發展及應用以Ro48-8071為基礎的新型式螢光性探針並針對氧化鯊烯環化酵素進行抑制作用的研究

國 立 交 通 大 學

生物科技學系

碩士論文

發展及應用以 Ro48-8071 為基礎的新

型式螢光性探針並針對氧化鯊烯環化

酵素進行抑制作用的研究

Development and Application of Newly

Fluorescent Ro48-8071-Derived Probes

發展及應用以 Ro48-8071 為基礎的新型式螢光性探針並針對氧化鯊 烯環化酵素進行抑制作用的研究

Development and Application of Newly Fluorescent Ro48-8071-Derived Probes to Study Oxidosqualene Cyclase

研究生：魏大景 Student : Ta-Ching Wei 指導教授：吳東昆 教授 Advisor : Dr. Tung-Kung Wu

國 立 交 通 大 學

生物科技學系

碩士論文

A Thesis

Submitted to Department of Biological Science and Technology College of Science

National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master

in

Biological Science and Technology July, 2007

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

發展及應用以 Ro48-8071 為基礎的新型式螢光性探針並針對氧化鯊 烯環化酵素進行抑制作用的研究 研究生：魏大景 指導教授：吳東昆 教授 國立交通大學 生物科技學系 摘要 氧化鯊烯環化酵素(OSC, E.C.5.4.99.-)將受質氧化鯊烯經由一連 串環化/重組的反應催化形成膽固醇的前驅物-羊毛硬脂醇。此家族的 酵素在固醇類和三萜類產物的生合成途徑中扮演著特別的角色，並且 對於降膽固醇藥物以及抗真菌劑的研發都很有幫助。本論文已成功的 從牛肝中，經由一連串的純化步驟，並利用SDS-PAGE電泳分析，得 到分子量約為80 kDa純的氧化鯊烯環化酵素。並且利用Ro48-8071這 一個很有效的氧化鯊烯環化酵素抑制劑，將其與實驗中所選的五個具 螢光性質的化合物：4-(4,5-diphenyl-lH-imidazol- 2-yl)-phenylboronic acid(DPA)、naphthalene-1-boronic acid(NA-1)、naphthalene-2-boronic acid(NA-2) 、 biphenyl-3-boronic acid(BP-3) 和 biphenyl-4-boronic acid(BP-4)，利用Suzuki偶合的方法進行結合，期望發展成具有抑制效 果的螢光探針，經由質譜儀與核磁共振儀的分析後，確定已成功的合 成出目標物。另外，由抑制酵素活性的實驗中發現，Ro4-NA1、

混合的對照組在螢光放射光譜上沒有改變，但是在經過去鹽管柱 （desalting column）層析法將蛋白質與沒有作用的螢光探針做分離， 發現在有蛋白質出現的部分有螢光的現象，初步推測有可能是因為 DPA的結構沒有進入酵素的活性區中，使得螢光的強度沒有被削弱， 之後還要再做進一步的確認。 本論文希望最後能利用這些帶有螢光特性的Ro48-8071衍生抑制 劑能提供氧化鯊烯環化酵素在結構與功能性上的探討，或能更進一步 提供在蛋白質體學上的應用，以及對於降膽固醇藥物篩選上有所幫 助。

Development and Application of Newly Fluorescent Ro48-8071-Derived Probes to Study Oxidosqualene Cyclase

Student : Ta-Ching Wei Advisor : Dr. Tung-Kung Wu

Department of Biological Science and Technology National Chiao Tung University

Abstract

Oxidosqualene cyclases (OSC, E.C.5.4.99.-) catalyze the conversion of the linear

2,3-oxidosqualene into the fused ring compounds such as lanosterol, the precursor of

cholesterol, via a series of cyclization and rearrangement. Due to its intrinsic

important role in the biosynthetic pathway of steroids and triterpenoids, OSC has been

an attractive target for the development of antifungal and hypocholesterolemic drugs.

Accordingly, bovine liver OSC had been successfully purified via three

chromatographic columns in our laboratory and exhibited a clear single band with

molecular weight about 80 kDa from the analysis of SDS-PAGE. Moreover, OSC in different mammalian sources has been effectively inhibited by a potent inhibitor,

Ro48-8071. But the different orientation of this inhibitor was examined from either

crystal structure or photoaffinity labeling experiments. In order to better understand

the inhibiting mechanism as well as to solve the exact inhibitor binding site, several

inhibition activity at the concentration up to 100μM but less than Ro4-NA1, Ro4-NA2 and Ro4-BP4. Among those fluorescent probes, Ro4-DPA showed the worst inhibition even though at the concentration of 100μM. The results of inhibition experiment indicated that the fluorescent modification of Ro48-8071 dramatically

reduces the inhibition activity. The steric effect or orientation changes way occur

among these modified inhibitors within the enzymatic active site. In terms of the

molecular docking experiment, the interactions between the fluorescent modification

of Ro48-8071 probes and the active site of bovine liver OSC as well as the orientation

of probes have dramatically changed. Hence, the lower-inhibition activity via

fluorescent modification could be reasonably explained via the three-dimensional

protein-ligand docked complex models.

On the other hand, from the fluorescent spectra examination, there is no obvious

difference between the bovine liver OSC-Ro4-DPA complex and the native Ro4-DPA

molecule. However, after Hi-Trap desalting column purification, the fraction with

OSC also exhibited slight fluorescent intensity, the result showed that the DPA group

might interact but not integrate within the protein active site. In the future, further

improved newly site-specific fluorescent probes will be developed and applied to the

謝誌

回首這七百多天的研究生涯，充滿了各式各樣的挑戰，以及許許 多多的寶貴回憶。研究是一條不歸的路，必需經歷各種的挑戰以及許 多的失敗在加上些許的運氣才能獲得豐碩的成果，即使沒有好的成 果，但過程中所學習到的各種經驗以及實驗技巧，都將成為我在研究 這條路上珍貴的寶藏。然而這篇論文的結束，並不代表研究的路就此 結束，而是代表著新的開始、新的挑戰，以及許多方面還需要再努力 充實自己。在這段過程中所經歷的悲喜，以及感動過的所有人事物， 和支持我幫忙我的所有的人，不論深淺輕重，都將在心底永存。而這 篇論文的完成，首先最為感謝的是我的指導教授吳東昆博士，給我進 入實驗室學習的機會，在實驗上指導實驗設計的觀念，以及面對事情 應有的積極態度，和最後論文的修改及建議。此外，也非常感謝口試 委員袁俊傑老師、林敬堯老師及刁維光老師在事務繁忙之餘抽空審閱 修改我的論文初稿，並對於本論文的實驗設計以及實驗結果與討論方 面給予許多寶貴的意見，讓我能將此論文撰寫得更加完備。 另外，最想要感謝的是實驗室的大學長程翔學長，他亦師亦友的 教導我，以及對於這個題目的設計和遇到實驗瓶頸時都給予了非常大 的幫助，可以說是孕育這個題目的母親；感謝媛婷學姊在Pichia表現 上的指導及幫助，以及生活上的關心和照顧；感謝裕國學長在實驗上 的建議以及實驗技巧上的指導，以及協助抗體的製作及指導；感謝晉

上的加油打氣；感謝跟我一同瘋一同呆的好哥們小妹在我實驗不順時 的鼓勵和協助；感謝好朋友呆文宣，在我打混的時候會拉我一把，讓 我能即時清醒。也感謝學弟妹文祥、小高、采婷以及新進的實驗室的 成員聖慈、天昶、禕庭、亦諄在我實驗的期間以及最後寫論文及口試 時的幫忙。 此外，也要感謝交通大學應化貴儀中心李蘊明小姐在MASS分析 上的協助，以及清大化學貴儀中心彭菊蘭小姐在NMR分析上的幫忙。 最後要感謝養育我的爸爸媽媽和我的弟弟，感謝你們一路的關心 和鼓勵，還有女友馨儀在這研究所這兩年一路的陪伴與照顧和適時的 鼓勵，讓我在低潮的時候能夠振作，也感謝所以關心過我以及指導過 我的人，在此以小小的篇幅以及分享我的研究成果來表達我真誠的謝 意，真的謝謝大家！

目 錄

頁次

中文摘要………...……….……I

英文摘要………...III

謝誌……….V

目錄………...VII

圖目錄……….X

表目錄………..XII

附錄……….XIII

第一章 緒論

1-1 膽固醇的重要性………...………..1 1-2 氧化鯊烯環化酵素的簡介……….…………...…..……...4 1-3 降低膽固醇藥物的新目標-氧化鯊烯環化酵素...……...………...7 1-3-1 氧化鯊烯環化酵素為抑制膽固醇生成的目標蛋白.…….…...8 1-3-2 抑制氧化鯊烯環化酵素造成的雙機制調控作用….…….…...9 1-4 氧化鯊烯環化酵素的酵素學...………...………10 1-5 鯊烯-蛇麻烯環化酵素的晶體結構...12 1-6 鯊烯-蛇麻烯環化酵素與抑制物 Ro48-8071 複合物的晶體結構...17 1-7 利用嗜甲醇酵母菌 Pichia pastoris 表現外來蛋白…………..……20 1-7-1 Pichia pastoris 對甲醇的代謝作用………....…….….21 1-7-2 Pichia pastoris 之表現載體………....…….….22

