主编分册主编编写人员

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主编分册主编编写人员

汪忠汪忠李朝晖

汪忠李朝晖曹志江

吴国荣孙传友余跃林

(3)

同学们^，当你们畅游在知识海洋时^，可曾想到^，生物科学与人类社会的关系比其他科学更为密切^；当你们漫步在科学丛林时^，可曾感知^，生物科学就在你我的身边^……

回顾生物科学近百年来的发展史^，许多重大的事件^，如孟德尔遗传规律的发现^、基因学说的创立^、^ＤＮＡ分子双螺旋结构的确定^、人类基因组计划的完成^……仿佛还在昨天^；许多伟大的科学家^，如孟德尔^、摩尔根^、沃森^……仿佛就在眼前^。在如今这瞬息万变的时代^，生物科学在迅猛地发展^，基因工程^、生物克隆^、生物芯片等成果的取得^，引起了全世界的广泛关注^。与此同时^，我们还应该知道^，千百年来^，在这些伟大成果的背后^，有许多默默无闻的工作者和无数平凡的事情^，所有这些都是生物科学发展进程中不可或缺的^、充满生命活力的组成部分^！

２０世纪后期^，生物科学在物理学和化学等学科发展的基础上取得了长足的进展^，已经深入到分子水平探究生命活动的本质^。一般来说^，新生的交叉学科在很大程度上是未来科学的先驱^，而生物科学的研究领域正是产生这些新生学科科学启蒙思想的沃土^。难怪许多科学家早就预言^，^２１世纪生物科学将是自然科学中最为活跃的学科之一^。

当今^，人类生存环境恶化的倾向对以造福人类为理想目标的科学提出了严峻的挑战^，人们对科学进一步发展的期待日益迫切^。生物科学在迎接挑战中^，不断地丰富着自己^。随着数学^、技术科学^、物理学^、化学等学科的不断渗透交融^，^２１世纪的生物科学必将取得更加重大的突破^，呈现出更加欣欣向荣的景象^。生活在这样一个激动人心的生物科学时代^，我们怎能不兴奋呢^！

千鸟竞翔^，万马奔腾^，是生命的一种壮美^；^ＤＮＡ分子的双螺旋^，是生命的一种结构美^……同学们^，生物科学中蕴含着各种形态的美^，让我们在追求美的同时^，也用美去感染你我身边的每一个人^！

编者

２０14 年 ⁶ 月

(4)

………

第一节基因工程概述 ……… ⁷

基因工程的发展历程 ……… ⁷

基因工程的工具

^—^——

酶与载体 ……… ⁹

基因工程的实施过程 ……… ^１3 第二节关注基因工程 ……… ²¹

基因工程的应用 ……… ²¹

转基因生物的安全性问题 ……… ²⁸

生物武器的危害性 ……… ²⁹

第三节蛋白质工程 ……… ³⁵

蛋白质工程概述 ……… ³⁵

蛋白质工程的应用 ……… ³⁸

……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… 第一节细胞工程概述 ……… ⁴⁵

细胞工程的基本技术 ……… ⁴⁶

第二节植物细胞工程的应用 ……… ⁵⁴

植物组织培养技术的应用 ……… ⁵⁴

植物细胞培养技术的应用 ……… ⁵⁶

………

第二章细胞工程第一章基因工程

绪论关注生物科学新进展

………

关注生物科学新进展 ……… ……… ^２

(5)

第三章胚胎工程

………

……… …………

………

第一节受精和胚胎发育 ……… ⁷²

哺乳动物生殖细胞的发生和体内受精 ………… ⁷²

哺乳动物胚胎发育的基本过程 ……… ⁷⁵

第二节胚胎工程及其应用 ……… ⁸¹

胚胎工程的主要技术 ……… ⁸¹

胚胎工程的应用 ……… ⁸⁶

……… ……… ………… ……… ……… ………

第四章生态工程

……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… 第一节生态工程及其原理 ……… ⁹⁸

生态工程的概念 ……… ⁹⁸

生态工程的基本原理 ……… ⁹⁹

第二节生态工程实例 ……… ¹⁰⁷

治污生态工程 ……… ¹⁰⁷

生态恢复工程 ……… ¹¹⁰

生态农业工程 ……… ¹¹²

……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… 第三节动物细胞工程的应用 ……… ⁶¹

动物细胞与组织培养 ……… ⁶¹

动物细胞核移植与体细胞克隆 ……… ⁶²

动物细胞融合和单克隆抗体 ……… ⁶⁵

………

(6)

(7)

人类基因组测序的部分电泳图

当

当 2211 世世纪纪悄悄然然来来临临，，我我们们发发现现关关注注生生命命科科学学发发展展的的人

人越越来来越越多多了了。。就就连连电电影影制制片片商商也也接接连连推推出出《《再再生生人人》》、、

《

《蜘蜘蛛蛛侠侠》》等等源源于于生生物物科科学学重重大大发发现现的的科科幻幻片片。。这这就就是是当当代

代生生物物科科学学的的诱诱人人魅魅力力和和巨巨大大影影响响。。２２１１世世纪纪生生物物科科学学与与技

技术术正正酝酝酿酿着着新新的的突突破破，，这这会会给给农农业业、、医医疗疗与与卫卫生生保保健健等等领

领域域带带来来根根本本性性的的变变化化。。

绪论

● 生物科学是 ²¹ 世纪最活跃的学科之一

● 生物科学发展的主要趋势

关

关注注生生物物科科学学新新进进展展

(8)

