中華民國第五十屆中小學科學展覽會

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中華民國第五十屆中小學科學展覽會作品說明書

科別：生活與應用科學科組別：高中組

作品名稱：「菇」且送你一顆「糖」

關鍵詞：海藻糖合成酶、香菇柄培養基、基因重組大腸桿菌

編號：

(2)

頁次

摘要---1

ㄧ、研究動機---1

二、研究目的---2

三、研究設備及器材---2

四、研究方法---5

實驗大綱---5

(一) 比較香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液的蛋白質濃度，並比較用此萃取液作為培養基以培養重組大腸桿菌的生長情形---6

1.萃取液的製備---7

2.萃取液的蛋白質濃度---7

3.菌種活化---7

4.接菌培養---8

5.菌量數---8

6.菌體乾重---8

(二)選定香菇柄萃取液的適當培養濃度---9

1.香菇柄萃取液的製備---9

2.接菌培養---9

(3)

(三)配製加入不同切蛋白酵素之5％香菇柄萃取物培養基，培養大腸

桿菌，篩選適合重組大腸桿菌生長的培養基流程圖---10

1.配置培養基---11

2.接菌培養---11

3.測量菌體乾重---11

(四)檢測海藻糖生成量---11

1.取得海藻糖合成酶粗酵素液---11

2.測定海藻糖生成量---11

(五)測量香菇柄粉水分含量---12

五、研究結果---13

(一)選擇最適當的樣品當作培養基的氮源---13

1.比較萃取液蛋白質濃度---13

2.比較基因重組大腸桿菌菌量數---13

3.比較基因重組大腸桿菌菌體乾重---14

(二)比較不同濃度香菇柄萃取液對基因重組大腸桿菌生長影響---14

1.菌量數---14

(三)篩選適合基因重組大腸桿菌生長培養基，並比較不同培養基之菌體乾重---14

(四)比較海藻糖生成量及海藻糖合成酶酵素活性---15

(五)計算成本損失，並估算與比較培養基成本---18

(4)

1.水分含量---18

2.材料價格---18

3.計算配置 50mL 培養基所需成本---18

六、討論---18

七、結論---19

八、未來展望---19

九、參考資料及其他---20

(5)

表次

頁次

表一、5％、10％香菇柄萃取液培養所得菌量數---14

表二、菌體乾重---14

表三、材料價格---18

表四、配50mL 培養基所需成本---18

(6)

圖次

頁次

圖一、分光光度計(Spectrophometer)---2

圖二、溫震盪培養箱(Orbital shaker incubator)---3

圖三、自動迴旋微生物接種儀(Whitley automatic spiral plater)---3

圖四、酸檢測定儀(pH meter)---3

圖五、恆溫水槽(Circulator)---3

圖六、超音波細胞破碎機(Ultrasonic processor)---4

圖七、HPLC 及附屬設備---4

圖八、蛋白質濃度標準曲線---7

圖九、使用迴旋式接種儀塗抹菌液於LB agar 平板---8

圖十、海藻糖合成酶粗酵素液與麥芽糖溶液於水浴槽反應---11

圖十一、海藻糖濃度標準曲線---12

圖十二、香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液蛋白質濃度---13

圖十三、以濃度10^-4塗抹 LB agar 平板所得菌量數---13

圖十四、以2.5％香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液為培養基培養重組大腸桿菌所得菌體乾重---14

圖十五、麥芽糖標準品以高效能液相層析儀分析結果---15

圖十六、海藻糖標準品以高效能液相層析儀分析結果---15

(7)

成酶粗酵素液與麥芽糖作用後之糖組成---15

圖十八、加入Flavouzyme 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液培養基所得的海藻

糖合成酶粗酵素液與麥芽糖作用後之糖組成---16

圖十九、加入Papain 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液培養基所得的海藻糖合

圖二十、加入Pepsin 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液培養基所得的海藻糖合

圖二十一、以未經蛋白酶處理之5％香菇柄萃取原液為所得的海藻糖合成

酶粗酵素液與麥芽糖作用後之糖組成---17

圖二十二、以LB 培養基所得的海藻糖合成酶粗酵素液與麥芽糖作用後之

糖組成---17

圖二十三、海藻糖合成酶酵素活性---17

(8)