2-2 緩衝溶液與實驗溶液的配置………...……....31 2-3 實驗儀器………...…....35 實驗方法 2-4 牛肝中氧化鯊烯環化酵素的純化..………….………...……..36 2-4-1 溶解微粒體(Microsome)…...………..……..…..….37 2-4-2 粗萃取液(Crude Extract).……….…....……....……....37 2-4-3 Q-Sepharose 陰離子交換管柱層析…………...……..……....37 2-4-4 Hydroxyapatite Gel 管柱層析………...………...……...38 2-4-5 HiTrap Heparin 管柱層析……….….…….……..….….38 2-4-6 酵素的分子量及純度分析……….…………..……....38 2-4-7 酵素溶液的保存……….…………..…...….39 2-5 蛋白質濃度與酵素活性的測量…….………...…..……...40 2-6 利用 Pichia 系統表現牛肝氧化鯊烯環化酵素…………...…...42 2-6-1 表現載體的構築……….…………..…...….42 2-6-1 酵母菌之轉化作用……….…………..…...….44 2-6-1 重組酵母菌之表現……….…………..…...….46 2-7 受質 2,3-氧化鯊烯的合成……..….……….…………...…...47 2-8 氧化鯊烯環化酵素抑制物 Ro48-8071 的合成…….……...……..49 2-9 新型螢光抑制物的合成.……….…..…...52 2-9-1 含有硼酸基團螢光探針的硼酸酯化反應………...…..52 2-9-2 螢光探針與抑制物 Ro48-8071 的結合……….…..….…54 2-10 新型螢光抑制物對於氧化鯊烯環化酵素的抑制………...….57

第三章 結果與討論

3-1 氧化鯊烯環化酵素的純化……...……….…...……...…...58 3-1-1 酵素的溶解與粗萃取液……….….…….58 3-1-2 管柱層析的純化分析……….…………...…...58 3-1-3 酵素分子量判定………...………..…….61 3-2 利用 Pichia 表現系統表現牛的氧化鯊烯環化酵素....…………...62 3-3 新型具螢光探針抑制劑………....…………...63

3-3-1 螢光標定抑制劑對於酵素的抑制分析…….………...63 3-3-2 溶劑對於螢光標定抑制劑的影響………..….65 3-3-3 螢光標定抑制劑的吸收光譜測量………..….66 3-3-4 螢光標定抑制劑的最大吸收波長的位移現象…………..….68 3-3-5 螢光標定抑制劑的莫耳激發係數………..….69 3-3-6 不同溶液極性對 Ro4-DPA 的螢光放射光譜的影響...…..….71 3-3-7 螢光探針 Ro4-DPA 與氧化鯊烯環化酵素的相互作用....….72 3-4 螢光抑制劑與牛的氧化鯊烯環化酵素的入塢交互作用………...76

第四章 結論與未來展望……….…..

…...80

第五章 參考文獻………...……….

84

附錄

附錄一

………...……….

91 附錄二

………...……….

92 附錄三

………...……….

95

圖目錄

圖 1-1 膽固醇的化學結構………...……….…...…………2 圖 1-2 膽固醇在動物體內的生合成代謝途徑………...……...3 圖 1-3 動物中氧化鯊烯環化酵素的催化反應………....………4 圖 1-4 四個物種的(氧化)鯊烯環化酵素胺基酸序列比對圖...…….…..5 圖 1-5 自然界中的(氧化)鯊烯環化酵素.………...…6 圖 1-6 膽固醇與氧化膽固醇的生化合成雙途徑…..………..7 圖 1-7 鯊烯-蛇麻烯環化酵素的晶體結構圖...…...………..….13 圖 1-8 蛇麻烯進入酵素活性空腔作為模板的空間立體圖..…..…...14

圖 1-9 Asp455 與 Cys456 及 Cys533 氫鍵拉扯誘導 Epoxide 開環...….16

圖 1-10 氧化鯊烯環化酵素抑制劑 Ro48-8071 的化學結構式...……17 圖 1-11 鯊烯-蛇麻烯環化酵素與抑制物 Ro48-8071 複合物共同的晶體 結構……....……….……...18 圖 1-12 蛇麻烯、Ro48-8071 及 LDAO 三者的重疊立體示意圖………19 圖 2-1 TLC 活性測試示意圖…………..………...……..41 圖 2-2 直鏈型質體 DNA 與酵母菌 genome 的重組作用..……...……..45 圖 2-3 受質 2,3-氧化鯊烯的合成途徑...………….…………..………..48 圖 2-4 氧化鯊烯環化酵素抑制物 Ro 48-8071 的合成途徑……..……49 圖 2-5 螢光化合物及硼酸酯化後的螢光化合物……..………..52 圖 2-6 具硼酸基的螢光化合物其硼酸酯化反應流程..………..53 圖 2-7 合成之螢光物標定 Ro48-4071..………...54

圖 2-8 利用 Suzuki coupling 反應合成 Ro4-DPA………...55

圖 2-9 利用 Suzuki 偶合反應合成具螢光標定的 Ro48-8071………...56 圖 3-1 Q-Sepharose 陰離子交換樹脂的管柱層析結果…...………...59 圖 3-2 Hydroxyapatite Gel 的管柱層析結果………...……..……..60 圖 3-3 牛肝中氧化鯊烯環化酵素純化的 SDS-PAGE 結果.…………...61 圖 3-4 Ro48-8071 對於氧化鯊烯環化酵素的抑制作用…..……..……64 圖 3-5 螢光標定抑制劑對於氧化鯊烯環化酵素的抑制作用………....64 圖 3-6 螢光標定抑制劑在 TLC 下以波長 365nm 光照..……….…65

圖 3-7 螢光標定抑制劑在(a)DMSO 和(b)5 mM Kpi 下以波長 365nm 光 照激發……...………65 圖 3-8 螢光化合物在5mM Kpi / 0.1% TX-100 環境下吸收光譜範圍..67 圖 3-9 在5mM Kpi / 0.1% TX-100 的環境下的莫耳激發係數…..…....70 圖 3-10 Ro4-DPA 在不同極性溶液環境下的的螢光放射光譜..…...…71 圖 3-11 Ro4-DPA 在有/無與氧化鯊烯環化酵素混合的螢光放射光....72 圖 3-12 不同濃度下 Ro4-DPA 的螢光放射光譜..…....….…...73 圖 3-13 通去鹽管柱後所收集的部分經由 SDS-PAGE 分析銀染結果..73 圖 3-14 去鹽管柱層析結果在波長 365nm 光照………...………….…..74 圖 3-15 去鹽管柱層析結果的 BCA 分析……….…….………...74 圖 3-16 去鹽管柱層析結果的螢光強度分析………..75 圖 3-17 (a)Ro4-NA1 對牛的氧化鯊烯環化酵素進行入塢作用的結果與 (b)Ro4-NA2 對牛的氧化鯊烯環化酵素進行入塢作用的結果……….78 圖 3-18 (a)Ro4-BP3 對牛的氧化鯊烯環化酵素進行入塢作用的結果與 (b)Ro4-BP4 對牛的氧化鯊烯環化酵素進行入塢作用的結果……….78 圖 3-19 (a)Ro4-DPA 入塢作用的結果與 Ro48-8071 比對為不同位向且 (b)Ro4-DPA 的 50 個最佳計算結果皆與 Ro48-8071 不同位向……….79

表目錄

表 1-1 比較脊椎動物和酵母菌中的氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素的 純化效果及其特性………....…...…...…..11 表 2-1 牛肝中氧化鯊烯環化酵素的純化流程…………....…….…….36 表 2-2 製作 SDS-PAGE 電泳膠片的配方...39 表 2-3 PCR 反應試劑的量………...43 表 2-4 PCR 反應條件………...43 表 2-5 甲基利用表現型態的篩選…...…...45 表 2-6 Taq polymerase PCR 反應試劑用量...46 表 2-7 抑制劑與氧化鯊烯環化酵素抑制作用的流程圖………...….57

附錄

附錄一. 根據牛的 OSC 基因序列所設計的兩組引子用在 Pichia 表現 系統中表現載體的構築...91 附錄二. Ro4-DPA 的 EI-MS 及 NMR 光譜分析...92 附錄三. Ro4-NA1、Ro4-NA2、Ro4-BP3、Ro4-BP4 的 EI-MS 及 NMR 光譜分析...95

第一章 緒論

1-1 膽固醇的重要性

固醇類(Sterols)是多環脂醇類物質之通稱，以四或五個融合環 (fused-rings)作為其結構的中心骨架，主要的差異僅在於支鏈上的長 短或官能基的不同。固醇類可普遍存在於動物、植物和細菌中，而且 彼此具有很相似的結構；在大多數真核細胞中，固醇類為細胞膜組成 及生理調控上的重要脂質成分1。 在動物體內最常見的固醇類物質中，以膽固醇(Cholesterol)最為 重要【圖1-1】；而膽固醇是一種類似脂肪的複合體，主要是由肝臟所 製造產生，其次是在腸、腎上腺皮質及動脈管壁上生成，同時也可經 由食物的攝取而獲得2。其廣泛的存在於動物體內，其中以腦及神經 組織含量最為豐富。例如，在高等動物中，它是組成細胞膜的重要成 分，可調控細胞膜的流動性，影響胞內外物質的滲透作用；另外，膽 固醇也是膽汁、固醇類荷爾蒙、維生素D3、紅血球及神經組織等胞內 生理代謝物質的重要前驅物。而膽固醇在體內代謝生成膽汁可以幫助 脂質的消化及脂溶性維生素的吸收；人體也可利用膽固醇，自行合成 脂溶性維生素D3，而維生素D3是一種具有激素功能的固醇，會影響鈣 質吸收，造成血鈣與骨鈣的迴饋循環平衡，並刺激基因表現與增加骨

質的強度3。此外，膽固醇也是脂質筏(Lipid raft)的組成成分。Lipid raft

是指細胞膜中一塊固性區域，當細胞膜上膽固醇比例增加，細胞膜的 流動性會減少，即一塊較不具流動性的富含膽固醇區域4。許多文獻 的研究也指出，脂質筏(Lipid raft)可能與訊息傳遞、發炎反應、細胞 移動(Migration)、神經傳導等反應有關，如：阿茲海默症(Alzheimer’s disease)5。因此，膽固醇也同時參與了體內許多重要的生理調控作用。 膽固醇在體內的運送需要藉由其與脂蛋白間的結合方式加以運 送 ， 可 分 為 三 種 脂 蛋 白 ：(1) 非 常 低 密 度 脂 蛋 白 - 膽 固 醇

