使用分散性液相液相微萃取和線上濃縮技巧結合毛細管電泳檢測水中的農藥

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(1)國立高雄大學應用化學系碩士論文. 使用分散性液相液相微萃取和線上濃縮技巧結合毛細管電泳檢測水中的農藥 The Use of Dispersive Liquid-Liquid Microextraction and On-line Sample Stacking Combined with Capillary Electrophoresis to Determine Pesticides in Water. 研究生：陳曼儂撰指導教授：劉福鯤博士. 中華民國一零三年七月.

(2) 目錄第一章. 前言………………………………………………………………………………………… 3. 第二章. 文獻回顧…………………………………………………………………………………. 5. 2.1. 農藥 ........................................................................................... 5. 2.2. 毛細管電泳 ............................................................................... 8. 2.2.1. 毛細管電泳的歷史…………………………………………….. 8. 2.2.2. 毛細管電泳基本原理………………………………………… 10. 2.2.3. 電滲流 (Electroosmotic flow)………………………………... 11. 2.2.4. 電泳流速 (Electrophoretic flow rate)………………………… 12. 2.2.5. 操作模式……………………………………………………… 14. 2.2.5.1. 毛細管區帶電泳法 (Capillary Zone Electrophoresis, CZE).... 14. 2.2.5.2. 微胞電動層析法 (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC or MEKC)…………………………. 15. 2.2.5.3. 毛細管膠體電泳法 (Capillary Gel Electrophoresis, CGE)……………………………………………....................... 16. 2.2.5.4. 毛細管等電聚焦法 (Capillary Isoelectric Focusing, CIEF)... 17. 2.2.5.5. 毛細管等速電泳法 (Capillary Isotachophoresis, CITP)…….…………………………………………………..... 17. 2.3. 樣品線上濃縮 .......................................................................... 18. 2.3.1. 正向堆積模式 (Normal Stacking Mode, NSM)………………19. 2.3.2. 反向電極極性堆積模式 (Reversed Electrode Polarity Stacking Mode, REPSM)……………………………………………….. 20 I.

(3) 2.3.3. 反向遷移微胞堆積 (Stacking with Reverse Migration Micelles, SRMM)………………………………………………………... 20. 2.3.4. 場強放大樣品注射 (Field-Enhanced Sample Injection, FESI) 21. 2.3.5. 反向遷移微胞之場強放大樣品注射 (Field-Enhanced Sample Injection with Reverse Migration Micelles, FESI-RMM)…… 22. 2.3.6. 反向遷移微胞與水的堆積 (Stacking with Reverse Migration Micelles and Water Plug, SRW)……………………………... 23. 2.3.7. 清掃堆積模式 (Sweeping)…………………………………… 24. 2.4. 離線濃縮 ................................................................................. 25. 2.4.1. 液相微萃取…………………………………………………… 25. 2.4.1.1. 單滴微萃取 (Single drop microextraction, SDME)………... 26. 2.4.1.2. 中空纖維微萃取 (Hollow-fiber liquid phase microextraction, HF-LPME)…………………………………………………… 27. 2.4.1.3. 分散性液相液相微萃取 (Dispersive liquid-liquid microextraction)………………………………………………. 29. 第三章. 實驗步驟與樣品分析…………………………………………… 35. 3.1. 實驗藥品與儀器設備 .............................................................. 35. 3.1.1. 實驗藥品……………………………………………………… 35. 3.1.2. 儀器設備……………………………………………………… 37. 3.2. 實驗步驟 ................................................................................. 37. 3.2.1. 農藥分析……………………………………………………… 37. 3.2.1.1. 標準溶液製備...................................... 37 II.

(4) 3.2.1.2. 緩衝溶液的製備.................................... 38. 3.2.1.3. 毛細管處理…………………...……………………………… .40. 3.2.2. 實驗操作條件………………………………………………… 41. 3.2.2.1. 濃縮前的優化………………………………………………… 41. 3.2.2.2. REPSM 的優化………………………………………………. 41. 3.2.2.3. Sweeping 的優化……………………………………………… 41. 3.2.2.4. DLLME 結合 Sweeping……………………………………… 44. 3.2.2.5. 實際樣品處理理…………………………………………....… 45. 第四章. 結果與討論………………………………………………………………………….. 46. 4.1. 偵測波長的選擇 ...................................................................... 46. 4.2. 毛細管區帶電泳 ...................................................................... 47. 4.3. 微胞電動層析 .......................................................................... 47. 4.3.1. 添加不同的有機修試劑……………………………………… 47. 4.3.2. ACN 含量 (%)………………………………………………... 49. 4.3.3. Na2B4O7 緩衝溶液的優化……………………………………. 50. 4.3.3.1. 改變 Borax 濃度……………………………………………… 50. 4.3.3.2. 改變 SDS 濃度........................................................................... 50. 4.3.4. 最佳化的緩衝溶液…………………………………………… 51. 4.3.5. 精確性 (Precision)……………………………………………. 53. 4.3.6. 準確性 (Accuracy)…………………………………………… 54. 4.4. 線上濃縮-反向電極極性堆積模式 (REPSM) ....................... 56. 4.4.1. 鹽類添加……………………………………………………… 57 III.

