行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
中醫藥對肝再生能力之影響(3/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC93-2320-B-039-004- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 中國醫藥大學學士後中醫系 計畫主持人： 蔡金川 計畫參與人員： 蔡金川,梁秀蓮,黃志揚,江俊緯,吳嘉平,武執中,李婷婷 報告類型： 完整報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 94 年 10 月 31 日
中醫藥對肝再生能力之影響(3/3)
(93-2320-B-039-004-) 中文摘要: 將大白鼠肝臟利用 Thioacetamide 造 成肝臟的損傷，再運用四種中草藥(包 括:丹參、黨參、高氏柴胡、丁豎杇) 及做為正控制組的 silymarin，研究其 損傷之後的肝臟在 1 天、3 天及 7 天之 肝臟再生之作用機轉。並從增生訊息 途徑之增生因子 HGF 及其下游之因子 FAK、Cyclin D、Cyclin E、Rb 之蛋白 質表現量觀察其對肝臟增生作用的調 控。從結果中我們發現，四種中藥在 經 thioacetamide 誘毒後的肝臟再生 情形中，會造成不同的時間對 HGF 增 生途徑因而有所不同。在肝臟再生 1 天時，丹參對 HGF 途徑之誘導最大。 然而，在 3 天及 7 天之肝臟增生中則 以高氏柴胡對 HGF 途徑之促進為最大。 前言: HGF 即為 scatter factor 主要扮演著 肝臟增生(liver regeneration)角色 (1)，在生物生長過程中主要調控胚胎 生長、組織增生、癌細胞生長及管質 增生等方面，另外透過 Receptor 能夠 調節 Cell proliferation、survival、 motility 及 morphogenesis(2)。 肝細胞增生因子 HGF(Hepatocyte growth factor)為一個雙硫鍵結的 heterodimer，是由 69 kDa 的α-chain 及 34kDa 的β-chain 所組成，而α -chain 則為具有一個 hairpin domain 的 N 端；β-chain 則為具有四個 Kringle domains 的 Serineprotease(3.4)。同時 HGF 大多位於
Kidney，mammary gland，lung and tooth 等基質組織中(stromal tissue) 並且具有增生及再生的作用。HGF 是一 種具有生物活性的 growth factor，以 誘導細胞進行 survival，migration， proliferation 及 tubulogenesis。HGF 和其 receptor( c-met) 結合在各種組 織中以 autocrine 及 paracrine 的作 用，促使細胞的 mitogenic， motogenic，及 morphogenic。HGF 是 透過 c-met、FAK 之相關分子訊息途 徑，進入 Cell cycle 中以促使肝細胞 增生活化 Rb 及 E2F 來促進細胞的增 生。
FAK 為細胞 Cell adhesion、 migration、survival、及
proliferation 之訊息中間調節者(5)
並且調節 cell cycle(6)。其中
Overexpression FAK 加速 Cyclin D1 的 Transcriptional Activation 用於 細胞循環中之 G1 到 S 期的調節(7,8)。
G1 到 S 期受到 Cyclin D、Cyclin E、 Cyclin A 之調節。在早期之 G1 期， Cyclin D 結合 cdk4/6;在晚期之 G1 期，Cyclin E 結合 cdk2;Cyclin A 則 結合 cdk2 以調節早期之 S 期。之後再 經由 Rb、E2F 等之 Transcription factors 調節基因現及 DNA 的合成(9)。 實驗材料: 動物品系:Wistar 品系雄性大白鼠 (Wistar Albino Rats)
動物週齡:4~6 週，體重約在 180~220 克間。 飼養方式:空調房間、溫度維持在 22 ± 5℃，半日照環境，一隻一籠分籠飼 養，自由引水及飼養標準飼料。 (B)中草藥材 委託中國醫藥學院附設醫院中藥局 主任張永勳博士收集並鑑定基源 益氣藥：黨參 ( Codonopsis pilosula (Franch) Nannf，Companulacese) 活血藥：丹參 ( Salvia miltorrhiza Bunge，Labiatae) 和解藥：高氏柴胡 ( Bupleurum kaoi，Umbelliferae) 清熱藥：丁豎杇 ( Elephantopus scaber L.，Compositae) 水抽出物之製備：稱重，加水煮沸 1 小時，趁熱過濾兩次，得濾液，真空 減壓濃縮，得濃縮液。濃縮液進行冷 凍乾燥得乾燥粉末，秤重，並計算產 率(yield)。 實驗方法與步驟： 1. 動物 將動物隨機分為 6 組，分別為：控制 組、益氣組、活血組、和解組、清熱 組以及西藥對照組。除控制組外，經 由腹腔注射投予 Thioacetamide 100mg/kg 連續 14 天，並在初次投藥 後第 8 天，開始連續口服中藥及西藥 對照。第 15 日開始執行部分肝切除手 術，並在術後 1、3、7 天犧牲取內臟 以供後續實驗。 2. 組織研磨萃取: 將肝臟組織(0.1g)以 PBS 清洗後，以 1 ml 之 PBS Buffer 均質。接以 12,000rpm 離心 30 分鐘，取上清液。 3.西方墨點分析 ( Western Blotting Analyses ) 取 20ug 的肝臟蛋白萃取液，加入適量 的 PBS ( 0.14M NaCl, 3mM KCl, 1.4mM KH2PO4、6H2O, 14mM K2HPO4 )及 4ul 的 dye，在 95℃下作用 10 分鐘使蛋白變 性 。 然 後 將 蛋 白 樣 品 以 12 ﹪ polyacrylamide gel 以 110 伏特，進 行蛋白電泳 90 分鐘。