学习目标

● 简述生物科学是 ^２１世纪最活跃的学科之一

● 举例说出生物科学的主要发展趋势

关

关注注生生物物科科学学新新进进展展

１９７３年建立的重组 ^ＤＮＡ技术标志着现代生物技术开始兴起^，并应用于生产实践^。如今以基因工程^、细胞工程等为代表的现代生物技术^，正广泛地应用于食品^、医药^、化工^、农业^、能源^、材料^、环境等领域^，并取得了令世人瞩目的成就^，显示出了不可估量的发展潜力^。

生物科学是 21 世纪最活跃的学科之一

生物科学是一门历史悠久的学科^。 ^{１６～１８}世纪^，生物科学的突出成就是一些分支学科^，如解剖学^、生理学^、分类学^、胚胎学等的先后建立和发展^。^１９世纪是生物科学全面发展的世纪^，在这期间创立的细胞学说^、生物进化论和遗传理论被称为现代生物科学的三大基石^。 ^２０世纪^，生物科学发生了巨大的变革^，从静态的^、定性描述性的学科向动态的^、定量实验性的学科转化^。在微观层面^，对生命本质的探索已经深入到分子生物学水平^，人类基因组计划的完成则标志着生物科学新时代的开始^。在宏观层面^，现代生态学已发展成为以人类为研究主体的^、多层次的综合性学科^，在解决影响人类发展的全球性问题上^，正发挥着越来越重要的作用^。

事实：

积极思维为什么说生物科学是^２１世纪最活跃的学科之一^？

不少科学家认为^，生物科学在 ^２１世纪仍将是自然科学中最活跃的学科^。什么是热门学科^？什么是前沿领域^？要回答这两个问题不能从主观愿望出发^，而要从当前科学发展的客观实际出发^。一般来说^，判断科学领域的重要性^，首先要看从事这一学科工作的人数^，这主要体现在发表的有价值的高水平科学论文的总数上^；同时也要参考一个时期内科学上的重大突破^，如获得诺贝尔奖的成果等^。那么^，有大量科学家涌入^，并且发表了大量有价值的科学论文的学科必然是热门学

(9)

图^１部分以我国科学家的研究成果为封面图的^{ｎａｔｕｒｅ}和^{Ｓｃｉｅｎｃｅ}

科^，不断出现重大突破的领域必然是前沿领域^。进入某一学科的科学家越多^，发表论文的数量越多^，表明这一学科领域越活跃^，影响也越大^。

对于一篇科学论文的水平和价值的评价^，国际上常用发表这篇论文的刊物的水平来衡量^。而刊物的水平通常是根据刊物的^“影响因子^”来判断的^。所谓^“影响因子^”，就是指在全世界范围内对这种刊物所发表的论文的引用情况^。每年发表论文数量越多的学科^，在有关论文中的相互引用就越频繁^，有关刊物的^“影响因子^”也就越高^。刊物的^“影响因子^”在一定程度上代表了某一学科在国际科学界的活跃程度^，反映了这一学科的重要性和它在现代科学发展中的地位^。

全世界自然科学范畴内共有^{８０００}余种期刊^。美国科学信息研究所^（^ＩＳＩ^）是对全世界科学信息收集最完全的权威机构^，它出版的科学引文索引^（^ＳＣＩ^）也最具有权威性^。 ^ＳＣＩ收录了 ^{８０００} 余种期刊中较为重要的 ^{４０００} 余种^，在数^、理^、化^、天^、地^、生六大分支中^，生物科学刊物占总数的 ^{２８．６％}^；而在

“影响因子^”位列前 ^１０的刊物中^，除著名的多学科综合性刊物英国的 ^{ｎａｔｕｒｅ}和美国的 ^{Ｓｃｉｅｎｃｅ} 外^，全部是生物科学领域的刊物^。这充分表明了生物科学在整个自然科学发展中的领先地位^。这一情况已经延续多年^，并且从近^１０余年的发展趋势来看^，这种状况还将延续下去^。可以预计^，生物科学仍将是整个自然科学领域中最为活跃的学科^。

分析：举出身边发生的事例^，说明生物科学在迅猛发展^。生物科学在^２０世纪已经取得了巨大的成就^，在自然科学的发展中也处于领先地位^，并正向着前所未有的广度和深度迅速地发展^。

(10)

生物科学发展的主要趋势

根据当代自然科学和^２０世纪生物科学发展的规律^，许多专家预测^：^２１世纪生物科学的发展趋势是对生命现象及其本质的研究不断深入和扩大^，并向着微观与宏观^、基础理论与开发应用等方面全方位地发展^（图^２^）。

生物科学向着日益深入生命本质的方向发展

生物科学将深入研究细胞^、分子和基因^，并综合分析它们是如何相互作用而形成复杂生命系统的^。图为科学家在进行人类基因组测序^。

生物科学向着多学科交叉与融合的方向发展

生物科学与数学^、物理^、化学^、信息技术等学科之间的大综合^、大交叉^，将从不同侧面^、不同层次揭开生命之谜^。图为应用^Ｘ射线晶体衍射法测定蛋白质结构^。

生物科学向着基础研究和应用研究统一的方向发展随着生物技术及其产业化的发展^，生物科学基础研究成果转化为生产力的前景非常广阔^。图为利用发酵罐生产药品^、食品等^。

图^２ ^２１世纪生物科学发展的主要趋势

生物科学

生物科学向着生物资源保护与可持续利用的方向发展生物科学将深入地研究生物及其生存环境之间相互作用的规律^，并在相关规律的指导下^，重视生物资源的保护与可持续利用^。图为生物质能开发利用研讨会的宣传海报^。

(11)