(5) 4.4.2. 反轉電壓時間………………………………………………… 59. 4.4.3. 進樣前後打進水層或有機層………………………………… 61. 4.4.4. 注射量………………………………………………………… 61. 4.5. 線上濃縮-清掃堆積模式 (Sweeping) .................................... 64. 4.5.1. 改變 pH 值…………………………………………………… 64. 4.5.2. 樣品基質中硼酸鹽類濃度…………………………………… 66. 4.5.3. 緩衝溶液中 SDS 濃度……………………………………… 68. 4.5.4. 添加鹽類……………………………………………………… 69. 4.5.5. 注射時間……………………………………………………… 72. 4.5.6. 精確性和準確性……………………………………………… 75. 4.5.7. 線上濃縮後的提升因子……………………………………… 78. 4.6. 分散性液相液相微萃取結合 Sweeping .................................. 79. 4.6.1. 萃取劑種類…………………………………………………… 79. 4.6.2. 萃取劑體積…………………………………………………… 81. 4.6.3. 分散劑種類…………………………………………………… 82. 4.6.4. 分散劑體積…………………………………………………… 83. 4.6.5. pH 值………………………………………………………….. 84. 4.6.6. 鹽類添加……………………………………………………… 85. 4.6.7. 實際應用……………………………………………………… 87. 第五章. 結論………………………………………………………………………………………. 90. 第六章. 未來展望………………………………………………………………………………. 91. 第七章. 參考文獻………………………………………………………………………………. 93 IV.

(6) 表目錄表 2.1 實驗用的 12 種農藥特性和最大殘留值 ........................................... 7 表 2.2 實驗用十種農藥的分子結構 ............................................................. 8 表 2.3 常見離子液體的物理性質 .............................................................. 34 表 3.1 本實驗使用的藥品 .......................................................................... 35 表 3.2 農藥標準品 ...................................................................................... 36 表 3.3 濃縮前的優化條件 .......................................................................... 42 表 3.4 REPSM 的優化條件 ........................................................................ 43 表 3.5 Sweeping 的優化條件...................................................................... 43 表 4.1 十種農藥的日內和日間標準偏差、檢量線和檢量線線性迴歸係數 ..................................................................................................................... 54 表 4.2 十種農藥的回收率 LOD 和 LOQ ................................................... 55 表 4.3 SDS 濃度與樣品基質/緩衝溶液的導電度比值關係 ..................... 69 表 4.4 NaCl 濃度與樣品基質/緩衝溶液的導電度比值關係 .................... 72 表 4.5 九種農藥的日內標準差、日間標準差、檢量線及檢量線回歸係數 ..................................................................................................................... 76 表 4.6 九種農藥樣品的回收率、LOD、LOQ .......................................... 77 表 4.7 九種農藥進行 REPSM 和 Sweeping 的 LOD 提升因子 ................ 79 表 4.8 實驗所用萃取劑的物理特性 .......................................................... 81 表 4.9 九種農藥經過 DLLME、Sweeping 和兩者結合後偵測靈敏度的提升倍率……………………………………………………………….86 表 4.10 九種農藥在經由 DLLME 與 Sweeping 技巧結合後的偵測極限和分別在飲用水、自來水和池水中的回收率.........................................87. V.

(7) 圖目錄圖 2.1 Tiselius 的移動介面法構造圖 ......................................................... 10 圖 2.2 以鹼性物質活化後的毛細管內部構造 .......................................... 13 圖 2.3 水合陽離子靠近管壁形成電雙層的構造 ....................................... 13 圖 2.4 施加外加電壓時，EOF 往陰極泳動的毛細管內情況 .................. 13 圖 2.5 (a) 毛細管電泳方式的平板流(上)及層析圖(下) (b) 流體動力方式的拋物線流(上)及層析圖(下) ................................................... 14 圖 2.6 CZE 基本原理 ................................................................................. 15 圖 2.7 MEKC 基本原理.............................................................................. 16 圖 2.8 CGE 基本原理 ................................................................................. 17 圖 2.9 CIEF 的基本原理 ............................................................................ 17 圖 2.10 CITP 基本原理 .............................................................................. 18 圖 2.11 NSM 的原理 .................................................................................. 19 圖 2.12 REPSM 的原理 .............................................................................. 20 圖 2.13 SRMM 的原理 ............................................................................... 21 圖 2.14 FESI 的原理 ................................................................................... 22 圖 2.15 FESI-RMM 的原理 ........................................................................ 23 圖 2.16 SRW 的原理 .................................................................................. 24 圖 2.17 酸性緩衝溶液下的 Sweeping 原理 .............................................. 25 圖 2.18 DI-SDME 的示意圖 ....................................................................... 27 圖 2.19 中空纖維萃取的示意圖 ................................................................ 28 圖 2.20 DLLME 的操作流程...................................................................... 30 圖 2.21 LD-DLLME 的流程示意圖 ........................................................... 32 圖 2.22 常見離子液體的陰陽離子結構 ..................................................... 33 圖 3.1. LD-DLLME 的操作過程 .............................................................. 44 VI.

