2.1 在不同時期加入莪朮對斑馬魚胚胎發育的影響. 在莪朮 0.975g/L 濃度的作用下，0 小時組及 12 小時組在 96 小時統計其孵化率時，發現分別下降 15%、10%。而 24 小時組及 48 小時組的孵化率雖最後與對照組一樣到達 100%，但在 60 小時觀察時，發現 15~20%有延遲孵化的現象(圖 4-2-1)。本濃度在人體用藥範圍.. 26.

(40) 圖 4-2-1 在不同胚胎發育時期加入 0.975g/L 莪朮對斑馬魚胚胎孵化率的影響. 在莪朮 1.950g/L 濃度的作用下，0 小時組、12 小時組及 24 小時組在 96 小時統計其孵化率時，發現分別下降 5%、10%、15%。而 0 小時組及 48 小時組的孵化率，在 60 小時觀察時，發現 5~10%有延遲發化的現象 (圖 4-2-2)。. 27.

(41) 圖 4-2-2 在不同胚胎發育時期加入 1.950g/L 莪朮對斑馬魚胚胎孵化率的影響. 在莪朮 2.925g/L 濃度的作用下，0 小時組、12 小時組及 24 小時組在 96 小統計其孵化率時，發現分別下降 65%、5%、25%。而 48 小時組的孵化率雖最後與對照組一樣達到 100%，但在 60 小時觀察時，發現 60%有延遲孵化的現象(圖 4-2-3)。. 28.

(42) 圖 4-2-3 在不同胚胎發育時期 2.925g/L 莪朮對斑馬魚胚胎孵化率的影響. 在莪朮 3.900g/L 濃度的作用下， 12 小時組及 24 小時組在 96 小統計其孵化率時，發現分別下降 25%、35%，而 0 小時組孵化率為 0。48 小時組的孵化率雖最後與對照組一樣到達 100%，但在 60 小時觀察時，發現 100%延遲孵化 (圖 4-2-4)。. 圖 4-2-4 在不同胚胎發育時期加入 3.900g/L 莪朮對斑馬魚胚胎孵化率的影響 29.

(43) 在不同時期給予莪朮對斑馬魚胚胎死亡率的影響中，可看到在莪朮高濃度 (2.935g/L, 3.900g/L)的作用下，0 小時組及 24 小時組的死亡率明顯高於 12 小時組及 48 小時組 60%以上。在莪朮 0.975g/L 濃度的作用下，也可看到 0 小時組及 24 小時組的死亡率略高於 12 小時組及 48 小時組 5~10%(圖 4-2-5)。. 圖 4-2-5 莪朮在不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響. 從上述結果可看到，莪朮低濃度組(0.975g/L)在胚胎受精後 24 及 48 小時加藥會延遲孵化(圖 2-2-1)；莪朮高濃度組(2.925g/L, 3.900g/L)在胚胎受精後 48 小時加藥會有大於 60%的個體延遲孵化，且在胚胎受精後 0 及&24 小時加藥孵化率會大幅下降(大於 40%)(圖 2-2-3、圖 2-2-4)。死亡率方面，在加藥濃度 2.929g/L 及 3.900g/L 的組別，. 30.

(44) 胚胎受精後 0 及 24 小時加藥對胚胎死亡率影響較大，死亡率高於其他組 50%以上(圖 2-2-5)。. 4.2.2 三稜在不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎發育的影響. 在三稜 1.5g/L 濃度的作用下，各組孵化率皆達 95%以上，在 48 小時觀察，24 小時組有 10%提早孵化。而在 24 小時組及 48 小時小時組有 10%延遲孵化 (圖 4-2-6)。. 圖 4-2-6 三稜在不同時期加入 1.5g/L 藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響. 在三稜 3.0g/L 濃度的作用下，在 96 小時觀察，24 小時組的孵化率下降 35%；在 36 小時觀察時，24 小時組在 12 小時組及 24 小時組，有 10%提早孵化。而在 84 小時觀察時，12 小時組及 24 小時組也發現大於 20%延遲孵化，另外也發現 0 小時組及 24 小時組有 10%延遲孵化(圖 4-2-7)。. 31.

(45) 圖 4-2-7 三稜在不同時期加入 3.0g/L 藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響. 在三稜 4.5g/L 濃度的作用下，在 96 小時觀察，12 小時組和 24 小時組孵化率分別下降了 5%、20%。在 60 小時觀察，12 小時組及 24 小時組，有大於 60%延遲孵化，而 48 小時組有 10%延遲孵化(圖 4-2-8)。. 圖 4-2-8 三稜在不同時期加入 4.5g/L 藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響. 32.