瑞典皇家科学院^２００２年^１０月 ^９日宣布^，将 ^２００２年诺贝尔化学奖的一半授予美国弗吉尼亚联邦大学教授约翰^·芬恩

（Ｊ．Ｂ．Ｆｅｎｎ）和日本京都岛津制作所工程师田中耕一^（^{Ｋ．Ｔａｎａｋａ}^），

他们分别创建了使生物大分子软吸附电离的不同方法^，使生物大分子的质谱分析成为可能^；将另一半授予瑞士联邦技术研究所科学家库尔特^·维特里希^（Ｋ．Ｗüｔｈｒｉｃｈ），他创建了利用核磁共振波谱确定溶液中蛋白质等生物大分子三维结构的方法^。由于三人在实验方法和技术上的革命性突破^，使科学家现在能够快速可靠地确认生物大分子^，并获得它们的三维结构^。

2002 年诺贝尔化学奖

约翰^·芬恩田中耕一库尔特^·维特里希

他们三人在研究生物大分子的基础分析方法上的创新性成就^，不仅促进了生物科学与技术的蓬勃发展^，还被广泛应用于新药研发^、食品安全^、疾病诊断^、环境保护^、污染监测等方面^。

评价指南

１．为什么说生物科学是²¹世纪最活跃的学科之一^？它的发展趋势可能是什么^？

２．尝试从宏观和微观两个方面列举事

例^，阐述生物科学的研究正从生命现象深入到生命活动的本质^。

(12)

蓝色玫瑰

玫

玫瑰瑰花花绚绚丽丽多多彩彩，，但但是是自自然然界界里里没没有有蓝蓝色色的的玫玫瑰瑰，，因因为

为普普通通玫玫瑰瑰缺缺少少一一种种编编码码合合成成蓝蓝色色色色素素的的基基因因。。有有科科学学家

家克克隆隆了了这这种种基基因因，，把把它它导导入入普普通通玫玫瑰瑰，，终终于于使使传传说说中中

“

“天天上上有有，，地地上上无无””的的蓝蓝色色玫玫瑰瑰在在人人间间绽绽放放。。你你是是否否对对这这样样的

的基基因因工工程程感感兴兴趣趣了了？？好好好好学学习习本本章章内内容容吧吧！！

第一章

● 基因工程概述

● 关注基因工程

基

基因因工工程程

(13)

学习目标

● 简述基因工程的发展历程

● 举例说出基因工程的工具

● 简述基因工程的实施过程

关键词基因工程

第

第一一节节基基因因工工程程概概述述

在我国的十二生肖中^，有一种属相是龙^。龙是传说中的一种神奇动物^，能呼风唤雨^，善腾云驾雾^。它的角似鹿^、鼻似狮^、目似虎^、唇似牛^、爪似鹰^、鳞似鱼^、身似蛇^，在自然界中显然不存在这样的动物^。但是^，在不久的将来通过基因工程也许会创造出龙呢^！

基因工程的发展历程

20世纪⁵⁰年代初期至 ⁷⁰年代^，是分子遗传学迅猛发展^、快速进步的年代^。在这短短的²⁰多年间^，许多有关分子遗传学的基本原理相继提出^，大量的重要发现不断涌现^。

1953 年^，沃森^（J.D. Watson）和克里克^（^{F. Crick}^）建立了

DNA 分子双螺旋结构模型^。 ¹⁹⁵⁷ 年^，美国科学家科恩伯格

（A. Kornberg）及其合作者首次在大肠杆菌中发现了^DNA聚合酶^，这是一种可以在体外催化合成 ^DNA的酶^，从此拉开了

DNA合成研究的序幕^。 ¹⁹⁵⁸年^，梅塞尔森^（M. Meselson）和斯塔尔^（^{F. Stahl}^）发现了^DNA半保留复制的机理^，揭示了基因之所以能够代代相传且准确保留的分子本质^。同年^，克里克提出了描述遗传信息流向的中心法则^，阐明了基因表达过程中遗传信息从^DNA到^RNA^，再到蛋白质的传递途径^。

自¹⁹⁶¹年开始至¹⁹⁶⁶年^，经过尼伦伯格^（M.W. Nirenberg）

和霍拉纳^（H.G. Khorana）等科学家的努力^，全部 ⁶⁴ 种遗传密码均被成功破译^，从而将^RNA分子上的核苷酸顺序同蛋白质肽链中的氨基酸顺序联系起来^，这是分子遗传学发展过程中影响最为深远的科学发现之一^。¹⁹⁶⁷年^，罗思^（^{T.F. Roth}^）和赫林斯基^（D.R. Helinski）发现细菌拟核外的质粒具有自我复制能力^，并能在细菌细胞之间转移^，这一发现为基因的转移找到了一种运转工具^。同年^，科学家在大肠杆菌细胞中发现了^DNA 连接酶^。

1970 年^，两位美国科学家特明^（^{H.M. Temin}^）和巴尔的摩^（D. Baltimore）各自在^RNA病毒中发现了逆转录酶^，进而证明遗传信息也可以从^RNA反向传递到^DNA^，这是对中心法则

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图^1-1 电子显微镜下的大肠杆菌质粒

的重大补充^。同年^，史密斯^（^{H.O. Smith}^）等人从流感嗜血杆菌中分离到第一种特异性很强的限制性核酸内切酶^。¹⁹⁷⁷年^，英国科学家桑格^（^{F. Sanger}^）测定了噬菌体 ^{φ X174}的基因组序列^，这是首次完整基因组的测序工作^。