(8) 圖 3.2 IL-DLLME 的操作流程 .................................................................. 45 圖 4.1 十種農藥的 UV 吸收光譜 .............................................................. 46 圖 4.2 SDS 的結構 ..................................................................................... 47 圖 4.3 20 mM 的 Tris 緩衝溶液 (pH 8.0)，含 SDS 50 mM，各添加 8% (1) 乙腈(2) 甲醇(3) 異丙醇的電泳圖………………………………...48 圖 4.4 Tris 20 mM, SDS 50 mM (pH 8.5)的緩衝溶液中，添加不同的 ACN 量 (%)……………………………………………………………… .49 圖 4.5 固定 SDS 濃度和 pH 值，改變 Borax 濃度的電泳圖 ................... 50 圖 4.6 固定 Borax 濃度和 pH 值，改變 SDS 濃度 .................................. 51 圖 4.7 十種農藥在兩種緩衝溶液系統下的遷移時間 .............................. 52 圖 4.8 十種農藥在兩種緩衝溶液系統下的解析度 .................................. 52 圖 4.9 濃縮前的電泳圖 .............................................................................. 53 圖 4.10 樣品基質中，鹽類濃度對理論板數的影響 ................................. 58 圖 4.11 樣品基質中，鹽類濃度對解析度的影響 .................................... 58 圖 4.12 反轉電壓時間對理論板數的影響 ................................................ 59 圖 4.13 反轉電壓時間對解析度的影響 .................................................... 60 圖 4.14 反轉電壓時間對訊號面積的影響 ................................................ 60 圖 4.15 加入水或有機溶劑層對理論板數的影響 .................................... 61 圖 4.16 注射量對理論板數的影響 ............................................................ 62 圖 4.17 注射量對解析度的影響 ................................................................ 63 圖 4.18 REPSM 後的農藥電泳圖 .............................................................. 63 圖 4.19 Borax 20 mM 下，不同 pH 對樣品分離時的解析度 ................... 65 圖 4.20 Borax 20 mM，不同 pH 對樣品分離時的理論板數 .................... 65 圖 4.21 Procymidon 在硼酸鹽類基質中不同時間的 UV 圖 ..................... 66 圖 4.22 樣品基質中硼酸鹽類濃度對九種農藥的理論板數影響 ............. 67 VII.

(9) 圖 4.23 樣品基質中硼酸鹽類濃度對九種農藥的解析度影響 ................. 67 圖 4.24 緩衝溶液中 SDS 濃度對理論板數的影響 ................................... 68 圖 4.25 緩衝溶液中 SDS 濃度對解析度的影響 ....................................... 69 圖 4.26 樣品基質中氯化鈉濃度對理論板數的影響 ................................ 70 圖 4.27 樣品基質中氯化鈉濃度對解析度的影響 .................................... 71 圖 4.28 樣品基質中添加氯化鈉的電泳圖 ................................................ 71 圖 4.29 注射量對理論板數的影響 ............................................................ 73 圖 4.30 注射量對解析度的影響 ............................................................... 73 圖 4.31 Metalaxyl 在 sweeping 後注射時間與訊號高度和訊號寬度的關係 ..................................................................................................................... 74 圖 4.32 Pyrimethanil 在 sweeping 後注射時間與訊號高度和訊號寬度的關係 ................................................................................................... 74 圖 4.33 注射秒數占整個毛細管的體積 (%) ............................................ 75 圖 4.34 九種農藥經過 Sweeping 後的電泳圖 .......................................... 78 圖 4.35 萃取劑種類對九種農藥萃取效率的影響 .................................... 80 圖 4.36 萃取劑體積對九種農藥萃取效率的影響 .................................... 82 圖 4.37 分散劑種類對九種農藥萃取效率的影響 .................................... 83 圖 4.38 分散劑體積對九種農藥萃取效率的影響 .................................... 84 圖 4.39. pH 值對九種農藥萃取效率的影響 ............................................ 85. 圖 4.40 氯化鈉對九種農藥萃取效率的影響 ............................................ 86 圖 4.41 結合 DLLME 與 Sweeping 後的農藥電泳圖。(A)未添加，(B) 添加 25 ppb pesticides 的電泳圖 .................................................... 88 圖 6.1. dSPE 操作流程 ........................................................................... 92. VIII.

(10) 使用分散性液相液相微萃取和線上濃縮技巧結合毛細管電泳檢測水中的農藥指導教授: 劉福鯤博士國立高雄大學應用化學系學生: 陳曼儂國立高雄大學應用化學系. 摘要農藥在大自然環境中隨處可見，是主要的汙染物之一。農藥殘留於水果和蔬菜收成時，將對人體造成傷害; 因為農藥在環境中的濃度低且處於複雜基質當中，例如: 土壤、食物等等，所以開發一個高效率的檢驗方法為食品安全把關是有必要的。毛細管電泳具有高效能、分離時間短、樣品和溶劑需求量少和操作簡單，在分析環境領域上越來越受歡迎。但毛細管電泳偵測極限比其他層析儀器較低，為提升偵測靈敏度，可採用靈敏度更高的偵測器 (例如: 質譜)，或是利用樣品前處理的方式，包含線上濃縮、固相萃取和固相微萃取等離線濃縮技巧。本研究是利用毛細管電泳中的微胞電動層析模式同時分離九種農藥，同時結合分散性液相液相微萃取法和 Sweeping 技巧。最佳化的緩衝溶液是 pH 9.2 的 10 mM 硼酸鹽類緩衝溶液，添加 60 mM 的 SDS 和 18%的 ACN，分離時間可以在 13 分鐘之內完成。LOD 在 0.28-2.30 ng mL-1，LOD 的提升倍率可達 350 到 3407 倍之間。應用在飲用水、自來水和池水上的回收率為 69.5-117%。此方法為首次結合 Low density dispersive liquid-liquid microextraction (LD-DLLME) 和 Sweeping 檢測水中的農藥。. 關鍵字: 毛細管電泳 (CE)、微胞電動層析 (MEKC)、農藥、線上濃縮、分散性液相液相微萃取 (DLLME) 1.