(VLDL-cholesterol)，負責從肝臟將脂質攜帶至全身各組織，同時 VLDL也會轉變為LDL；(2) 低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-cholesterol)， 將膽固醇運送至全身各部位，但若含量過高會對人體不利，因而被稱 為「壞」的膽固醇，也是造成血管阻塞、硬化的元凶；(3) 高密度脂 蛋白-膽固醇(HDL-cholesterol)，為一種對人體有利的膽固醇，可將黏 在血管上多餘的膽固醇運送回肝臟代謝排除，降低血液中膽固醇的含 量。由於現今人類生活習慣及飲食型態的改變，往往容易造成血液中 膽固醇含量過高的情形，使得心血管疾病發生的機率大大提高。而心 血管相關的疾病正是現今人類十大死因排行之一的高危險因子6-8；儘 管膽固醇對於人類健康具有負面的影響，但也是體內不可或缺的生化 代謝物質，因此需要有適當的含量比例才能夠維持人體正常機能的進 行6。 【圖 1-1】膽固醇的化學結構 在動物體內，膽固醇的生合成是由兩個碳原子的乙醯輔酶A HO

【圖 1-2】膽固醇在動物體內的生合成代謝途徑 Ubiquinone Blood Lipoproteins Steroid Hormones Bile Acids Cell Membrane Acetyl-CoA HMG-CoA HMG-CoA Reductase Mevalonic acid Isoprenoid intermediate Farnesyl pyrophosphate Squalene Squalene Synthase 2,3-Oxidosqualene Squalene Epoxidase Oxidosqualene Cyclase Lanosterol Ergosterol Cholesterol Isopentenyl tRNA Dolicol Heme

1-2 氧化鯊烯環化酵素的簡介

直線型的氧化鯊烯經由氧化鯊烯環化酵素(OSC)的催化轉變成具

有四環結構的羊毛硬脂醇之過程【圖1-3】，被認為是膽固醇生合成途

徑中最特別且令人感到興趣的步驟，因為此步驟是膽固醇生合成途徑 中唯一的環化反應。而控制此過程的關鍵角色，即為氧化鯊烯環化酵 素(oxidosqualene cyclase ; E.C. 5.4.99.-)。在整個氧化鯊烯環化酵素催 化的過程中，包含了質子化(Protonation)、環化(Cyclization)、重組 (Rearrangement)及消去(Elimination)等反應步驟，至少超過 10 個共價

鍵的斷裂和生成，顯現出環化機制的高複雜性和高立體選擇性9。

【圖 1-3】動物中氧化鯊烯環化酵素的催化反應

以真菌S. cerevisiae OSC酵素分別與C. albicans OSC酵素、植物A.

thaliana CAS酵素及細菌A. acidocaldarius SHC酵素三者作胺基酸序

列比對(Alignment)後，發現彼此相同度達到63%、36%及16%【圖 1-4】，其中又以C-端區域較N-端的胺基酸序列更為相近10；另外，將 O HO oxidosqualene cyclase 2,3-oxidosqualene Lanosterol

於氧化鯊烯環化酵素的催化功能具有重要的影響力，一般認為環化酵 素的Q-W功能區域與酵素催化過中程涉及的十幾個鍵的斷裂、生成所 釋放的焓(enthalpy)有關，可能是藉由電子轉移過程吸收反應過多的能

量來穩定酵素結構13。

【圖1-4】 對於H. sapiens OSC (Hs)、A. thaliana CAS (At)、S. cerevisiae OSC (Sc)及 A. acidocaldarius SHC (Aa)四個物種的氧化鯊烯環化酵 素胺基酸序列比對圖。具有顏色部份表示對於H. sapiens OSC及

A. acidocaldarius SHC兩個酵素所預測的二級結構，紅色區塊代表

三萜類的環化酵素家族是由一群功能相近的同源(Homologous)

酵素所組成【圖1-5】，在不同物種中的氧化鯊烯環化酵素，可催化產

生具多樣性(Diversity)及複雜性(Complexity)的產物結構，並且保有各 物種間的專一性及演化性。在哺乳類動物與真菌中，氧化鯊烯環化酵 素(oxidosqualene-lanosterol cyclase, OSC)能將氧化鯊烯轉變成羊毛硬 脂醇，進而在哺乳類動物中生成膽固醇，在真菌中則產生麥角脂醇 (Ergosterol)；在高等的植物和海藻中，則透過功能相近的環化酵素 (cycloartenol synthase, CAS)催化產生環阿屯醇(Cycloartenol)；而就大 多數的原蟲類和細菌而言，鯊烯不需要先經由環氧化步驟形成氧化鯊 烯，便可直接作為受質，藉由鯊烯蛇麻烯-環化酵素(squalene-hopene

cyclase, SHC)催化生成蛇麻烯(Hopene)9, 15。

Squalene Hopene

2,3-Oxidosqualene

Cycloartenol _{Lanosterol Ergosterol}

Squalene epoxidase Squalene-hopene cyclase(SHC) Bacteria Oxidosqualene-cycloartenol synthase(CAS) Oxidosqualene-lanosterol cyclase (OSC)

Squalene

1-3 降低膽固醇藥物的新目標-氧化鯊烯環化酵素

由於氧化鯊烯環化酵素可以催化直線型的2,3-氧化鯊烯經由環化 及骨架重排反應生成羊毛硬脂醇，此產物為膽固醇生合成途徑中，第 一個出現具四環結構固醇類化合物的前驅物16。除此之外，此酵素也 催化肝X受體(liver X receptor, LXR)的活化並且對於24(S),25-氧化膽 固醇的生成進行調控。抑制氧化鯊烯環化酵素，會使得24(S),25-氧化 膽固醇的量增加，且進一步降低膽固醇的生成。因此，根據膽固醇生 合成的雙機制發現17【圖1-6】，抑制氧化鯊烯環化酵素不但可以降低 血液中低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-cholesterol)的含量，並且可以進一 步的避免大量的低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-cholesterol)被巨噬細胞吞 噬(macrophage)，並沉積在動脈壁的血管內膜中，造成動脈粥樣硬化 (atherosclerosis)的發生2, 6-8。根據近幾年來在專一性抑制劑、定點突變 與利用同源性高的細菌鯊烯-蛇麻烯環化酵素(squalene-hopene cyclase, SHC)進行分子模擬的研究以及人類氧化鯊烯環化酵素晶體結構等實 驗的研究基礎下，此反應機制在過去五十幾年中，已經被相當程度的 探討與解釋18-20。並且更加確認此酵素作用的機制，相信未來對於設 計新的降低膽固醇藥物會有很大的幫助。 【圖1-6】膽固醇與氧化膽固醇的生化合成雙途徑 HMG-CoA reductase Acetyl-CoA HMG-CoA Mevalonic acid Squalene 2,3-Monoepoxysqualene 2,3;22,23-Diepoxysqualene Lanosterol Cholesterol 24(S),25-Epoxylanosterol 24(S),25-Epoxycholesterol Cholesterol synthesis pathway Alternative oxysterol synthesis pathway epoxidase 2,3-Oxidosqualene cyclase

1-3-1 氧化鯊烯環化酵素為抑制膽固醇生成的目標蛋白

由於氧化鯊烯環化酵素在膽固醇生合成途徑中扮演很重要的角 色，其不僅能催化2,3-氧化鯊烯轉變成為羊毛硬脂醇，也可以在另一 個 氧 化 固 醇 類 生 合 成 途 徑 中 將2,3;22,23- 雙 氧 化 鯊 烯 催 化 形 成 24(S),25-氧化膽固醇21。另外，2,3;22,23-雙氧化鯊烯跟2,3-氧化鯊烯比 較下，對於氧化鯊烯環化酵素有較低的Km值，所以在部分抑制氧化 鯊烯環化酵素的情況下，24(S),25-氧化膽固醇較膽固醇易被生成22。 另外，24(S),25-氧化膽固醇也可以很有效的活化肝X受體(LXR)23，進 而增強細胞中調控脂質代謝的許多重要基因的表現，包含三磷酸腺苷 結合盒A1(ATP-binding cassette A1, ABCA1)、三磷酸腺苷結合盒 G1(ATP-binding cassette G1, ABCG1) 、 三 磷 酸 腺 苷 結 合 盒 G5(ATP-binding cassette G5, ABCG5) 和 三 磷 酸 腺 苷 結 合 盒 G8(ATP-binding cassette G8, ABCG8)等。而這些基因也都牽涉細胞中

膽 固 醇 的 流 出 ， 並 進 一 步 促 進 固 醇 調 節 因 子 結 合 蛋 白1c(sterol

response element binding protein 1c, SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty

acid synthase)和脂蛋白分解酶(lipoprotein lipase)的表現24。

另外，經由從前的研究結果發現，24(S),25-氧化膽固醇不僅僅可 以抑制3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A(HMG-CoA)的活性，同時也可以促 進3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A(HMG-CoA)的減少，進而產生一個協同

輔酶A(HMG-CoA)的能力，進而抑制膽固醇生成28。 在動物實驗中也發現分別餵食倉鼠(Hamsters)、松鼠猴(Squirrel monkeys)和阿根廷小型猪(Göttingen minipigs)氧化鯊烯環化酵素抑制 劑Ro48-8071並且與未餵食抑制劑的控制組動物做比較，發現血液中 低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-cholesterol)的量降低了約30~35％27。因此 在小型動物體的實驗中發現，氧化鯊烯環化酵素的抑制確實能夠降低 血液中低密度脂蛋白-膽固醇的量。經由許多的研究證明，氧化鯊烯 環化酵素確實很有潛力用來發展設計降膽低固醇藥物。