電泳完成後，將 凝 膠 平 舖 在 以 transfer buffer ( 24.7mM Tis-base,192mM glycine 以 及 20﹪methanol，最後補 ddH2O 到 1L,PH 8.3 ~ 8.4 )潤濕的濾紙，蓋上 PVDF membrane 之後，蓋上一層濾紙， 放入 transfer tank 之中，以 150mA 電流，transfer 2 個小時。然後將 PVDF membrane 取出，依照各種不同分子量 抗體位置，剪成一小長條狀，在放入 含有 0.1﹪Tween 20 的 5﹪脫脂牛奶 中 ， blocking 一 個 小 時 之 後 ， 將 membrane 取出放入密封袋中，加入 2ml 含有 0.1﹪Tween 20 的 5﹪脫脂牛奶， 及一次抗體，包含:α-tubulin，HGF， FAK，Cyclin D1，Cyclin E，Rb 等一 級抗體(Santa Cruz Biotechnology) 置於 4℃冰箱中，反應 24 小時。取出 membrane 以 TBS+Tween 20 wash 三次， 每次 5 分鐘。
之後，再將 membrane 取出放入新的密 封袋中，加入含有 0.1﹪Tween 20 的 5 ﹪脫脂牛奶 2ml 及二次抗體，包含： anti-rabbit IgG，anti-mouse IgG， anti-goat IgG ，在室溫中，反應 2 個小時。重覆 wash 步驟，最後加入 7.5ml 的 substrate buffer ( 76.8mM Tris-HCl ,1M NaCl , 5mM MgCl2、
(3,3`-diaminobenzidine)染色約 5 分 鐘 。 觀 察 結 果 並 做 相 對 密 度 測 量 (relative density measurement)。 結果: 大白鼠經由餵以 Thioacetamide 之 後，會造成肝臟的慢性損傷。而本研 究投予中草藥並觀察肝臟誘導增生與 中草藥之間的相關性，主要探討增生 因子 HGF 的相關訊息途徑。從短時間 的實驗中做觀察，中草藥丹參能誘導 並且促進 HGF 之蛋白質表現量之增 加。同時，其下游之相關訊息因子蛋 白，FAK 則對黨參、高氏柴胡、丁豎杇 等中草藥均具有相當的蛋白表現。然 而丹參對 FAK 之促進並無相當顯著的 表現。但 FAK 所誘導之下游蛋白 Cyclin D、Rb 均有增加的趨勢。另外，丹參對 Cyclin E 之蛋白誘導並無相當顯著的 表現。因此，更進一步的觀察肝臟再 生 1 天後，發現丹參對 HGF 之蛋白呈 現量則有增加的趨勢。而下游之相關 蛋白 FAK、Cyclin D、Cyclin E、Rb 之蛋白質表現量均有增加。相同的， 更進一步的觀察，以 thioacetamide 使肝臟受損後，經過肝臟的 3 天再生， 觀察增生因子途徑之蛋白質表現量。 從結果中得知，HGF 之蛋白質表現量以 高氏柴胡為最高。其下游之蛋白質因 子 FAK、Cyclin D、Cyclin E、Rb 均 有增加的現象。然而，Cyclin E 則以 丹參對其蛋白質呈現量為最高。Rb 方 面，則以黨參之蛋白質之表現量為最 高。但高氏柴胡對 Rb 蛋白質之誘導與 對照組之比較亦有增加的現象。然 而，在長期的 7 天肝臟增生中，高氏 柴胡對其增生因子 HGF 及其下游之相 關訊息因子 FAK、Cyclin D、Cyclin E、
Rb 均能促進其蛋白質量的增加。相同 的，正對照組 silymarin 亦有相對的 增加。 1 day HGF fold 1 1.1 1.2 2.3 1.2 2.5 2.3 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S FAK fold 1 1.2 1.3 1.1 1.2 2.1 1.1 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S Cyclin D fold 1 1.5 1.2 1.2 1.5 1.8 2.1 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S Cylin E fold 1 1.2 1.2 1 1.2 1.6 1.1 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S Rb fold 1 1.5 1.3 1.1 1.2 1.7 1.2 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S
3 day HGF fold 1 1 2 1 1.6 1.5 1.5 1.6 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S FAK fold 1 0.9 0.6 1.6 0.91 1.5 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S Cyclin D fold 1 0.8 0.4 1.7 0.8 1.2 1.3 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S Cyclin E fold 1 0.7 0.8 1.6 1.4 1.7 1.5 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S Rb fold 1 1.1 1.3 1.5 1.6 1.6 1.6 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S 7 day HGF fold 1 1.1 1.3 1.6 1.3 1.2 1.5 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S FAK fold 1 0.9 1.1 1.8 0.9 1.2 1.3 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S Cyclin D fold 1 1.1 1.1 2.5 1.2 1.3 1.5 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S Cyclin E fold 1.1.1 2.5 1.9 1.1 1.1 1.2 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S Rb fold 1 0.9 1.1.1.8 1.5 1.2 1.5 Tubulin N TA ESL BK CP SMB S 討論: 大白鼠利用 thioactamide 造成肝臟損 傷後，再餵以中草藥丹參、黨參、高 氏柴胡、丁豎杇等中草藥。觀察四種 中草藥對肝臟再生之功效，及其所透 過的作用機制。從對增生因子(HGF)的 誘導及促進作用中，在最初期的 1 天 丹參能促進 HGF 的蛋白質表現。而其 下游之 FAK 因其他機制的互相調控， 如 MEK、ERK2 等 MAPK 之調節而影響。 然而，透過 FAK 所調節之細胞循環