(11) The use of Dispersive Liquid-Liquid Microextraction and On-line Sample Stacking Combined with Capillary Electrophoresis to Determine Pesticides in Water Advisor: Dr. Fu-Ken Liu Department of Applied Chemistry National University of Kaohsiung Student: Man-Nung Chen Department of Applied Chemistry National University of Kaohsiung. ABSTRACT Pesticides are the pollutants and high persistence in the environment. Their residues present in fruits and vegetables may represent a serious hazard to human health. Analysis of pesticides is a difficult task for food safety since frequently they are found in low concentrations with complex matrices such as soils, foods, etc. Capillary electrophoresis (CE) is increasingly popular in environmental field due to its high separation efficiency, speed of analysis, low consumption of sample and reagent and simplicity, however, with inadequate limit of detections (LODs) . To overcome detection problems, one is to use more sensitive detection systems (i.e., mass spectrometry), the other one is to develop the preconcentration procedures based on on-line stacking methods or based on off-line operation procedures (solid-phase extraction, or solid-phase microextraction). The thesis is to separate nine pesticides by CE at the same time. The optimized buffer is [Borax 10 mM, SDS 60 mM, pH 9.2] with 18% (v /v) ACN. The separation time is within 13 minutes. After the combination both preconcentration procedures (LD-DLLME and Sweeping) allowed the determination of these pesticides in water samples at concentration between 0.28 to 2.3 ppb. Apparent recovery values were in the range 69.5-117%. The enhancement factors of LODs are 350 to 3407 times. The potential of the method was the first time of using Low density dispersive liquid-liquid microextraction (LD-DLLME) combined with Sweeping to determine the pesticides in the water samples.. Keywords: Capillary electrophoresis (CE), micellar electrokinetic capillary chromatography (MEKC), pesticides, on-line stacking, dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) 2.

(12) 第一章. 前言. 世界人口持續增加，為提高農產品的產率，使之達最高的產量，使用農藥是必要的。現代農業生產的過程中常遭受昆蟲及病菌的危害，使得收成減少或是無法收成，因此藉由噴灑農藥對於農作物的產率有很大的幫助。但是農藥的大量使用，破壞地球上的水文系統，農藥可能會降解或是殘留在環境水質當中，而危害到人體的健康，各個國家訂定法規嚴格監控農藥在農作物及食品上的最大殘留量；所以需要發展出高選擇性且高靈敏性的分析技巧檢測農藥，以控制、掌握良好的環境和食品。毛細管電泳是近年來極具多種功能、有潛力且能偵測多種廣泛分析物的分析儀器。具有樣品需求量小、分析時間短、高解析度和高再現性等優點，廣泛應用在生化、醫學、環境的分析上。本實驗利用毛細管電泳搭配紫外光-可見光二極陣列檢測器，同時分離九種常見的農藥。由於毛細管電泳進樣量少、偵測窗口短，使得偵測靈敏度低。為了提升偵測靈敏度，必須使用線上樣品堆積或是其他離線的樣品前處理。在一般操作毛細電泳時，只有帶電分析物能以毛細管區帶電泳分析，中性分析物必須用微胞電動層析才能分離出來。因此，操作微胞電動層析，分離中性分析物，即在緩衝溶液中加入離子性的界面活性劑，使界面活性劑的濃度達到臨界微胞濃度 (critical micellar concentration, CMC)，形成微胞，依分析物在微胞和水相緩衝溶液的交互作用不同，產生不同的泳動速率達到可分離的效果。本實驗中首次利用微胞電動層析技巧分離這些農藥，並且結合 sweeping 線上濃縮技巧及低密度分散性液相液相微萃取 (LD-DLLME)，結果顯示再現性良好、不錯的萃取效率及大幅提高偵測靈 3.

(13) 敏度。. 4.