(46) 在三稜 6.0g/L 濃度的作用下，在 96 小時觀察，0 小時組及 24 小時組的孵化率分別下降了 15%、60%。而在 60 小時觀察，0 小時組、12 小時組、24 小時組及 48 小時組分別有 5%、65%、40%、15%延遲孵化，其中 12 小時組及 24 小時組延遲的比例較高(圖 4-2-9)。. 圖 4-2-9 三稜在不同時期加入 6.0g/L 藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響. 在不同時期給予三稜對斑馬魚胚胎死亡率的影響中可看到在高濃度(3.0g/L, 4.5g/L, 6.0g/L)時，胚胎受精後 0&24 小時加藥組的死亡率明顯高於其他組(大於 60%)，在濃度 1500 ppm 的組別也可看到胚胎受精後 0&24 小時加藥的組別略高於其他組 5~20%(圖 4-2-10)。. 33.

(47) 圖 4-2-10 三稜在不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響. 由上述結果可看出三稜高劑量組(3.0g/L, 4.5g/L, 6.0g/L)在 12 小時組及 24 小時組的孵化狀況有明顯的延遲或提前。在 12 小時組及 24 小時組加藥，濃度 1.5g/L 組有 10% 提早孵化，超過 25%延遲孵化，而在濃度 4.5g/L 及 6.0g/L 時有大於 40%的個體延遲 24 小時孵化。在圖 4-2-10 中可發現三稜在胚胎受精後 0 小時及 24 小時加藥，死亡率的影響較大，大於其他時期加藥的組別 60%以上。由此可看出三稜對胚胎孵化率的影響在受精後 12 小時及 24 小時較明顯，而對死亡率的影響則在 0 小時及 24 小時較明顯。. 4.2.3 水蛭在不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎發育的影響. 從圖 4-2-11 可看出，在胚胎受精後 0 小時給予水蛭，高濃度組(1.00g/L, 0.75g/L)平 34.

(48) 均孵化率有延遲 15%~30%，但在 72 小時孵化率之間並無顯著差異(p>.05)。. 圖 4-2-11 水蛭在受精後 0 小時不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎孵化率的影響. 在胚胎受精後 12 小時給予水蛭，在 96 小時觀察，1.00g/L 組在胚胎孵化率低於 0.25g/L 組及對照組，達顯著差異(p=.025, p=.014)，顯示高濃度的水蛭對受精後 12 小時的胚胎孵化有影響(圖 4-2-12)。. 35.

(49) 圖 4-2-12 水蛭在受精後 12 小時不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎孵化率的影響. 從圖 4-2-13 可看到，在胚胎受精後 24 小時給予水蛭，在 96 小時觀察時，1.00g/L 組及 0.25g/L 組孵化率高於對照組 10%~15%。. 36.

(50) 圖 4-2-13 水蛭在受精後 24 小時不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎孵化率的影響. 在圖 4-2-14 中可看到，在胚胎孵化後 48 小時給予水蛭時，在 84 小時觀察時，加藥組(0. 25g/L, 0.50g/L, 0.75g/L, 1.00g/L)較對照組提早孵化，且在 96 小時觀察時，孵化率加藥組較對照組高。. 37.

(51) 圖 4-2-14 水蛭在受精後 48 小時不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎孵化率的影響. 在圖 4-2-15 中可看到，在胚胎孵化後 0 小時給予水蛭，各組死亡率變化不大，相差值不超過 10%，死亡率的差異不顯著(p>.05)；在 12 小時加藥，死亡率的平均數有隨加藥濃度上升，但其間並無顯著差異(p>.05)；在 24&48 小時加藥，死亡率皆為 0。. 38.

(52) 圖 4-2-15 水蛭在不同時期加入藥物對斑馬魚胚胎死亡率的影響. 由上述結果看出，水蛭對斑馬魚受精後 12 小時的胚胎有影響，1.0g/L 的濃度下會造成孵化率下降(圖 4-2-12)。但在其他組別並無看到水蛭對胚胎孵化率及死亡率有明顯的影響。. 4.3 斑馬魚胚胎型態上影響. 本實驗做了形態上的觀察，發現莪朮及三稜在胚胎受精後 24 小時加藥的組別會有個體出現心包膜膨大的情形。心包膜膨大的情況如圖 4-3，紅色虛線處為心包膜的位置，在 a 圖對照組中可看到從卵黃囊的曲線向頭部延伸時，在心包膜的位置會略為凹陷，但在 b,c 二圖莪朮及三稜組從卵黃囊向頭部的曲線到心包膜時，曲線有向體外突出，藉此 39.

