數種天然食材對ApoE剔除鼠代謝症候群與動脈硬化的影響

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(1)國立台灣師範大學人類發展與家庭學系營養科學與教育組. 碩士論文. 數種天然食材對 ApoE 剔除鼠代謝症候群與動脈硬化的影響 The effects of some natural food materials on metabolic syndrome and atherosclerosis in apoE knockout mice. 指導教授：吳文惠博士研究生：顏妙容. (Wen-Huey Wu, Ph.D.) (Miao-Jung Yen). 中華民國九十九年一月.

(2) 第一章緒論. 第一章緒論近年來由於社會型態之轉變，現代人因為壓力過大、忙碌、少動、吃多等不正常生活型態，造成肥胖、慢性病、代謝症候群發生率提高。代謝症候群包含了腹部肥胖、高血糖、高三酸甘油酯、高血壓、HDL-C 過低等症狀，根據衛生署 97 年統計國人十大死因中，因代謝症候群所衍生之疾病高達五項(心臟性疾病、腦血管疾病、糖尿病、慢性肝病肝硬化、高血壓性疾病)，其所佔百分比 30.9 %，超過名列十大死因首位惡性腫瘤的 28.9%。研究指出，患代謝症候群之非糖尿病患者其未來罹患第二型糖尿病機率為一般成人的 4 倍，且心血管疾病風險增加 30%("Executive Summary of The Third Report of The National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, And Treatment of High Blood Cholesterol In Adults (Adult Treatment Panel III)," 2001)；顯示代謝症候群與第 2 型糖尿病及心血管疾病間具高度關聯性，若疏於適當控制，則可能轉變為心血管疾病或第 2 型糖尿病，影響健康甚大，為不可忽視之重要課題。植物化學物質(phytochemicals)為存在於植物中的化合物，於人體正常功能的運作中並不需要此物質，但在健康或是減緩疾病症狀上具有益的功效。和 phytochemicals 相關的主要化合物包括了 flavonoids、phytoestrogens、 isothiocyanates、monoterpenes、organosulfur compounds、saponins、capasaicin 及 sterols…等。近年來研究發現，飲食中攝取 phytochemicals 於心血管疾病、代謝症候群等慢性疾病或癌症的預防上具保護效用 (Cornwell, Cohick, & Raskin, 2004; Oak, El Bedoui, & Schini-Kerth, 2005; Park & Pezzuto, 2002)。植物性雌激素(phytoestrogens)屬 phytochemicals 中的一個家族，具有和哺乳類雌激素 17 β-estradiol(E2)相似的化學構造和功能，並且能夠和雌激素受器(estrogen receptor;ER)結合 (Zava & Duwe, 1997)。其分類大致可分為異黃酮 (isoflavone)、木質素 (lignan)、香豆素 (coumestane)及二苯乙烯(stilbenes)四大類，其對健康帶來的潛在好處除了本身和雌激素受器相關作用的特性外，也影響了酵素、蛋白質合成、細胞增生、血管新生、脂質氧化及細胞分化…等作用 (Adlercreutz & Mazur, 1997; Knight & Eden, 1996)。近年來關於植物性雌激素的研究日益增多，尤其對 1.

(3) 第一章緒論. 於停經後婦女因為雌激素缺乏造成的體內代謝紊亂和停經等症狀具保護效果。苜宿含 saponin 及 Ginistein、Daidzein、coumestrol 等植物性雌激素成分，其中具植物性雌激素活性的 coumestrol，可刺激子宮的活性，與雌激素受器α和 β(ERα,ERβ)結合，且與 ERβ 親和力甚至高於 E2，預期對 ERβ 表現高的組織會有保護效應 (Kuiper et al., 1998)；但另外研究指出，苜蓿芽乙酸乙酯萃物可顯著延長 SLE (MRL/lpr)小鼠生命，故此成分對與雌激素有關的女性自體免疫疾病可能有抑制效果(洪永瀚，2008)，而且可能經由 selective estrogen receptor modulator (SERM)，對心血管等 ERβ 表現高的組織預期也會有保護效果。研究指出茉莉甲醇萃物具雌激素活性(陳永如，2007)，其中所含的 flavonoids 對於脂蛋白氧化、血小板聚集以及葡萄糖恆定、肝臟脂質代謝等具有益處(Peluso, 2006)，顯示其對於心血管疾病、肥胖、脂肪肝以及第二型糖尿病的預防或改善可能有所助益。苦瓜之瓜果內含有苷類(glycosides)、皂素(saponins)、生物鹼(alkaloids)、固定油(fixed oils)、三萜類化合物(triterpenes)、蛋白質和類固醇等具生物活性之 phytochemicals；其中所含的固醇類皂素的混合物(charantins、生物鹼)及a polypeptide-p、momordin Ic、oleanolic acid 3-Omonodesmoside及 oleanolic acid 3-O-glucuronide具降血糖特性；同時對於血脂及肝脂具調節作用。本實驗室於先前研究結果發現，投與1%山苦瓜乙酸乙酯萃取物於高脂飲食餵養之ApoE剔除雄鼠，可顯著的降低其新生內層與中層面積比率57% (p<0.05)，另外也發現1%山苦瓜乙酸乙酯萃取物可降低餵食高脂飲食ApoE剔除鼠之主動脈縱切脂肪堆積 28%，證明山苦瓜乙酸乙酯萃取物具有改善動脈硬化的效果。此外，於細胞實驗亦發現苦瓜乙酸乙酯萃取物可下降巨噬細胞在LPS刺激下Nitric oxide 及MMP-9 的產生量。台灣趙氏於研究中指出苦瓜乙酸乙酯萃取物具有活化PPARα及γ的能力，為PPARα/γ活化劑(趙哲毅，2003)，可能對於近年來研究中提及之動脈硬化衍生血管新生(neoangiogenesis)造成的斑塊破裂現象具調控作用，故預期此萃物對於代謝症候群中和發炎相關之動脈硬化後期斑塊穩定度具保護效益。囓齒類動物體內膽固醇大部分為 HDL 所攜帶，和人類脂蛋白代謝情況不同，本身並不容易有心血管疾病的發生。而若將動物體內 ApoE 基因剔除，小鼠則會因為清除血液中乳糜微粒 (chylomicron)及極低密度脂蛋白 (very low-density 2.

(4) 第一章緒論. lipoprotein；VLDL)能力降低，而誘發出血脂上升、病徵和損害區域分佈與人類動脈硬化發生位置相似的現象(Nakashima, Plump, Raines, Breslow, & Ross, 1994)。呈上所述，本研究將分為兩個主題進行探討：實驗（一）以易產生動脈硬化之 ApoE 剔除去卵巢母鼠為實驗動物模式，模擬停經婦女體內代謝紊亂現象，分別投與苜蓿芽乙酸乙酯萃物或茉莉甲醇萃物混入高脂半合成飼料中餵食，探究食材對於停經後引起之代謝症候群及動脈粥狀硬化的效用；而實驗（二）則以山苦瓜乙酸乙酯萃物混入高脂半合成飼料中餵食 ApoE 剔除公鼠，期能了解此萃物是否具有對動脈粥狀硬化後期斑塊穩定度及其他動脈硬化相關發炎現象之改善效果。. 3.

(5) 第二章文獻回顧. 第二章文獻回顧第一節雌激素與代謝症候群壹、代謝症候群定義及診斷標準 (一) 代謝症候群定義代謝症候群是指一群相互關聯的代謝性危險因子單獨或同時叢聚於同一個體上；而這些危險因子包括了高血壓、高血糖、血脂異常及肥胖…等。Reaven 博士於1988年首次將其命名為Syndrome X，而後經由世界衛生組織(World Health Organization, WHO)在內的許多醫學組織於1998年正式定名為「代謝症候群」。關於代謝症候群的潛在病理至今仍未相當清楚，但已陸續有研究指出其主要和胰島素阻抗及肥胖具關聯性。許多研究團體嘗試將代謝症候群作定義並界定其臨床診斷標準，然而不同團體診斷分類也有部分差異性(見表 2-1)；目前最簡單的也最為被廣泛使用於研究之診斷工具為美國心臟協會/國家心肺和血液研究中心 (American Heart Association and the National Heart, Lung and Blood Institute; AHA/NHLBI)及國際糖尿病聯盟 (International Diabetes Federation; IDF)所界定出之標準(Taslim & Tai, 2009)。. (二)代謝症候群診斷標準各團體對代謝症候群所定義的範圍分歧，但儘管如此，其診斷皆以胰島素阻抗(insulin resistance)、高血糖(hyperglycemia)、血脂異常(dyslipidemia)、中央型肥胖(central obesity)、高血壓(hypertention)為五項重要的指標特色(Shaw, Hall, & Williams, 2005)。世界衛生組織(WHO)於 1998 年發表代謝症候群的診斷標準定義，主要是以胰島素阻抗的觀點出發，藉著高胰島素血症、葡萄糖耐受性失調或第二型糖尿病等症狀來判定診斷。接著 1999 年，歐洲胰島素阻抗研究團隊(EGIR) 也發表了其對代謝症候群診斷的定義，定義內容和 WHO 的內容相似，但重點強調在排除微蛋白尿症狀診斷標準的存在；2001 年，美國國家膽固醇教育計劃 (NCEP:ATP III)對代謝症候群的定義主要是以心血管疾病中冠狀動脈疾病之高 4.

(6) 第二章文獻回顧. 度風險為考量；而 2003 年美國臨床內分泌學會(AACE)則將定義著重於不具第二型糖尿病但有胰島素阻抗的個體；2005 年國際糖尿病聯盟(IDF)則是將中央型肥胖視為胰島素阻抗診斷的必須條件，並設立出種族間不同切點的新分類 (Cornier et al., 2008)。而國內代謝症候群判斷界定則是根據行政院衛生署國民健康局於 2004 年參照國情以及世界各國診斷標準而訂定，主要將腹部肥胖單獨列為五項危險因子之中的一項(表 2-2)。. 5.