1-3-2 抑制氧化鯊烯環化酵素造成的雙機制調控作用

近年來，Telford 等人對於利用氧化鯊烯環化酵素抑制劑來調控 大型動物的脂蛋白B(apolipoprotein B)代謝的機制上很有成果31，脂蛋 白B(apolipoprotein B)為低密度脂蛋白(LDL)和非常低密度脂蛋白 (VLDL)的主要結構蛋白。利用新發展出來的氧化鯊烯環化酵素抑制 劑Ro0714565對迷你猪所做的相關研究中，發現血液中低密度脂蛋白 -脂蛋白元B(LDL-apoB)濃度大量的減少，並且非常低密度脂蛋白-脂 蛋白元B(VLDL-apoB)分泌至血液中的量也減少許多，更造成肝臟中 膽固醇濃度降低，進而增加肝臟中低密度脂蛋白受體(LDL receptor) 和HMG-CoA reductase的表現量17。而且LXR基因表現量的增加也會 增強ABCG5和ABCG8基因在肝臟和腸中的表現。另外，研究指出在 肝臟中三酸甘油脂的濃度沒有受到氧化鯊烯環化酵素抑制劑的影 響，這也就是說脂肪酸和三酸甘油脂的生成是不會因為氧化鯊烯環化 酵素的活性被抑制而有所影響。由此可知，透過膽固醇生合成雙機制 的作用，抑制氧化鯊烯環化酵素的活性，不但可以降低低密度脂蛋白 -膽固醇的量，也可調控體內總膽固醇的含量。

1-4 氧化鯊烯環化酵素的酵素學

藉由傳統蛋白質純化(Purification)或是經由重組基因的蛋白質表 現系統，目前已有許多物種的環化酵素可順利被純化得到 32；但由過 去 的 研 究 發 現 氧 化 鯊 烯 環 化 酵 素 其 低 穩 定 性 及 需 與 膜 結 合 (membrane-bound)的特性，需要加入適量的介面活性劑(Detergent)和 鹽類濃度來維持純化過程中的酵素活性，以提高酵素純化的效率，造 成酵素純化技術上的困難度增加，進而影響到對於氧化鯊烯環化酵素 的研究發展。目前，氧化鯊烯環化酵素已經有從牛肝、鼠肝、猪肝中 直接純化取得【表 1-1】，另外還有藉由基因轉殖技術而從酵母菌

(yeast) 、 甲 醇 酵 母 菌 (pichia pastoris) 以 及 昆 蟲 細 胞 表 現 系 統 (baculovirus expression system)等不同的蛋白質表現系統表現出來。

氧化鯊烯環化酵素首先是從植物中純化所得到33，分別為 氧化鯊 烯-環阿屯醇環化酵素(oxidosqualene-cycloartenol cyclase)和β-香桂素 合成酵素(β-amyrin synthase)，研究中發現在添加非離子性清潔劑 (Triton X-100)之後，能夠大幅提高氧化鯊烯環化酵素的活性，且以具 有活性的可溶性酵素形式存在；根據前述的實驗方法，由哺乳類動物 老鼠的肝臟中也純化出氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素34，純化倍率可 達到 1,800 倍，並由 SDS-PAGE 上觀察到分子量約為 75 kDa ，為 往後的鼠肝(78 kDa)35 及猪肝(75 kDa)的純化研究奠定一個良好的基 礎36。

另外，將鼠肝中氧化鯊烯環化酵素所相對應的基因序列，利用分

子選殖(Cloning)的技術，從酵母菌中成功地分離出erg7基因35；並可

順利獲得氧化鯊烯環化酵素的開放解讀序列(open reading frame , ORF)，包括終止密碼子在內共含有2196個核苷酸，可轉譯為731個胺 基酸，分子量約為83.4 kDa的酵素10。 而在實驗室過去學長姐的努力之下，我們成功地從牛肝中純化到 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素，其分子量約為80 kDa，純化得到的 活性倍率較細胞微粒體時的比活性明顯增加了700多倍37。 物種 參考文獻 酵素分子量 比活性 脊椎動物 猪 11 - 256 nmol/hr/mg 猪 36 75 kDa 2643 nmol/hr/mg 老鼠 36 78 kDa - 狗 36 73 kDa - 人 36 75 kDa - 老鼠 34 75 kDa 436 μkat/mg 老鼠 35 65 kDa 58 pmol/min/mg 牛 37 80 kDa 1747 pmol/min/mg 真菌類 酵母菌 10 83.4 kDa - 【表1-1】比較脊椎動物和酵母菌中的氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 的純化效果及其特性 38。

1-5 鯊烯-蛇麻烯環化酵素的晶體結構

細菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)中的鯊烯-蛇麻烯環化酵素(SHC) 的晶體結構，發表在1997 年的 Science 期刊上【圖 1-7】，對於研究三 萜類(氧化)鯊烯環化酵素而言，可說是一項非常重大的突破 18。因為 鯊烯-蛇麻烯環化酵素，可將鯊烯環化形成蛇麻烯，與哺乳類動物氧 化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素(OSC)的功能很相近，因此推測兩者在酵 素結構上也可能彼此非常接近，且經由胺基酸序列的比對後，證實此 兩種環化酵素之間確實具有 20 ~ 26% 的相同度 10 ，所以根據鯊烯-蛇麻烯環化酵素的晶體結構，同時也給予了有關氧化鯊烯-羊毛硬脂 醇環化酵素在空間結構上的良好參考依據。 由鯊烯-蛇麻烯環化酵素的晶體結構中，顯示出一個同型雙倍體 (homo-dimeric)的嵌入式膜蛋白質(integral membrane protein)；單元體 (Subunit)彼此互相環繞成兩個類似啞鈴形的結構區域(Domain)，並以 α-Helix 構形為主【圖 1-7】；其中 Domain 1 形成了 α6-α6的圓桶狀結 構，而 Domain 2 則可能會嵌入於 Domain 1 的空間，也形成了一個α-α 的 圓 桶 狀 ， 此 兩 個 特 殊 區 域 透 過 一 些 環 線(Loops)與五條較短的 β-Sheet 結構，組合出中空的活性區通道，約有 1200 ~ 1600 Å 的空間 範圍，此凹陷的活性空腔(Active cavity)位置，能夠藉由空間旁的胺基 酸互相配合，而產生具有協調性的運動，有利於受質與產物在酵素內 的進入與釋出18。

腔附近主要是非極性胺基酸，然而卻在空腔頂端(Asp376 附近)和底 部(Glu45 附近)出現了小範圍的極性區域，與非極性的活性空腔形成 強烈的對比；因此，從空間上推斷，帶正電性頂端部分可能與起始反 應的質子化有關，而極性底部則可能導致環化結束前的去質子化反 應；而位於兩極性旁的微小空間，則可能是水分子協助催化作用之處。 【圖1-7】鯊烯-蛇麻烯環化酵素的晶體結構圖，N、C、E 及 L 分別 代表了胺基酸序列的 N 端、C 端、受質入口及抑制劑作用位置；黃

色為內部 α-Helix 結構，紅色為外部 α-Helix 結構，綠色為 β-Sheet

將細菌(A. acidocaldarius)中的鯊烯-蛇麻烯環化酵素與酵母菌(S. cerevisiae)中氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素兩者加以比較，發現兩者 擁有由空腔頂端的高相似性(higher homology)向底部位置逐漸降低， 反而形成低相似性(lower homology)的特性【圖1-8】。鯊烯-蛇麻烯環 化酵素與抑制劑LDAO(N,N-dimethyldodecylamine-N-oxide) 的作用， 進 一 步 地 確 定 了 活 性 空 腔 的 存 在 以 及 極 性 頂 端 的 區 域 是 在 序 列 DXDD motif 的附近(胺基酸 374 ~ 377)，而此位置正好與酵素的起始 反應位置相當接近，所以極性的頂端推測為具有提供質子的功用，可 引發鯊烯的雙鍵與其進行反應，進而產生一連串環化過程的一個重要 因素，其中又以Asp376位置的作用最為顯著 (而在酵母菌中的相對位 置Asp456也發現相當重要)18, 33。

另一個由晶體結構中的重要發現，則是觀察到許多高度保留性的 Q-W motif 於鯊烯-蛇麻烯環化酵素中，共重複了八次(氧化鯊烯環化 酵素中也重複了五次)18；這些高度保留性的Q-W motif 在晶體結構中 大多數是位在兩個 α-α 構形的連接處，雖然並不是座落於活性中心 內，而只是圍繞在酵素的表面部分，但是胺基酸Q 與 W 的側鏈可以 藉由互相堆疊而產生氫鍵與疏水性作用力的複雜網狀特性，而分別與 相鄰的或連接的 α-Helix 結構發生作用，使得所有的 α6-α6及部分的 α-α 構形能夠互相連接形成一個穩定且緊密的圓桶狀結構，同時也可 以吸收催化作用時多餘的反應能量，而在催化過程中達到穩定酵素結 構的功用39。 同屬於三萜類環化家族的鯊烯-蛇麻烯環化酵素(SHC)常被用以 做為了解氧化鯊烯環化酵素(OSC)環化機制的結構模組，但此同源性 結構模組有其限制性。而人類的氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素之 X-ray 晶體結構、酵素的活性區域及活性區胺基酸基團可能參與的反 應機制，目前已經正式發表在2004 年 Nature 期刊中 20。經先前文獻 的研究証明氧化鯊烯環化酵素催化氧化鯊烯經由環化反應生成四環 的羊毛硬脂醇，是透過活性區上的 Asp455 酸催化開環，使環氧基 (Epoxide)的氧被質子化而有環化起始反應，同時也建構了酵素中催化 環化反應過程 40。因此，利用人類氧化鯊烯環化酵素(OSC)的 X-ray 晶體結構，可發現氧化鯊烯環化酵素(OSC)是利用活性區的 Cys456 及 Cys533 與 Asp455 有氫鍵的交互作用，藉此氫鍵的拉扯效應增強 Asp455 的酸性，進而幫助酸誘導開環的起始環化。當一個催化循環 完成，Asp455 會透過水分子及 Glu459 的羧酸基團，或是藉最後脫氫 步驟的質子轉移再質子化【圖1-9】。

