嘉南藥理大學專題研究計畫研究成果報告

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嘉南藥理大學專題研究計畫研究成果報告

計畫編號：CN10303

總計畫計畫名稱：Benzodiazepinedione 及其衍生物之合成、生物活

性評估與化粧品開發

子計畫三計畫名稱：Benzodiazepinedione 及其衍生物之化粧品功能

性評估與產品開發

執行期間：103 年 1 月 1 日至 103 年 12 月 31 日

■整合型計畫 □個別型計畫

計畫總主持人：汪文忠計畫主持人：

子計畫主持人：呂尚謙

中華民國 104 年 03 月 05 日

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目錄

一、研究摘要 --- 2

二、簡介 --- 3

三、研究材料與方法 --- 7

四、結果與討論 --- 9

五、參考文獻 --- 15

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一、研究摘要

真菌經由二次代謝調控路徑來調節其生長型態與發育方式，對於人類而言，這些真菌二次代謝物具有相當大的利用價值，例如抗生素、降膽固醇藥物等。費式麴菌 (Neosartorya fischeri)生長於液態培養基，其培養過濾液的主要二次代謝物為 aszonalenin (acetylaszonalenin 代謝合成路徑的中間產物)及 acetylaszonalenin。由於目前文獻研究對於 acetylaszonalenin 之活性功能尚不明確，因此值得進一步探討其真正的生物活性。而 acetylaszonalenin 之分子具有 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 的結構，研究數據指出 benzodiazepinedione 骨架的化合物是一種具多樣生物活性的化學結構。本計畫 ( 子計畫三 ) 之實驗目的乃配合子計畫一合成 benzodiazepinedione 及其衍生物之研究成果，分析評估其化粧品相關之功能性，我們預期可尋找出具有化粧品相關功能性之 benzodiazepinedione 及其衍生化合物，可作為新穎性之功能性化粧品原料，並進一步開發為功能性化粧保養品。

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二、簡介

目前對於真菌二次代謝(secondary metabolism)路徑的研究文獻中，大 部份的研究多屬子囊菌(Ascomycota)的真菌，其中又以麴菌屬(Aspergillus) 的研究較為廣泛並深入。費式麴菌 (Neosartorya fischeri)生長於液態培養 基之過濾液的主要二次代謝物為 acetylaszonalenin 。由於目前對於 acetylaszonalenin 之功能尚未明確瞭解，因此值得進一步探討其真正的生物活性。而 acetylaszonalenin 之分子具有 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 的結構，研究數據指出 benzodiazepinedione 骨架的化合物具有鎮靜及安眠之中樞神經作用，研究文獻中發現某些 benzodiazepinedione 亦能表現出抗癌與抗菌活性，是一種具多樣生物活性的化學結構。本計畫(子計畫三)之實驗目的乃配合子計畫一合成 benzodiazepinedione 及其衍生物之研究成果，分析評估其化粧品相關之功能性，包括抗菌活性分析、抗玻尿酸酶 (anti-hyaluronidase) 活性分析及抑制基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP)等活性分析，我們預期可尋找出具有化粧品功能性之新穎性化合物，並進一步開發為功能性化粧品。

真菌本身藉由二次代謝路徑來調控其生長型態與發育方式¹，此外對於人類而言，這些真菌二次代謝物具有相當大的利用價值，例如抗生素、

降膽固醇藥物或抗氧化成份等 ²。目前對於真菌二次代謝 (secondary metabolism)路徑的研究文獻中，大部份的研究多屬子囊菌 (Ascomycota) 的真菌，其中又以麴菌屬(Aspergillus)的研究較為廣泛並深入。費式麴菌 (Neosartorya fischeri)生長於不同溫度、不同培養基及不同轉速振盪下，於 菌絲體的主要二次代謝物為 fumitremorgin B，而於培養過濾液的主要二次代謝物可以為 aszonalenin (acetylaszonalenin 代謝合成路徑的中間產物)、

acetylaszonalenin 或 12,13-dihydroxyfumitremorgin C (fumitremorgin B 代謝 合成路徑的中間產物)。另一方面，土麴黴 (Aspergillus terreus) 被發現其