(7) 第二章文獻回顧. 表 2-1 代謝症候群診斷分類(Cornier et al., 2008) Table 2-1 Criteria for Diagnosis of Metabolic Syndrome NCEP 臨床診斷. WHO(1998). AACE(2003). EGIR(1999). IDF(2005). AHA/NHLBI(2005). ATPIII(2001) 葡萄糖耐受性受葡萄糖耐受性. 損，空腹血糖調節受. 無，但以下五項徵象. 無，但以下五項徵受損或空腹血損，第二型糖尿病或加上以下任何兩胰島素阻抗胰島素敏感性降低種因子. 無. 象中具任何三項糖調節受損，加即為代謝症候群. 中具任何三項即為代謝症候群. 上以下任何一個臨床診斷. 加上以下任何兩種因子腰臀比:. 腰圍：. 腰圍：. 腰圍：腰圍增加(族群特. 男性≧0.9. 男性≧94cm. 男性≧102cm. 女性≧0.85. 女性≧80cm. 女性≧88cm. 肥胖. BMI≧25 kg/m2 異 ) 加上以下任何男性≧102cm 兩種因子. 女性≧88cm. TG≧150mg/dl. TG≧150mg/dl. HDL-C:. HDL-C:. 男性≦40mg/dl. 男性≦40mg/dl. 女性≦50mg/dl. 女性≦50mg/dl. 及/或 BMI>30kg/m2 TG≧150mg/dl TG≧150mg/dl. TG≧150mg/dl 及/. TG≧150mg/dl. 及/或 HDL-C:. 或男或女性 HDL-C:. 及 HDL-C:. 男性≦35mg/dl. HDL-C<39mg/dl. 男性≦40mg/dl. 男性<40mg/dl. 女性≦50mg/dl. 女性<50mg/dl. 血脂異常. 女性≦39mg/dl. 收縮壓 ≧ 130mmHg 收縮壓 ≧ 130mmHg ≧ 140/90 mmHg 血壓. ≧140/90 mmHg. ≧130/85 mmHg. ≧130/85 mmHg. 或高血壓反應. 葡萄糖耐受性受. 或舒張壓 ≧ 85 或舒張壓 ≧ 85 mmHg或高血壓. mmHg或高血壓. 葡萄糖耐受性. 葡萄糖耐受性受葡萄糖. 損，空腹血糖調節 >110mg/dl. 受損，空腹血糖 >110mg/dl. 受損 ( 但非糖尿包括糖尿病. 調節受損(但非包括糖尿病. 病). 糖尿病). >110mg/dl. 損，空腹血糖調節受損或第二型糖尿病其他胰島素阻. 其他. 微蛋白尿. 抗的特徵. AACE: American Association of Clinical Endocrinology,AHA/NHLBI: American Heart Association/National Heart, 6.

(8) 第二章文獻回顧 Lung, and Blood Institute, BMI: body mass index,DBP,EGIR: European Group for the Study of Insulin Resistance, HDL-C: high density lipoprotein cholesterol, NCEP ATP III: National Cholesterol Education Program-Adult Treatment Panel, TG: triglycerides. 表 2-2 行政院衛生署國民健康局公告代謝症候群臨床定義 Table 2-2 Taiwan clinical criteria for Diagnosis of Metabolic Syndrome 危險因子腹部肥胖(Central Obesity). 正常值腰圍:男性≧90cm，女性≧80cm (或身體質量指數≧27kg/m2). 血壓偏高. 收縮壓≧130mmHg 或舒張壓≧85mmHg. 空腹血糖偏高. 空腹血糖值≧100mg/dl. 三酸甘油酯偏高. 三酸甘油酯≧150mg/dl. 高密度脂蛋白膽固醇過低. 男性：<40mg/dl，女性<50mg/dl. 7.

(9) 第二章文獻回顧. 貳、代謝症候群相關病理研究關於代謝症候群病理研究中，許多學者認為胰島素阻抗(insulin resistance) 是和其他危險因子相連的主要中心致病因素，而部份其他研究認為代謝症候群是藉由肥胖(obesity)所導致的一些併發症所引起(Grundy ,2004)。但不論為胰島素阻抗或是肥胖，研究已清楚證實此兩者之間和代謝症候群具相關性。胰島素阻抗是指胰島素在特定濃度時，將血糖帶入細胞的能力受到阻抗而減少，產生低於正常的反應。其和體內醣類及脂質代謝紊亂關係甚大，是造成代謝症候群病徵的主要致病因子。近數十年來肥胖的盛行率於世界各地不斷地增加，雖然肥胖與胰島素阻抗並無直接關聯，但於過去許多研究中發現，肥胖與胰島素阻抗、代謝症候群中之心血管疾病、第二型糖尿病發生率的日益增加具強烈相關性(Eckel, Grundy, & Zimmet, 2005)。值得注意的是，脂肪組織的分布於胰島素敏感度上具有重大的影響，因此，已有研究顯示，腹腔臟器的脂肪堆積與胰島素阻抗具強烈相關性，並且為不同於肥胖的獨立因子(Gastaldelli et al., 2005)。另外，肥胖中脂肪細胞的增加代表著其細胞數目增加與細胞的大小變大，此現象和早熟動脈硬化、胰島素阻抗、血脂異常及高血壓息息相關(Gimeno & Klaman, 2005; Kahn & Flier, 2000)。近年來研究發現，和肥胖相關的脂肪組織除了可儲存脂肪外，也是個免疫-代謝-內分泌(immune-metabolic-endocrine)器官；其可分泌許多具旁分泌和自體分泌活性的物質，稱之為 Adipokines(如：Leptin、 Resistin、Visfatin)。Adipokines 能夠誘導胰島素阻抗、發炎、血脂異常、血凝過快(hypercoagulability)、動脈硬化相關之內皮細胞功能損傷及代謝症候群等現象。除此之外，脂肪組織也可分泌出促發炎的介質，如：TNF-a、IL-6、IL-1、 PAI-1…等。其中 TNF-a 可刺激脂肪水解並誘導胰島素阻抗、高胰島素血症、高血壓等症狀；IL-6、IL-1 於肥胖中會過度製造；PAI-1 於肥胖情況下濃度增高，會促進血栓的形成，導致動脈硬化和心血管疾病危險性的增加。由以上敘述證實，胰島素阻抗與肥胖於代謝症候群的發展上扮演重要的角色(Fulop, Tessier, & Carpentier, 2006)。. 8.

(10) 第二章文獻回顧. 叁、更年期婦女雌激素缺乏與代謝症候群相關性雌激素於女性體內具有維持生殖功能之角色，具調節體內不同組織、系統的功能。除了可作用於腦部抑制食慾、調節能量消耗及代謝之外，也可作用於脂肪組織上。研究發現，腹部脂肪堆積和代謝症候群強烈相關，雌激素會調節脂肪組織的發展及功能，調控脂肪組織內雌激素受器 ERα、ERβ，影響脂肪細胞的生長與分化。過去有研究將動物體內卵巢剔除模擬雌激素缺乏造成代謝症候群之模式，結果發現，去卵巢的大鼠於體重、腹脂、皮下脂肪、肝脂顯著高於未去卵巢之組別，並有胰島素阻抗之現象(Lemieux, Picard, Labrie, Richard, & Deshaies, 2003)；去卵巢之母猴經過雌激素處理後，其血液中總膽固醇濃度顯著低於對照組別，並明顯抑制動脈硬化發展，顯示雌激素的存在與否和代謝症候群息息相關。於更年期婦女中，由於年紀的老化或是雌激素缺乏等因素，其生理上時常發生體重增加或是形成脂肪堆積於腹部中央肥胖(android fat distribution)的現象。除此之外，由於停經後卵巢失去功能，更容易使體內血液中三酸甘油酯、LDL-C 濃度上升，HDL濃度減低、Lipoprotein(a)濃度不規則增加等引起脂質代謝改變的情形發生，使血脂組成更傾向於代謝症候群之特徵。根據 Wing RR 等人於研究中將更年期婦女(menopause)與更年期前期 (perimenopause)婦女做比較，發現在三年的觀察期間，其兩組之間的體重並無顯著差異性，然而更年期婦女的組別之腰臀比(waist to hip ratio, WHR)及腹部脂肪、腹部間脂肪堆積顯著增加(Wing, Matthews, Kuller, Meilahn, & Plantinga, 1991) 。學者推測更年期婦女此種脂肪堆積的形式(android-type fat distribution )可能部份和雌激素濃度降低、男性賀爾蒙/雌激素比值增加相關，且上述因素也和動脈硬化脂蛋白及空腹胰島素濃度的增加具強烈相關性 (Soler, Folsom, Kaye, & Prineas, 1989)。. 9.

(11) 第二章文獻回顧. 第二節雌激素與動脈硬化壹、動脈硬化 (一) 動脈硬化相關之危險因子動脈硬化是造成心臟病發及中風的主要潛在因素，於西方國家中，死因為動脈硬化的比例高達 50%。其通常被視為一種慢性發炎的型式，是由許多危險因子的影響之下，促使動脈壁血管內皮層(endothelial lining)損傷所引起，當內皮細胞損傷失去保護功能，則會導致動脈壁通透性改變、細胞表面黏附因子及細胞激素表現增加等促發炎現象(Ross, 1999)。使內皮細胞功能異常而造成動脈硬化的可能原因包括了 LDL 濃度的增加、吸菸造成的自由基堆積、高血壓、糖尿病、基因變異、血中 homocysteine 濃度上升以及微生物感染…等危險因子，在眾多遺傳和環境危險因子當中，美國心臟學會(American Heart Association)於 1999 年的疾病預防會議中將其分成以下三項類別： (1)傳統危險因子(Traditinal and conventional risk factors) 屬致病性危險因子，已有大量研究證據證實和動脈硬化有直接因果相關的危險因子。如：抽菸、糖尿病、血脂異常及高血壓 (2)條件性危險因子(conditional risk factors) 和心血管疾病風險的增加具相關性，但還未被完整引證的危險因子。如：同型半胱氨酸(Homocysteine)、C-反應蛋白(C-reactive protein;CRP)、纖維蛋白原 (Fibrinogen)、脂蛋白(a)(Lipoprotein(a))、高三酸甘油酯血症…等。 (3)促發性危險因子(predisposing risk factors) 透過具強烈因果相關危險因子(傳統危險因子)的作用或影響條件性危險因子而造成其加速動脈硬化發展或獨立影響的危險因子。如：年齡、性別、家族史、基因遺傳、種族，以及過重、肥胖活動量不足、非糖尿病胰島素阻抗、社會隔離、憂鬱及壓力…等。除了以上三種分類的危險因子之外，動脈硬化相關的危險因子正不斷擴大中，仍有些動脈硬化病程相關的顯著變化需要運用，而為了適應這一個納入現有知識的 10.