【圖1-9】Asp455 與 Cys456 及 Cys533 的氫鍵拉扯效應幫助受質氧化 鯊烯上之官能基Epoxide 誘導開環; Trp387、Phe444、Trp581 穩定 A 環形成與 B 環形成的 C-6、C-10-碳陽離子中間物; Tyr98 的側鏈對 B 環形成能量較傾向的椅形構形有立體阻 礙20  

1-6 鯊烯-蛇麻烯環化酵素與抑制物Ro48-8071複合物

的晶體結構

目前Ro48-8071對於人類肝細胞中氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵

素是一個很有效的抑制劑【圖1-10】，其結構主要由二苯甲基酮

(benzophenone (BP) moiety)，六碳長鏈間隔(hexacarbon spacer)及四級

胺(quaternary ammonium group) 三個部分所組成27；Ro48-8071對於人

類肝細胞在體外(in vitro)動力學的試驗中顯示，其IC50可達到6.5 nM， 在老鼠肝細胞中也有40 nM的效果，而對於細菌中的鯊烯-蛇麻烯環化 酵素IC50 則有9.0 nM的效果33；此外，Ro48-8071的抑制方式推測為非 抑制型(Noncompetitive)的抑制，表示其作用位置應不同於受質與環化 酵素結合的活性區域。 【圖1-10】氧化鯊烯環化酵素抑制劑Ro48-8071的化學結構式 透過鯊烯-蛇麻烯環化酵素與抑制劑Ro48-8071複合物的晶體結 構上可以發現，在細菌中的鯊烯-蛇麻烯環化酵素，胺基酸Phe129正 好在受質進入酵素的開口通道結構處，可以穩定Ro48-8071其溴 (bromo-)取代基位置；氟(flouro-)取代基則是模擬水分子的位置，可以 提供氫鍵的特性；帶正電性的四級胺位置，則與受質接受質子化的區 域相當鄰近，其正電荷證實能夠被Trp489、Trp312和Phe365等芳香環 胺基酸以 cation-π interactions 的力量所穩定；長鏈狀的hexacarbon則 可藉由其非極性的特點使得Ro48-8071更加深入酵素的活性中心；位 於 bezophenone上的C=O官能基，則經由Phe605的芳香環以其高密度 O F O Br N H C H CH COO HOOC

的 π 電子力量達到穩定【圖1-11】；因此，整個Ro48-8071的結構都 被化學作用力所包圍，Phe166、Val174、Phe434、及Cys435更是緊密 束縛住活性空腔的立體結構，維持空間形狀而不受到影響41。 【圖1-11】鯊烯-蛇麻烯環化酵素與抑制物Ro48-8071複合物共同的晶 體結構，灰色部份代表Ro48-8071，E 為 Ro48-8071進入的路線，以 虛線表示， Asp376 則推測為環化反應起始的位置42。

【圖1-12】蛇麻烯、Ro48-8071及 LDAO 三者的重疊立體示意圖，其 中產物蛇麻烯為黃色，Ro48-8071為黑色，及 LDAO 為淺藍色；周 圍的數字則表示可穩定活性中心結構的相關胺基酸位置42。 除此之外，利用與受質結構類似的蛇麻烯或LDAO對於鯊烯-蛇麻 烯 環 化 酵 素 進 行 入 塢 試 驗 ， 並 比 較 其 與 鯊 烯- 蛇 麻 烯 環 化 酵 素 -Ro48-8071的結構複合體之間的差異，可以發現三者在活性空腔內的 相對位置十分相似，可以證實抑制物模擬受質結構所產生的抑制作用 是可行的；而根據其空間鄰近相對應的胺基酸，也可判斷其在與受質 結合或是能夠穩定活性中心及進行催化過程中所需扮演的角色【圖 1-12】；然而，有些結果卻是與之前實驗相左，如Ala44位置在利用放 射性物質親和力標記的實驗中被推測是相當重要的41，但從Ro48-8071 複合物的晶體結構卻發現Ala44與Ro48-8071之間的距離達到14 Å，已 遠超過了可進行氫鍵或其他分子作用力的距離，反而是在Ala44旁的 Glu45位置還更加靠近抑制物，而且由空間上判斷，Ala44似乎是朝向 酵素外緣的，而非位在活性空腔內。因此，氧化鯊烯環化酵素與 Ro48-8071複合物的相關實驗除了可以提供另一個不同於複合物晶體 結構的探討方向，更進一步的了解受質與酵素在真實環境下所進行的 作用機制，同時也可以與過去實驗結果相互比較，除了能印證現有已 知的研究，也能夠對於實驗相異之處提供合理的解釋。並對於研究氧 化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素的催化機制，提供了另一個新的研究的 方向。

1-7 利用嗜甲醇酵母菌Pichia pastoris表現外來蛋白

早期蛋白質表現系統的發展大多以大腸桿菌(E. coli)宿主系統為 主，主要的原因是大腸桿菌(E. coli)具備培養簡單且實驗操作方便的 優點。但該系統無法表現出經過真核細胞後轉譯修飾過之正確構形的 蛋 白 質 。 而 在 另 一 方 向 以 酵 母 菌 表 現 系 統 來 說 ， Saccharomyces cerevisiae是近幾十年來最常被使用於表現外來蛋白質的酵母菌之 一，主要是因為S. cerevisiae的許多基因序列、胞器及其功能和高等真 核生物(higher eukaryotes)，甚至人類的細胞相同，並具備高等真核細 胞特有的後轉譯修飾作用(post-translational modification)。所以，有越 來越多的研究利用酵母菌表現系統表現哺乳類動物蛋白。但是利用S. cerevisiae 表現外來蛋白質，較常發生的問題是表現具分泌性蛋白時 常會出現過度醣基化 (hyperglycosylation) 的現象，造成外來蛋白的 產量通常只有細胞總蛋白的1-5% 。另外，若表現的外來蛋白對細胞 造成緊迫(stress)的現象時，也常造成基因穩定性的降低，尤其是所表 現的蛋白質如果對酵母菌具有毒性時，這種外來基因不穩定現象會更 加明顯43, 44。許多研究也發現，以S. cerevisiae來表現分泌性蛋白質時， 表現蛋白會有很高的比例和宿主細胞的蛋白以結合的形式存在，使得 表現量降低45-47。因此，許多的替代性的酵母菌表現系統也陸陸續續

的 被 提 出 ， 如 ﹕ Pichia pastoris48 、 Hansenula polymorpha49 、

Schizosaccharomyces pombe50、Yorrowia lipolytica51、Kluyveromyces

1-7-1 Pichia pastoris 對甲醇的代謝作用

在1969 年，Ogata等人研究發現，酵母菌Pichia pastoris是一種利

用 甲 醇(methanol)做為其唯一碳源並供給自身所需能量的嗜甲醇

(methylotrophs)酵母菌54。P. pastoris對甲醇的代謝是由酒精氧化酶

(alcohol oxidase , AOX)來啟動，甲醇在進入過氧化體(peroxisome)後經 酒精氧化酶(alcohol oxidase, AOX)催化後分解成甲醛(formaldehyde) 和過氧化氫(hydrogen peroxide)，因過氧化氫對細胞有毒性，故此步 驟必須在過氧化體(peroxisome)中發生。由於AOX對氧(O2)的親和性 低，因此酵母菌必須大量的合成此一酵素以執行其功能。酒精氧化酶 (AOX)的產生是由P. pastoris基因體上的AOX1和AOX2 兩個基因表 現而來，但大部份參與酒精代謝反應的酒精氧化酶(AOX)均是由 AOX1來表現，是最主要代謝甲醇的酵素55。AOX1可被甲醇誘導及調 節其表現，且酒精氧化酶(AOX)僅有在甲醇存在的環境下才能恆定大 量表現56, 57，如有其它碳源(如glucose、glycerol等)存在時，即偵測不 到來自酒精氧化酶(AOX)的存在。而P. pastoris在以甲醇培養時，其利 用甲醇的反應路徑中第1個酵素AOX1可以被大量合成並持續佔細胞 可溶性蛋白質總量的30%的特性58，因此可以利用AOX1基因的啟動子 來控制外來基因的表現。以P. pastoris表現系統表現外來基因大致分 有 三 個 重 要 的 步 驟 ，(1) 表 現 載 體 之 構 築 ﹔ (2) 表 現 質 體 轉 型 transformation作用﹔(3) 表現酵母菌株之篩選。目前已有許多不同特 性的表現載體以及宿主酵母菌株可依所表現蛋白之特性而選擇所需 之材料。

1-7-2 Pichia pastoris 之表現載體

構成P. pastoris表現載體的主要核酸結構有origin、expression cassette 和select marker三個部分。表現卡匣(Expression cassette)，包

括 有 一 個 啟 動 子 (promoter) 和 轉 錄 終 止 序 列 (transcription

termination)，且在這兩個序列之間有一段具有數個限制酵素切位的外 來基因插入序列(multiple cloning site)。目前在P. pastoris表現載體中常

使 用 的 啟 動 子 有 下 列 四 種 ﹕(1) 代 謝 甲 醇 AOX 酵 素 之 啟 動 子 PAOX1，在僅有甲醇存在時才會啟動及表現﹔(2) 代謝glycerol的GAP 酵素(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase)之啟動子PGAP，亦是 P. pastoris之強啟動子之一(strong-promoter)59。因不需用甲醇來誘導即 可持續表現，故應用在所表現之蛋白不能含有有害物質(如石油相關 化 學 物 ) 之 食 品 等 級 蛋 白 ﹔ (3) 表 現 glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase 基因之啟動子PFLD1，是由甲醇或是甲