(14) 第二章. 文獻回顧. 2.1 農藥由於化學農藥便宜、方便施用及藥效顯著，因此最常被應用來防治植物病蟲害。近幾年大量使用農藥以提升農作物的生產率，使得農藥的殘留物殘留大自然中，甚至超過法規的毒害濃度，危害到人體健康，或 1. 是其他動物的生存。農藥係指用於防除農林作物或其產物產之病蟲鼠害、雜草，或用於調節農作物生長，或用於調節有益昆蟲生長者。大部分農藥由於作用為殺蟲、殺菌或除草等特性，或多或少對人體、動物或環境造成某種程度上的風險或危害。農藥依來源大概分成化學農藥和生物農藥，化學農藥以化學方法製成;而生物性農藥來源是生物和其衍生物。農藥大致分成殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、殺螨劑、植物生長調節劑、殺鼠劑等等2。傳統上氣相層析儀3和高效能液相層析儀4對農藥的檢測已很完善，但缺點是花費成本高、有毒溶液用量大、分離時間長且有時候需要在分離過程中加入複雜的分離梯度；因此，毛細管電泳儀在農作物的檢測上越來越受歡迎。Rodriguez-Delgado等人所分析的農藥包含本實驗中的九種農藥，他們結合固相萃取和線上濃縮技巧檢測水質中的農藥。偵測靈敏度在33.6-216 ppb5。以PDMS/DVB材質的固相微萃取法，檢測自製玫瑰酒中相同的農藥，線性範圍在0.18-6 ppb，偵測極限在0.04-0.929 ppb6。利用固相萃取結合線上濃縮檢測番茄當中的農藥，線性範圍在0.5-2.5 mg/kg，偵測極限在0.134-0.476 mg/kg7。利用固相微萃取結合線上濃縮方式分析 5.

(15) 自製酒中的農藥，偵測極限在0.054-0.113 ppb8。Fang等人利用sweeping 濃縮技巧結合微胞電動層析CE，檢測穀類及蔬菜中triazine除草劑。偵測靈敏度提高 479-610 倍，偵測極限在 0.02-0.04 ng/g ，平均回收率在 82.8-96.8%9。表2.1~2.2所示為本實驗上所用的農藥樣品特性與結構，12種農藥中， 10種是殺菌劑，2種是殺蟲劑 (pirimicarb和tetradifon)，分為10個家族；隨著時間演變，殺菌劑由多作用點、保護性、預防性的藥劑種類，在60年代以後，演變成單一作用點、選擇性高、系統性的農藥，農藥開發朝向單一性作用、劑量低、高毒性等方向發展。因為此類農藥的低劑量、高毒性作用下，受到植物生產者的歡迎和使用，但因為此類農藥的用效機制具專一性，產生的抗藥性逐漸成為農藥使用的問題2。. 6.

(16) 表 2.1 實驗用的 12 種農藥特性和最大殘留值 pKa8. HVb. Mr. Kow8. (g/mole)a. Log P. Carbendazim. 191.2. 1.38-1.49. 4.2. Benzimidazole. 100. Pirimicarb. 238.3. 1.70. 4.44. Carbamate. 5. Metalaxyl. 199.3. 1.75. <<0. Acylalanine. 100. Pyrimethanil. 279.3. 2.84. 3.52. Anilinopyrimi. -. Nuarimol. 314.7. 3.18. -. Pyrimidine. -. Procymidon. 284.1. 3.14. -. Dicarboximide. -. Azoxystrobin. 352.5. 2.50. -. Methoxyacrylate. 5000. Fenarimol. 331.2. 4.25. -. Pyrimidine. 30. Tebufenozide. 403.4. 3.69. -. Diacylhydrazine. 200. Benalaxyl. 325.4. 3.54. -. Acylalanine. -. Penconazol. 284.2. 3.72. 1.51. Triazole. -. Tetradifon. 356.1. 4.61. -. Organo-sulurus. -. Pesticide. a. 分子量. b. 飲用水當中農藥的健康值10. family. (ppb). 7.

(17) 表 2.2 實驗用 12 種農藥的分子結構. Pirimicarb. Pyrimethanil. Tebufenozide. Fenarimol. Nuarimol. Carbendazim. Benalaxyl. Procymidone. Metalaxyl. Azoxystrobin. Penconazol. Tetradifon. 2.2 毛細管電泳 2.2.1 毛細管電泳的歷史 1937年，瑞典科學家Tiselius11發展出如圖 2.1，所示的儀器架構，以移動介面電泳法 (moving boundary eletrophoresis)成功的分離蛋白質。因為Tiselius的貢獻，於是在1948年獲得諾貝爾獎。毛細管電泳的應用最早是在1967年由Hjerten12提出利用直徑3 mm的 8.

(18) 石英窄管，以甲基纖維素修飾管壁，將石英管在慢速地旋轉下分離核酸、病毒、無機離子蛋白質，是現今毛細管電泳的雛形。傳統的電泳雖然應用廣泛，但分離時間長、效率低、和非自動化是其缺點。取代傳統電泳的方式是將電泳分離移至毛細管內發生，1974年，Virtenen13 使用內徑 200-500 μm的毛細管，雖然可有效抑制焦耳熱降低，但分離電壓過低，使得分離效率差。1981年，Jorgenson和Lukacs14使用內徑75 μm的熔融態二氧化矽的毛細管分離胺基酸，並使用靈敏度高的雷射誘導螢光偵測，理論板超過40萬。因為毛細管的表面積和體積的比值大，具有抗對流作用和減少焦耳熱發生，散熱更快，短時間內得極佳分離效率，改善傳統電泳缺點。實驗快速、訊號形狀對稱和分離效果好，證實可利用毛細管電泳進行微量且高效的分析，在毛細管電泳的發展中是一大躍進。 1983 年，Hjerten15提出毛細管凝膠電泳法 (Capillary Gel Electrophoresis, CGE)。 1984 年， Terabe16 提出微胞電動層析法. (Micellar electrokinectic. chromatography, MEKC)。在緩衝溶液中添加界面活性劑，使界面活性劑達到微胞臨界濃度會形成微胞。利用微胞帶正電或負電的特性，以及分析物跟微胞和緩衝溶液間不同的親水性或是親脂性，因而可分離不帶電的中性分子，例如芳香環化合物等。1985年，Hjerten17用毛細管電泳作傳統電泳等電聚焦法，藉由兩性物質的等電點不同而分離，發展出毛系管等電聚焦法 (Capillary isoelectric focusing, CIEF)。毛細管電泳另一個要解決的問題就是偵測靈敏度，其係因此技巧的樣品用量一般只有10-9升和偵測窗口短而造成。爾後陸續發展多種解決方法包括線上濃縮和離線濃縮 (例如固相萃取或液相-液相萃取等)，可以提 9.