(53) 判斷莪朮及三稜在胚胎受精後 24 小時加藥對心包膜有影響。. 40.

(54) 0ppm. a 三棱 24hr 3.0g/L. b 莪朮 24hr 1.950g/L. c 圖 4-3 斑馬魚胚胎受藥物影響後的形態變化 (a)對照組(b)三稜胚胎受精後 24 小時加藥(3.0g/L) (c)莪朮胚胎受精後 24 小時加藥 (1.950g/L)。相較對照組，三稜及莪朮組心包膜膨大。 *紅色虛線處為心包膜位置，藍色虛線為卵黃囊. 41.

(55) 莪朮組在高劑量(1.950g/L 以上)時，孵化率在胚胎受精後 0、24&48 小時有明顯的影響，而在死亡率的部分則在胚胎受精後 0&24 小時有影響。三稜組在高劑量組(3.0g/L 以上)，孵化率在胚胎受精後 12&24 小時有較明顯影響，死亡率與莪朮影響的時間相同都在胚胎受精後 0&24 小時有較明顯影響。由此可看到三稜跟莪朮影響其死亡的時期在胚胎發育初期(0 小時)及中期(24 小時)；而孵化率的部分，莪朮影響的範圍為胚胎發育的初期及中後期，三稜則為發育中期。而水蛭在本研究中只有在胚胎受精後 12 加藥對其孵化率有影響；死亡率方面則差異不大。另在形態學的觀察上發現莪朮及三稜在胚胎受精後 24 小時加藥對心包膜發育有影響。. 42.

(56) 第伍章、. 討論. 水蛭的相關研究中有出現結果相悖的狀況，在黃超培等人(2011)對妊娠大鼠灌餵 5000 mg/kg 的水蛭凍乾粉發現無畸形，但在以水蛭煎液灌餵妊娠 7~11 天的小鼠及對受精後 24 小時的斑馬魚胚胎注射水蛭素兩篇研究中皆有發現畸形(苗曉玲等，2005； Jagadeeswaran, 1997)，結果不同的原因有實驗動物不同及藥物形態上的不同，有影響者為水煎液及萃取物水蛭素，而凍乾粉無影響，在本研究中使用生粉也未受影響，由此看出水蛭生粉及凍乾粉若未經萃取其藥性成分可能較難釋出，所以未造成影響。在胚胎受精後 0 小時加藥給予藥物時，水蛭組試藥濃度高至 1.00g/L 對斑馬魚胚胎發育並無發現影響，而莪朮組及三稜組則分別在試藥濃度 2.925g/L 及 4.5g/L 開始影響胚胎孵化率及死亡率。水蛭在黃超培等人(2011)對妊娠大鼠灌餵 15g/kg 的水蛭凍乾粉發現無畸形等結果與本研究結果相同，但在以水蛭煎液灌餵妊娠 7~11 天的小鼠及對受精後 24 小時的斑馬魚胚胎注射水蛭素兩篇研究中皆有發現畸形(苗曉玲等， 2005；Jagadeeswaran, 1997)。由於水蛭及水蛭素造成畸形的研究給藥時期皆在妊娠中期，故本研究也觀察了不同時期給藥的結果，發現在水蛭對胚胎無影響，判斷有可能是藥性成份不易通過卵膜。在胚胎發育初期(受精後 0 小時)給予莪朮的影響中，本研究發現在濃度 2.929g/L 以上胚胎的孵化率及死亡率均上升，在田麗莉、董健勇與黃長江(2010)用莪朮醇對斑馬魚胚胎的研究中也發現孵化率明顯下降的現象，另外在莪朮混懸液對妊娠小鼠的研究中也有發現胚胎退化、剝落的現象(陳梓樟等，1981)，由此可推斷莪朮會影響妊娠的原因之一為胚胎受到影響所造成。三稜在之前的研究中有餵食妊娠母鼠 400 mg/kg 三稜水溶液造成幼鼠出現心臟發育遲緩、鼻腔型態異常、纖維細胞生長因子(Fibrolast growth factor 1, FGF-1)降低等症狀，以及用 3~12g/kg 三稜水煎液餵食餵食母鼠的實驗中發現幼鼠流產率上升，與前兩者相似，本研究也發現三稜濃度大於 4.5g/L 會造成胚胎孵化率大幅下降，由此可推斷三稜導致胚胎發育不良為妨礙 43.