摘要

蕈柄使用率少，且價格便宜，而蕈頭則為農業廢棄物。本實驗利用蕈柄、蕈頭的萃取液作為培養基氮源，培養含有 Picrophilus torridus trehalose synthase 基因片段的重組大腸桿菌(Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3) )(E.coli PTTS in RGB)取代高成本培養基 Luria-Bertani(LB)，生產海藻糖合成酶，進而與酵素反應液(麥芽糖溶液)作用生產海藻糖。

本實驗發現香菇柄萃取液的蛋白質濃度最高，且培養出的菌量數最多、菌體乾重最重。故我們利用香菇柄作為培養基的氮源材料，再分別加入四種蛋白酶反應後，發現加入Pepsin 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液培養基所產之基因重組大腸桿菌的菌體乾重高於 LB 培養基。再經離心破菌後，得到海藻糖合成酶粗酵素液，結果發現加入 Pepsin 蛋白酶之培養基酵素活性亦高於LB 培養基。所以本實驗發現使用加入 Pepsin 蛋白酶之 5％

香菇柄萃取液作為培養基效果較LB 培養基好，不僅產量高且成本可降低三分之二倍。

壹、研究動機

由相關文獻指出，我們得知食用蕈類含有多量的蛋白質，根據化學分析乾燥香菇中蛋白質含量為13.9％。蕈傘供應一般食用，蕈柄部份製成素食材料，其餘卻成為大量廢棄物，因此本研究希望能利用其蕈類蛋白質作為培養基中之氮源。我們使用工廠所不需要的廢棄蕈柄、蕈頭作為培養基主要成分，同時達到環保與低成本的效果。

由於大腸桿菌培養簡易、生長快速，且其內部遺傳基因已全被解讀，所以本實驗利用基因重組大腸桿菌大量生產海藻糖合成酶，進而生產海藻糖。此基因重組大腸桿菌為 蕭介夫研究團隊由嗜熱及嗜酸性古細菌Picrophilus torridus(DSM 9790)中，選殖到一種全 新耐熱性海藻糖合成酶(Trehalose synthase)的基因，將之表現於大腸桿菌中大量生產。

海藻糖是新一代崛起的多功能醣類，具有保濕功能，被廣泛運用於食品的製作與保存，如：乾燥食品、冷凍食品、西點糕餅、糖果、飲料、發酵食品、冰淇淋等。尤其在日本洋菓子的製作上，為了配合日本能接受的甜度較歐洲少的特性，使用海藻糖取代一部份砂糖，甜度僅砂糖45％，仍可支撐菓子的組織、味道、口感及香味，呈現低甜度的風味。海藻糖運用十分廣泛，除食品加工，亦可運用於化妝品及醫藥工業方面。但在自然界中只存在於部分動植物及藻類，且含量少，因此早期工業多利用酵母菌生產海藻糖，相對於其他醣類成本較高且產量低，且純化困難。1990 年代，生產一公斤海藻糖 700 美元，後來許多研究團隊研發利用酵素生產海藻糖，生產一公斤 5-6 美元，故我們希望開發較低成本的材料來製造海藻糖。

(9)

「菇」且送你一顆「糖」~以香菇柄為氮源培養大腸桿菌生產海藻糖合成酶

2

貳、研究目的

本研究的主要目的為利用廉價的蕈柄及廢棄的蕈頭製成培養基取代一般所使用的高成本LB 培養基培養大腸桿菌生產海藻糖合成酶，其實驗比較項目如下：

一、比較香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭中的蛋白質濃度，並比較用此萃取液作為培養基對基因重組大腸桿菌生長的影響，以選擇最適當的樣品當作培養基的氮源。