(19) 升此技巧的偵測極限18,19；偵測器的發展也從UV偵測器發展到以電化學20 的方式偵測，或是與靈敏度極高的質譜偵測21。毛細管電泳比起高效能液相層析儀，具有較短的分析時間與高的解析度，但一般只有帶電或是離子性樣品才能被毛細管區帶電泳法 (Capillary Zone Electrophoresis, CZE)分析，然而，電動層析的發展已經能解決此問題。電動層析能同時分析帶電和中性的分析物，在多種電動層析的方法中，微胞電動層析是最受歡迎的方法22。. 圖 2.1 Tiselius 的移動介面法構造圖 11. 2.2.2. 毛細管電泳基本原理其分離原理是在外加高電場下，在毛細管內形成電滲流. (electroosmotic flow, EOF) 而帶動整體分析物前進；也依各種帶電荷離子性樣品在電壓下，受到不同的吸引或排斥力量移動。詳細的樣品分離原理詳述如下。. 10.

(20) 2.2.3. 電滲流 (Electroosmotic flow). EOF是依毛細管內壁的表面存在有電雙層時上施加一高壓電場而得。在pH > 3下，石英毛細管表面會因-SiOH解離而帶負電，如圖2.2所示，為了維持電中性，緩衝溶液中的陽離子會靠近毛細管表面聚集，毛細管表面的負電荷與水溶液中的正電荷之間形成電雙層，其電位差稱為 Zeta potential。由Stern的電雙層理論可知此電雙層分兩層:第一層是穩固層 (Stern layer)，係因毛細管管壁上的silanol group吸引緩衝溶液中的正電物質，而排列成緊密不易滑動的離子層；第二層是靠近毛細管的水合陽離子形成擴散在穩固層外，且吸附強度比較低的一層，稱為擴散層 (diffusion layer) (圖2.3)。因為毛細管兩端加壓時，管內的擴散層集體往陰極端前進而有EOF23。(圖2.4) EOF的大小可以用速度或淌度表示如下:. VEOF = (εζ /η)E. (2.1). 或 μ. εζ η. VEOF = EOF速度 μ. = EOF的淌度. ζ = zeta potential ε = 溶液的介電常數 E = 施加電壓 η = 黏度 11. (2.2).

(21) Zeta potential是依毛細管表面帶電荷而定，跟pH值有關，牽動EOF 的強弱。EOF大小隨pH值增大而變大，在高pH值下，其速度比任何樣品的電泳流速率都還要快，使得分析物朝同一方向移動，未分離完全即快速到達偵測窗口端。相反地，低pH值時帶負電的毛細管壁會藉由庫倫作用力吸附帶正電的分析物。基本上控制EOF的大小是藉由管壁帶電荷情況或緩衝溶液的黏度。公式 (2.2)顯示，藉由降低電場，EOF速度會變小，但藉由此法可能會造成分離效能和解析度變差；而以調整緩衝溶液的pH值是改變EOF和分析物淌度的最佳且簡單的方式。在毛細管中的電滲流特點是沿著管切面前進的連續平面流，如圖2.5 (a)顯示，和圖2.5 (b)壓力產生的拋物線流比較，平面流在樣品在分離過程中比較不會擴散。. 2.2.4. 電泳流速 (Electrophoretic flow rate). 帶電荷化合物的泳動速度跟電場強度成正比，而電場強度大小取決於電壓大小和施加電場的長度。EOF和分析物淌度性質的優化是影響成功分離結果的關鍵因素。以公式 (2.3)表示電泳流速與電場強度、毛細管長度及電泳遷移速率的關係 :. Vep = μepE = μepV / L Vep = 帶電荷樣品的泳動速度 (m / s) μep = 電泳遷移速率 (m / Vs) E = 電場強度 (V / m) 12. (2.3).

(22) V = 施加的電壓 (V) L = 施加電場的長度 (m). 圖 2.2 以鹼性物質活化後的毛細管內部構造 23. 圖 2.3 水合陽離子靠近管壁形成電雙層的構造 23. 圖 2.4 施加外加電壓時，EOF 往陰極泳動的毛細管內情況 23 13.