(12) 第二章文獻回顧. 分類系統，非此三個類別的危險因子則歸類為 emerging risk factors (Liapis, Avgerinos, Kadoglou, & Kakisis, 2009)。. 表 2-3 動脈硬化及心血管疾病危險因子的分類 (Liapis, Avgerinos, Kadoglou, & Kakisis, 2009) Table 2-3 Categories of risk factors for atherosclerosis and cardiovascular diseases(Liapis, Avgerinos, Kadoglou, & Kakisis, 2009) conventional. predisposing. conditional. 年齡糖尿病. 性別：男性、停經後婦女. 血脂異常. 過重/肥胖. 高血壓. 胰島素阻抗體能活動不足. emerging 發炎指標(Inflammatory markers)：. CRP(hsCRP). Serum amyloid A, WBC count,. Fibrinogen. cytokines (IL-1_, IL-6, IL-10, IL-18,. Lipoprotein(a). MCP-1 etc),cell adhesion molecules. Hypertrigyceride. (ICAM-1, VCAM-1, P-selectin, etc),. 家族遺傳史/基因. soluble CD40 ligand,. 社會經濟因素、. protease activated receptors, ESR,. 種族、民族. lipoprotein-associated PLA2 傳染性物質(Infectious agents): Chlamydia pneumoniae, CMV,HSV 1 and 2, Helicobacter pylori, hepatitis A 血管鈣化指標 (Vascularcalcification markers): osteopontin, osteoprotegerin, setuin 高凝狀態和止血的因素 (Hypercoagulable states and hemostatic factors): Lupus anticoagulant, D-dimers, markers of platelet activation, TPA, PAI-1, prothrombin 1 and 2, protein Z. 11.

(13) 第二章文獻回顧. 基質金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinases) 內皮幹細胞(Endothelial progenitor cells) 脂肪細胞因子（Adipokines） leptin, adiponectin 白蛋白，肌酐，尿酸(Microalbuminuria, creatinine, urate) 氧化壓力(Oxidative stress): ox-LDL, LOX-1,myeloperoxidase, oxidant capacity, ROS, etc 其他各方面因子(Miscellaneous): alcohol, PAPPA-A, asymmetric dimethylarginine, HSP sdLDL. CMV, Cytomegalovirus; CRP, C-reactive protein; ESR, erythrocyte sedimentation rate; hsCRP, high-sensitivity C-reactive protein; HSP, heat-shock proteins;HSV, herpes simplex virus; ICAM-1, intercellular adhesion molecule 1; IL, interleukin; LOX-1, lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1; MCP-1,monocyte chemotactic protein-1; ox-LDL, oxidized low-density lipoprotein; PAI-1, plasminogen activator inhibitor-1; PAPPA, pregnancy-associated plasma protein-A; PLA2, phospholipase A2; ROS, reactive oxygen species; sdLDL, small dense low-density lipoprotein; TPA, tissue plasminogen activator; VCAM-1,vascular cell adhesion molecule-1; WBC, white blood cell.. 12.

(14) 第二章文獻回顧. (二) 動脈硬化致病機轉心血管疾病是導致人類死亡的主要原因之一(Murray & Lopez, 1997)。而於心血管疾病領域當中，動脈硬化已被視為一種發展緩慢且複雜的慢性發炎疾病。 Ross 及 Glomset 於 1973 年首先提出了動脈硬化的致病機轉假說： response-to-injury，認為動脈硬化起始源自於血管內皮細胞的損傷及功能異常所造成。其動脈硬化的病理特徵發展進程大概分為下列幾個階段： (1)內皮細胞功能失調(Endothelial Dysfunction) 動脈硬化損傷最早發生於內皮細胞產生改變，其改變包括了受到一氧化氮(nitric oxide)、前列環素(prostacyclin)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor)、血管緊張素-二(angiotensinII)，與內皮素(endothelin)的影響，造成內皮細胞對脂蛋白和血漿中要素的通透性增加，促使低密度脂蛋白(low-density lipoprotein)移入血管內膜，沉積於內皮下間隙(subendothelial space)並氧化生成氧化性低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein)，除此之外，也增加白血球黏附分子(leukocyte adhesion molecules，如：L-selectin, integrins, platelet–endothelial-cell adhesion molecule 1)、內皮細胞黏附分子(endothelial adhesion molecules，如：E-selectin, P-selectin, intercellular adhesion molecule 1, vascular-cell adhesion molecule 1)的表現，連同受到氧化性低密度脂蛋白及細胞激素刺激而分泌的單核球趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1)、介白素-8 （interleukin-8）、PDGF、巨噬细胞群落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor)、造骨蛋白（Osteopontin）共同影響促使白血球遷移至動脈壁。 (2)脂肪條的形成(Fatty-Streak Formation) 脂肪條的形成為血管損傷早期現象，其最先是由富含脂質的單核球和巨噬細胞、 T-淋巴球所組成，接著於形成過程中涉及了平滑肌細胞的移形、泡沫細胞的形成、T-cell的活化、血小板聚集和附著等發炎反應，並刺激白血球移行、附著於血管壁。 (3)更為複雜的損傷(Formation of an Advanced, Complicated Lesion) 當脂肪條進展為更嚴重的損傷，其會藉著連續的白血球附著以及滲入進行巨噬細胞堆積，且會由平滑肌細胞生成纖維帽並覆蓋白血球、脂質及其殘骸的混合物， 13.

(15) 第二章文獻回顧. 最終導致壞死核(necrotic core)生成。和巨噬細胞堆積相關的因子包括了：macrophage colony-stimulating factor, monocyte chemotactic protein 1,oxidized LDL，纖維帽的形成和platelet-derived growth factor, transforming growth factorb, interleukin-1, tumor necrosis factor a的活性增加、結締組織退化減少相關。而壞死核的生成代表凋亡(apoptosis)和壞死的結果，增加了蛋白質水解活性和脂質的堆積。 (4)不穩定纖維斑塊(Unstable Fibrous Plaques in Atherosclerosis) 纖維帽的破裂或纖維斑塊潰瘍通常發生於纖維帽變薄的位置，造成纖維帽變薄主要是由於巨噬細胞的活化和滲入，釋放出金屬基質蛋白酶(metalloproteinases)及其他蛋白質水解酵素(proteolytic enzymes)，導致基質(matrix)的裂解並形成血栓或出血。. 14.

(16) 第二章文獻回顧. 圖 2-1 動脈硬化過程-(a)內皮細胞功能損傷(b) 脂肪條形成(c) 更為複雜的損傷 (d) 不穩定纖維斑塊(Ross,1999) Figure2-1 (a)Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis (b) Fatty-Streak Formation in Atherosclerosis (c) Formation of an Advanced, Complicated Lesion in Atherosclerosis (d) Unstable Fibrous Plaques in Atherosclerosis(Ross,1999) (a). (b). (c). (d). 15.

(17) 第二章文獻回顧. (三) 動脈硬化相關因子 (1)MMP-9(matrix metalloproteinases-9) 在動脈硬化病程發展中，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases; MMPs)會大量表現並參與心血管疾病致病之過程。基質金屬蛋白酶是一個需要鋅離子的肽鏈內切酶(endopeptidase)家族，由單核球、巨噬細胞、平滑肌細胞所分泌製造出，當基質金屬蛋白酶過量分泌，會分解血管壁上之細胞外基質(extracellular matrix; ECM)，造成血管新生(neovascularization)、斑塊破裂及細胞移行、增生等發炎現象，進而形成血栓(atherothrombosis)，調控著動脈硬化中不同分期的狀態(Rodriguez, Orbe, & Paramo, 2007)。基質金屬蛋白酶可根據受質特異性及結構的不同分為 collagenases (MMP1,8 及 13)、gelatinase (MMP-2 和 9) 、stromelysins (MMP-3,10 及 11)及 membrane-type MMPs(MT-MMP)四大類，而 MMP-9(matrix metalloproteinases-9)即屬於基質金屬蛋白酶四大分類中 gelatinase 類別中的一種(gelatinase B)，分子量為 92kDa，主要可以分解細胞外基質(extracellular matrix; ECM)中的膠原蛋白 Type IV、V、 VII、X、XIV，及 gelatin、elastin、proteoglycans 等(Rodriguez, Orbe et al. 2007)。 MMP-9 於動脈管壁中平滑肌細胞的移行扮演著重要的角色。當血管受到損傷， MMP-9 會分解細胞外基質，並使血管中層的平滑肌細胞移行至內膜，產生血管內膜增生之動脈硬化現象(Luttun et al., 2004)。動脈硬化斑塊是一個動態的構造，歷經細胞外基質連續的 remodeling。斑塊中若產生內部出血(intraplaque hemorrhage)、纖維帽破裂(cap rupture)、纖維帽潰瘍(cap ulceration)等急性改變，則易造成臨床上局部性出血之症狀(Falk, Shah, & Fuster, 1995)。研究發現，MMP-9 在動脈硬化不穩定斑塊中的表現量極高(Loftus et al., 2000)，若過度表現，則會使不穩定斑塊產生破裂，而爆破出血形成血栓造成猝死的危險。Kai 等人(Kai et al., 1998)發現，患急性冠心病症狀之病人，血漿中 MMP-9 的濃度會產生明顯增加的現象，但此現象是短暫的。顯示 MMP-9 於動脈硬化中斑塊不穩定的發生過程中扮演一重要角色。另外，MMP-9 的濃度也可以反應發炎的程度(S. J. Lin et al., 2007)，藉由抑制其酵素活性，當作藥物治療斑塊不穩定的目標。. 16.

(18) 第二章文獻回顧. (2) IL-1β(Interleukin-1β) IL-1β源自於 IL-1，和另一分子 IL-1α執行相似但不完全相同的生物功能。合成 IL-1 的先驅分子之分子量為 31kDa，經由 IL-1β-converting enzyme 作用之後，會形成 17.5kDa 之成熟分子(Cerretti et al., 1992)。IL-1β存在於發炎位置，會誘導發炎(Dinarello & Wolff, 1993)，研究發現 IL-1β會與 TNF-α在許多細胞中行加乘作用，活化促發炎的反應，並且增加內皮細胞黏附因子的表現(Iida & Komiyama, 2009)。動脈硬化為慢性發炎反應，Kirii 等人(Kirii et al., 2003)於動物實驗中指出，缺乏 IL-1β的 ApoE -/- mice 動脈硬化損傷程度可降低約 30%，並且伴隨 VCAM-1 及 MCP-1 表現減少的現象，顯示其與動脈硬化致病過程具密切相關性。 (3) HO-1 (Hemoxygenase-1) 第一型血紅素氧化酶(Hemoxygenase-1,HO-1)，為一分子量 32-kDa 之蛋白質，能夠藉著許多的刺激源(如：重金屬、活性氧、細胞激素、氧化 LDL…)而受到誘發，其可分解催化紅血球中原卟啉環四吡咯血紅素(protoporphyrin ring of tetrapyrrole heme)，進而釋放出膽紅素(bilirubin)、一氧化碳(CO)及二價鐵離子 (ferrous iron) (Ponka, 1999; Tenhunen, Marver, & Schmid, 1968) 。在所分解的產物中，膽紅素具防禦氧化壓力的能力；研究指出，血清中高濃度的膽紅素可能藉由抑制 LDL 氧化及清除自由基的途徑而與動脈硬化風險呈現負相關的情形(Neuzil & Stocker, 1994)；而另一產物：一氧化碳於血管緊張度的生理角色則類似於一氧化氮(NO)，可使血管擴張，對急性高血壓具保護的潛力，故缺乏 HO-1 的小鼠會患有肺高血壓症(pulmonary hypertention)之症狀(Liu, Chapman, Peyton, Schafer, & Durante, 2002; Morita & Kourembanas, 1995; Yet et al., 1999)。鐵離子也為 HO-1 的產物之一，其可提供電子，具有細胞毒性之潛力，會促氧化，但會與肝臟中衍生出的鐵蛋白(ferritin)結合，間接進行抗氧化作用 (Balla et al., 2007)。雖然 HO-1 的三個產物中膽紅素與一氧化碳具保護作用、鐵離子會促氧化，但研究已顯示出其保護性之功能超越鐵離子的害處，故 HO-1 對於氧化壓力的保護、心血管疾病致病過程具有十分重要的保護機制(Idriss, Blann, & Lip, 2008)。 (4) TM (thrombomodulin) 凝血酶調節素表現於血管內皮細胞表面，為生理上重要抗凝血因子，能夠和 17.