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主要二次代謝產物之一的 acetylaszonalenin ，其生合成路徑推測由 anaAT-anaPS-anaPT 基因叢集所產生的基因產物所調控(如圖一所示)^{3, 4}。

圖一、費式麴菌(N. fischeri)及土麴黴(A. terreus)參與生合成 acetylaszonalenin 的基因叢集及路徑

費式麴菌(N. fischeri)生合成 acetylaszonalenin 的代謝路徑，其中 anaPS 基因產物為 putative non-ribosomal peptide synthetase (anaPS)，參與

acetylaszonalenin 生合成路徑第一步驟之催化作用；anaPT 基因產物為 prenyltransferase (anaPT)，參與 acetylaszonalenin 生合成路徑第二步驟之催

C

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化作用；anaAT 基因產物為 acetyltransferase (anaAT)，參與 acetylaszonalenin 生合成路徑第三步驟之催化作用。然而此基因叢集在 N. fischeri 中的排列 順序如圖一 A 所示，為 anaPS-anaPT-anaAT；在出現在 A. terreus 的基因 叢集則如圖一 B 所示，為 anaAT-anaPS-anaPT ；預測兩株麴菌之 acetylaszonalenin 生合成路徑催化為相同步驟，如圖一 C 所示 ^{3, 5}。由於 acetylaszonalenin 目前在其功能與活性的研究上尚不明確，非常值得進一步的探討研究 acetylaszonalenin 及其衍生物之生物活性。Acetylaszonalenin 為費式麴菌(N. fischeri)液態培養時培養過濾液中最主要的二次代謝物，在 本實驗室先前的研究成果中亦得到證明，結果如圖三以箭頭標示(在層析圖譜上滯留時間為 22.5 分鐘有主要吸收峰，分子量為 415)。我們先前得 到的研究成果顯示，費式麴菌(N. fischeri)於 YMG (Yeast and Malt extract with Glucose Media)培養基，在起始酸鹼值 pH 4.5、溫度 40℃、氮源為 meat peptone 的培養條件下，培養 7~14 天能有效提高二次代謝物 acetylaszonalenin 的產量⁶，如圖二之 HPLC 分析圖所示。

圖二、費式麴菌(N. fischeri)液態培養 14 天後培養過濾液中二次代謝物的 HPLC 分析圖及其主要二次代謝物 Acetylaszonalenin 之質譜圖

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費式麴菌 (Neosartorya fischeri)與土麴黴 (Aspergillus terreus) 均被 發現可以合成 acetylaszonalenin，對於兩種真菌一定會有其真正的必要目的，但由於目前對於 acetylaszonalenin 之生物功能尚不明確，因此值得進一步探討其真正的生物活性。而 acetylaszonalenin 之分子具有 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 的結構，研究數據指出 benzodiazepinedione 骨架的化合物具有鎮靜及安眠之中樞神經作用，研究文獻中亦發現某些 benzodiazepinedione 類衍生物表現出抗癌與抗菌的活性，是一種具多樣生物活性的化學結構。在另一方面，Benzodiazepinedione 是具有苯並二氮雜七元環的結構，為 alprazolam, clonazepam, diazepam, estazolam, nitrazepam, triazolam 等藥物的重要結構單元。而 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 結構化合物(如圖三所示)，在相關研究文獻則顯示可能具有抗凝血、抗腫瘤、抗菌與抗痙攣的活性^7-9。

NH HN O

O

R₁ R₂

圖三、1,4-benzodiazepine-2,5-dione 化合物結構

因此，本計畫 ( 子計畫三 ) 之實驗目的乃配合子計畫一合成 benzodiazepinedione 及其相關衍生物之研究成果，分析評估其化粧品相關之功能性，包括細胞毒性分析、清除 DPPH 自由基 (,-diphenyl--picrylhydrazyl) 之抗氧化活性測定、抗酪胺酸酶 (anti-tyrosinase)的美白活性分析、抗玻尿酸酶(anti-hyaluronidase)的抗過敏活性分析及抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)之延緩膠原蛋白破壞的活性分析，我們預期可尋找出具有化粧品功能性之新穎性 benzodiazepinedione 類化合物，作為功能性化粧品原料，並進一步開發為具有積極功能性的化粧品。

