成大研發快訊 - 文摘 成大研發快訊 第九卷 第二期 - 2009年六月五日 [ http://research.ncku.edu.tw/re/articles/c/20090605/4.html ]
魚類如何防禦病毒侵擾:石斑魚Mx蛋白可以結合病毒鞘
蛋白對抗病毒
陳永茂
1、蘇永霖
1、謝佩璇
1、黃劭凌
1、楊惠郎
1,2,3、陳宗嶽
1,2,3,* 1國立成功大學生物科學與科技學院生物科技研究所 2國立成功大學海洋環境及工程技術研究中心 3國立成功大學農業生物技術研究中心 ibcty@mail.ncku.edu.twDevelepmental and Comparative Immunology 32:825-836, 2008
水
產養殖業從很早以前就已經存在了,但是一直到近三十年來,水產養殖 才開始受到重視並快速發展。我國水產養殖業以能養殖近120種魚貝類著名國 際,由於台灣為世界三大水產養殖國之一,而台灣的養殖技術,特別是魚苗 的孵化部分,更是整個東南亞的第一名,也是魚苗及幼魚的重要輸出國,因 此當疾病蔓延爆發時受到的影響也較大,再者因為魚苗容易受到病毒的感 染,一旦爆發疫情,就會造成魚苗在短時間內的大量暴斃,而造成經濟上的 嚴重損失,因此,如何防止疫情的發生,就顯得十分地重要。台灣在亞洲石 斑魚水產養殖之科技為大陸、東南亞國家之中心,石斑魚養殖戶也是技術傳 播大陸及東南亞國家之橋樑。然而,環視整個石斑魚水產養殖產業結構,疾 病造成的高死亡率是養殖業急待突破之瓶頸。但是在近幾年來,在養殖的過 程中常常可以發現在石斑魚在從卵孵化到吋苗的這段期間內,小魚經常會有 不正常如旋轉般的游動情況,稱為飛旋症(Spiralic disease),而造成此種病徵所之疾病的死亡率極高,有時甚 至高達90~100 %,造成養殖業者的極大損失。目前已經知道,造成此一疾病的原因是因為魚類在受到神經壞 死病毒(Nervous Necrosis Virus, NNV)的感染之後,所引起的魚體不正常游動及大量死亡的現象。因此研究石 斑魚相關免疫系統、病原、及疫苗,利用免疫系統是生物體為了抵禦外來病原與保護自體安全所衍生出之獨 特防禦機制,開發疫苗或提升免疫力以應用於疾病防治上,是具有發展必要之課題。由於免疫系統是生物體為了抵禦外來病原與保護自體安全所衍生出之獨特防禦機制。一般而言,生物防禦外 來病原入侵之機制可分為兩種, 一種是先天性免疫(innate immunity)或又稱為非專一性免疫
(nonspecific immunity),包括四種防禦屏障:(1)物理性屏障(physical barriers):是身體抵禦外來病 原的第一道防線,包括皮膚和黏膜。(2)生理性屏障(physiologic barriers):包括溫度、pH、氧和一些溶 解因子如溶解脢(lysozyme)等。(3)胞攝及吞噬作用屏障(endocytic and phagocytic barriers):利用膜 的凹陷或伸出偽足將外來病原攝入免疫細胞中加以消滅。(4)發炎反應的屏障(inflammatory response): 藉由血管擴張、增加血管通透性等加速體內更多淋巴細胞消滅病原。另一種是後天免疫(acquired
immunity)或又稱為專一性免疫(specific immunity),藉由特定之免疫細胞如B淋巴球、 T淋巴球針對特定 外來物進行消滅, 具有抗原專一性(antigenic specificity) 、多樣性(diversity)、記憶性(immunologic memory)與自我辨識性(self/nonself recognition)四大主要特性。干擾素(IFN)屬先天性免疫,干擾素 於1957 年英國科學家Isaacs 和Lindenmann 在研究病毒干擾現象時發現,即病毒感染的細胞能產生一種因 子,作用於其他細胞干擾病毒的複製,因而命名為干擾素。經由干擾素所仲介的免疫反應為哺乳類對抗病毒
的第一道防線,目前已知的干擾素主要分成三大類型,第一型為主要受到病毒的直接誘導生成,有IFN-α、
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STAT