二、比較不同濃度的香菇柄萃取液對基因重組大腸桿菌生長影響，以選擇適宜的培養基濃度。

三、在香菇柄萃取液加入不同蛋白酶後，比較對基因重組大腸桿菌生長的影響。

四、將培養後的基因重組大腸桿菌，以超音波破菌，取得海藻糖合成酶粗酵素液，再以酵素反應液(麥芽糖溶液)為基質，進行反應，生產海藻糖，並求其酵素活性。

五、培養基成本估算與比較。

参、研究設備及器材

一、原料：

來自於台中縣新社鄉香菇之家種植的香菇與杏鮑菇，取其廉價的香菇柄及廢棄香菇頭。品種為黑早271。

二、蛋白質濃度的測定：分光光度計、蛋白質試劑(Bio-Rad Protein Assay dye reagent)、

比色管。

(圖一)分光光度計(Spectrophometer): V-500, Jasco (Tokyo, Japan)。

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三、大腸桿菌的培養與計數：恆溫震盪培養箱、全自動迴旋微生物接種儀。

(圖二)恆溫震盪培養箱(Orbital shaker incubator): S306R, Firstek Scientific (新竹,台灣)。

(圖三)全自動迴旋微生物接種儀(Whitley automatic spiral plater): 豐記儀器。

四、培養基的配置：酸鹼測定儀、恆溫水槽。

(圖四)酸檢測定儀(pH meter): PHM210, Radiometer Analytical (Villeurbanne, France)。

(圖五)恆溫水槽(Circulator): Firstek Scietific(新竹,台灣)。

(11)

4

五、取得海藻糖合成酶粗酵素液與海藻糖生成量的檢測：超音波細胞破碎機、拋棄式過濾器、抽氣過濾機、氰甲烷、高效能液相層析儀(High pressure liquid chromatography, HPLC)。

(圖六)超音波細胞破碎機(Ultrasonic processor):XL-2020, Heat System (New York, U.S.A)。

(圖七) HPLC 及附屬設備：

(一)層析管柱：Lichrosphor^® 100, NH2 250×4(mm), 5µm,默克(Darmstadt, Germany)。

(二)管柱控溫裝置(column oven): Model L-2350, Hitachi (Tokyo, Japan)。

(三)幫浦(pump): Model L-2130, Hitachi(Tokyo, Japan)。

(四)偵測器(RI detector): Model L-2490, Hitachi(Tokyo, Japan)。

(五)自動注射器(Auto sampler): Model L-2200, Hitachi(Tokyo, Japan)。

(六)積分軟體: HPLC D-2000 Eltie, Hitachi(Tokyo, Japan)。

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肆、研究方法

實驗大綱：

香菇柄香菇頭杏鮑菇頭

分析蛋白質濃度比較對基因重組E. coli生長影響

選擇最適樣品當作培養基的氮源

選擇適當樣品濃度

分別加入選定蛋白酶

5％香菇柄萃取液 LB broth

培養E. coli生產海藻糖合成酶

與麥芽糖溶液反應

以HPLC分析海藻糖產量

香菇柄香菇頭杏鮑菇頭

分析蛋白質濃度比較對基因重組E. coli生長影響

選擇最適樣品當作培養基的氮源

選擇適當樣品濃度

分別加入選定蛋白酶

5％香菇柄萃取液 LB broth

培養E. coli生產海藻糖合成酶

與麥芽糖溶液反應

以HPLC分析海藻糖產量

(13)

6

一、比較香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液的蛋白質濃度，並比較用此萃取液作為培養基以培養重組大腸桿菌的生長情形

香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭

磨粉,篩網過篩

2.5％、5％、10％、15％

香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液

離心取上清液

分析蛋白質濃度

取2.5%香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液50mL

接菌培養置於滅菌釜滅菌

利用全自動迴旋微生物接種儀接種

110rpm, 27℃,48hr

數菌

菌種活化

稀釋菌液

測量分光值

選定適當菌液濃度

置於培養箱 37℃,24hr 置於滅菌釜滅菌

分裝離心管離心

去除上清液

以去離子水清洗,離心2次

加去離子水混勻,倒至鋁皿

以100 ℃烘乾24hr

秤量菌體乾重

置於乾燥箱中冷卻香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭

磨粉,篩網過篩

2.5％、5％、10％、15％

香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液

離心取上清液

分析蛋白質濃度

取2.5%香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液50mL

接菌培養置於滅菌釜滅菌

利用全自動迴旋微生物接種儀接種

110rpm, 27℃,48hr

數菌

菌種活化

稀釋菌液

測量分光值

選定適當菌液濃度

置於培養箱 37℃,24hr 置於滅菌釜滅菌

分裝離心管離心

去除上清液

以去離子水清洗,離心2次

加去離子水混勻,倒至鋁皿

以100 ℃烘乾24hr

秤量菌體乾重

置於乾燥箱中冷卻

(14)