(57) 妊娠的原因之一。本研究在不同時期加藥對斑馬魚胚胎的影響中，發現莪朮及三稜在胚胎受精後 0 及 24 小時加藥的死亡率高於其他時期加藥，而在同樣具有抗凝血作用的水蛭研究中也有出現類似的狀況，在斑馬魚胚胎受精後 24 小時前注射水蛭素，造成胚胎畸形，但在胚胎受精後 24 小時之後注射水蛭素無影響，該研究中有提到斑馬魚胚胎受精後 22-25 小時為胚胎的造血期(Jagadeewaran, Liu, & Eddy, 1997)，故本研究認為莪朮及三稜對胚胎受精後 0 及 24 小時加藥造成胚胎死亡的原因可能為其抗凝血成分的影響。而在莪朮與三稜對胚胎受精後 24 小時加藥的組別中，本研究發現胚胎有心包膜膨大的狀況出現，此現象在前述水蛭素的研究也有發現(Jagadeewaran, Liu, & Eddy, 1997)。引發心包膜腫大的藥物有抑制心血管生成藥物 Sutent (Hung, Zhang, Li, Lei, Yuan, Cui, Hoi, Chan& Lee, 2012)、致斑馬魚胚胎心包膜膨大藥物 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). 、. 凝. 血. 酶. 原. 抑. 制. 劑. (prothrombin. inhabit). -. (Day,. Krishnegowda&. Jagadeeswaran, 2004)等。前述藥物導致心包膜膨大的原因皆與心血管生成的因子及凝血有關。本研究認為妨礙凝血機制導致胚胎發育可能是影響發育的原因，但本研究未作此部分的觀察，以期未來研究可做這方面的觀察。本研究發現莪朮、三稜會對早期胚胎造成影響導致發育不良，並推論造成發育不良的原因可能為凝血酶原生成受組導致心血管發育不良的結果。由於本研究未觀察凝血酶原的生成及其他有關的因子，所以還需要後續的實驗做確認。. 44.

(58) 參考文獻梁橋麗、孔麗娟、吳啟南、段金廒(2012)。三稜的化學成分研究。中草藥，43(6)，1061-1064。毛慧芬(2008)。流產徵兆不可不小心。摘錄 http://www.femalecare.url.tw/yellowpage/fuchanke_15.html 田麗莉、董建勇、黃長江 (2010)。莪朮醇對斑馬魚胚胎發育的影響。溫州醫學院學報， 40(6)，557-559+563。行政院衛生署台灣中藥典編修小組(2013)。臺灣中藥典第二版。行政院衛生署中醫藥委員會。中華民國行政院環境保護署環境檢驗所(2013)。生物急毒性檢測方法－羅漢魚靜水式法。取自 http://www.niea.gov.tw/analysis/method/m_n_1.asp?m_niea=B902.13B 黃超培、何為濤、趙鵬、李彬、王彥武、傅傳忠、何勵、蘇愛榮（2011）。水蛭素凍乾粉對大鼠的致畸性研究。檢測研究，23(3):226-231。侯家玉、方泰惠(2007)。中藥藥理學。北京：中國中醫藥出版社。苗曉玲、曹東、母昌敏、代蓉、陳林興（2005）。部分破血活血中藥對妊娠早期小鼠流產及死胎的影響。雲南中醫中藥雜誌，26(1)，31-32。陳梓樟、胡堯碧、汪洋（1981）。莪朮對小白鼠卵巢、宮內膜及胚胎的作用。中草藥， 12(3)，26-29。袁濤、華會明、裴月湖(2005)。三稜的化學成分研究(Ⅰ)。中草藥，36，1607-1610。國家藥典委員會(2005)。中華人民共和國藥典 2005 年版一部。北京：化學工業出版社， 11-12. 45.

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(61) options that may benefit the couple. Reproductive Biomedicine Online 11, 371–381. Weimar, C. H. E., Post Uiterweer, E. D., Teklenburg, G., Heijnen, C. J., & Macklon, N. S. (2013). In-vitro model systems for the study of human embryo–endometrium interactions. Reproductive biomedicine online, 27(5), 461-476. Xu, Q., Bauer, R., Hendry, B. M., Fan, T. P., Zhao, Z., Duez, P., . . . & Hylands, P. J. (2013). The quest for modernisation of traditional Chinese medicine. BMC Complement Altern Med, 13, 132. doi: 1472-6882-13-132 [pii] 10.1186/1472-6882-13-132 [doi] Organization for Economic Co-operation and Development[OECD](2013). Test No. 236: Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test. doi:10.1787/9789264203709-en Rubinstein, A. L.(2003). Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Curr Opin Drug Discov Deve, l 6, 218–223. Hung, M. W., Zhang, Z. J., Li, L. S., Lei, B., Yuan, S., Cui, G. Z., Hoi, P. M., Chan, K., & Yuen Lee, S. M. (2012). From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: A new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. doi:10.1155/2012/605303 Zhong, Z. F., Hoi, P. M., Wu, G. S., Xu, Z. T., Tan, W., Chen, X. P., Cui, L., Wu, T., & Wang , Y. T. (2012). Journal of Ethnopharmacology, 141(2), 721-727. .. 48.