(Cell cycle)調控因子 Cyclin D 則亦 為丹參所誘導之蛋白表現量為最高。 Cyclin D 為結合 cdk4/6 調節早期的 G1 期，Cyclin E 則結合 cdk2 調控晚 期之 G1 期。因此，丹參在晚期之 G1 則並無顯著的作用。但是丹參在 Rb 的 蛋白質表現中亦有促進的作用。。然 而，在肝臟增生 3 天時，丹參之作用 機制轉為次要，則其高氏柴胡對 HGF 的蛋白誘導已有增加的趨勢。而丹參 此時則對 Cyclin E 之誘導具有相當高 的蛋白質表現量。此時丹參對肝臟之 再生作用則為 G1 晚期所調節。但抑癌 因子 Rb 之蛋白質表現量則 以黨參為最，丹參次之。所以，我們 更進一步的觀察在長時間的七天肝臟 再生中，肝臟促進再生的作用機制與 HGF 的相關性。從結果中得知，在七天 的肝臟増生中，高氏柴胡能夠誘導 HGF 及其下游的 FAK、Cyclin D、Rb 之蛋 白質表現量。已與三天之肝臟再生相 同。然而，丁豎杇對 G1 晚期的 Cyclin E 之蛋白質量則在肝臟再生七天時亦 有顯著的增加。因此，中草藥對肝臟 再生之作用因作用在不同之細胞循環 週期而有不同作用功效。 參考文獻:
1. Mars WM. Liu ML. Kitson RP. Goldfarb RH.Gabauer MK. Michalopoulos GK.(1995)
Immediate early detection of urokinaes receptor after partial hepatectomy and its implications for initiation of liver
regeneration.Hepatology. 21(6);
1695-701.
2. Tatyana Merkulova-Rainon,
Patrick England, Shunli Ding, Corinne Demerens, and Gerard Tobelem.(2003)The N-terminal Domain of Hepatocyte Growth Gactor Inhibits the Angiogenic Behavior of Endothelial Cell Independently from Binding to the c-met Receptor. The Journal
of Biological Chemistry. Vol 278, No 39, 37400-37408.
3. Bottaro DP, Rubin JS, Faletto DL, Chan AM, Kmiecik TE, Vande Woude GF and Aaronson SA.(1991) Iden-tification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product.
Science 251,802-804.
4.Naldini L, Weidner KM, Vigna E, Gaudino G, Bardelli A, Ponzetto C, Narsimhan RP, Hartmann G, Zarnegar R,Michalopoulos GK, Birchmeier W and Comoglio PM.(1991)Scatter factor and hepatocyte growth factor are indistinguishable ligands for the MET receptor. EMBO J
10,2867-2878.
5 Zhao J,Bian ZC, Yee K, Chen BP, Chien S, Guan Jl.(2003)
Identification of
transcription factor KLF8 as a downstream target of focal adhesion kinase in its
regulation of cyclin D1 and cell cycle progression. Mol Cell,
11(6), 1503-15.
6.Ji-He Zhao, Heinz Reiske, and Jun-Lin Guan.(1998) Regulation
of the cell cycle by Focal Adhesion Kinase.The Journal of
cell Biology, volume 143, Number 7, 1997-2008.
7.Heinz R, Reiske, JiHe Zhao, Dong Cho Han, Lee Ann Cooper, Jun-Lin Guan.(2000) Analysis of FAK-associated signaling pathway in the regulation of cell cycle progression. FEBS Letters, 486,
275-280.
8.Jihe Zhao, Richard Pestell, and Jun-Lin Guan.(2001)
Transcriptional Activation of Cyclin D1 Promoter by FAK Contributes to Cell Cycle Progression. Molecular Biology
of the Cell, Vol 12, 4066-4077.
9.Lukas ER, Bartley SM, Graveel CR, Diaz ZM, Dyson N, Harlow E, Yamasaki L, Farnham PJ. (1999) No effect of loss of E2F1 on liver regeneration or hepatocarcino-genesis in C57BL/6J or C3H/HeJ mice.Mol Carcinog. 25(4),
