實驗一 培養液製作與菌種復育
實驗目的
本實驗介紹培養液及培養基的製備，大腸桿菌的培養，菌種的保存所使用的 基本技術。
實驗原理
培養細菌的培養基必須提供下列幾種基本的基本的營養條件:1.碳 2.水分 3.
氮源4.磷 5.硫 6 不同的礦物質養分，如鐵和鎂。大腸桿菌能在只有一種碳源與簡 單的氮源的簡單培養基中生長。
實驗研究上常用到的培養基，成份有可能是複雜且詳細組成不詳的混合物，
或是由多種塩類及其他已知成分所組成。例如LB 培養液，其主要成份是酵母菌 萃取物(Yeast extract)和蛋白月柬(Tryptone)所組成的。形式又分液態或是固態培養 基。液體培養基是將各成份溶於純水中，若加入洋菜(Agar，從紅藻中萃取出來的 複雜萃取物)則會成為固體培養基。洋菜是固體微生物培養基理想的凝固劑，因其 具有良好的溶解特性，但對大部分的細菌不具營養價值。固體洋菜會在90 到 100
℃會溶解，液體洋菜會在約42℃時凝固。
滅菌過程可以去除所有活的微生物，培養基在做純系培養時必須將所有的微 生物去除，培養容器則要密封或用錫箔蓋住以避免滅菌後又遭污染。製備培養基 常需要高溫高壓滅菌鍋，讓培養基於特定時間內暴露在高溫高壓中，以確保沒有 其他可能的微生物污染。一般來說121℃的高溫，蒸氣壓 15Psi，滅菌 20 分鐘就 已足夠。但如果欲滅菌之物品體積較大或是欲處理生物污染性廢棄物時，則會適 當提高滅菌時間。欲滅菌物品之體積若大於 200ml 則需提高滅菌時間至 25min
3.使用高溫滅菌鍋要在通風良好的地方使用。
實驗步驟
A.儀器用具
1. 高溫滅菌鍋 2. 電子天平 3. 燒杯
4. RO water(reverse osmosis water) 5. DDwater (Distilled Deionized water) 6. 廣口血清瓶(或其他合適的容器) 7. 恆溫培養箱
8. 接種環或滅菌過的牙籤
B.藥品試劑
1. LB Broth 25g/L
2. 或 10g/1L Tryptone，5g/1L Yeast extract，10g/1L NaCl 3. 培養用等級洋菜粉 Agar
4. 大腸桿菌 E. coli
C.方法步驟
A) LB 培養液
1.以 LB 粉(LB Broth)25g/1L，的濃度配置溶液，將培養液裝至培養瓶，蓋上瓶蓋(不 能鎖緊)，以鋁箔紙蓋住，將培養瓶放置在培養籃中。
2.利用高溫滅菌鍋消毒
a.利用高溫滅菌鍋前要先加一次水(RO)使水蓋過底部加熱元件，才將滅菌籃放 入，先插上安全銷，再鎖緊鍋門。滅菌鍋如下圖所示:
b. 高溫滅菌後必須等它慢慢排氣，只有當氣體完全排出，才能安全的打開滅菌鍋.
帶耐熱手套取出材料，消毒20 分鐘實際需要約 40 分鐘，因為還要把空間加熱及 排氣時間包含在內。
3. 滅完菌後，取出培養液，等培養液溫度下降至 55℃後加入所需抗生素，並視需 要分裝。若有多餘培養液不馬上使用，將瓶蓋鎖緊，保存在4℃的冰箱。
B) LB 培養基
1. 同 LB 培養液的做法，但多加入 1.5％的培養用等級 agar。
2. 利用高溫滅菌鍋消毒。
3. 培養基凝固前。倒入微生物用的培養皿，置於抽風櫃中，以防污染，等待完全 凝固後，蓋緊蓋子，放在室溫或4℃備用。
2. 將小管裡所有菌液吸取到另一已裝好適當培養液的試管，或是直接用接種環沾一 下菌液後直接畫盤。或是用接種環刮取單一菌落，並在目的培養役中輕晃數下。
(接種環使用前後均需使用酒精燈或本生燈消毒) 3. 37℃培養 8 小時以上(菌液須震盪)。
D) 單一菌落之分離:利用劃線法 (需使用培養基)
1. 在操作台內將接種環，以酒精先消毒，再將環上以火燒紅。
2. 等環冷卻後，取含有菌落的培養基，輕刮一個菌落。(若為過夜菌液，則將接 種環浸一下。)
3. 打開空白的培養基。將沾有菌落或菌液的接種環在培養基上輕輕劃過數條橫 條，畫法各異，可參考下圖畫法
4. 劃好後，再恆溫培養箱培養 8 小時以上。成功的畫盤將會出現分離的單一菌 落，如下圖:
5. 培養完如不馬上使用，可放置在 4℃冰箱保存。
恆溫培養箱，可調空溫度，在固定溫度下培育菌種。
結果與分析
培養完的菌液, 呈現黃白色混濁狀, 培養基則會有單一菌落或是連續生長的痕 跡. 如下圖, 其中圓形單一顆粒狀物即為獨立的菌落:
2. 如何辨別菌落是否為獨立菌落?
3. 如何辨識所培養的樣品是否遭受污染?
4. 為何滅菌時, 若有具瓶蓋的瓶子欲處理, 需將其鬆開?
5. 緊急洗眼站/急救箱/緊急淋浴處/逃生出口位置在何? 請圖繪說明之.
6. 若遇強酸/強鹼/生物污染性液體潑灑於身上, 處理程序為何?
*請以完整記錄格式, 包含問題與討論, 於記錄本上撰寫一份報告, 並將記錄本收藏 於指定的地點(實驗室內), 以便隨時翻閱查詢. 記錄本將於期末發還給學員.
參考資料
1. F. M. Ausubel et. al., “Shirt Protocols in Molecular Biology”, 5th ed. United States of America: Joh Wiley & Sons, Inc., 2002.