上述这些原理的提出和发现的涌现^，为基因工程的创立与发展奠定了强有力的理论与技术基础^。

1972年^，美国斯坦福大学科学家伯格^（^{P. Berg}^）领导的研究小组完成了世界上首次^DNA分子体外重组^。他们使用同一种限制性核酸内切酶^，在体外对猿猴病毒^SV40的^DNA和^λ噬菌体的^DNA分别进行酶切^，再用^DNA连接酶将两者的酶切片段连接起来^，结果获得了重组的杂种^DNA分子^，这种重组^DNA 分子包含^{SV40 DNA}片段和^λ噬菌体^DNA片段^。

1973年^，斯坦福大学科学家科恩^（^{S. Cohen}^）领导的研究小组也成功地利用大肠杆菌质粒^（图 ^1-1^）进行了另一个体外重组 ^DNA分子实验^。他们将一种大肠杆菌的质粒^DNA^（^DNA上有卡那霉素抗性基因^）和另一种大肠杆菌的质粒 ^DNA^（^DNA 上有四环素抗性基因^）混合后^，加入同一种限制性核酸内切酶^，对 ^DNA分子进行切割^，再用^DNA连接酶将酶切片段连接起来形成重组 ^DNA分子^。用这种连接后的^DNA混合物去转化大肠杆菌^，结果发现^，在子代大肠杆菌菌落中^，有一些表现出了既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗性特征^。这说明重组质粒的 ^DNA分子上既有卡那霉素抗性基因又有四环素抗性基因^。

在科恩进行的实验中^，重组^DNA分子上的两种抗性基因都来源于大肠杆菌^。那么^，在不同物种之间的^DNA 能否实现重组呢^？为了回答这个问题^，科恩和美国加州大学科学家博耶

（H. Boyer）合作^，将非洲爪蟾核糖体蛋白基因的 ^DNA片段与大肠杆菌的质粒进行重组^，再把重组的^DNA转入大肠杆菌^，结果成功转录出了相应的^mRNA^。这次成功的合作说明了真核生物的基因可以和原核生物的基因进行重新组合^，打破了传统的种间遗传物质不能交换的重重壁垒^，开创了基因工程^。

简单地说^，基因工程^（ｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）是指在体外通过人工^“剪切^”和^“拼接^”等方法^，对生物的基因进行改造和重新组合^，然后导入受体细胞^，并使重组基因在受体细胞中表达^，产生人类需要的基因产物的技术^。基因工程又称为^DNA重组技术^。

1976年^，博耶用质粒为载体^，将生长抑制素释放因子的基因转入大肠杆菌^，并成功表达^。企业家闻讯后拜访了博耶并与之协议成立基因公司^，于¹⁹⁷⁷ 年第一个生产出了治疗肢端肥大症的生长抑制素释放因子^。以往生产这种激素^，是从动物的

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图^１－2 巨型小鼠^（后^）和正常小鼠^（前^）

下丘脑中提取^，每获 ^{1 mg}需要¹⁰万只羊^。通过基因工程制备的工程菌来生产^，要获得^{1 mg}这种激素^，只需不到^{2 L}的培养液^。随后^，基因工程产品人胰岛素^、人生长激素^、人干扰素等相继问世^，并带来了巨大的经济效益^。

１９８２年^，美国科学家帕米特^（Ｒ. D．Ｐａｌｍｉｔｅｒ）等人采用显微注射法^，将带有大鼠生长激素基因的重组^DNA分子转入小鼠受精卵内^，并将早期胚胎植入小鼠体内妊娠^，结果分娩出了带有大鼠生长激素基因的小鼠^。该小鼠生长迅速^，体型是同一胎中其他小鼠的^１．８倍^，称为巨型小鼠^（图^１－2^）。这一实验的成功表明了外源基因不仅可以转入动物的受精卵基因组中^，而且可以在受精卵发育成的新个体中表现出外源基因所决定的性状^。

1983年^，美国科学家通过农杆菌转化法培育出了世界上首例转基因植物^——^—转基因烟草^。从此之后^，以基因工程为基础的生物技术^，作为前途远大的高技术产业在世界范围内兴起^。

基因工程的工具———酶与载体

图^１－3 双链^DNA分子结构与磷酸二酯键位置

“分子手术刀^”——^—限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶^，又称限制酶^，是基因工程的重要工具之一^。限制酶的特异性^（专一性^）很高^，能识别 ^DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列^，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开^（图 ^1-3）。

磷酸二酯键

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把两种来源不同的^ＤＮＡ分子用同一种限制酶来切割^，形成相同的末端^。那么^，怎样将切割后的片段重新连接起来呢^？

科学家已经陆续从近³⁰⁰种微生物中分离出约^{4 000}种限制酶^。例如^，某种限制酶^（ÊcoRⅠ^）是从大肠杆菌^（Escherichia coli）的^R型菌株分离出来的^，用字母ÊcoR表示^，其中Ê是生物属名的第一个字母^，^co是种名的头两个字母^。它又是从大肠杆菌^R型菌株中分离出来的第一种限制酶^，就命名为ÊcoRⅠ^。

限制酶能识别的特定的脱氧核苷酸序列也被称为识别序列^。大多数限制酶识别的序列由 ⁶ 个核苷酸组成^。例如^，

EcoRⅠ、Hind Ⅲ和 ^BamHⅠ三种限制酶识别的序列分别为

- GAAT T C -

- C T TAAG -、- AAGCT T -

- T TC GAA -和^{- GGATCC -}_{- CCTAGG -}^。也有一些限制酶识别的序列由 ^{4 、 5} 或 ⁸ 个核苷酸组成^。识别序列中一般具有回文序列^，即在限制酶的切割部位^，DNA分子的一条链正向读的碱基顺序^（如^-CTGCAG-）与另一条链反向读的顺序