(一)香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液的製備 1.將乾燥香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭磨粉。

2.利用 20mesh 篩網過篩。

3.將其各製成 2.5％、5％、10％、15％萃取液，置於滅菌釜滅菌。

4.以 8000rpm 於 4℃離心 15min，取其上清液。

(二)香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液的蛋白質濃度

1.使用分光光度計，在比色管加入 R.O.水，測量空白值(Blank)。

2.配標準品小牛血清蛋白(BSA, Bovine serum albumin)溶液。

3.各加入小牛血清蛋白 150mL(2％、4％、 6％、 8％、10％、12％、14％、

16％、18％、20％)和 1.5mL 蛋白質試劑(Bio-Rad Protein Assay dye reagent：

去離子水=1:4(v/v))至 2mL 微量離心管混勻，室溫下反應 5 分鐘，反應期間須避光，使用分光光度計，在 595nm 下測量分光值，並製出標準曲線圖。

y = 4.1987x + 0.0943 R² = 0.9917

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

(圖八)蛋白質濃度標準曲線(x:蛋白質濃度 y:分光值) (單位：mg/mL)。

4. 各加入 150μL 香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液(2.5％、5％、10％、15％) 和1.5mL 蛋白質試劑，在 595nm 下測量分光值，並以小牛血清蛋白質之標準曲線，計算其蛋白質濃度。

(三)菌種活化

Ampicillin：50mg/mL in H20

Chloramphenicol：34mg/mL in 75％ ethanol Kanamycin：15mg/mL in H20

Tetracycline：12.5mg/mL in 75％ ethanol (需避光)

1. 每次實驗皆從-80℃冰箱中取出進行活化，首先將菌液劃線於加有上述四種抗生素之LB agar 平板，於 37℃培養 24hr，此為第一次活化。

2. 再以接種環取單一菌落至 50mL LB broth 培養基中，以 110rpm 於 37℃震盪

(15)

8

(四)接菌培養

1.選定適當菌液濃度。

2.將 2.5％香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液各分裝 50mL 至 3 個凹槽三角瓶，

接菌，以 110rpm 於 27℃震盪培養 48hr。

(五)利用全自動迴旋微生物接種儀得知菌量數 1.取 1mL 菌液序列稀釋至 10^-5。

2.使用全自動迴旋微生物接種儀塗抹濃度 10^-4、、10^-5菌液於LB agar 平板，於 37℃培養 24hr，計算菌落數。

(圖九)使用迴旋式接種儀塗抹菌液於 LB agar 平板。

(六)菌體乾重

1.預先取鋁皿編號後放入烘箱中以 100℃烘乾至恆重，紀錄鋁皿重量(W1)。

2.取 5mL 菌液置於離心管，以 8000×g 離心去除上清液，利用去離子水清洗、離心兩次。

3.加入去離子水混勻，置於已恆重之鋁皿。

4.放在 100℃烘箱 24hr 後，將其放置乾燥箱冷卻，並測其重量(W2)。

5.帶入公式計算，得知菌體乾重。

菌體乾重(g/L) =

W W 1000 mL mL

5

1

2

− ×

(16)

二、選定香菇柄萃取液的適當培養濃度

(一)香菇柄萃取液的製備 1.將乾燥香菇柄磨粉。

2.利用 20mesh 篩網過篩。

3.將其製成 10％萃取液，置於滅菌釜滅菌。

4.以 8000rpm 於 4℃離心 15min，取其上清液。

(二)接菌培養 1.菌種活化。

3.將 5％、10％香菇柄萃取液各分裝 10mL 至 3 支試管，接菌，於 27℃培養 24hr。

(三)利用平板培養法得知菌量數 1.取 1mL 菌液序列稀釋至 10^-7。

(17)