(23) 圖 2.5 (a) 毛細管電泳方式的平板流(上)及層析圖(下) (b) 流體動力方式的拋物線流(上)及層析圖(下) 23. 2.2.5. 操作模式. 毛細管電泳的多功能性而衍生出多種操作方式，運用不同的原理、不同的操作模式，可達到不一樣的效果，CE基本操作方式大致分為: 1. 毛細管區帶電泳法 (Capillary Zone Electrophoresis, CZE) 。 2. 微胞電動毛細管層析法 (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC)。 3. 毛細管凝膠電泳法 (Capillary Gel Electrophoresis, CGE) 。 4. 毛細管等電聚焦法 (Capillary Isoelectric Focusing, CIEF) 。 5. 毛細管等速電泳法 (Capillary Isotachophoresis, CITP) 。. 2.2.5.1 毛細管區帶電泳法 (Capillary Zone Electrophoresis, CZE) CZE是最簡單、應用最廣泛、發展最成熟的一種分離模式。毛細管 14.

(24) 只要充滿緩衝溶液即可，分離原理依樣品遷移速度的不同在不同的特定區間分離；在此模式中，陰陽離子是依靠EOF分離，不同的緩衝溶液組成有不同的分離效果；對於中性分子無法分離只能跟EOF一起移動。實驗上可以透過改變緩衝溶液組成、pH值、溫度、離子強度、黏度等獲得最佳的分離條件。應用範圍廣泛包含胺基酸、胜肽、離子和大範圍的結構異構物等等24。圖 2.6為CZE的基本原理，Vep是電泳流而Veo是電滲流。. 圖 2.6 CZE 基本原理 25. 2.2.5.2 微胞電動層析法 (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC or MEKC) MEKC同時兼俱有電泳和層析的特點，由Terabe在1984年提出，在 CE應用中極為廣泛，能同時分離中性分析物和帶電離子的電泳技術16。在緩衝溶液中添加大量界面活性劑，當濃度達臨界微胞濃度 (例如SDS 在8.2 mM達臨界微胞濃度) 時形成微胞。如圖 2.7所示，呈球狀的微胞內部是界面活性劑的疏水端與緩衝溶液不互溶，帶電荷端則朝向緩衝溶液，根據中性樣品跟微胞間的作用力不同而分離。使用不同的界面活性劑與分析物的選擇性也會改變，就像改變液相層析管柱的靜相的相同效果。有機溶劑的添加可減緩溶質跟微胞間的疏水性作用力，也可改變溶質選 15.

(25) 擇性。. 圖 2.7 MEKC 基本原理 22. 2.2.5.3 毛細管膠體電泳法 (Capillary Gel Electrophoresis, CGE) CGE是依分子尺寸大小的分離模式，已經被用在生物大分子上，例如: 蛋白質和核甘酸等等26。具有相同質荷比分析物在有分子篩作用的聚合物內進行分離，且EOF必須越小越好，才能降低溶質分散的情形。CGE 因為跟傳統平板式的凝膠電泳有相同分離機制，所以被拿來比較。CGE 相較於傳統平板式的凝膠電泳有下面幾個優點: 1.可施加比一般大10-100 倍的電壓而不會有焦耳熱現象，2.直接線上偵測，3.儀器自動化。在CGE 用的凝膠材質需具備一些性質，例如與分析物的互溶性，適合分析物的孔洞大小和熱穩定性，才能當作適當的電泳分離介質。凝膠孔洞大小是由不同濃度的凝膠而形成不一樣的孔洞大小，適合不同分子量範圍的分析物。但它不能用在中性分子的分析上，因為EOF的現象被凝膠基質抑制，而無法產生淨移動25。圖 2.8為CGE基本原理。. 16.

(26) 圖 2.8 CGE 基本原理 15. 2.2.5.4 毛細管等電聚焦法 (Capillary Isoelectric Focusing, CIEF) CIEF主要是針對兩性化合物分離的一種模式，同時帶有正電荷和負電荷的稱為兩性化合物，也稱做兩性離子(Zwitterion)，在一特定pH值下，有相同濃度的陰陽離子，淨電荷為零，所以在電場中不會移動，因此分析物無法被分離，此時pH稱為該物質的等電點。如圖 2.9所示，不同的兩性化合物有不同的等電點，藉由pH差異達堆積效果，再跟隨EOF抵達偵測窗口。在1985年，由Hjerten發展此技巧，常用來分離肽和蛋白質在等電點的基礎上，並已經可用來分離等電點差小於0.005倍的蛋白質17。. 圖 2.9 CIEF 的基本原理 27. 2.2.5.5 毛細管等速電泳法 (Capillary Isotachophoresis, CITP) 等速電泳法是一個“移動邊界”的電泳技術，結合兩種緩衝溶液系 17.