（如^-GACGTC-）完全一致^。

限制酶像^“分子手术刀^”一样^，能够切割 ^DNA 分子^，按照切割方式的不同^，可分为错位切和平切两种^。错位切是在 ^DNA 分子两条链的不同部位进行切割^，切割后两个末端均留下一段游离的单链^，科学家将这种单链称为黏性末端^。平切是在^DNA分子两条链上相同的部位进行切割^，切割后形成一个平口末端^。例如^，EcoRⅠ的错位切方式如图^1-4 所示^，HaeⅢ的平切方式如图^1-5 所示^。

图^1-5 一种限制酶^（^{Hae Ⅲ}^）的平切示意图图^１－4 一种限制酶^（^EcoRⅠ^）的错位切示意图

一种限制酶黏性末端

黏性末端切点

切点切点

一种限制酶切点

5′ 3′

3′ 5′

5′ 3′

3′ 5′ 3′ 5′

5′ 3′

3′ 5′

5′ 3′

3′ 5′

5′ 3′

3′ 5′

平口末端

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知识海洋不同的限制性核酸内切酶

基因工程中常用的限制酶针对识别序列进

行切割^，切割后形成 ^3′端黏性末端^、^5′端黏性末端或平口末端^（表^Ⅰ^）。

表^Ⅰ 一些常用的限制酶识别的序列与切割产生的末端类型

限制酶识别序列与切割部位产生的

末端类型限制酶识别序列与切割部位产生的末端类型

BbuⅠ - GCATGC -

- CGTACG - ^3′端黏性末端 ^NotⅠ - GCGGCCGC -

- CGCCGGCG - ^5′端黏性末端

Hind Ⅲ - AAGCTT -

- TTCGAA - ^5′端黏性末端 ^EcoRⅠ ^{- GAATTC -}_{- CTTAAG -} ^5′端黏性末端

HpaⅠ - GTTAAC -

- CAATTG - 平口末端 ^AluⅠ ^{- AGCT -}_{- TCGA -} 平口末端

“分子针线^”——^—^DNA连接酶

对于两个具有黏性末端的^DNA分子^，通过碱基互补配对可将黏性末端的两条链之间的碱基连接起来^，而要形成重组

DNA分子^，还必须将基本骨架之间通过磷酸二酯键^“缝^”上^，就像断成两截的梯子^，不仅要把中间的踏脚连接起来^，还要把两边的扶手接合在一起^。所以^，基因工程还需要一种被称为^“分子针线^”的工具酶^—^——^ＤＮＡ连接酶^（图 ^１－6^{）。}

图^１－6 限制性核酸内切酶和^ＤＮＡ连接酶作用示意图

同一种限制酶

ＤＮＡ连接酶

5′ 3′

3′ 5′

5′ 3′

3′ 5′

5′ 3′

3′ 5′

5′ 3′ 5′

3′ 5′ 3′ 5′

3′ 5′ 3′

3′ 5′

5′ 3′

3′ 5′

(18)

实践：

1.制作^DNA分子片段^：参照图^1-6^，分别在两张硬纸板上制作^“^DNA 分子^”片段甲和片段乙^，要求每个片段有 ^25～35对碱基^，

其中的序列至少有一段为^“^{-GAAT TC-}-CT TAAG- ”（图

1-7）。

边做边学模拟限制酶和 ^DNA连接酶的作用过程

2.模拟活动^：

（1）在片段甲和片段乙上分别找出^EcoRⅠ 能够识别的序列^“^{-GAAT TC-}-CT TAAG-”。

（2）用剪刀模拟 ^EcoRⅠ在片段甲和片段乙上进行切割^，形成带有黏性末端的^DNA 片段^。

（3）分别从切割甲^、乙产生的片段中选择一个^，用透明胶带模拟^DNA连接酶将两个黏性末端连接起来^。

讨论：

在上述活动中为什么要用同一种限制酶切割两种^DNA分子呢^？在图^1-7中^，切割后的片段可以连成几种新的^DNA分子^？

“分子搬运工^”——^—目的基因进入受体细胞的载体

将外源基因导入受体细胞并使其在受体细胞中稳定遗传和表达^，还需要一定的^“分子搬运工^”，基因工程上将它们称为载体^。目前^，常用的载体有质粒^、^λ噬菌体的衍生物^、动植物病毒等^。质粒是细菌细胞中一类裸露的^、结构简单^、独立于细菌拟核^DNA之外^，并具有自我复制能力的环状 ^DNA分子^（图^1-

8）。它是最早被应用的载体^。

质粒^DNA分子上至少包括^：含有复制原点且能保证在受体细胞中进行独立复制的复制区^；独特的标记基因^，如四环素抗性基因^、氨苄青霉素抗性基因或某些生化表型等标记基因^，用于鉴定和选择重组 ^DNA分子^；目的基因^（外源基因^）插入位点^，即限制性核酸内切酶的切割位点^，便于目的基因的插入^。事实上^，在基因工程相关操作中^，被用做载体的质粒一般都是经过人工改造过的^。

用限制酶切割质粒和外源^DNA分子^，并通过^DNA连接酶的连接^，就能将质粒和外源^DNA分子组成一个重组 ^DNA 分子^，即外源基因表达的载体^。

图^1-8 大肠杆菌与质粒载体的基本结构示意图

目的基因插入位点

复制原点

抗生素抗性基因大肠杆菌

拟核

质粒

A C T T C G A T G G A A T T C A G A A C T T C T C C A A T C

T G A A G C T A C C T T A A G T C T T G A A G A G G T T A G C T C T T G A T G G A A T C T C A G A A T T C A G T C T G T G A A T C