10

三、配製加入不同蛋白酶之 5％香菇柄萃取液培養基，培養大腸桿菌，篩選適合基因重組大腸桿菌生長的培養基

加入5％香菇柄萃取液150mL於血清瓶

分別各調到適當pH值

5％香菇柄萃取液

將pH值調至7.5

各分裝至3個凹槽三角瓶(50mL) 滅菌

菌種活化,選定適當菌液濃度,接菌培養 110rpm,27℃48hr 分裝15mL,45mL離心管離心

去除上清液 45mL

15mL

菌體回溶於磷酸鈉緩衝溶液以去離子水清洗,離心2次

以超音波破菌

加入麥芽糖溶液進行酵素反應

於沸水中使酵素失活10min

0.2μm濾膜過濾

以HPLC分析海藻糖產量加去離子水混勻,倒至鋁皿

以100℃烘乾24hr

秤量菌體乾重

Flavouzyme LB

Alcalase Papain Pepsin 加入不同蛋白酶加入5％香菇柄萃取液150mL於血清瓶

分別各調到適當pH值

5％香菇柄萃取液

將pH值調至7.5

各分裝至3個凹槽三角瓶(50mL) 滅菌

菌種活化,選定適當菌液濃度,接菌培養 110rpm,27℃48hr 分裝15mL,45mL離心管離心

去除上清液 45mL

15mL

菌體回溶於磷酸鈉緩衝溶液以去離子水清洗,離心2次

以超音波破菌

加入麥芽糖溶液進行酵素反應

於沸水中使酵素失活10min

0.2μm濾膜過濾

以HPLC分析海藻糖產量加去離子水混勻,倒至鋁皿

以100℃烘乾24hr

秤量菌體乾重

Flavouzyme LB

Alcalase Papain Pepsin 加入不同蛋白酶

(18)

(一)配置培養基

1.將 4 瓶 150mL5％香菇柄萃取液調至蛋白酶反應之適當 pH 值。

Alcalase：pH7.5，50℃ (液態) Flavouzyme：pH6，50℃

Papain：pH7.5，50℃

Pepesin：pH2，37℃

(利用 HCl、NaOH 調整 pH)

3. 將 0.9g、0.9c.c.蛋白酶加入 5％香菇柄萃取液，並在其適當溫度之水浴槽反應15min，期間需搖晃，使其均勻反應。

4.將四瓶經過蛋白酶處理之 5％香菇柄萃取液培養基、LB 培養基、未經蛋白酶處理之5％香菇柄萃取液培養基，pH 值調至 7.5。

(二)接菌培養 1.菌種活化。

3.將上述之培養基各分裝 50mL 至 3 個凹槽三角瓶，接菌，以 110rpm 於 27℃震盪培養48hr。

(三)測量菌體乾重四、檢測海藻糖生成量

(一)取得海藻糖合成酶粗酵素液

1.取 45mL 菌液至離心管，以 8000×g 轉速離心 10min，去除上清液，回溶於 4.5 mL 磷酸鈉緩衝溶液(20mM、pH7)，混勻。

2.以超音波(Sonicator)震盪破菌，破菌 10sec、間隔 20sec，避免產生高溫破壞酵素活性及菌體，進行30 次循環，共 15min。

(二)測定海藻糖生成量

1.將破菌後取得海藻糖合成酶粗酵素液 50μL 與 1mL 酵素反應液(以磷酸鈉緩衝溶液(50Mm、pH6.0)配製成 150mM 麥芽糖溶液)裝入 1.5mL 微量離心管，在 45℃

水浴槽反應 25min，反應期間需搖晃混勻。

(19)