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三、研究材料與方法

1. 抗菌活性分析(紙錠抑菌試驗又名瓊脂紙錠擴散法，Agar disc diffusion method)：

紙錠抑菌試驗是最常用的抑菌實驗方法之一。將欲觀察之細菌塗抹於培養基之後，再將圓形 paper disc (8mm) ( Tokyo Roshi Kaisha, Japan ) 置於培養基，以微量滴管給予紙錠定量之待測試樣品後，置入烘箱培養，觀察固定時間之後紙錠週圍產生抑菌圈的大小，並測量含紙錠直徑的抑菌圈(Diameter of inhibition zone)大小，判斷待測樣品的抑菌能力。抑菌活性之判讀是依測量抑菌圈直徑大小所得之平均值，直徑大小大於 10.0 mm 是具有抗菌活性。10.0 mm 為輕度活性，11.0-15.0 mm 為中度活性，16.0-20.0 mm 為高度活性。單一抑菌成份抑菌實驗步驟簡述如下：(1)所有培養基必須先用滅菌斧滅菌過。(2)菌種先用液態培養基於 37℃震盪培養活化一天。(3)將菌液的濃度控制於 107 cfu/ml，取 100μl 的活化菌液，以三角玻棒均勻的塗佈於固態培養基中。(4)靜置 30 分鐘，使菌液乾燥，以防止菌液集中於 disc 上，也可防止 disc 因吸收了菌液而無法吸收足量的樣品。(5)於每盤固態培養基上放置 3 枚 disc (三重複實驗)，於 disc 上分別滴入 40μl 的樣品溶液。(6) 放置於 37℃培養箱中，培養 24 小時後觀察結果。

2. 抗玻尿酸酶(anti-hyaluronidase)活性分析：

首先收集有處理或無處理(控制組) A. terreus 或 A. nidulans 基因 轉型株餵食後產生之代謝產物與玻尿酸酶之混合液，進行蛋白質電泳分析；電泳結束後，將電泳槽中之膠片取出，浸泡於 washing buffer 中，

於室溫震盪 1 小時後，移除 buffer，再加入 reaction buffer 於 37℃水浴鍋震盪反應 16 小時。反應完畢後將膠片取出，浸泡於 0.5% Alcian blue solution 中震盪，進行膠片染色 2 小時後，再浸泡於 destaining buffer 中，

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退染約 1~2 小時至 band 清晰可見為止，最後再以玻璃紙封片固定於壓克力板上，放置室溫下自然風乾。

3. 基質金屬蛋白酶(MMPs)酵素活性電泳分析方法(zymography)：

收集有處理或無處理(控制組) A. terreus 或 A. nidulans 基因轉型 株餵食後產生之代謝產物之 3T3 老鼠纖維母細胞的胞外培養基，收集的胞外培養基經 Centricon 10 (Millipore)的濃縮(約 100 倍濃縮)，其蛋白質濃度以 Bio-Rad protein determination assay kit 測量，取約相同量(10

 g)的蛋白質，於 10%的 Tris-Glycine gels (with 0.1% 膠原蛋白)進行 non-denaturing 的蛋白質電泳分析，電泳完成後，於室溫、緩和搖擺振盪的情形下，電泳膠片以 2.5%的 Triton X-100 處理 30 分鐘以恢復蛋白質的活性，電泳膠片再與 developing buffer (Bio-Rad) 於室溫下先反應 30 分鐘，然後於 37℃下再反應至少 24 小時，反應完成後，電泳膠片以 0.1%的 Coomassie blue (in 9.2% acetic acid and 45.4% methanol) 於室溫下染色 20 分鐘，然後以 9.2% acetic acid 與 45.4% methanol 清洗 10 分鐘，重複 2 次，最後以 10% acetic acid 與 10% methanol 清洗至代表 基質金屬蛋白酶活性強弱的的白色 bands 出現為止，即完成 A. terreus 或 A. nidulans 基因轉型株餵食後產生之代謝產物對於基質金屬蛋白 酶活性影響的分析步驟。