(62) 附錄一豐年蝦軟化卵殼方法 1. 豐年蝦卵 36 g 加入自來水(4-5 L)於 5 L 塑膠燒杯中打氣 1 h 2. 加入 5.4 g NaOH 於 600 ml 自來水以打氣幫助溶解 3. 以 100 μ m 直徑 20 cm 的大濾網撈起豐年蝦卵 4. 加入 300 ml 漂白水(6% 次绿酸鈉)於含 NaOH 水溶液中,並放入濾網上的豐年蝦卵, 置於攪拌器攪拌 3- 6 分鐘 (大陸金魚牌—6 分鐘; 美國紅/黃標- 3 分鐘;要嚴格遵守時間) 5. 以 100 μ m 濾網撈起豐年蝦卵,並在自來水下沖洗至少 3 分鐘 6. 在養殖桶中放入 12 L 養殖水及 300 g 海鹽並放入處理過的豐年蝦卵,打氣並照光 24 h 就可收獲 (Note: 天冷時必需加入加溫棒並調到 31℃) Note: 1. 若不馬上孵處理過的豐年蝦卵,可以 300 ml 自來水將豐年蝦卵由濾網移在小塑膠袋中, 加入 50 g 海鹽, 攪拌溶解海鹽,放入 4 ℃冰箱 3-4 天後仍可使用。節自臺灣斑馬魚中心中研院分支(2012)。. 49.

(63) 附錄二 Maintenance, breeding and typical conditions for zebrafish embryo toxicity tests Zebrafish (Danio rerio) Origin of species Sexual dimorphism. Feeding regime. India, Burma, Malakka, Sumatra Females: protruding belly, when carrying eggs Males: more slender, orange tint between blue longitudinal stripes (particularly evident at the anal fin) Dry flake food (max. 3% fish weight per day) 3 - 5 times daily; from three days before spawning, plus frozen adult brine shrimp (Artemia spec.) nauplii or small daphnids of appropriate size obtained from an uncontaminated source twice daily (ad libitum). To guarantee for optimal water quality, excess feces should be removed approx. one hour after feeding.. Maintenance of parenthal fish. Approximate weight of adult fish Illumination. Fluorescent bulbs (wide spectrum); 10 - 20 μmol/m2/s, 540 1080 lux, or 50 - 100 ft-c (ambient laboratory levels); 12 - 16 hrs photoperiod. Water temperature Water quality. 26±1 °C O2＞80% saturation, hardness: e.g., ~ 30 - 300 mg/L CaCO3,. Further water quality criteria. NO3-:<48mg/L, NH4+ and NO2-: <0.001 mg/L, residual chlorine <10 μg/L, total organic chlorine <2 ng/L, pH = 6. 8.5 Particulate matter <20 mg/L, total organic carbon <2 mg/L, total organophosphorus pesticides <50 ng/L, total organochlorine pesticides plus polychlorinated biphenyls <50 ng/L e.g., 180 L , 1 fish/L. Tank size for maintenance Water purification. Recommended male to female ratio for breeding. Permanent (charcoal filtered); possible are combinations with semi-static renewal maintenance or flow-through system with continuous water renewal 2:1 (or mass spanwing). 50.

(64) Breeding tanks. Egg structure and appearance Spawning rate. e.g., 4 L tanks equipped with steel grid bottom and plant dummy as spawning stimulant; external heating mats, or mass spawning within the maintenance tanks Stable chorion, highly transparent, non-sticky, diameter ~ 0.8 – 1.2 mm A single mature female spawns at least 50 - 80 eggs per day. Depending on the strain, spawning rates may be considerably higher. The fertilisation rate should be ≧70%. For first time spawning fish, fertilisation rates of the eggs may be lower in the first few spawns.. Test type. Static, semi-static renewal, flow-through, 26±1 °C, 24-well plates (2 ml per cavity). 節自 OECD(2013)test No.236. 51.

(65) 附錄三 96 小時 LC50 之計算流程圖. 節自中華民國行政院環境保護署環境檢驗所(2013). 52.

(66)