胺(methylamine)誘導表現之啟動子60(4) PPEX61和PYPT162是表現力較

弱的啟動子，應用在表現量不能太高之蛋白的表現時。目前常使用的 篩選基因(select marker)有HIS4胺基酸基因與Zeocin抗藥性基因。若在 載體上帶有一段HIS4(histidine dehydrogenase)基因和AOX1基因的啟 動子部份及其上、下游基因序列63時，當質體插入宿主之染色體上， 便可以使這重組之P. pastoris菌株能在不含有histidine的培養基上生 長，而AOX1基因序列是提供使載體能夠以homologous recombination 之方式交換至宿主基因體之AOX1基因上﹔而Zeocin抗藥性基因是源

1-7-3 表現質體之嵌入 (integration) 染色體之作用方式

P. pastoris表現系統並非使用游離基因(episome)形式的載體，所

以外來的表現載體皆採取嵌入(integrate)的方式插入至P. pastoris酵母 菌的基因體中，而這種方式插入的外來基因可穩定的存在菌株中。而 將表現載體嵌入酵母菌染色體的方式有兩種：第一，是single crossover type insertion event，為表現載體藉由AOX1或His4啟動子序列直接利 用同質重組(homologous recombination)的方式將表現載體嵌入酵母菌 染色體中；第二，則是以單一刀口切割於表現質體之標示基因(如 AOX1及His4之promoter 5’端)內，質體DNA會以_{Ω狀的插入方式和酵} 母 菌 基 因 體 上 相 同 基 因 序 列 進 行 同 質 重 組 (homologous recombination)，但此種方法可能會導致原先之AOX1基因產生缺陷， 因而使轉形後之P. pastoris重組菌株其甲醇利用率降低55。通常傳送質 體DNA進入酵母菌的方法以原生質球狀體作用(spheroplasting)及電 孔 作 用(electroporation)兩 種 方 法 的 效 率 較 高65。 而 利 用 聚 乙 二 醇

1,000(PEG 1,000)或是氯化鋰(lithium chloride)的方式則效率較低。

1-7-4

Pichia pastoris

之 蛋 白 質 後 修 飾 作 用

(post-translational modification)

酵母菌表現系統和大腸桿菌表現系統最大的不同點就是酵母菌 會進行與高等真核生物相似的蛋白質後修飾作用(post-translational modification)，例如辨識訊息序列(signal sequence)、蛋白質的摺疊 (folding)、雙硫鍵(disulfide bond)的形成、蛋白質水解作用（proteolytic） 以及O-和N-linked的醣基化(glycosylation)。P. pastoris本身所產生的分 泌蛋白非常少，即使有，其產量也很低，故以分泌形式產生的外來表 現蛋白會成為培養上清液中主要的蛋白。目前被使用在表現載體上的 PHO1 (acid phosphatase signal)是由P. pastoris分離的分泌序列，已成功 的用在外來蛋白的表現。許多外來蛋白本身的分泌序列亦能成功的應

66_{。α-factor 序列乃由19個胺基酸序列所構成，其中有三個N-linked醣} 基化的位置及一個Kex2 endopeptidase作用切位67，可在分泌後自動切 去α-factor序列。另外，在過去的經驗中，有一些蛋白無法以PHO1或 是α- factor來形成分泌型式之蛋白，故須由蛋白本身分泌序列進行突 變68或是以合成分泌序列69的方式來達成。 由上述我們可歸納出，選擇以Pichia pastoris表現系統來表現外來 蛋 白 質 具 以 下 之 優 點 ﹕(1) P. pastoris 的 醣 基 化 程 度 僅 8~9 個 mannose，不會有高度醣基化之缺點﹔(2) P. pastoris很容易便能藉由 發酵而達到很高的酵母菌濃度﹔(3)P. pastoris所使用的質體是屬於插 入性質體 (integrative plasmid)，藉由這種質體帶著外來基因插入在其 染色體上，可以提高外來基因的穩定性，使在大規模培養時不會由於 基因的不穩定而使產量降低70。

1-8 研究動機與目的

這 幾 十 年 來 的 臨 床 研 究 已 經 證 實 低 密 度 脂 蛋 白(low density lipoproteins, LDL)對於膽固醇在體內的運送扮演相當重要的角色6；由 於隨著生活型態的改變，導致人類飲食習慣及食物的改變，造成現在 許多人都有膽固醇過高的現象以及困擾，同時血液中的膽固醇含量也 往 往 會 與 高 膽 固 醇 症 (hypercholesterolemia) 、 動 脈 粥 狀 硬 化 (atherosclerosis)、及心血管疾病(cardiovascular diseases)的發生有著密 不可分的關聯2, 6-8，另一方面，血漿中低密度脂蛋白的升高與冠狀動

脈心臟病(coronary heart disease）的相互關聯性已經被確定，而且膽 固醇的降低也證實了對於避免冠狀動脈心臟病的發生有很好的效 果。且經由臨床醫學的研究指出接受降低膽固醇療程的許多心肌梗塞 （myocardial infarction）存活者、患有心絞痛（angina pectoris）的患 者和其他患有動脈粥狀硬化症(atherosclerosis)的病人其症狀都獲得了 相當的改善27。而針對血液中過高的膽固醇含量，目前藥物治療的方 向主要是針對體內肝臟的膽固醇生合成途徑進行抑制，其中大多數又 以催化速率決定步驟的酵素 HMG-CoA reductase 作為抑制的目標 6, 71_{，就目前而言是以Statins 類藥物為主；但此方式會影響其下游的異} 戊二烯中間物與三萜類化合物的生成，繼而影響具重要生理功能的二 次代謝物的形成與調節，如血基質(Heme)、長萜醇(Dolichols)和泛醌 (Ubiquinone)等【圖二】，而有較嚴重的副作用產生 72。例如，近幾年 以肌毒性的產生較為大眾所關注，包含肌病變中的肌肉疼痛或無力等 症狀，更有一部分服用此 Statins 類藥物的患者併發高致命性的橫紋 肌溶解症( Rhabdomyolysis )，且併發肌毒性的機轉也未完全的明確。 因此，我們需要繼續設計更有效及更安全的新式降膽固醇藥物， 以改善現有藥物的不足；而這幾十年來氧化鯊烯環化酵素的研究特別 對於其催化受質進行環化/重排反應的反應機制和其對於設計抗真菌 劑(antifungal)、降膽固醇藥物(hypocholesterolemic)等的化學治療劑其 應用潛力感到興趣9, 38, 73。因為羊毛硬脂醇可說是首先具有固醇類特

有的四環中心結構，調控羊毛硬脂醇生成的酵素即是氧化鯊烯環化酵 素，若能夠有效地抑制其催化作用，相對地就能夠降低膽固醇的生 成。另一方面，由於氧化鯊烯環化酵素位在代謝途徑較下游的位置， 且部分抑制其酵素活性也會促進膽固醇生合成雙機制的作用，使得 24(S),25-氧化膽固醇的量增加，進而抑制膽固醇的生成，另外也希望 可以降低使用後副作用的產生；且由於氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵 素只存在於動物及真菌中，現在已有許多藥廠針對此酵素發展出抗真 菌(antifungal)的藥物 74，具有相當良好的效果；因此，未來不論是發 展可以降低高膽固醇症或是抗真菌的藥物，都將是非常具有市場競爭 力的研究方向。 從以往的研究發現，(氧化)鯊烯環化酵素家族以鯊烯或氧化鯊烯 作為受質，分別依循不同反應路徑，形成了許多相似卻不相同的中間 物 ， 造 成 各 物 種 間 代 謝 產 物 的 差 異 結 果 ， 對 於 這 類 具 有 複 雜 性 (Complexity)、效率性(Efficiency)及立體選擇性(Stereo-selectivity)的環 化酵素，利用分生定點突變技術來研究突變的氧化鯊烯環化酵素的演 化以及影響產物多樣性的因素，用以解釋氧化鯊烯環化酵素在環化機 制和酵素結構兩者之間的關聯性15, 73；對於了解氧化鯊烯環化酵素催 化環化和重排反應的機制有很重大的貢獻，並且對於酵素催化機制的 了解也有助於抑制劑的設計跟研發。 細菌(A. acidocaldarius)中的鯊烯-蛇麻烯環化酵素的晶體結構在

氧化鯊烯環化酵素的酵素構造及催化機制上提供了很好的參考依 據，對於探討結構-功能關係間的影響也具有重大的突破。 本論文的實驗目標則是希望藉由發展一種新型式且具螢光性質 的抑制劑與氧化鯊烯環化酵素作結合，利用螢光的特性來偵測抑制劑 與酵素之間的相互作用關係，以獲得更多有關哺乳類動物中氧化鯊烯 環化酵素活性區結構上的特性，並希望能夠對於酵素的催化反應機制 及受質進入酵素的通道和活性區相關胺基酸之間的作用有更進一步 的瞭解，且進而對於設計降低膽固醇生成的藥物提供一個良好的發展 方向。

第二章 實驗材料及方法

實驗材料

2-1 實驗材料與藥品

Benzamidine Fumaric acid Lanosterol (LA) N-bromosuccinimide (NBS) Phenylmethylsufonyl fluoride (PMSF) Silver nitrate Triton X-100 (TX-100) 以上皆購自於 Sigma。 4-Bromobenzoyl chloride 1,6-Dibromohexane N-allylmethylamine 以上皆購自於 Fluka。 3-Fluoroanisole 以上皆購自於 Aldrich。 Naphthalene-1-boronic acid Naphthalene-2-boronic acid