(19) 第二章文獻回顧. 可活化 fibrinogens、platelets 等凝血因子的凝血酶(thrombin)結合，當結合成複合體後，TM 會活化 protein C，使其由促凝血的蛋白酶，轉換成抗凝血，中斷凝血機制，進而達到抑制凝血、減緩發炎等反應(Califano et al., 2000)。研究顯示，TM 可以經由 MAPK/ERK 的途徑修飾 thrombin receptor 依賴的細胞內訊息傳遞，進而抑制平滑肌細胞增生，故能夠調節受動脈硬化損傷攻擊的血管壁，可降低血栓、新生內皮層(neointima)形成；亦可減少發炎細胞滲入、基質裂解之情形(Waugh et al., 2000)，顯示 TM 對於動脈硬化之病理形成機制扮演重要的相關因子。 (5) Adiponectin Adiponectin 又名 Acrp30 (adipocyte complement-related protein of 30 KD)、apM1 (adipose most abundant gene transcript 1)、AdipoQ 或 GBP28 (gelatin binding protein of 28 KD)，分子量約 30kDa，為類膠原蛋白的一種(collagen-like protein)，是由脂肪細胞所分泌之細胞激素。其豐富表現於脂肪細胞中，且於脂肪組織中同時具有自分泌(autocrine)以及旁分泌(paracrine)的作用，這些作用涉及了分化、基因表現和生物功能，並連同內分泌作用共同影響血糖恆定、脂質代謝以及血管生理，於體內執行胰島素敏感、抗發炎、抗動脈粥狀硬化等作用(Lara-Castro, Fu, Chung, & Garvey, 2007)。 Adiponectin 主要分泌於血液循環當中，濃度到達 0.5~30ug/ml 即可被偵測到，相較於其他種類的細胞激素，其濃度是相對較高的(Arita et al., 1999)。研究發現，Adiponectin 可降低動脈硬化損傷區域的大小，並抑制血管新生內膜 (neointima)增厚及受傷血管中平滑肌細胞的增生(Matsuda et al., 1998) ，也能減少 VCAMs 的表現(Ouchi et al., 1999)。 Li 等人(Li et al., 2007)，利用血管內超聲波掃描術（intravascular ultrasonography），將人類 adiponectin 重組腺病毒蛋白(recombinant adenovirus expressing human adiponectin , Ad-APN)經由 adventitia 或 intima 的途徑 transfer 於紐西蘭兔體內表現，結果發現不管是經由何種途徑，受 Ad-APN 處理的組別，動脈硬化斑塊的大小分別下降了 28.9%及 25.6%，並且同時也抑制了 VCAM-1、 ICAM-1 mRNA 的表現量；另有一研究將小鼠內 apM1 基因剔除(adiponectin knockout mice)，發現會造成小鼠體內產生胰島素抗性，並加劇血管新生內皮層 18.

(20) 第二章文獻回顧. 之形成(Kubota et al., 2002)，顯示 adiponectin 具有抗動脈粥狀硬化之功效，於動脈硬化的預防上扮演著重要的角色。 Adiponectin 在對胰島素敏感組織調節葡萄糖及脂質代謝上也扮演了很重要的角色：Beltowski 等人於研究中指出，Adiponectin 可能經由增加脂質氧化、抑制糖質新生作用或是抑制脂肪組織上 TNF-α 的訊號傳遞、直接影響胰島素訊息傳導等途徑來促進胰島素敏感性(Beltowski, 2003)。研究發現，將人類 adiponectin 基因轉殖於小鼠肝中表現，可顯著下降脂肪堆積而減少體重增加，內臟、腹腔中脂肪細胞也較小，並有較長的壽命(Otabe et al., 2007)。且當腹部脂肪、血漿葡萄糖、HA1c 以及胰島素抗性增加，血漿 Adiponectin 濃度即下降(Lara-Castro et al., 2007)。其他研究也證實，Adiponectin 濃度的降低和肥胖的發展相關，且患第二型糖尿病和心血管疾病的病人體內之 Adiponectin 濃度顯著低於一般健康個體。(Hotta et al., 2000; Ouchi et al., 1999; Pischon et al., 2004)；顯示 Adiponectin 一貫地和一些代謝症候群的構成要素相關。 (6) Leptin leptin，瘦體素，分子量16kDa，由白色脂肪細胞所分泌，研究指出瘦體素於囓齒類中可增加胰島素敏感度(Sivitz, Walsh, Morgan, Thomas, & Haynes, 1997)，亦可調控囓齒類動物和人類食物攝取、能量消耗及全身能量平衡等作用。由於其會作用在腦中的下視丘，產生飽足感而減少進食量(Houseknecht, Baile, Matteri, & Spurlock, 1998)，故當掌控leptin的基因發生突變、使leptin濃度減低時，會使食物攝取增加，易有肥胖風險。一開始對 leptin 的了解是作為抗肥胖的賀爾蒙，但 leptin 的表現受脂肪組織能量儲存狀況影響(Hamilton, Paglia, Kwan, & Deitel, 1995; Tritos & Mantzoros, 1997)。代謝症候群包含腹部肥胖、胰島素拮抗、高 TG、低 HDL-C、高血壓，目前很多學者認為這些症狀的產生是由腹部肥胖所引起，故當腹部肥胖現象產生，脂肪細胞質量變大時，脂肪細胞所分泌 adipokines 亦增加，會產生更多的 leptin，形成”leptin resistance”的狀態，引起胰島素拮抗、影響內皮細胞功能，或致動脈粥狀硬化等作用(Lau, Dhillon, Yan, Szmitko, & Verma, 2005)。Lee 等人(Lee, Shin, & Choue, 2009)於研究中利用不同的飲食(高脂或高糖)觀察 C57BL/6 小鼠血脂以及促發炎因子、adipokines 之狀態。結果發現受高脂誘發體重、體脂肪增 19.

(21) 第二章文獻回顧. 加之肥胖小鼠體內 leptin 濃度顯著增加，且此組別之小鼠體內促發炎因子 IL-6 及 TNF-α、葡萄糖、胰島素濃度、HOMA-IR 指數及血膽固醇、肝臟 TC、TG 濃度亦顯著高於 leptin 低之組別，顯示體重及脂肪組織皆與 leptin 相關，且 leptin 濃度會影響體內發炎反應之現象。此外，於 leptin 與心血管疾病方面之臨床研究顯示，血管造影中確認具冠狀動脈硬化病情之患者，其 leptin 濃度是未來心血管疾病的重要獨立預測因子(Wolk et al., 2004)。但 leptin 對於心血管疾病病理影響頗為複雜，至今尚未完全被了解，仍待更深層之研究。. (四) 應用於動脈硬化研究之動物模式過去許多研究曾使用兔子以及基因轉殖鼠作動脈硬化研究，而 ApoE 基因剔除鼠(ApoE knockout mice)則為最受歡迎的動物模式。主要是因為正常小鼠與人類脂蛋白代謝的情況不同，其體內膽固醇大部分為 HDL 所攜帶，儘管正常小鼠攝食或合成膽固醇，肝中 LDL 仍能快速被清除，導致血清中膽固醇濃度大約只有 85mg/dl，無法誘發出動脈硬化中高血脂的狀態。而 ApoE 基因為由肝和腦所合成的一種醣蛋白，可作為接受器的 ligand，清除乳糜微粒(chylomicrons)及 VLDL(very low-density lipoprotein)；也可藉著血管中的單核球及巨噬細胞被合成，故被認為對於膽固醇恆定以及動脈硬化血管中的發炎反應具有局部效應。研究發現，若將 ApoE 基因剔除，此基因轉殖鼠將會自發性地產生動脈硬化症狀，即使餵食一般飲食(chow diet)，血液中膽固醇濃度仍高於 500mg/dl(Meir & Leitersdorf, 2004)。Piedrahita 等人發現，餵食 ApoE 基因剔除小鼠 chow diet，於十週大可觀察到泡沫細胞損傷；十五週時會發展出包含泡沫細胞及平滑肌細胞的中程度損傷，纖維斑塊的病灶於二十週齡可觀察到；更加嚴重的鈣化及血管壁變薄情形則至少於 32 週齡時發生。而若將飲食型態轉換為西方飲食(western diet)，則會更加速動脈硬化病程的發展(Piedrahita, Zhang, Hagaman, Oliver, & Maeda, 1992)。頭臂動脈是連接主動脈弓到右鎖骨下動脈和右頸總動脈的小血管，最近研究指出，年紀較大的 ApoE 剔除鼠於頭臂動脈(brachiocephalic artery)斑塊堆積情形和人類脆弱的斑塊相似，其包括了細胞核心壞死、斑塊內出血、壞死物通過血管腔… 20.

