第二章 材料與方法
2.4 離體實驗
將日本鰻以0.05% 2-phenoxyethanol 麻醉後，依實驗需求取得紅體和 眼睛組織，並進一步取得紅體和眼睛之細胞。
2.4.2.紅體細胞的取得
在三角錐瓶中，胰凝乳蛋白酶取8mg (α- chymotrypsin，0.25mg/ml) 取8mg、膠原蛋白酶取 8mg (collagenase，0.25mg/ml)和分解酶取 8mg (dispase，0.25mg/ml)溶解於磷酸鹽緩衝溶液中，總體積為 25ml，再經由 0.2μm的無菌過濾膜至 50ml離心管後，置於冰上備用，在滅菌玻璃皿（內 含磷酸鹽緩衝溶液）中使用滅菌解剖剪去除結締組織並將組織剪碎後，
放入配置好的酵素混合液中，反應條件為4℃過夜(overnight)作用後，再
於室溫中作用ㄧ小時後，置於冰上約3 分鐘，再以無菌滴管吸除酵素後，
並將組織移置15 ml微量離心管中，加入 6~7 mL 磷酸鹽緩衝溶液，以 1mL 針筒(拔除針頭部分)沖刷細胞(此為利用機械作用原理)，再以過濾網 (70μm)過濾，約反覆一到二次後，將其內容物移置 15 ml離心管，再以 4500rpm，4℃，離心 8 分鐘。以無菌滴管吸除上清液，加入含 10%胎牛 血清培養液(M199)打散細胞，使細胞和 10 %胎牛血清培養液(M199)混合 均勻(此處添加量以細胞量及實驗設計而定)。取出 100μl的細胞懸浮液與 100μl的trypan blue均勻混合，取出混合後的細胞 10μl放入細胞計數器 (hemacytometer)中，以顯微鏡觀察細胞數量，並計算細胞計數器九宮格
裡四直角大格的活細胞數目。若是死細胞會被trypan blue染成藍色(因 trypan blue是染細胞核，細胞破裂後才會裸露出細胞核)，活細胞則不呈 色。且取得紅體組織時，因其含紅血球，而以顯微鏡觀察紅血球為橢圓 形、形狀規則，而細胞形狀較不規則。細胞總數=(細胞計數器上四直角 大格的活細胞數/4)×104。經細胞計數之後的細胞總數，計算細胞數的濃 度約每毫升105~10 的細胞數，將其平均種入 12 孔細胞培養盤中，並以6
含10%胎牛血清的培養液培養三天。之後每三天，若細胞生長狀況良好
則吸除培養液且添加10%胎牛血清的培養液(M199)培養，並培養於 25℃，5％CO2中直到為進行實驗所需之細胞量，即可加入欲處理的外源 激素。另外，培養的前一天，12 孔細胞培養盤需貼附(coating)ㄧ層明膠(1
％的gelatin；購自SIGMA)約 12 小時以上(一般至少 20 分鐘以上)，之後 吸除明膠，再以DEPC水清洗ㄧ次，待乾燥後即可使用。
2.4.3 眼球細胞的取得
在三角錐瓶中，胰凝乳蛋白酶 8mg (α- chymotrypsin，0.25mg/ml)取 8mg、膠原蛋白酶取 8mg (collagenase，0.25mg/ml)和分解酶取 8mg (dispase，0.25mg/ml)溶解於磷酸鹽緩衝溶液中，總體積為 25ml，再經由 0.2μm 的無菌過濾膜至 50ml 離心管後，置於冰上備用，在滅菌玻璃皿（內 含磷酸鹽緩衝溶液)中使用滅菌解剖剪將水晶體取出後，放入配置好的酵 素混合液中，反應條件為4℃過夜(overnight)作用後，再於室溫中作用ㄧ
小時後，置於冰上約3 分鐘，再以無菌滴管吸除酵素後，並將組織移置
15 ml 離心管中，加入 6~7 mL 磷酸鹽緩衝溶液，以 1mL 針筒(拔除針頭 部分)沖刷細胞(此為利用機械作用原理)，再以過濾網(70μm)過濾，約反
覆一到二次後，再將其移置15ml 微量離心管， 以 4500rpm，4℃，離心 8 分鐘。以無菌滴管吸除上清液，以含 10%胎牛血清培養液(M199)打散 細胞，使細胞和10 %胎牛血清培養液(M199)混合均勻，且補至 10ml，最 後將細胞液倒入T-75 細胞培養瓶，完成細胞初代培養。
2.4.4 眼睛細胞繼代培養
將培養於 T-75 培養瓶中貼附細胞繼代培養。首先，倒除培養瓶中的 培養液並以磷酸鹽緩衝溶液清洗2~3 次後，加入 37 Trypsin 5~6 ml℃ 於培 養瓶中，輕搖使覆蓋培養瓶底部後開始拍打三分鐘，過程中以倒立顯微 鏡觀察細胞切除的狀態調整酵素作用的時間，經酵切可見細胞漂浮於液 面後，立即加入10%胎牛血清培養液 5~6ml 中止酵素活性(於冰上作業)，
均勻混合後倒入15ml 離心管，以 4500rpm ，4℃，離心 8 分鐘，離心後 吸除上清液並加入3~4ml 10%胎牛血清培養液(M199)打散細胞，使細胞 和10 %胎牛血清培養液(M199)混合均勻，且補至 10ml，最後將細胞液倒 入T-75 細胞培養瓶，完成細胞繼代培養。
2.4.5 離體外源激素處理
首先，以無菌微量滴管吸除12 孔細胞培養盤中的培養液並以 PBS 清洗2 ~ 3 次後，加入 0.1 %或不含胎牛血清的培養液(M199)培養細胞 30 分鐘後，加入欲處理的外源激素。以實驗的作用時間而定，若是一天內 則以不含胎牛血清的培養液(M199)培養，而一天以上的作用時間，則以 0.1 %或不含胎牛血清的培養液(M199) 培養，並且需於三天更換培養 液，且內含欲處理的外源激素。
2.4.6
細胞全 RNA 抽取
利用Viogene公司的total RNA Mini kit抽取細胞全RNA。首先，吸 除培養液並以磷酸鹽緩衝溶液沖洗兩次。12 孔的培養盤中，每孔加入 350 μl的RX buffer(每一毫升的RX buffer含有 10μl的β-mercaptoethanol)，輕輕 敲打後靜置5 分鐘後，加入同體積(350 μl) 75 %酒精(需以高純度酒精配 置)並均勻混合。將混合液置入Total RNA Mini column中，以 13000rpm，
4℃，離心 1 分鐘。離心後倒除下清液，加入 0.5 ml WF buffer，以 13000rpm，4℃，離心 1 分鐘(WF的作用為使RNA鍵結於column)。離心 後倒除下清液，加入0.7ml WS buffer，以 13000rpm，4℃，離心 1 分鐘(WF 的作用為沖刷非鍵結於column的物質)。離心後倒除下清液，再以 13000 rpm，4℃，離心 3 分鐘後(此步驟目的在於更完全去除酒精成分)，將column 放入新的1.5ml 微量離心管中並加入 15 μl的RNase-free ddH2O(置於 column中央)，靜置 1 ~ 2 分鐘後，以 13000rpm，4℃，離心 2 分鐘。離心 後的下清液即為細胞全RNA，需置於-70℃下保存。