12

2.海藻糖合成酶：麥芽糖海藻糖轉化

3.反應結束後，放入沸水中失活 10min。

4.使用 0.2μm 拋棄式過濾器過濾。

5.以高效能液相層析儀進行分析。(移動相：CH3CN：去離子水=85：15(v/v)) 6.將面積帶入標準曲線，得知海藻糖生成量。

y = 64877x + 58528 R² = 0.9993

0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 (圖十一)海藻糖濃度標準曲線(x:海藻糖濃度 y: 海藻糖面積)(單位：mM)。

7.將海藻糖濃度帶入公式計算，得知海藻糖合成酶之酵素活性。

ml 05 . 0

1 min

25 1 mole

mole l 10

1000 mM 1.05

trehalose

(U) = × ×

³

× ×

m 酵素活性 μ

五、測量香菇柄粉水分含量 (一)水分含量

1.預先取鋁皿編號後放入烘箱中以 100℃烘乾至恆重，紀錄鋁皿重量(W)。

2.加入約 3g(W1)的乾燥香菇柄粉於已恆重之鋁皿。

3.放在 100℃烘箱 24hr 後，將其放置乾燥箱冷卻，並測量重量(W2)。

4.帶入公式計算，得知水分含量。

水分含量(％) = ( ) 100 %

1 2

1⁻ − ×

W W W W

5.購買時的香菇柄，雖然已經過乾燥處理，但還是含有少許水分，因此實際上可以使用的香菇柄少於購買時的重量，故在計算成本計算需列入考慮。

(20)

伍、研究結果

一、選擇最適當的樣品當作培養基的氮源

(一) 比較香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液蛋白質濃度，以香菇柄萃取液濃度最高。

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

2.50% 5% 10% 15%

香菇柄香菇頭杏鮑菇頭

蛋白質濃度(mg/mL)

萃取液濃度

(圖十二)香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液蛋白質濃度。

(二) 比較於香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭培養基之基因重組大腸桿菌菌量數，以2.5 ％香菇柄萃取液為培養基所得菌量數最多。

0 200000000 400000000 600000000 800000000 1000000000

菌量數(cfu)

培養基種類 (圖十三)以濃度 10^-4塗抹LB agar 平板所得菌量數。

(21)

14

(三) 比較香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭培養基之基因重組大腸桿菌菌體乾重，得知以 2.5％香菇柄萃取液為培養基所得菌體乾重最重。

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

菌體乾重(g/L)

(圖十四)以 2.5％香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液為培養基培養基因重組大腸桿菌所得菌體乾重。

結果：由蛋白質濃度及所產基因重組大腸桿菌菌量數、菌體乾重比較下，2.5％香菇柄萃取液所得結果較佳，故選擇香菇柄為培養基主要材料。

二、比較不同濃度香菇柄萃取液對基因重組大腸桿菌生長的影響

(一)利用平板培養法，5％、10％香菇柄萃取液培養得到菌量數無明顯差異 (表一) 5％、10％香菇柄萃取液培養所得菌量數

稀釋濃度不同濃度香菇柄萃取液

10^-5 10^-6 10^-7 5％香菇柄萃取液 5.65×10⁷±1.9×10⁷ －－ 10％香菇柄萃取液 5.25×10⁷±0.92×10⁷ －－三、加入不同蛋白酶之 5％香菇柄萃取物當培養基，比較其菌體乾重，以加入Pepsin 蛋

白酶之 5％香菇柄萃取液所培養出的菌體乾重最重 (表二)菌體乾重

培養基菌體乾重(g/L)

加入Alcalase 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液 1.35±0.33 加入Flavouzyme 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液 1.67±0.20

加入Papain 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液 1.2±0 加入Pepsin 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液 1.79±0.08

未經蛋白酶處理之5％香菇柄萃取液 1.16±0.02

LB 1.57±0.12 培養基種類

(22)

(圖十五)麥芽糖標準品以高效能液相層析儀分析結果。

(圖十六)海藻糖標準品以高效能液相層析儀分析結果。

(圖十七)加入 Alcalase 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液培養基所得的海藻糖合成酶粗酵素液四、比較海藻糖生成量及海藻糖合成酶粗酵素液之酵素活性