(22) 第二章文獻回顧. 等現象(Rosenfeld et al., 2000)。可提供一個小小的易分辨的區域，研究斑塊由穩定到破裂的過程(Williams, Johnson, Carson, & Jackson, 2002)。. 貳、更年期婦女雌激素缺乏與動脈硬化相關性已有多筆流病研究指出，男性和停經後婦女罹患心血管疾病的風險高於停經前婦女，顯示雌激素可能對心血管具有保護作用。此風險的降低可能部分是因為雌激素於脂質代謝上的作用以及血漿中脂蛋白成分為較傾向於不易產生動脈硬化所導致。另有研究指出，雌激素除可經由降低體脂肪量，影響胰島素敏感度與動脈硬化的形成，也可直接影響脂蛋白代謝、內皮細胞功能、降低血液中單核球細胞的黏結(Zhu, Everson, & Smart, 2004)。Patricia 等人於動物實驗中發現，給予雌激素處理的去卵巢 ApoE 剔除母鼠在動脈硬化損傷形成上具有抑制的效用，並且可降低血液中總膽固醇、三酸甘油酯濃度，加速脂蛋白 VLDL 的清除速率。另外，雌激素亦具抗發炎作用，停經後婦女血液中 CRP、SAA、IL-6 等發炎因子顯著上升 (Wakatsuki, Ikenoue, Shinohara, Watanabe, & Fukaya, 2004)，也有研究指出，其可藉由下降 ICAM-1、VCAM-1、TNF-a 等發炎因子來抑制心血管疾病之發生，除此之外，停經後肝臟脂解酶 (hepatic lipase, HL)活性提高，LPL 活性也有些微增加，因而增加 LDL 及 HDL 上之 TG、phospholipid 水解，使 LDL 粒子變得更小且更緊密，造成更易導致血管粥瘤形成之現象(Tikkanen, Wahala, Ojala, Vihma, & Adlercreutz, 1998)，顯示雌激素對於心血管疾病具保護作用。. 第三節植物性雌激素(Phytoestrogens) 壹、植物性雌激素生理功能及分類植物性雌激素屬植物化合物中的一個家族，為植物於代謝中生成的多酚非固醇類二級副產物(polyphenolic non-streroidal secondary by-products)，存在於人體或動物的膽汁、尿液、精液、血液或糞便中，具有和哺乳類雌激素 17 β-estradiol(E2) 相似的化學構造和功能，並且能夠和雌激素受器(estrogen receptor;ER)結合(Zava & Duwe, 1997)。多筆研究指出，植物性雌激素同時具有雌激素促進劑(agonist)與拮抗劑(antagonist) 21.

(23) 第二章文獻回顧. 之效用，於代謝中可根據內生性雌激素17 β-estradiol濃度、性別以及停經狀態的不同，而決定其執行雌激素作用(Estrogenic effect)或是抗雌激素作用(Antiestrogenic effect)的特性。研究發現，當植物性雌激素的本身濃度處於10-5~10-8M，會刺激雌激素受器，與受體結合並產生雌激素效用；於10-4~10-5M濃度時，則會和17 β-estradiol競爭雌激素受器執行抑制作用，產生抗雌激素作用(Wang, Sathyamoorthy, & Phang, 1996)。而由於植物性雌激素同時具有agonist和antagonist作用，可將之視為一種選擇性雌激素受體調節器 (selective estrogen receptor molulators, SERMs)。 SERMs可和雌激素受器(ER)結合，並根據組織的形式改變接受器的生物活性。雌激素受器主要分為 ERα和 ERβ兩種形式，其根據目標位置的不同而改變本身的分佈和密度：ERα主要存在於乳房、子宮、卵巢組織、睪丸、腎上腺、腎臟中； ERβ則分佈於乳房、子宮、卵巢組織、前列腺及腦、胸腺、肺、心血管系統、膀胱、骨骼及皮膚中(Enmark & Gustafsson, 1999)。植物性雌激素對於 ERβ有較高的結合力，可選擇性作用在心血管與骨骼，減少刺激乳房或子宮內膜。目前植物性雌激素大致可分為四類，其皆為酚類化合物，分別為：異黃酮 (isoflavone)、木質素 (lignan)、香豆素 (coumestane)及二苯乙烯(stilbenes)；異黃酮主要存於豆類食品中，為類黃酮(flavonoids)的亞綱，以配糖類(glycoside)的形式存在，於腸道中被水解成糖苷配基(Aglycones)，並經由小腸內皮細胞被傳送 (Dixon & Ferreira, 2002; Sumner, Mendes, & Dixon, 2003)。木質素主要的飲食來源為種子、全麥麵包、蔬菜、茶，可被腸內微生物轉變為 enterodiol 和 enterolactone (Mazur et al., 1998)；香豆素於植物發芽期間含量豐富，coumesterol 是具有雌激素活性的主要化合物，可激活雌激素受器的訊息傳遞路徑，主要來自於豆科植物的芽或是牧草中(Franke, Custer, Cerna, & Narala, 1995; Knuckles, deFremery, & Kohler, 1976)；而二苯乙烯分類中的 resveratrol 已被認定為植物性雌激素的主要化合物，以高濃度存在於葡萄皮中(Gehm, McAndrews, Chien, & Jameson, 1997)。. 貳、植物性雌激素與停經後婦女代謝症候群之相關性女性於停經後因缺乏雌激素保護，使得體內血脂濃度、體脂肪分佈及葡萄糖代謝產生紊亂，進而發展出高血壓、中心型肥胖、血脂異常、高血糖、高度心血管 22.

(24) 第二章文獻回顧. 疾病風險…等代謝症候群症狀；過去使用雌激素(estrogen)和黃體素(progestogen) 於賀爾蒙替代療法(Hormone replacement therapy，HRT)中來改善上述病情，但體內荷爾蒙的補充卻可能增加乳癌及子宮內膜癌、陰道出血等之風險，故基於避免發生這些副作用，尋找一可取代雌激素並可提供雌激素保護作用之預防性處理，對於停經婦女保健可謂一大福音 (de Kleijn, van der Schouw, Wilson, Grobbee, & Jacques, 2002)。研究發現植物性雌激素對於冠心疾病、動脈硬化、高血脂、癌症、及骨質疏鬆症等停經相關代謝症候群症狀具有改善的效果；如：多筆動物實驗研究結果中顯示，黃豆中所含的植物性雌激素可改善血脂、降低主動脈膽固醇酯濃度以及增加肝臟和脂肪組織中 insulin receptor mRNA 含量(Iritani, Sugimoto, Fukuda, Komiya, & Ikeda, 1997; Tham, Gardner, & Haskell, 1998)；具雌激素活性的 coumestrol 除了可影響生物體脂質代謝外，也可經由 insulin receptors 的改變作用於醣類代謝中調控個體肥胖或糖尿病的情況(Nogowski, Nowak, & Mackowiak, 1992)。因此，植物性雌激素的攝取可能對於停經婦女胰島素阻抗減低、抗氧化等代謝症候群相關症狀具潛在益處。. 参、植物性雌激素對心血管疾病的影響及作用機制已有多筆研究指出，雌激素對於心血管疾病具保護作用。植物性雌激素構造和雌激素相似，可和雌激素受器結合執行類似雌激素的功能，已有研究證實植物性雌激素可下降冠狀動脈心臟病(coronary heart disease)之風險。如：Anthony 等人 (Clarkson, Anthony, & Klein, 1996)於研究中餵食恆河猴易致動脈硬化的飼料，並於不同組別各自添加具植物性雌激素的大豆蛋白或是以酒精萃取不具植物性雌激素的大豆蛋白，結果發現餵食具植物性雌激素大豆蛋白的組別其血液中 LDL、 VLDL、膽固醇的濃度顯著降低，而母猴的 HDL 濃度呈現顯著增加的情形，顯示其植物性雌激素的成分於血脂和脂蛋白濃度調節上具有效用。而另外 Dodge 等人(Dodge et al., 1996)於研究中使用去卵巢大鼠為動物模式，投與大鼠口服劑量為 0.1~3.0mg/kg BW 的 isoflavone genistein，持續五週後，發現其具有顯著下降膽固醇濃度之功能。另外於大豆蛋白的後設分析研究中也發現，人類補充大豆蛋白能夠分別下降血清中總膽固醇、LDL、三酸甘油酯濃度 9.3%、12.9%和 23.

(25) 第二章文獻回顧. 10.5%(Tikkanen et al., 1998; Wiseman et al., 2000)。給予停經前及停經後婦女大量大豆異黃酮的補充，可促進動脈血管的順應性(arterial compliance)22%以上，增加心臟收縮和舒張期間動脈擴張和彈回的能力，減低動脈硬化發生率，顯示其可作用於動脈壁上增進血管的反應(Nestel et al., 1997)。在眾多降血脂、調節脂蛋白濃度等心血管保護作用的結果中，一些學者提出了植物性雌激素降血脂益處的可能機制：其一為 LDL receptors 活性增加，刺激了膽固醇的清除(Sirtori et al., 1995)，其二可能為植物性雌激素中的 Lignan 抑制了膽固醇中初級膽酸形成的速率限制酵素(cholesterol-7α-hydroxylase)活性，而影響了膽固醇恆定，使內生性膽固醇的合成被抑制(Hirose et al., 1991)。另外於多項研究中也發現，genistein 可作為蛋白酪氨酸激酶的抑制劑(protein tyrosine kinase inhibitor)，能夠將蛋白酪氨酸磷酸化，使血小板活化降低、減少血小板聚集和沉積，抑制動脈硬化病程的發展(Sargeant, Farndale, & Sage, 1993)。. 肆、植物性雌激素活性材料 (一)苜蓿芽苜蓿(Alfalfa)，學名 Medicago sativa L.，屬溫帶植物，為禾本科，多年生豆草，品種眾多。本次研究所使用的品種為澳洲紫花苜蓿，英文又稱為 lucerne，享有「藥草之王」(king of the herbs)美名，原產於亞洲西部及地中海東區，美國、澳洲與中南美洲為其盛產地，為普遍之日常食用蔬菜，營養豐富，且價值遠高於其它的豆種。苜蓿為含高成份皂素(saponin)及三烴基異黃酮(Ginistein俗名金雀異黃酮)、木質素異黃酮(Daidzein)等植物性雌激素成分的豆類植物，這些成分皆有益於心血管疾病的預防。其中具植物性雌激素活性的coumestrol，於苜蓿芽中含11~118 pg/g 的濃度，可刺激子宮的活性。研究中發現此成分能夠結合雌激素受器α和 β(ERα,ERβ)，且與ERβ 親和力甚至高於E2(Kuiper et al., 1998)，可有效地降低去卵巢大鼠血清中總膽固醇濃度，並防止因缺乏雌激素所引起之骨質流失症狀。另外有體內實驗研究發現，將苜蓿添加於飼料中餵食具高血脂的紐西蘭兔 12 週，可下降其血液中總膽固醇、LDL、三酸甘油酯濃度，顯著增加 HDL 濃度，且大動脈中脂肪條(fatty streak)的形成在苜蓿的影響下顯著減少(Asgary, 24.