G A G A A C T A C C T T A G A G T C T T A A G T C A G A C A C T T A G

甲

乙

图^1-7 用彩色笔绘制的^“^DNA分子^”片段

(19)

图^1-9 一种^ＰＣＲ仪

在自然界中^，生物体在传宗接代中发生着^DNA分子的重组^，导致产生对生物体有利或有害的变异^。这类^DNA分子的重组不受人的意志控制^，因此重组的结果难以预测^。基因工程产生的重组^DNA分子^，是根据人的意愿经过严密的设计而形成的^，在生物体外实现了不同来源的 ^DNA分子的拼接^，使得遗传信息朝着预期发生变化^。

基因工程涉及多种技术操作^，主要包括获取目的基因^，构建基因表达载体^，将目的基因导入受体细胞^，以及目的基因的检测和鉴定等步骤^。

1.获取目的基因

获取目的基因的方法很多^，如可通过基因文库获取目的基因^，也可通过 ^PCR 技术扩增目的基因^，还可通过化学方法直接人工合成等^。

先用酶切等方法将某种生物细胞的整个基因组 ^DNA切割成大小合适的片段^，再将这些片段分别与载体连接起来^，导入受体菌的群体并储存起来^，这样每个受体菌可能分别含有该种生物的不同基因^，因此这个群体被称为基因文库^。

如果基因文库中包含了某种生物的全部基因^，则称为基因组文库^；如果基因文库只包含了某种生物的部分基因^，则称为部分基因文库^。

在需要获取某种目的基因时^，怎样从基因文库中得到它呢^？在基因文库中^，不同的^DNA片段分别都得到了扩增^，因此^，只要根据基因的核苷酸序列^、基因的功能^、基因在染色体上的位置^、基因的转录产物^mRNA、基因的表达产物蛋白质等信息^，就可以直接从基因文库中获取目的基因^。

PCR

PCR 是多聚酶链式反应（polymerase chain reaction）的缩写^。这项技术是在体外通过酶促反应有选择地大量扩增目的基因或 ^DNA序列的技术^。运用 ^PCR仪^（图^1-9）扩增目的基因的操作比较简单^、容易掌握^、结果可靠^，能在较短的时间里将目的基因扩增百万倍以上^。美国科学家穆里斯

（K. B. Mullis）因发明^PCR技术于¹⁹⁹³ 年获得诺贝尔化学奖^。

对于比较小的目的基因^，在弄清脱氧核苷酸序列后^，通过^DNA合成仪直接人工合成^。

基因工程的实施过程

(20)

知识海洋 PCR原理

根据^DNA分子半保留复制原理^，^PCR技术能将一个基因不断地加以复制^，使其数量呈现指数式增加^。在^PCR中^，^DNA聚合酶不能从头开始合成

DNA，只能从^3′端延伸^DNA链^，因此^，^DNA复制需要引物^。引物是一小段^DNA或^RNA^，它能与模板

DNA的一段碱基序列互补配对^。用于^PCR的引物

长度一般为^20~30个核苷酸^。

当引物与双链^DNA解旋后形成的单链按照碱基互补配对原则结合后^，^DNA聚合酶就能从引物的^3′端开始延伸^DNA链^，^DNA的合成方向总是从子链的^5′端向^3′端延伸^。

3′ 5′

3′

5′

3′ 5′ 5′

5′ 5′ 3′

3′

5′

3′ 5′

图^Ⅰ 多聚酶链式反应程序示意图

第一次循环的产物第二次循环的产物

第三次循环的产物第一次循环的产物成为第二次循环的

模板^，再次经过变性^、退火和延伸三步第二次循环的产物成为第三次循环的模板^，再次经过变性^、退火和延伸三步

继续上述循环^，产物^DNA的数量呈指数式增长

TaqDNA聚合酶

4种脱氧核苷酸

模板^DNA 引物

①向离心管中加入模板

DNA、引物和⁴种脱氧核苷酸以及^TaqDNA聚合酶

②变性^：在^{９4 ℃}高温下^，作为模板的双链^ＤＮＡ解旋为单链^ＤＮＡ

③退火^（复性^）：反应体系的温度降至 ^{55 ℃}^（由引物复性温度决定^），引物与单链^ＤＮＡ上的特定部位相互配对

④延伸^：反应体系的温度回升到 ^{７２ ℃}左右^（^ＴａｑDNA 聚合酶的最适反应温度^），按照单链 ^DNA上的脱氧核苷酸序列^，^４种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则^，在

ＴａｑDNA聚合酶的作用下连接到引物之后^，使引物链延伸^，形成互补的^ＤＮＡ双链

3′ 5′ 3′ 5′

5′ 3′ 5′ 3′

缓冲液

(21)

2.构建基因表达载体

将外源基因导入受体细胞并使之有效表达^，需要先构建基因表达载体^，它是实施基因工程的核心步骤^，其操作过程是将目的基因与质粒^、λ噬菌体或一些动植物病毒等在体外进行重组^。

基因表达载体不仅要使目的基因进入受体细胞并有效表达^，而且要能稳定存在且遗传给后代^。所以^，一个基因表达载体除了目的基因外^，还应包括启动子^、终止子和标记基因等^（图^{1 - 10）。}

启动子是位于目的基因上游的一段核苷酸序列^，是^RNA聚合酶识别^、结合的部位^。它与 ^RNA聚合酶的结合就像^“开关^”一样^，驱动基因的转录活动^，并引发相应的^mRNA合成^。