(一) 測定海藻糖生成量

1.51 2.59 3.62 13.25 26.45

0 5 10 15 20 25 30

Retention Time (min) 0

50 100 150 200 250 300 350 400

Intensity (mV) 麥芽糖

400

3.63 14.09 16.71

350

300

250

Intensity (mV)

200

150

100

50

0

0 5 10 15 20 25 30

Retention Time (min)

2.59 7.52 14.05 17.13 26.73

3.65

350

300

250

200

150

Intensity (mV) 100

海藻糖

50

0

0 5 10 15 20 25 30

(23)

16

(圖十八)加入 Flavouzyme 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液培養基所得的海藻糖合成酶粗酵素液與麥芽糖作用後之糖組成。

(

(圖二十)加入 Pepsin 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液培養基所得的海藻糖合成酶粗酵素液與麥芽糖作用後之糖組成。

圖十九)加入 Papain 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液培養基所得的海藻糖合成酶粗酵素液與麥芽糖作用後之糖組成。

1.85 2.57 3.64 7.53 11.39 13.92 17.43 26.79

0 5 10 15 20 25 30

50 100 150 200 250 300 350

Intensity (mV) 2.92 7.52 14.05 17.16 26.73

3.65

0 5 10 15 20 25 30

50 100 150 200 250 300 350

Intensity (mV) 1.36 7.52 14.03 17.12 26.57

3.65

0 5 10 15 20 25 30

50 100 150 200 250 300 350

Intensity (mV)

(24)

十一)以未經蛋白酶處理之 5％香菇柄萃取原液為所得的海藻糖合成酶粗酵素液與

(圖二十二)以 LB 培養基所得的海藻糖合成酶粗酵素液與麥芽糖作用後之糖組成。

350

(圖二

麥芽糖作用後之糖組成。

0 10 20 30 40 50 60

Alcalase Flavouzyme1

Papain

Pepsin

LB broth

原液

(圖二十三)海藻糖合成酶粗酵素液之酵素活性。

結果：由(圖二十三)得知，加入 Pepsin 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液所得粗酵素液產生的

2.58 7.53 14.05 17.40 26.87

3.63

0 5 10 15 20 25 30

50 100 150 200 250 300 350

Intensity (mV) 2.89 3.64 7.52 14.13 17.20 26.53

300

250

Intensity (mV)

200

150

100

50

0

0 5 10 15 20 25 30

酵素活性(U)

培養基

(25)

18

五

(一)由實驗得知，取得的香菇柄水分含量約為 3.43％

(二)材料價格

(表三)材料價格 Pepsin 蛋白酶 NT$ 7000/kg

、計算成本損失，並估算與比較培養基成本

香菇柄 NT$100/600g LB broth NT$ 1680/500g (三)計算配置 50mL 培養基所需成本

(表四)配 50mL 培養基所需成本

Pepsin 蛋白酶＋5％香菇柄萃取液 NT$1.05+0.43=1.48

LB 培養基 NT$4.2

如果能以其作為培養基，並有效培養基因重組大腸桿菌，進而生產海藻糖合成酶粗酵素液，再以麥行反應生產海藻糖，應該會是個極大的效益，但其蛋白質濃度與培養的基因重組大腸桿菌菌量數經過實驗，均不如香菇柄。推測可能原因為蕈接太空包其他物質成分，導致其含有蛋白質部分較香菇柄少，故所得結果不如預期，無法達到更低成本的目標。

二、若能省去蛋白酶，我們可以再降低成本，故比較未經蛋白酶處理之5%香菇柄萃取體乾重與海藻糖合成酶粗酵素液之酵素活性

的比較下，5％香菇柄萃將5％香菇柄萃取液培養

基數量乘以兩倍所得基因重組大腸桿菌菌量數及海藻糖合成酶粗酵素液之酵素活

性，則可能高於LB 培比較兩者之成本差異，培養基所需成本

計算，5％香菇柄萃取液培養基所需成本為 NT$0.43，而 LB 培養基為 NT$4.2，若

經基主要材料，並增加其兩倍培養量，也

可達到相對高產量、低成本之效果。

結果：加入Pepsin 蛋白酶之 5％香菇柄萃取液的成本較 LB broth 培養基約少三分之二倍，且可達到產量高、成本低之目的。

陸、討論

一、蕈頭為廢棄物，

芽糖為基質，進

頭為連部分，會摻雜

液與LB 培養基的實驗結果，雖然在菌

取液培養基皆較LB 培養基低，若

養基。最後以50mL

將5％香菇柄萃取液培養基所需成本乘以兩倍，其結果仍低於 LB 培養基，故以未過蛋白酶處理之5％香菇柄萃取液為培養

(26)