(26) 第二章文獻回顧. Moshtaghian, Hosseini, & Siadat, 2008)。. (二)茉莉茉莉，又名茉莉花，原產於印度、巴基斯坦，為素馨屬（Jasminum）常綠灌木或藤本植物的統稱。株高 1~1.5 公尺，葉具光澤，葉色翠綠並呈橢圓或廣卵形，單葉對生，葉脈羽狀，近全緣，花多為白色，有梗且具濃郁香氣(王雲章， 1989)。茉莉之花、葉、根可入藥，屬常見之中國藥用植物。過去傳統將其茉莉之花用於泡茶飲用，具有理氣、開鬱、安神、辟穢，治外表發熱、瘡毒等功效，印度也廣泛將茉莉之花和葉作為民間醫藥以預防婦女乳癌發生以及子宮出血症狀的抑制(Kolanjiappan & Manoharan, 2005)。對於茉莉的科學研究指出，茉莉乙醇萃取物對於受傷的大鼠具有鎮痛以及抗發炎的效果(Atta & Alkofahi, 1998)。Kolanjiappan 等人(Kolanjiappan & Manoharan, 2005)也於實驗中發現，利用口服的方式投與大鼠 300mg/kg 的茉莉花乙醇萃取物十四週，可抑制大鼠腫瘤的生成，同時也具有抗脂質過氧化並促進抗氧化之作用。除此之外，研究指出茉莉具雌激素活性(陳永如，2007)，也含 flavonoids 成分，於過去研究發現植物中的 flavonoids 和心血管疾病的致死率呈負相關，對於動脈硬化中脂蛋白氧化、血小板聚集以及葡萄糖恆定、肝臟脂質代謝等具有益處 (Peluso, 2006)，顯示茉莉對於心血管疾病、肥胖、脂肪肝以及第二型糖尿病的預防或改善可能具有開發之潛力。. 25.

(27) 第二章文獻回顧. 第四節苦瓜壹、苦瓜介紹苦瓜，學名 Momordica charantia，英文名稱為 bitter melon、bitter gourd 或 balsam pear ，印度稱其為 karela ，屬於葫蘆科 (Cucurbitaceae) 家族中之苦瓜屬 (Momordica)，於中國、印度等國家被作為抗糖尿病、治療創傷等疾病之民間醫療用藥。其營養素包括了 94.3％的水，0.7％的蛋白質，脂肪 0.1％，3.1％的碳水化合物，1.2％纖維素，0.5％灰分，及 0.03％少量的維生素 C (台灣食物成份分析，1998)。本次研究所使用的苦瓜品種為山苦瓜，英文名為kakorot，學名Momordica charantia L.var.abbreviata Seringe，中文別名野苦瓜、短果苦瓜、假苦瓜、小苦瓜，原產於熱帶亞洲，而現今在台灣已馴化為野生植物，產期為4~9月，瓜果外型呈長卵橢圓狀，果體較玲瓏，果長3~15公分，果寬2~4公分，約為一般苦瓜的10至 15分之一，表面具疣狀突起和軟刺，未成熟時其果皮為濃綠色，當成熟後則為橘黃色果皮，至熟透後其果皮會自然裂成三片而露出深紅色的種子。山苦瓜比一. 般之苦瓜更加苦中帶甘，可以涼拌、煮食、炒食，或將之泡為苦瓜飲用茶，若煮過後其苦味會轉成苦甘味，具有促進食慾、解渴、清涼、解毒、明目及軀寒之效用。近年山苦瓜已馴化人工栽植，且花蓮農業改良場將該地區山苦瓜進行選種、雜交改良，產出口感介於栽培種大苦瓜及野生小苦瓜之品種，於2004年命名為『花蓮一號』上市販售 (全中和, 2005)。. 貳、苦瓜生理效用及相關研究 (一)苦瓜與動脈硬化過氧化體增殖劑活化受器(PPAR ,peroxisome proliferate-activated receptor)是核受器家族的成員，共有 PPARα、PPARβ 及 PPARγ 三種 isoform，其中 PPARα/γ 對組織的專一性較高，主要存於肝臟、脂肪及心臟組織中。PPARα 是 fibrate 類降血脂藥之作用標的，可有效地降低 TG、游離脂肪酸，並增加 HDL 濃度；PPARγ 則是 Thiazolidinedione (TZD)類抗糖尿藥物之作用標的，同樣於 TG 及游離脂肪 26.

(28) 第二章文獻回顧. 酸濃度具調節作用。近年研究指出，PPARα/γ可能涉及調控動脈硬化後期衍生之血管新生(neoangiogenesis)，而導致冠狀動脈及頸動脈中動脈硬化斑塊破裂的現象(Biscetti et al., 2008) 。台灣趙氏將 CHO-K1 細胞以穩定轉染方式建立出能篩選可活化 PPARα 或 γ 物質的細胞株。結果發現，苦瓜乙酸乙酯萃取物具有活化 PPARα 及 γ 的能力，為 PPARα/γ活化劑，因此推測此萃物對於動脈硬化具保護效用(Chao & Huang, 2003)。本實驗室於先前於動物實驗中發現，投與 1%山苦瓜乙酸乙酯萃取物於高脂飲食餵養之 ApoE 剔除雄鼠，可顯著的降低其新生內層與中層面積比率 57% (p<0.05)，另外也發現 1%山苦瓜乙酸乙酯萃取物可降低餵食高脂飲食 ApoE 剔除鼠之主動脈縱切脂肪堆積 28%，證明山苦瓜乙酸乙酯萃取物具有改善動脈硬化的效果(詹鳳紋，2006)。而以細胞為模式探討苦瓜抗粥狀動脈硬化機轉及有效成分，發現山苦瓜乙酸乙酯萃取物可下降巨噬細胞在 LPS 刺激下 Nitric oxide 及 MMP-9 的產生量(黃湘儒，2007)，另一獨立實驗中也發現，山苦瓜乙酸乙酯萃取物可降低人類主動脈內皮細胞在 TNF-α 刺激下 ICAM-1、MCP-1 表現(蕭嘉羚， 2007)，以及被單核球黏附的程度，顯示此苦瓜萃取物對動脈硬化具保護效益。各方學者不斷研究苦瓜具生理功能的有效成分，發現苦瓜萃物具降低促發炎激素(IL-1β、IL-6、TNF-α)之抗發炎作用(Kobori et al., 2008; Lii, Chen, Yun, & Liu, 2009)，顯示其於動脈硬化中之發炎現象可能具預防及延緩效果。. (二)苦瓜與降血脂作用研究發現苦瓜對具糖尿病大鼠上具降血脂作用。本實驗室於先前動物實驗中發現，投與 1%山苦瓜凍乾粉末於高脂飲食餵養之 ApoE 剔除雄鼠，可顯著下降小鼠血液膽固醇與三酸甘油酯濃度；而山苦瓜乙酸乙酯萃取物具提升血液中 HDL 濃度的功效。此外，其他研究團體亦陸續發現：投與大鼠苦瓜的甲醇、乙醇萃取物及苦瓜汁能夠下降血清總膽固醇、三酸甘油酯、LDL、尿素(urea)、肌酐(creatinine)，丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase; ALT)，天冬氨酸轉氨酶(spartate transaminase; AST)；且增加血清中 HDL-C，顯示苦瓜可能校正高血脂情形，且保護肝腎功能(Abd El Sattar El Batran, El-Gengaihi, & El Shabrawy, 2006; 27.

(29) 第二章文獻回顧. Chaturvedi, George, Milinganyo, & Tripathi, 2004; Fernandes, Lagishetty, Panda, & Naik, 2007)。口服苦瓜汁十週後，能將上升的三酸甘油酯、總膽固醇、磷脂質、 malonedialdehyde(MDA)和下降的 HDL-C 濃度恢復為正常值；而苦瓜也將肝中擾亂的脂質生成酵素活性作恢復，一旦將苦瓜萃取物拿走，則高血糖、高血脂的情形將再度發生(Ahmed, Lakhani, Gillett, John, & Raza, 2001; Chaturvedi, 2005; Yadav, Moorthy, & Baquer, 2005)。 Nerukar 等人利用人類肝癌細胞株(HepG2 cells)為實驗模式，發現苦瓜汁能夠降低細胞內三酸甘油酯的合成、分泌以及 ApoB 的釋出(Nerurkar et al., 2005)，將苦瓜汁投與餵食高脂飲食之大鼠，可以減少其脂肪生成，並下降血清胰島素和瘦體素(leptin)濃度、使葡萄糖耐受性正常化(Q. Chen, Chan, & Li, 2003) 。在眾多苦瓜補充的研究當中，結果發現其能夠顯著下降大鼠血液中總膽固醇、肝中膽固醇及三酸甘油酯濃度，甚至於糖尿病鼠中，也會增加其中高密度膽固醇 (HDL)濃度(Ahmed et al., 2001; Jayasooriya et al., 2000; Virdi et al., 2003)。. (三)苦瓜與降血糖作用本草綱目記載『苦瓜性味苦、寒、無毒，具有清邪熱、解勞乏、清心明目之效；苦瓜子則具益氣壯陽之效』(明.李時珍)。苦瓜於中國傳統醫療中為藥物使用的植物之ㄧ，中國華南以苦瓜作為中草藥方至少 600 年，其可用來作為治療糖尿病、消除腹痛、脹氣之傳統用藥，於現代醫學研究中，苦瓜被認為是”植物胰島素”，為具 166 個殘基的多肽鏈，於皮下注射後具有潛在的降血糖作用(Khanna, Jain, Panagariya, & Dixit, 1981)。研究發現，苦瓜內含有許多具植物生物活性化學成分，包括：苷類(glycosides)、皂素(saponins)、生物鹼(alkaloids)、固定油(fixed oils)、三萜類化合物(triterpenes)、蛋白質和類固醇等(Grover & Yadav, 2004) 。而研究指出，固醇類皂素的混合物：charantins 及生物鹼為苦瓜中的降血糖化學物質；除此之外還有一些分離出的植物化合物(charantins、a polypeptide-p、 momordin Ic、oleanolic acid 3-Omonodesmoside 及 oleanolic acid 3-O-glucuronide) 皆具有降血糖活性；Matsuda 等人指出苦瓜中 oleanolic acid 3-Omonodesmoside 及 momordin Ic 之成分可抗高血糖(Khanna et al., 1981; Matsuda et al., 1998)。苦瓜降低血糖是已被確認的作用，有大量的動物研究證實了苦瓜改善糖尿 28.