终止子是一段特殊的^DNA片段^，是载体上终止目的基因转录的核苷酸序列^。

标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中

是否含有目的基因^，以便筛选出含有目的基因的细胞^。标记基因主要是抗性基因^、某些生化表型基因^。例如^，抗生素抗性基因就可以作为一种标记基因^。

由于受体细胞有可能是动物细胞^、植物细胞或微生物细胞^，并且目的基因导入受体细胞的方法也不一定相同^，因此^，构建的基因表达载体会不完全相同^。

3.导入目的基因

将基因表达载体导入受体细胞是实施基因工程的重要步骤^。受体细胞不同^，导入目的基因的方法也不尽相同^。

目前^，农杆菌转化法是最常用的将目的基因导入植物细胞的方法之一^。农杆菌是一种生活在土壤中的微生物^，能在自然条件下感染双子叶植物或裸子植物^，但不会感染大多数单子叶植物^。当双子叶植物或裸子植物受到损伤时^，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物^，吸引农杆菌向伤口处移动^。农杆菌中^Ti质粒上可转移的 ^{DNA（T-DNA）}能进入受体细胞^，并整合到受体细胞染色体的 ^DNA上^。农杆菌转化法就是将目的基因插入到 ^Ti质粒的^T-DNA上^，利用农杆菌的转化作用^，将其插入植物细胞染色体的^DNA上^，使目的基因的遗传特性得到稳定的维持和表达^。

图^1-10 基因表达载体模式图插入基因

终止子

抗生素抗性基因

启动子复制原点

(22)

积极思维抗软化番茄是如何培育出来的^？

分析：以大肠杆菌为受体^，以人生长激素基因为目的基因^，设计并绘图表示通过基因工程生产人生长激素的过程^。

多聚半乳糖醛酸酶基因

ｍＲＮＡ多聚半乳

糖醛酸酶破坏细胞壁

使番茄软化

图^1-11 普通番茄及其软化机理

Ti质粒含目的基因的重组^Ti质粒

普通番茄细胞

培养

抗多聚半乳糖醛酸酶基因

ｍＲＮＡ２ｍＲＮＡ１和^{ｍＲＮＡ２}配对导致不能合成多聚半乳糖醛酸酶

含重组^Ti质粒的农杆菌抗多聚半乳糖

醛酸酶基因

（目的基因^）

图^１－12 抗软化番茄的培育和抗软化机理示意图

多聚半乳糖醛酸酶基因抗多聚半乳糖醛酸酶基因

培育

事实：番茄营养丰富^，是人们喜爱的一种果蔬^。普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因^，控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶^，该酶能破坏细胞壁^，使番茄软化^，不耐贮藏^（图^１－11^）。科学家通过基因工程将一种抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞中^，从而获得了抗软化番茄^。这种番茄保鲜时间长^，利于番茄的储存和运输^（图^１－12^）。

ｍＲＮＡ１

多聚半乳糖醛酸酶基因

导入基因

此外^，还有一些方法也可以将目的基因导入植物细胞^。

多聚半乳糖醛酸酶基因转入农杆菌

(23)

图^１－13 显微注射^DNA

显微注射法是将目的基因导入动物细胞的常用方法 ^（图

1-13）。一般要先准确掌握母畜的性周期^，再加以人工调节^，使母畜在预先确定的时间排

卵^，以保证获得大量的刚刚受精的卵^；然后用手术或非手术的方法收集卵^，经短暂的离心处理后^，放在显微镜下用口径^{1 μm}的玻璃微管向细胞核注射 ^{500 ～600} 个拷贝的目的基因^；最后把这些单细胞胚胎移植到另外一头处于相同性周期的母畜的体内^。经过这样处理后^，在后代中就会出现 ^1%～

3%的转基因动物^。效率虽然不高^，但结果相当稳定^。全世界已在各种动物身上进行了大量的实验^，生产出多种转基因动物^。

科学家通过实验发现^，经过适当处理后^，细胞膜对 ^DNA 的通透性会发生改变^，细胞变得容易接受外来的 ^DNA，处于这种状态的细胞称为感受态细胞^。例如^，大肠杆菌经过^Ca²⁺处理^，就成为容易受质粒 ^DNA转化的细胞^。以大肠杆菌等原核生物为受体细胞的转化过程^，一般先用^Ca²⁺处理^，使其成为一种能够吸收周围环境中^DNA分子的感受态细胞^，然后再将这些感受态细胞和重组的基因表达载体混合于缓冲液中^，在温度适宜的条件下感受态细胞吸收^DNA 分子^，完成转化过程^。

4.检测和鉴定目的基因

在基因表达载体导入受体细胞的过程中^，由于操作失误和不可预测的干扰等^，并不是所有受体细胞都能按照预先设计的方案获得基因表达载体的^，真正获得目的基因并能有效表达的只是其中的一部分^。如何筛选出这一部分细胞呢^？

首先^，应该从 ^DNA水平检测^。 ^DNA分子杂交法就是一种检测方法^，其基本原理是具有一定同源性的两条^DNA单链^，在一定条件下^（适宜的温度等^）可以按照碱基互补配对原则形成双链^。杂交过程中^，杂交的双方是待测的^DNA和用放射性同位素标记的已知^DNA片段^（又称为基因探针^）。若待测^DNA

(24)

其次^，还应该从^RNA水平检测重组体^，主要是检测目的基因是否能发挥其功能^，即是否转录出相应的 ^mRNA分子^。例如^，采用上述分子杂交技术^，从待测转基因生物细胞中提取

mRNA分子^，用已标记的目的基因作为探针与^mRNA杂交^，如果有杂交带出现^，表明目的基因转录出了相应的^mRNA分子^。

最后^，应该从蛋白质水平进行检测^。一般先从待测转基因生物中提取蛋白质^，再用相应的抗体进行抗原^—抗体杂交^。如果有杂交带出现^，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质^。