Cyclohexane Dichloromethane Diethyl ether

Di-potassium hydrogen phosphate (KPi)

EDTA·Na2

Ethanol (95% and 99%) Ether

Ethyl acetate (EA) Hydrochloric acid 37% Hexane Hydroxylamine 50% (HA) Isobutanol Methanol Nitrobenzene N,N-dimethylacetamide Potassium chloride (pellet) Potassium carbonate

Sodium bicarbonate Sodium carbonate Sodium sulfate

Tetrahydrofuran (THF) Trichloroacetic acid (TCA) 以上皆購自於 Merck。 Squalene 99%

p-Anisaldehyde pinacol

4-(4,5-diphenyl-lH-imidazol-2-yl)phenylboronic acid (DPA)

以上購自於ACROS。

Glycerol

以上皆購自於 BDH。 Acrylamide

Dithiothreitol (DTT)

N,N’-Methylene-bis-acrylamide

Millipore polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Q-Sepharose Fast Flow Gel

HiTrap Heparin column

以上皆購自於 Amersham Pharmacia Biotech。 Hydroxyapatite HT Gel

以上購自於Bio-Rad。

Ammonium persulfate (APS) Sodium dodecylsulfate (SDS)

以上皆購自於Gibco BRL。

Chromatography Silica Gel 200~450 mesh 以上購自於 Fisher。

BCA Proteins Assay Kit 以上購自於 Pierce。 牛肝 (Bovine Liver)

取自台中肉品屠宰場以及桃園肉品屠宰場，並保存於 -80 °C 冰 箱中。

2-2 緩衝溶液與實驗溶液的配置

Homogenization Buffer I (HB I)，4 L，pH = 7.4：

含有100 mM Tris-base、1 mM EDTA-Na2、1 mM DTT、1 mM

Benzamidine及40 μg /mL PMSF。

Homogenization Buffer II (HB II)，4 L，pH = 7.4：

含有20 mM Tris-base、1 mM EDTA-Na2、1 mM DTT、1 mM

Benzamidine及40 _{μg /mL PMSF。}

Ion Exchange Buffer (IEB)，4 L，pH = 7.4：

含有20 mM Tris-base、1 mM EDTA-Na2、1 mM DTT、1 mM

Benzamidine，40 _{μg /mL PMSF及0.5 % TX-100。}

Hydroxyapatite Buffer (HAB)與 Heparin Buffer (HB)，4 L，pH = 7.4：

含有5 mM KPi (磷酸氫二鉀)、1 mM DTT 及 0.5 % Triton X-100。

30% Polyacrylamide/ 1% Bisacrylamide：

5g N,N’-Methylene-bis-acrylamide 加入 375mL 40% Arcrylamide，加二

次水至125mL

20% SDS 溶液：

取10g Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)，加入二次水至 50mL

1.5M Tris(pH 8.8)：

取91g 的 Tris 加入去離子水至 500mL，調整 pH 值至 8.8

1M Tris(pH 6.8)：

10% APS：

取1g Ammonium Persulfate，加入去離子水至 10mL

5X Sample Buffer：

取0.5mL 1M Tris(pH 6.8)、0.8mL Glycerol、0.8mL 20% SDS 溶液，在

加入0.4mL β-Mercaptoethanol、0.2mL 0.05% Bromophenol Blue 加入

去離子水至10mL

SDS Running Buffer：

取14.4g Glycine、3g Tris、1g SDS 再加入去離子水至 1L

膠片染色液 (0.1 % Coomassie blue R-250 Stain Solution)：

取1 g 的 Coomassie brilliant blue R-250，溶於 400 mL 的甲醇中，再

加入100 mL 的醋酸，加二次水至體積為 1 L。

脫色溶液 I (Destain Solution I)：

將甲醇400 mL 與醋酸 100 mL 混合後，加二次水至體積為 1 L。

脫色溶液 II (Destain Solution II)：

將甲醇50 mL 與醋酸 70 mL 混合後，加二次水至體積為 1 L。

1.34 % Yeast nitrogen base (過濾滅菌存放於 4 ℃一年) 4×10-5 % Biotin (過濾滅菌後可存放於 4 ℃一年) 1 % Glycerol (過濾滅菌後存放於室溫)

存放於4 ℃ 4~6 個月

BMMY 培養液：

1 % Yeast extract、2 % Peptone，高溫高壓滅菌後再加入下述之試劑 100 mM Potassium phosphate pH 6.0 (高壓滅菌後存放於室溫)

1.34 % Yeast nitrogen base (過濾滅菌後存放於 4 ℃一年) 4×10-5 % Biotin (過濾滅菌後存放於 4 ℃一年)

5 % Methanol (過濾滅菌後存放於 4℃一年)

存放於4 ℃ 4~6 個月

Low salt LB 培養液 (pH 7.0)：

1 % Tryptone、0.5 % Yeast extract、0.5 % NaCl，高壓滅菌後存放於室

溫

Low salt LB 培養基：

2 % agar、1 % Tryptone、0.5 % Yeast extract、0.5 % NaCl，高壓滅菌

後存放於4 ℃

MM 培養基：

2 % agar，高壓滅菌後分別加入 1.34 % Yeast nitrogen base (過濾滅菌

存放於 4 ℃一年)、4×10-5 % Biotin (過濾滅菌後可存放於 4 ℃一

年)、0.5 % Methanol (過濾滅菌後存放於室溫)，之後將之存放於 4 ℃ MD 培養基：

2 % agar，高壓滅菌後分別加入 1.34 % Yeast nitrogen base (過濾滅菌

存放於 4 ℃一年)、4×10-5 % Biotin (過濾滅菌後可存放於 4 ℃一

YPD 培養液：

1 % Bacto yeast extract、2 % Bacto peptone、2 % Dextrose 高壓滅菌後

存放於4℃

TBS 緩衝液：

50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl 高溫高壓滅菌後存放於室溫 PBS 緩衝液：

1.37g Na2HPO4，在加入 0.35g NaH2PO4 及 8.77g NaCl，加二次水至 1L(pH 7.4)，存放於室溫

2-3 實驗儀器

均質機 (Brinkmann)

高速離心機 (Allegra 21 Series, Beckman) 超高速離心機 (Sorvall RC 5C)

微量旋轉式真空濃縮機 (Spin Vaccum, SAVANT)

紫外光/可見光光譜儀 (DU 7500 Spectrophotometer, Beckman) 超過濾裝置 (Ultrafiltration System, Amicon)

微盤光譜分析儀 (Fusion Universal Microplate Analyzer, Packard) 高效率液相層析儀 (High Performance Liquid Chromatography, Beckman)

螢光光譜儀(Fluorescence Spectrophotometer, Hitachi FL-4500) PCR(Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 9700)

實驗方法

2-4 牛肝中氧化鯊烯環化酵素的純化

取約500 克的牛肝，加入緩衝液後攪碎 ↓ 高速離心(10,000g)去除組織及雜質 ↓ 超高速離心(123,000g)分離得到細胞微粒體(microsomes) ↓ 加入緩衝液後進行均質化(Homogenize) ↓ 利用介面活性劑(Triton X-100) 將細胞膜上的蛋白質溶解至溶液中 ↓ 超高速離心得到蛋白質粗萃取液(crude extract) ↓ 依序進行管柱層析法(Column Chromatography)純化 (1) Q-Sepharose Fast Flow 管柱層析

(2) Hydroxyapatite 管柱層析 (3) HiTrap Heparin 管柱層析

2-4-1 溶解微粒體(Microsome)

由-80°C 冰箱中取出牛肝約 500 克，置於 4°C 冰箱中解凍並以 HB I 緩衝液清洗，將肝切成小方塊狀後，以牛肝與 HB I 為 1 : 2 的體 積比例打碎，每攪打 30 秒鐘即冰浴冷卻 10 秒鐘，持續直到溶液中無 塊狀物存在；之後在 4°C 下以轉速 10,000xg 離心 30 分鐘，取出上清 液(supernatant)後將沈澱物丟棄，在 4°C 下以轉速 123,000xg 超高速離 心1 小時 30 分鐘，收集細胞微粒體(microsomal pellets)【表 2-1】。

2-4-2 粗萃取液(Crude Extract)

將所有細胞微粒體沈澱物溶於100mL 的 HB II，並置於冰浴中； 以均質機每分鐘 20,000 轉的轉速將微粒體沈澱打散；再加入總濃度 為0.5% Triton X-100 和 1 mM DTT，在 4°C 下以磁石攪動至少 1 小時； 最後在4°C 下以 123,000xg 超高速離心 1 小時 30 分鐘，收集上清液。

2-4-3 Q-Sepharose 陰離子交換管柱層析

將粗萃取液進行BCA Assay 濃度測量，估算所含的蛋白質總量，

並決定需填充於管柱中Q-Sepharose Fast Flow 陰離子交換樹脂所需的

體積。先以4 倍樹脂體積的 IEB 來平衡管柱中的 Q-Sepharose 陰離子 交換樹脂；再將粗萃取液導入，同時開始收集流出物 (Flowthrough)； 以4 倍填充樹脂體積的 IEB 將無法與樹脂結合的蛋白質先沖洗出，同 時也收集流出物 (Wash)。接著分別以 20 mM、50 mM、70 mM 和 100 mM 四種不連續的氯化鉀(KCl)鹽梯度沖提，以每管 10 mL (約 800 滴) 收集。收集完畢後將每管分別取樣做酵素活性測試和蛋白質濃度測 量，將具有活性且蛋白質濃度較高的部分收集起來。經由透析(Dialysis) 方式除去KCl 鹽類和進行緩衝溶液的交換 (HAB, pH 7.4)，第一次透 析約2 ~ 3 小時，第二次則放置隔夜；之後利用超過濾法(Ultrafiltration) 濃縮溶液至剩餘體積約30 mL。