(30) 第二章文獻回顧. 病症狀的效用。如：台灣謝氏於研究中發現，山苦瓜全果凍乾粉末及其乙酸乙酯、酒精萃物可預防因高脂飲食造成的高血糖、高血清胰島素及葡萄糖不耐等症狀(謝婉郁, 2005)。Day 等人(Day, Cartwright, Provost, & Bailey, 1990)指出，葡萄糖吸收及胰島素分泌或肝腎功能正常的小鼠於口服苦瓜水萃物之後，可下降其血糖濃度。此外，苦瓜也能降低 STZ 誘導的糖尿病鼠血糖濃度。學者對苦瓜具有的療效提出一些可能性，包括了其能夠抑制 STZ 誘導的過氧化作用以及 β-cells 的細胞凋亡，並且增加了肝和肌肉中的肝醣，活化肝中 glucokinase、hexokinase phosphofructokinase(Rathi, Grover, Vikrant, & Biswas, 2002)。不同溶劑的苦瓜萃取物也有相似降血糖的效果，Miura 等人於研究中以第二型糖尿病基因轉殖小鼠(KK-Ay mice)為動物模式，發現苦瓜的水萃物能夠經由 GLUT4 易位而顯著增加小鼠的胰島素敏感度、降低血糖(Miura et al., 2001)。以四氧嘧啶(alloxan)誘導出糖尿病的大鼠，在口服苦瓜之後，其血糖下降並延遲了白內障的發生(Srivastava, Venkatakrishna-Bhatt, & Verma, 1988); Singh N 等人投與糖尿病大鼠苦瓜的丙酮萃取物 15~30 天後，能夠減少其血糖及血液膽固醇於一個正常的範圍，而即使在 15 天內停止治療，仍能將血糖維持在一個較低的濃度範圍(Singh, Tyagi, & Agarwal, 1989)。另外 Shibib 等人將苦瓜乙醇萃取物投與正常及糖尿病大鼠，發現此萃取物可經由肝中 glucose-6-phosphatase fructose-1,6-bisphosphatase 活性向下調節的途徑抑制動物體內糖質新生作用，且能夠藉著紅血球和肝中的 glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH)活性向上調節而增強葡萄糖氧化，進而下降其空腹血糖於正常值範圍內(Shibib, Khan, & Rahman, 1993) 。. 29.

(31) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群與動脈粥狀硬化之效應第一節前言根據 2003 年 Ford 等人之研究顯示，美國 20 歲及 40 歲以上成年人代謝症候群盛行率分別為 24%及 40%(Ford & Giles, 2003)，而我國台灣成年人之盛行率約為 14%(潘文涵，第三次全國營養健康調查)，顯示代謝症候群於全世界已開發國家患者人數日益增高且將為二十一世紀已開發國家中極為重要之健康危害。代謝症候群包含了腹部肥胖、高血糖、高三酸甘油酯、高血壓、HDL-C 過低等症狀，最終可能因動脈粥狀硬化導致心血管疾病。研究發現，女性於停經前心血管疾病之風險遠低於男性，但停經後，因缺乏雌激素保護，使得體內血脂濃度、體脂肪分佈及葡萄糖代謝產生紊亂，其患心血管疾病風險激增為與男性相當，因此雌激素對心血管疾病可能具保護效果。研究發現植物性雌激素對於冠心疾病、動脈硬化、高血脂、癌症及骨質疏鬆症等停經症狀具有改善的效果；植物性雌激素是一種存在於植物中的化學物質，其構造與雌激素相似，大致可以分為異黃酮 (isoflavone)、木質素 (lignan)、香豆素 (coumestane)及二苯乙烯(stilbenes)四大類，可提供停經婦女雌激素活性，有研究指出，苜蓿芽與茉莉之萃取物皆具雌激素活性(陳永如，2007)，因此本研究以易產生動脈硬化之 ApoE 剔除母鼠為實驗動物模式，依年齡及體重分為四組，小鼠達性成熟後將其卵巢摘除，模擬人類停經引發代謝症候群之代謝紊亂，誘發體脂增重與血脂上升後餵食高脂飼料(20%fat,0.15%cholesterol)加速動脈硬化，並分別投與 1%苜蓿芽乙酸乙酯萃物或 1%茉莉甲醇萃物，餵養 15 週後犧牲，觀察具雌激素活性的苜蓿芽乙酸乙酯萃物及茉莉甲醇萃物是否能夠下降血液中 TG 及 TC、血糖、游離脂肪酸，並增進胰島素及血液 adiponectin、減少脂肪堆積，且 32.

(32) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. 預期降低影響斑塊穩定與發炎情形之 MMP-9、IL-1 因子表現量，增加抗氧化及抗血栓之 TM、HO-1 保護因子表現量，以瞭解此兩種萃物對於抗代謝症候群及保護心血管疾病的效用。. 33.

(33) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. 第二節材料與方法壹、實驗設計及流程. 34.

(34) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. 貳、實驗動物飼養及手術 (一)實驗動物飼養自成功大學醫學院實驗動物中心購買 C57BL/6J apo E knockout 的雌性小鼠 44 隻(共分三個時間點購入，分別於三個時間點分組餵養)，購入後依年齡將小鼠分籠，適應 1~2 週後進行卵巢切除手術，並剪耳標辨別，再經 1 週適應，依年齡及體重將小鼠作 S 形分組分為五籠，分別為假手術組(Sham，20%fat)、高脂組(OVX，20%fat)， 1% 苜蓿芽乙酸乙酯萃物組 (OVX+A ， 20%fat+1%alfalfa) ， 1% 茉莉甲醇萃物 (OVX+JM，20%fat+1%jasminum)，除了假手術組外，其餘三組進行卵巢切除手術，手術後恢復期一週，給予 chow diet(MF-18,oriental yeast,日本)餵食。. (二)假手術及卵巢切除方法當母鼠達性成熟年齡(八~十二週齡)時進行假手術及卵巢切除手術，使用 pentolbarbitol(10mg/ml in 0.9% normalsaline,0.75cc/kg)將其麻醉，於背部脊椎右下及左下方用滅菌過之剪刀剪出皮層和肉層上之小切口，用鑷子將脂肪小心拉出，找到黏附於脂肪上的卵巢並以剪刀切除，剔除卵巢後再將脂肪放回，以手術釘將母鼠之傷口縫合，並擦優碘幫助傷口復合，同法處理另一側。術後給予照光保溫，並觀察術後情形等待甦醒。手術恢復期過後，將小鼠隔夜禁食並以眼窩採血方式取得 baseline 血液，開始給予實驗飼料。動物室環境溫度維持在 25℃，並設定每日 12 小時之光照、黑暗循環，飲水及飼料自由攝取，每週更換飼料並秤重紀錄飼料消耗以及體重增長情形，維持至犧牲為止。. 参、飼料 (一)苜蓿芽凍乾粉末本實驗所使用之苜蓿芽由台糖公司提供，共約 10 公斤全芽直接送至台大食科所，洗淨後進行冷凍乾燥，再自行於實驗室將凍乾後之苜蓿芽打成粉末，得到 0.70 公斤凍乾苜蓿芽粉末，產率為 7％。苜蓿芽凍乾粉末經成分分析，各成分所佔百分比如下：澱粉 33.6％、蛋白質 49.6％、脂質 2.6％、水分 10.5％、灰分 3.7％。 35.

(35) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. (二)茉莉花草粉末本實驗所使用之樣本購自家樂福，為大弘農產出產之茉莉乾燥花，取得乾燥樣品以研磨機打碎成粉末狀後，冰入-20℃冰箱待進行萃取。. (三)苜蓿芽乙酸乙酯萃取物乙酸乙酯萃物由本實驗室自行萃取，取 200g 苜蓿凍乾粉末浸泡於 4L 乙酸乙酯中，室溫下攪拌萃取 24 小時，再將萃取液於 55℃進行減壓濃縮，得到苜蓿芽乙酸乙酯萃取物，萃取率約 3~7％. (四)茉莉甲醇萃取物甲醇萃物由本實驗室自行萃取，取 200g 乾燥茉莉花粉末浸泡於 4L 甲醇中，室溫下攪拌萃取 24 小時，再將萃取液於 55℃進行減壓濃縮，得到茉莉甲醇萃取物，萃取率約 27.4％. (五)實驗飼料組成及配製基本組成參考 AIN-76(American Institute of Nutrition,1997)配方作修正，即將 fat 5% (低脂)之 AIN-76 配方比例經調整過後，使 fat20% (高脂)飲食之 protein, mineral, vitamin, cellulose 其營養密度和 fat 5%相同，並將 corn starch 與 sucrose 比例調整為 1：1。飼料組成與營養成分百分比如表 3-1 所示。實驗組的飼料以高脂飼料做修正，苜蓿芽乙酸乙酯萃物及茉莉甲醇萃物 1%取代高脂飼料中 1% butter，飼料組成與營養成分百分比如表 1 所示。半合成飼料各組共同成份包括酪蛋白 (ICN Biomed)、甲硫胺酸 (Sigma,USA)、玉米澱粉 (Samyang Genex corp, Seoul, Korea) 、蔗糖 ( 台糖精緻細砂 ) 、纖維素 (JRS.Vitacel, German)、奶油 (安佳無水奶油)、紅花籽油 (台糖紅花籽油)、AIN-76 礦物質預混物 (ICN Biomed)、AIN-76 維生素預混物 (ICN Biomed)、膽鹼 (Sigma)、膽固醇 (HAYASHI,Japan )。配製方式為先將粉狀成份依重量秤取，一一加入研缽磨細後混勻，其中蔗糖先使用研磨機磨細後使用。粉狀成份混勻後，分次拌入所需比例的奶油及紅花籽油，均勻混和後，以篩網過篩兩次，裝入雙層封口袋，置-20℃冰箱保存。苜蓿芽乙酸乙酯萃物及茉莉甲醇萃物則加入溶化的奶油或紅花籽油中，再加入其他粉狀成份中。飼 36.

(36) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. 料製成固體的方式為，將置於-20℃冰箱的飼料取出，以一定量粉末飼料分次加入二次水，稍微攪拌後，以 1kg 小型麵團攪拌機攪拌至均勻，秤重，鋪平以小刀切割成小塊，放入 45℃烘箱中烘乾兩天，秤重後，裝入密封袋中，置-20℃冰箱保存。表 3-1 實驗期飼料之組成. 組別. 高脂. 高脂苜蓿組. 高脂茉莉組. casein. 23.5. 23.5. 23.5. DL-methionine. 0.3. 0.3. 0.3. corn starch. 22.4. 22.4. 22.4. sucrose. 22.4. 22.4. 22.4. cellulose. 5.9. 5.9. 5.9. butter. 19. 18. 18. safflower oil1. 1. 1. 1. AIN-76 mineral mixture2. 4.1. 4.1. 4.1. AIN-76 vitamin mixture2. 1.2. 1.2. 1.2. Choline bitartrate. 0.2. 0.2. 0.2. cholesterol. 0.15. 0.15. 0.15. 苜蓿芽乙酸乙酯萃物. -. 1. -. 茉莉甲醇萃物. -. -. 1. Total calorie(kcal/100g). 454.4. 454.4. 454.4. Calorie density(kcal/g). 4.544. 4.544. 4.544. CHO calorie/calorie（％）. 39％. 39％. 39％. protein calorie/calorie（％）. 21％. 21％. 21％. Fat calorie/calorie（％）. 40％. 40％. 40％. Table 3-1 Composition of the Test Diets 1.飼料中的必須脂肪酸需佔總熱量的 1～2％，此必須脂肪酸主要由紅花子油來供應。 2. The composition of AIN-76 mineral mixture and AIN-76 vitamin mixture is as described in J. Nutr. 107:1340-1348(1997). 37.