为了培育某些特定性状^，有时还需要从个体水平对其生物学特定性状进行检测^。例如^，对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄^，需要先通过栽培获得果实后^，再与天然产品比较^，确定其是否具有了抗冻性状^。

经过几十年来无数科学家的努力^，基因工程已经发展成为一项比较成熟的技术^。基因重组的受体细胞已经从开始时的大肠杆菌推广到枯草杆菌^、酵母菌^、霉菌^、植物细胞^、昆虫细胞^、哺乳动物细胞^；外源基因不但能够整合到质粒中^，而且能整合到细胞的染色体上^。

中有能与探针互补的特异性^DNA片段^，用于示踪的放射性同位素标记会指示出其所在的位置^，表明目的基因已插入转基因生物染色体的 ^DNA中^（图 ^1-14）。

图^１－14 目的基因的检测示意图

A T C T C A G A A T T C A G T C T G T G A

T A G A G T C T T A A G T C A G A C A C T

C T T A A G T C A G

A T C T C A G A A T T C A G T C T G T G A

C T T A A G T C A G

目的基因片段

基因探针放射性同位素标记

基因探针目的基因片段

解旋

(25)

评价指南

一^、单项选择题

１．下列关于限制性核酸内切酶的叙述中^，错误的是 ^（ ^）

Ａ．它能在特殊位点切割^ＤＮＡ分子

Ｂ．同一种限制酶切割不同的^ＤＮＡ^，产生的黏性末端能够很好地进行碱基配对

Ｃ．它能任意切割 ^ＤＮＡ分子^，产生大量的 ^ＤＮＡ片段

Ｄ．每一种限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列

２．最早完成体外^DNA重组的科学家是

（）

Ａ．伯格 ^Ｂ．帕米特

Ｃ．科恩 ^Ｄ．博耶

３．下列关于基因工程的叙述中^，错误

的是 ^（ ^）

Ａ．体外重组^ＤＮＡ需要适宜的条件

Ｂ．基因工程又叫做重组^ＤＮＡ技术

Ｃ．基因工程是现代生物技术的核心

Ｄ．基因工程的受体细胞必须是大肠杆菌等原核生物

４．基因工程的主要技术环节依次为

（）

①导入目的基因

②构建基因表达载体

③目的基因的检测与表达

④获得目的基因

Ａ． ①②③④ Ｂ． ④②③①

Ｃ． ④②①③ Ｄ． ③②④①

５．下列关于培育抗软化番茄的叙述中^，

错误的是 ^（ ^）

Ａ．运载工具是质粒

Ｂ．受体细胞是番茄细胞

Ｃ．目的基因为多聚半乳糖醛酸酶基因

Ｄ．目的基因的表达延缓了细胞的软化

6．下列有关构建基因表达载体的叙述中^，错误的是 ^（ ^）

Ａ．将外源基因导入受体细胞^，需要先构建基因表达载体

Ｂ．基因表达载体能使目的基因进入受体细胞且能有效表达

Ｃ．进入受体细胞的基因表达载体一般能稳定存在^，但不能遗传给后代

Ｄ．一个基因表达载体除了目的基因外^，还应包括启动子^、终止子和标记基因等

7．下列属于检测和鉴定目的基因的方法

的是 ^（ ^）

Ａ．显微注射法 ^{Ｂ． PCR}技术

Ｃ．农杆菌转化法 ^Ｄ．核酸杂交法二^、技能增进题

分析证据客观地分析实验中得到的证据^，思考它们能说明什么问题^，是科学探究的重要技能之一^。

从供体细胞中获取目的基因^，与大肠杆菌细胞中的质粒重组^，构建成为基因表达载

体^，导入去除质粒的大肠杆菌细胞^，经培养后发现^，有的大肠杆菌克隆含重组质粒^，有的含非重组质粒^，还有的不含质粒^。分析这一证据^，你知道其中的原因吗^？

(26)

显微注射

显微注射法是目前应用比较广泛^、效果比较稳定的培育转基因动物的方法之一^。

以转基因鼠为例^，首先选择三只鼠^，一只雌鼠提供卵细胞^，一只雄鼠提供精子^，第三只鼠为雌鼠^，作为代孕母鼠^。给第一只雌鼠注射一种绒毛膜促性腺激素^，促使它大量排卵^。然后使其与雄鼠交配^，从交配完成后的雌鼠输卵管中取出受精卵^。精子进入卵细胞后的^{1 h}内^，精前核和卵前核一般是分开的^，等到卵细胞完成减数分裂^，卵前核和精前核才进行核配^。显微注射就是选择这个时期来完成的^。由于精前核比卵前核大一些^，容易在显微镜下观察到^，于是在对受精卵进行固定的情况下^，利用显微注射针可以把外源 ^DNA 注射到精前核中^。

注射完成之后^，通过显微移植手术将受精卵移植到第三只代孕雌鼠的子宫内^，受精卵逐步发育为幼鼠^。当然^，这些幼鼠还必须经过^DNA检测^，以确认是否转入外源 ^DNA，再通过一系列杂交^、筛选^，最后获得纯合转基因鼠^。

雌鼠^（^♀^）杂交

雄鼠^（^♂ ^）

×

卵前核精前核

用含有外源基因的显微注射器植入外源基因植入代孕雌鼠

产生嵌合幼鼠杂交筛选

纯合转基因鼠

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