2-4-4 Hydroxyapatite Gel 管柱層析

先以4 倍 Hydroxyapatite Gel 填充樹脂體積的 HAB 平衡管柱。注

入上述所得樣品，同時收集流出物 (Flowthrough)；再以 5 倍填充樹 脂體積的HAB 沖提，以每管 5 mL (約 400 滴) 收集。收集完後將每 管取樣做酵素活性測試和蛋白質濃度測量，具有活性且蛋白質濃度較 高的部分收集起來，濃縮溶液至剩餘體積約30 mL。

2-4-5 HiTrap Heparin 管柱層析

先以4 倍 HiTrap Heparin 填充樹脂體積的 HB 平衡管柱。將上述 所得的樣品導入，同時收集流出物 (Flowthrough)；以 4 倍填充樹脂 體積的 HB 把無法與樹脂結合的蛋白質先沖出，同時收集流出物 (Wash)。分別以 50 mM、100 mM 和 1 M 三種不連續的 KCl 鹽梯度 沖提，每管收集2 mL (約 200 滴)。收集完畢後分別取樣做酵素活性 測試、蛋白質濃度測量與SDS-PAGE 蛋白質電泳分析。

2-4-6 酵素的分子量及純度分析

配置適當比例的電泳膠片【表 2-2】，取出純化之蛋白質溶液與樣 品緩衝液為4：1 的體積比例混合，在 95°C 水浴下加熱 5 分鐘後，注 入於膠片上端的樣品凹槽內。先固定以 90 伏特的電壓進行電泳，當

12.5 % Separating gel 30 % acrylamide / 1 % bis-acrylamide 8 mL 1.5M Tris-buffer (pH8.8) 5 mL 20% SDS 100 _μL dd H2O 6.8 mL 10% APS 100 μL TEMED 10 μL Total Amount 20 mL 5 % Stacking gel 30 % acrylamide / 1 % bis-acrylamide 1.3 mL 1M Tris-buffer (pH6.8) 1.25 mL 20% SDS 50 _μL dd H2O 7.35 mL 10% APS 50 μL TEMED 10 μL Total Amount 10 mL

【表2-2】 製作 12.5 % separating gel 及 5 % stacking gel 電泳膠片的

配方

2-4-7 酵素溶液的保存

藉由 SDS-PAGE 電泳分析，可以判斷純化所得酵素的分子量大

小與純度，因此將具有活性且純度高(單一蛋白質帶)的部分收集後，

2-5 蛋白質濃度與酵素活性的測量

對於蛋白質濃度測定，所採用的方式是BCA (bicinchoninic acid)

Assay 技術，BCA Assay 類似於 Lowry 反應，但是以 BCA 試劑取代 Folin-Cocalteu 試劑，在鹼性環境下藉由蛋白質可使二價銅離子還原

成為一價銅離子，而兩個 BCA 分子則會與一價銅離子形成錯合物，

在波長562 nm 下產生明顯的紫色，利用光譜儀的分析則能夠以吸收

值的大小判斷溶液中蛋白質濃度的多寡。以商業化產品BCA Proteins

Assay Kit 進行蛋白質濃度測量，取出蛋白質溶液樣品 25 _{μL 於}

96-well ELISA plate 之中，加入已混合均勻的 BCA 試劑 200 _μL

(Reagent A / B = 50 / 1 的比例)，置於 37°C 下反應 30 分鐘，測量溶液

在波長560 nm 時的吸收值變化；同時，先配置好五個不同濃度的已

知BSA 標準溶液，可定出一線性的標準曲線(linear standard curve)，

而所測得的吸收值則可用內插法的方式，換算為對應蛋白質的濃度。 氧化鯊烯環化酵素的活性測試 (OSC Activity Assay)，是由觀察

產物的生成與否，以判斷酵素是否具有活性的方法。取5 _{μL 10 μM}

受質氧化鯊烯(OS)至微量管(eppendorf tube)中，加入 2 μL 0.5 % Triton

X-100 及 200 _{μL 蛋白質溶液，混合均勻後置於溫度 37 °C 下進行反應}

(Incubation) 2 小時。之後加入 EtOH / H2O = 9 / 1 的酒精溶液 200

μL，劇烈振盪(Vortex) 10 秒鐘，於 70 °C 下加熱 20 分鐘以中止反應；

如【圖 2-1】所示，具有活性的酵素溶液經過反應後，在 TLC 片

上與標準物羊毛硬脂醇(LA) 相同的位移距離(Rf) ，會出現一明顯的

紫色色點；相對地，若不具有活性的酵素反應，則僅會有受質 OS 的

綠色色點存在。

【圖2-1】 TLC 活性測試示意圖

(1：LA 標準物，2：OSC 無活性，3：OSC 具有活性)

O

2,3-oxidosqualene

HO

Lanosterol

2-6 利用 Pichia 系統表現牛肝氧化鯊烯環化酵素

2-6-1 表現載體的構築

利用基因選殖的方式，依據牛肝中的氧化鯊烯環化酵素(Bovin Liver oxidosqualene cyclase, B.L-OSC)基因序列設計合成兩段引子 (Primer)，所設計的限制酶切位為 Sac II / Xba I 和 Xho I / Xba I 兩組(參 照附錄一)，用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)的方法

以進行基因片段的增殖。取0.5_{μL 含有牛的氧化鯊烯環化酵素基因的}

染色體 DNA 當做模板，加入 15_{μL 3.3X XL Buffer II、3μL 25mM}

Mg(OAc)2、4_{μL dNTP mix(含 dATP, dCTP, dGTP 及 dTTP 各 2.5}

mM)、0.5_{μL rTth polymerase(2U/μL)、兩段引子各 1μL，最後以去離}

子水補至總體積為50_{μL【表 2-3】}。置入PCR 反應器(96-well GeneAmp

PCR System 9700 Thermal Cycler)中，PCR 反應條件為 94℃作用 15 秒、58℃作用 2 分鐘、72℃作用 7 分鐘共 29 個循環，最後以 72℃作

用 30 分鐘完成最後的反應【表 2-4】。將 PCR 產物經由 agarose gel

電泳分析(將 PCR 產物加入 1_{μL Loading Buffer 及 1μL SYBR Green I，}

利用1％洋菜凝膠以電壓 100 伏特進行電泳分析)確定正確大小後，與

pCR 2.1-TOPO 載體進行接合，並與大腸桿菌 XL1-Blue 勝任細胞 (competent cell)進行重組質體轉化作用(transformation)，最後均勻塗佈

於含 100_{μg/mL 的 ampicillin 的 LB 培養基上，培養隔夜後，挑選單}

【表2-3】PCR 反應試劑的量 部分 循環（次） 溫度（℃） 時間 1 1 94 1：00 2 29 94 0：15 58 2：00 72 7：00 3 1 72 30：00 4 1 4 pause 【表2-4】PCR 反應條件 將 含 有 牛 肝 中 的 氧 化 鯊 烯 環 化 酵 素 基 因 片 段 之 重 組 pCR 2.1-TOPO 質體經確認後，將牛肝中的氧化鯊烯環化酵素的基因片段

切出，與酵母菌表現載體 pPICZB 或 pGAPZαA 進行接合作用(利用

agarose gel 電泳分析把正確大小之載體與 DNA 序列切下，以 gel extraction kit 純化凝膠中的 DNA，並以一定比例 insert：vecter = 6：1

混合，抽乾後以 10_{μM 的二次水回溶，並加入接合酵素 T4 DNA}

Ligase，於 4℃下反應隔夜)，並轉化至大腸桿菌 XL1-Blue 勝任細胞，

再以含25_{μg/mL Zeocin 之低鹽 LB 培養基(low salt LB plate)進行重組}

反應物 體積（單位μL） template 0.5 Primer1 1 Primer2 1 3.3X XL Buffer II 15 25mM Mg(OAc)2 3 dNTP mix（各 2.5mM） 4 ddH2O 24.5 rTth polymerase 1

菌株的篩選。將各株重組質體DNA 經小量抽取後，以限制酵素切割 作用分析，確認接入基因具有正確的方向性，並且再進一步以核酸定

序分析確認基因序列的正確性。在完成pPICZB/B.L-OSC(Sac II / Xba

I)和 pGAPZ_{αA/B.L-OSC(Xho I / Xba I)重組表現載體的構築後，以低}

鹽LB 培養液(low salt LB medium)培養重組之大腸桿菌菌株，並以小

量 抽 取 並 純 化 質 體 DNA 以 提 供 進 行 酵 母 菌 之 電 孔 轉 化 作 用

(electroporation)。

2-6-2 酵母菌之轉化作用

取2μL 質體重組 DNA 先以限制酶酵素 Pme I 將 DNA 切成直鏈

(Linear)狀，經由 agarose gel 電泳分析，再利用 gel extraction kit 純化 DNA，保存於-20℃中。並且取單一菌落的 P. pastoris(GS115 或 X33) 在30℃下培養於 3mL YPD 培養液中震盪培養至隔夜，取 0.5mL 菌液 至100mL YPD 培養液中，30℃下培養至 OD600值為1.3~2 之間，於 4℃ 下以1,500xg 離心 5 分鐘，使菌塊與上清液分離，棄上清液並以冰的 100mL 無菌水回溶菌塊，再於 4℃下以 1,500xg 離心 5 分鐘，重複此 步驟兩次，最後用冰的100mL 的無菌 1M Sorbitol 回溶菌塊，並再於 4℃下以 1,500xg 離心 5 分鐘，棄上清液，之後以冰的 4mL 的無菌 1M Sorbitol 懸浮菌塊製備成酵母菌電孔勝任細胞。取已經切成直鏈形的 質體重組 DNA 2_{μL 與 50μL 的酵母菌電孔勝任細胞混合置於冰上 5}