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四、結果與討論

1. Benzodiazepinedione 是具有苯並二氮雜七元環的結構，而如圖三所示為 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 的基本結構，目前已取得共 9 個結構相關且具有不同官能基之合成物(如圖四所示)。

(A) HB020

(B) HB026

(C) HB079

(D) HB080

(E) HB083

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(F) HB086

(G) HB089

(H) HB091

(I) HB093

圖四、與 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 結構相關所衍生的 9 個結構相關 且具有不同官能基之化合物(A~I)

2. 完成之工作項目完成具有不同官能基之 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 合成物之抗菌(anti-microbial)活性分析。

以 9 個具有不同官能基之 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 基本結構的合成物(圖 二之化合物 A~I)進行抗菌活性分析，測試的菌種包括 Escherichia coli (大腸 桿菌), Staphylococcus aureus (金黃色葡萄球菌), Pseudomonas aeruginosa (綠 膿桿菌), Candida albicans (白色念珠菌), Propionibacterium acne (痤瘡桿菌), Corynebacterium spp. (短棒狀桿菌)等共 6 種微生物，以 disc diffusion method 進行測試，並以抑菌圈的直徑大小判斷其抗菌能力，結果顯示化合物 A~I

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對於此 6 種微生物均無抑菌圈產生，代表化合物 A~I 對於此 6 種微生物無抗菌活性。

3. 完成之工作項目完成具有不同官能基之 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 合成物之抗玻尿酸酶(anti-hyaluronidase)活性分析。

以 9 個具有不同官能基之 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 基本結構的合成物(圖二之化合物 A~I)進行抗玻尿酸酶活性分析，結果顯示化合物 A~I 對於玻尿酸酶均無抑制活性(圖五之 1~5)。

圖五之 1 化合物 A、D 對於玻尿酸酶(hyaluronidase)活性抑制分析

圖五之 2 化合物 B、C 對於玻尿酸酶(hyaluronidase)活性抑制分析

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圖五之 3 化合物 E、F 對於玻尿酸酶(hyaluronidase)活性抑制分析

圖五之 4 化合物 G 對於玻尿酸酶(hyaluronidase)活性抑制分析

圖五之 5 化合物 H、I 對於玻尿酸酶(hyaluronidase)活性抑制分析

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4. 完成之工作項目完成具有不同官能基之 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 合成物之基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)酵素活性抑制分析。

以 9 個具有不同官能基之 1,4-benzodiazepine-2,5-dione 基本結構的合成物(圖二之化合物 A~I)進行基質金屬蛋白酶之酵素活性抑制分析，結果顯示化合物 A~J 對於基質金屬蛋白酶 MMP-2 及 MMP-9 均無抑制活性(圖六之 1~5)。

圖六之 1 化合物 A、D 對於基質金屬蛋白酶(MMP)酵素活性抑制分析

圖六之 2 化合物 B、C 對於基質金屬蛋白酶(MMP)酵素活性抑制分析

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圖六之 3 化合物 E、F 對於基質金屬蛋白酶(MMP)酵素活性抑制分析

圖六之 4 化合物 G 對於基質金屬蛋白酶(MMP)酵素活性抑制分析

圖六之 5 化合物 H、I 對於基質金屬蛋白酶(MMP)酵素活性抑制分析

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五、參考文獻

1. Calvo AM, Wilson RA, Bok JW, Keller NP. Relationship between Secondary Metabolism and Fungal Development. Microbiol Mol Biol Rev. 2002; 66:

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3. Yin WB, Grundmann A, Cheng J, Li SM. Acetylaszonalenin biosynthesis in Neosartorya fischeri: Identification of the biosynthetic gene cluster by genomic mining and functional proof of the genes by biochemical investigation. J Biol Chem. 2009; 284: 100-109.

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5. Ames BD, Walsh CT. Anthranilate-Activating Modules from Fungal Nonribosomal Peptide Assembly Lines. Biochemistry. 2010; 49: 3351-3365.

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