訊號傳遞而活化下游基因啟動,透過這些干擾素下游蛋白的生成幫助生物抵抗病毒,主要有dsRNA-activated protein kinase (PKR), guanylate binding protein (GBP), Mx 蛋白, and 2′-5′ -oligoadenylate synthetase (OAS)等,這些干擾素下游的抗病毒產物可阻礙病毒穿透、脫殼、mRNA 合成、蛋白質合成、組 裝過程,進而抑制病毒複製。Mx 蛋白則被歸類為屬alternative antiviral pathway,此類的蛋白機制直接作用 在病毒,並且因其並非對所有病毒皆具抵抗能力,因而稱之選擇性的抗病毒途徑Mx 蛋白質主要功能為結合病 毒蛋白防止病毒複製,目前在魚類已證實在細胞內Mx 蛋白表現位置和其抗病毒途徑有所關聯。
本研究團隊過去六年對於宿主病毒間相互作用機制有深入之研究探討,且過去本研究室由差異性基因庫中發 現Mx蛋白為魚類重要病毒防禦機制的可能性,因此Mx蛋白與神經壞死病毒(NNV)間之作用機轉就成為我 們關注的焦點。由於NNV屬於野田病毒科(Nodaviridae)的betanodavirus屬,對魚類而言是一個重要的病毒 性疾病,通常會感染魚苗,並且在感染後會引起魚的神經壞死(viral nervous necrosis, VNN),腦脊髓炎 (encephalomyelitis)和液泡形成、腦病和視網膜病變(vacuolating encephalopathy and retinopathy, VER),並 造成大量的死亡。神經壞死病毒的病毒顆粒大小在25∼30微米左右,無封套膜、二十面體,屬於核糖核酸病 毒,具有兩條單股的正股RNA,稱為RNA1與RNA2,RNA1所產生的蛋白質為RNA 聚合酶(RNA
polymerase);而RNA2所產生的蛋白質為鞘蛋白(coat protein),主要是組成病毒外殼。為了進行關於抗病毒 功能基因之研究,我們團隊完成點帶石斑( Epinephelus coioides )抗病毒基因( Myxovirus rsistance, Mx)及啟 動子選殖定序與功能分析。並經分析點帶石斑魚Mx 基因啟動子活性,並證實此一啟動子所攜帶之GFP蛋白可 受病毒或Poly[I:C]所誘發而表現,因此點帶石斑魚Mx 基因啟動子可受NNV誘發其活性。而本團隊石斑魚動 物實驗研究中以NNV感染石斑魚,也可有效誘發石斑魚Mx 基因表現並於不同組織表現出與健康種苗之差異 性,特別是於NNV主要感染器官腦部於NNV感染後誘發石斑魚Mx 基因大量表現,是否與Mx基因抗病毒功能 具相關性是值得進一步探究之課題。
在本實驗室過去研究中發現Mx基因上游具有IRSE (Interferon-response stimulate element)的存在,且gMx蛋 白可被神經壞死病毒與poly [I:C]誘導表現(圖1);但IFN下游抗病毒蛋白何其多,加上poly [I:C]所啟動的防 禦機制並不只有Mx pathway,無法明確闡明gMx蛋白是否參與。為了證實石斑魚Mx蛋白的抗病毒功能,首先 一開始採取的策略是利用轉染技術使石斑魚魚鰭細胞株 (GF1)大量表現Mx蛋白,進行後續實驗。在得到大量 表現gMx-GFP 或gMx-His 融合蛋白的石斑魚泳鰭細胞株(GF-1)後,以不同之高劑量神經壞死病毒液分別感染 細胞,由實驗結果可見持續表現gMx-His 融合蛋白的組別在病毒感染後第三天、第四天、第五天的細胞存活 率皆比未表現gMx 蛋白的細胞高,證實表現有gMx 蛋白的石斑魚泳鰭細胞株(GF-1)在感染神經壞死病毒後確 實可提高細胞存活率。此外針對gMx 蛋白是否可影響病毒複製能力做研究,將表現有gMx-GFP 或gMx-His 融 合蛋白的石斑魚泳鰭細胞株及普通石斑魚泳鰭細胞株(GF-1)感染神經壞死病毒,由實驗結果可見,大量表現 gMx 蛋白之石斑魚細胞株在受到神經壞死病毒感染48 小時後,相較於控制組,其產生之病毒力價較低,病毒 產量相差約十倍,由此可知gMx 蛋白確實可幫助細胞影響病毒之複製而使得病毒產量下降(圖2),同時實驗 結果證實大量表現gMx蛋白之細胞株在受到神經壞死病毒感染後,其病毒組成蛋白RdRp 及外殼蛋白相較於控 制組有延緩出現及表現量較低之趨勢,且病毒外殼蛋白之RNA表現也受到影響,顯見gMx 蛋白可幫助細胞影 響病毒抗原表現。由上述結果證明gMx 蛋白具有抗病毒特性後,接下來進一步探討其分子作用機制,首先想 了解gMx 蛋白是否可和神經壞死病毒外殼蛋白結合,經由遠端西方點墨法 (Far Western blotting)證實gMx 蛋 白可和神經壞死病毒外殼蛋白結合,進一步我們利用gMx 蛋白與鞘蛋白各片段做結合試驗,證實gMx 蛋白的 作用區(effector domain)與鞘蛋白的N端是直接結合的(圖3),因此進一步將可探討石斑魚Mx抗病毒蛋白 與NNV鞘蛋白直接結合,是否與其有抗病毒功能及其可能調控機轉有關,圖4顯示我們目前的假說,希望未來 能有進一步突破。