柒、結論

、比較加入不同蛋白酶的5%香菇柄萃取液，對基因重組大腸桿菌生長狀況影響的實驗中，我們發現加入Pepsin 蛋白酶之 5%香菇柄萃取液為培養基培養基因重組大腸桿菌之菌體乾重最重1.79±0.08(g/L)。相較於加入其他蛋白酶 Flavouzyme、Alcalase、

Papain 的香菇柄萃取液為培養基、不加蛋白酶的培養基和 LB 培養基 1.57±0.12(g/L)，結果都較理想。

四、以高效能液相層析儀分析結果下，得知加入蛋白酶之5%香菇柄萃取液為培養基，培養基因重組大腸桿菌，所得海藻糖合成酶粗酵素液活性52.64(U)，與一般

broth 培養基的成本經過計算，是加入 Pepsin 蛋白酶

捌、未來展望

於糖尿病患者而言，是一大福祉。海藻糖的低致齬性比較不會造成蛀牙，有助於健康。

海藻糖製成的保養品，因海藻糖與人體內水分結構十分相似，能迅速補充皮膚的水分，

薄膜味不的原的蛋白質

一、從測量香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液蛋白質濃度實驗中，得知香菇柄萃取液所含蛋白質含量是最豐富的。另外也比較 2.5％香菇柄、香菇頭、杏鮑菇頭萃取液培養的基因重組大腸桿菌菌量數及菌體乾重，所得結果亦是以 2.5％香菇柄萃取液為培養基的產量最多。故我們選擇香菇柄萃取液做為氮源培養基因重組大腸桿菌以生產海藻糖合成酶粗酵素液。

二、以香菇柄萃取液做為氮源培養基因重組大腸桿菌，結果得知10%與 5%香菇柄萃取液，所產生的菌量數並無明顯差異，所以在降低成本的考量下，選擇 5%香菇柄萃取液當氮源。

三

Pepsin

所使用的LB 培養基所得海藻糖合成酶粗酵素液活性 42.19(U)比較，其結果較好。

五、利用所產基因重組大腸桿菌的菌量及所得海藻糖合成酶粗酵素液之酵素活性來探討不同培養基，並做最後的成本計算。所產基因重組大腸桿菌的菌體乾重及海藻糖合成酶粗酵素液酵素活性，以加入Pepsin 蛋白酶反應的 5％香菇柄萃取液的培養結果較LB broth 培養基佳。而 LB

反應的5％香菇柄萃取液所製之培養基成本的三倍，因此我們的實驗，除了效果比 LB broth 培養基佳，亦可降低成本。

海藻糖在日常生活中運用廣泛，在低糖蛋糕的製作上，能有效降低糖分及油脂，對

進而保護皮膚細胞、改善角質層的抵抗力，亦可替代水分子提供細胞造水功能，讓生物連結使肌膚處於飽水狀態，具有保濕及柔軟作用。手工餅乾由海藻糖取代蔗糖，甜變熱量卻減少一半，在過胖孩童比例趨高的今日，能帶給食品業者新的銷售策略。

由上例可知，若能大量生產海藻糖，將能帶來許多經濟效益。

往後我們會朝著以廢材原料為培養基的方向，例如：豆渣，尋找更適合當作培養基料，或是利用更有效的蛋白酶來培養基因重組大腸桿菌。再者，我們希望尋找有效白酶基因，運用基因轉殖技術，將蛋白酶基因殖入大腸桿菌，使其本身具有分解蛋的能力，以提高海藻糖的產量或降低生產成本，讓此具有高價值的醣類更能廣泛地

(27)

20

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