(37) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. 肆、動物犧牲與樣本收集動物於犧牲前一夜禁食 9~12 小時，隔日犧牲使用乙醚昏迷，用不含抗凝血劑之毛細管進行眼窩採血至無法再取血為止，然後再用針筒進行體外心臟採集血液，一隻老鼠約可採集 1.5-2c.c.全血，血液採集完畢，以高劑量之 pentolbarbitol 確保老鼠完全死亡，從腹部剖開至胸，以鑷子將腹主動脈(abdominal aorta)及胸主動脈 (thoracic aorta)與周圍之脂肪與結締組織分離，取子宮、腹部脂肪、腎周脂、心臟、肝臟、脾臟進行秤重，並以鑷子小心將整段動脈挑起，除去黏附在動脈上的脂肪與結締組織，以剪刀將動脈連同部分心臟取下，放入含 PBS 之滅菌拋棄式培養皿中，清理結締組織後將頭臂動脈、胸主動脈分段剪下。. 伍、樣本前處理及儲存 (一)血液: 眼窩採集的血液置於微量離心管中，4℃下靜置一段時間，待血液凝固後，於 4℃、12000rpm 條件下離心 3 分鐘，取上清液，可獲得血清，將血清分裝，保存於 -80℃冰箱，以待分析。. (二)血管：將分段剪下後之頭臂動脈及主動脈弓放入含 4％福馬林(paraformadehyde)之 PBS 固定液中進行固定 3 小時，接著以 PBS 浸潤 1 小時後放入 4℃冰箱保存待包埋。胸主動脈則以液態氮冷凍並儲存於-80℃冰箱保存。. (三)肝臟、腎臟、脂肪：將剪下的肝、腎臟及脂肪放入含 4％福馬林(paraformadehyde)之 PBS 固定液中進行固定，隔夜後以 PBS 浸潤 1 小時後放入 4℃冰箱保存待包埋。其餘的肝臟以液態氮冷凍並儲存於-80℃冰箱保存。. 陸、血液及血清分析 (一)葡萄糖分析利用血糖機(德國拜耳 ELITE 易理測血糖機)，於動物採血時滴取一滴血液(約 2μl) 38.

(38) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. 於血糖試紙上，等待讀取數值 30 秒，即可測得動物血液中葡萄糖濃度。. (二)膽固醇分析 1.原理主要原理是利用 detergent 將膽固醇及固醇酯自 lipoprotein 中釋出，以 cholesterol esterase 水解膽固醇酯得游離膽固醇 (free cholesterol)。 Cholesterol oxidase Free cholesterol. cholesterol-3-one + H2O2. 2 H2O2 + 4-aminoantipyrine + phenol peroxidase. quinoneimine. 產生紅色的 quinoneimine 測其 500nm 吸光值。以 cholesterol calibrator standard(Randox)做一標準曲線，利用內插法換算濃度。 2.實驗方法所採用的是市售組合試劑 (Randox)，以 Enzymatic CHOD-PAP method 測定。取 6μl 血清以生理食鹽水等倍稀釋後，取 5μl 稀釋後血清加 500μl 反應劑並作二重複，產生紅色的 quinoneimine 測其 500nm 吸光值。以 cholesterol calibrator standard (Randox)做一標準曲線，利用內插法換算濃度。. (三)三酸甘油酯分析 1.原理主要原理如下：. Triacylglycerol. Glycero + ATP. lipase. glycerol + free fatty acid. glycerokinase. L-α-glycerol-3-phosphate + ADP. Glycerol phosphate oxidase. L-α-glycerol-3-phosphate + O2. Dihycroxyacetonephosphate + H2O2 39.

(39) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. 在 peroxidase 催化下，H2O2 與 4-aminophenazone 和 4-chlorophenol 作用，產生紅色的 quinoneimine 2.實驗方法所採用的是市售組合試劑 (Randox)，以 Enzymatic CHOD-PAP method 測定。取 5μl 血清加 500μl 反應劑並作二重複，所採用的是市售的組合試劑(Randox)，以 Enzymatic CHOD-PAP method 測定。產生紅色的 quinoneimine 測其 500nm 吸光值。以 cholesterol calibrator standard (Randox)做一標準曲線，利用內插法換算濃度。. (四)游離脂肪酸分析 1.原理 Acyl CoA synthetase NEFA + ATP + CoA. Acyl CoA + AMP + PPi. Acyl CoA oxidase Acyl CoA + O2. 2,3-trans-Enol-CoA + H2O2. Peroxidase 2H2O2+ N-ethyl-N-(2hydroxy-3-sulphopropyl)m-toludine) + 4-amioantipyrine 最後產生青紫色產物，在 550nm 測定吸光值。 2.實驗方法所採的為市售試劑組(RANDOX FA 115, Amtrim, UK)。取 5μl sample 或 NEFA standard (1mmol/l)於 96 well plate，加入 100μl reagent 1，37℃下反應 10 mins，再加入 200μl reagent 2，在 37℃下反應 10 mins，於波長 550nm 測吸光值，做一標準曲線，以內插法可求得樣品 NEFA 濃度。. (五)胰島素分析 1.原理所採用的是市售 mouse insulin ELISA kit (Mercodia)，先將 50μl 的 conjugate solution 置於 96 well plate，再將 25μl 標準品 (系列稀釋)、血樣加入分析盤中，室溫反應 2 小時後，進行 wash，移除未與抗體結合的樣品，再加入 200μl peroxidase substrates 室溫下反應 15 分鐘，最後加入酸性溶液終止酵素呈色反應，於波長 450 nm 40.

(40) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. 下可測其吸光值，換算其 insulin 濃度。 2.實驗方法先將 50 μl 的 conjugate solution 置於 96 well plate，再將 25 μl 標準品(系列稀釋)、血樣加入分析盤中，室溫反應 2 小時後，進行 wash，移除未與抗體結合的樣品，再加入 200 μl peroxidase substrates 室溫下反應 15 分鐘，最後加入酸性溶液終止酵素呈色反應，於波長 450 nm 下可測其吸光值，吸光值越高者表示樣品中所含 insulin 濃度越高，其濃度值利用標準品並乘上稀釋倍數即可相對換算出。. (六)Adiponectin 分析 1.原理利用 96 孔的分析盤中已結合抗 adiponectin 的單株抗體，能專一的與 adiponectin 分子結合，再與 horseradish peroxidase conjugates anti mouse adiponectin polyclonal antibady 結合，利用 horseradish peroxidase 與 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine 及 H2O2 反應呈色而得知樣品中 adiponectin 濃度。 2.實驗方法本實驗採用市售 adiponectin ELISA kit (R&D)，根據三明治 (sandwich)酵素免疫分析原理測量血液中 adiponectin 濃度，此法係操作過程為：將標準品 (系列稀釋)、血樣 (稀釋 8000 倍)加入分析盤中，室溫反應 3 小時後，進行 wash，使未結合的樣品在清洗過程中被洗去，再加入 horseradish peroxidase conjugates anti mouse adiponectin polycolonal. antibady. 室溫下反應. 1. 小時，進行. wash. 後加入. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine 及 H2O2 (新鮮配置)，室溫下避光反應 30 分鐘，最後加入酸性溶液終止酵素呈色反應，並使藍色產物轉變為黃色，於波長 450 nm 下可測其吸光值，吸光值越高者表示樣品中所含 adiponectin 濃度越高，其濃度值利用標準品並乘上稀釋倍數即可相對換算出。. (七) leptin 分析 1.原理利用 96 孔的分析盤中已結合抗 leptin 的多株抗體，能專一的與 leptin 分子結合，再與 horseradish peroxidase conjugates anti mouse leptin polyclonal antibady 結合，利用 horseradish peroxidase 與 peroxidase choromogen substrate tetramethylbenzidine 反應 41.

(41) 第三章植物性雌激素活性材料對卵巢切除 ApoE 剔除小鼠抗代謝症候群之效應. 呈色而得知樣品中 leptin 濃度。 2.實驗方法本實驗採用市售 Leptin ELISA kit (Assay Pro)，根據三明治 (sandwich)酵素免疫分析原理測量血液中 leptin 濃度，此法係利用 96 孔的分析盤中已結合抗 leptin 的多株抗體，能專一的與 leptin 分子結合，再與 horseradish peroxidase conjugates anti mouse leptin polyclonal antibady 結合，利用 horseradish peroxidase 與 peroxidase choromogen substrate tetramethylbenzidine 反應呈色而得知樣品中 leptin 濃度。操作過程為：將標準品 (系列稀釋)、血樣 (稀釋 4 倍)加入分析盤中，室溫反應 2 小時後，進行 wash，使未結合的樣品在清洗過程中被洗去，再加入 horseradish peroxidase conjugates anti mouse leptin polycolonal antibady 室溫下反應 2 小時，進行 wash 後加入 peroxidase choromogen substrate tetramethylbenzidine，室溫下反應 30 分鐘，最後加入 0.5N hydrochloric acid 終止酵素呈色反應，並使藍色產物轉變為黃色，於波長 450 nm 下可測其吸光值，吸光值越高者表示樣品中所含 leptin 濃度越高，其濃度值利用標準品並乘上稀釋倍數即可相對換算出。. 柒、肝脂分析 (一)藥品配製藥品. 需要量. CHCl3. 200ml. Methanol. 100ml. 將 CHCl3 與 Methanol 分別取體積比 2：1 的量混合均勻。. (二)肝脂萃取液製備採 Folch 等學者 (1957) 之方法。取 0.2~0.3 克肝臟，放入 15 ml 玻璃瓶，加入 19 倍肝臟重量之萃取液 (CHCl3：Methanol = 2：1)體積，以均質機 ( Polytron, Kinematica AG, Littau, Switerland) 磨碎，再以二層濾紙過濾，收集清澈萃取液。. 42.