(27) 統使分析物在不同區域但等速的環境中25。樣品區域像三明治的結構，前端為帶領角色的緩衝溶液，後端為牽制角色的緩衝溶液。以陰離子的分析來說，緩衝溶液需含有陰離子性物質且具泳動比分析物更好，帶動分析物前進；抑制分析物則需要含陰離子性物質且泳動較差的緩衝溶液。每個樣品區域等速是因為電場在每個區域不斷的變化，而形成動態平衡，使得區域間的邊界很狹窄，如果分析物因為短暫的速度差跑到隔壁區域，也能瞬間回到原本的區域。CITP的另一個特點是每個區域的濃度相等，樣品區受到帶領角色的緩衝溶液而能達到前濃縮效果；缺點是找到一個完善pH值的兩個緩衝溶液系統很困難，且只能分離帶電性的樣品。圖 2.10為CIEF示意圖，A、B和C是分析物區帶，L和T分別為高導電和低導電的緩衝溶液區。. 圖 2.10 CITP 基本原理 25. 2.3 樣品線上濃縮由於毛細管電泳主要限制之一是偵測極限不佳，解決此限制有幾種方法，例如：將毛細管光徑增大、多次反射槽增加光徑距離、線上濃縮或萃取做樣品前處理、使用更靈敏的偵測器等28。其中，樣品濃縮上可分為分線上和離線方式，線上濃縮是濃縮完後即時分析偵測；離線濃縮則 18.

(28) 是濃縮跟分析偵測是分開進行29。其中，線上濃縮最具經濟效率，因為此技巧不用改變任何儀器的架構下即可進行。以下將介紹幾種常出現在文獻中的線上濃縮技巧。. 2.3.1. 正向堆積模式 (Normal Stacking Mode, NSM). NSM樣品濃縮是因為樣品區間和緩衝溶液之間的導電度差異誘導樣品區與緩衝溶液區之間具移動速度上的差異，因此產生濃縮的效果。研究上可藉由調整樣品移動，使樣品在緩衝溶液的緩速區產生堆積，因此可讓樣品濃度提升。如圖 2.11所示，此法首先在毛細管中先注入導電度較高的緩衝溶液，然後樣品溶於較低導電度的樣品基質中，在外加電場下，樣品在緩衝溶液的界面中泳動速度較慢。在微胞電層析實驗中，在正電壓下，帶負電的微胞攜帶樣品快速往正端移動至受到緩衝溶液的區帶抵制而變慢，因為速度差，樣品堆積在此邊界，達到濃縮的效果。因此，在NSM的濃縮機制中，濃縮效果的好壞與樣品基質和緩衝溶液間的導電度差有很大的關係30。. 圖 2.11 NSM 的原理 31 19.

(29) 2.3.2. 反向電極極性堆積模式 (Reversed Electrode Polarity Stacking Mode, REPSM). REPSM是一種效率高的線上濃縮方式之一，操作方法如圖 2.12所示。樣品溶於導電度低的樣品基質中 (有時不需要樣品調整導電度)，預先在毛細管通入緩衝溶液，再導入大量樣品，接著以反向電位操作，讓樣品基質在樣品堆積後從陽極端排除，直到電流變成原來的97-99%時，把電壓反轉成正電位做一般的樣品分離。電流控制的好壞會影響實驗的再現性，而樣品基質的排除可減少擴散效應32。. 圖 2.12 REPSM 的原理 32. 2.3.3. 反向遷移微胞堆積 (Stacking with Reverse Migration Micelles, SRMM). SRMM是在酸性含微胞的緩衝溶液下進行，在酸性下EOF很小；樣品則溶於水或是低導電度的溶液中。如圖 2.13所示，先在毛細管中導入緩衝溶液，再從陰極端導入大量樣品，在施加負電位下，樣品基質因很 20.

(30) 小的EOF會緩慢從陽極端排除，接著進行樣品的分離33。. 圖 2.13 SRMM 的原理 33. 2.3.4. 場強放大樣品注射 (Field-Enhanced Sample Injection, FESI). 此技巧是在充滿帶中性緩衝溶液的毛細管中注射一段水，水用來提升電場最終得到有效的堆積能力；如圖 2.14所示，樣品溶於低電導的中性微胞溶液中，再以反向電位下，電動進樣樣品。樣品進入到毛細管中與微胞作用前進，遇到水層時，樣品的電泳流速度會大於電滲流速度，當電流到達原本的97-99%時，電位轉向，水層排出，然後以正電位做分離和偵測34。. 21.

(31) 圖 2.14 FESI的原理34. 2.3.5. 反向遷移微胞之場強放大樣品注射 (Field-Enhanced Sample Injection with Reverse Migration Micells, FESI-RMM). 如圖 2.15所示，FESI-RMM是在充滿帶酸性的緩衝溶液毛細管中，以壓力注射一段水；樣品溶於低電導的酸性微胞溶液中，以反向電位注射樣品，當電流在原本的70-90%時，把樣品瓶換成緩衝溶液瓶，接著在反電位下進行樣品分離。跟SRMM一樣，不需轉換電位35。. 22.

(32) 圖 2.15 FESI-RMM 的原理 35. 2.3.6. 反向遷移微胞與水的堆積 (Stacking with Reverse Migration Micells and Water Plug, SRW). 如圖 2.16所示，樣品溶於比緩衝溶液導電度還低的溶液中，並在基質中添加高於臨界微胞濃度的界面活性劑，提升溶質的溶解度。堆積的機制是因為樣品的電泳流在達堆積邊界時，劇烈的速度改變；再以負電位分離，各個樣品的集中堆積和移除樣品基質、水是同時發生36。. 23.

(33) 圖 2.16 SRW 的原理 36. 2.3.7. 清掃堆積模式 (Sweeping). 如圖 2.17所示，Sweeping是先導入含有微胞的低pH值酸性緩衝溶液，使EOF趨近於零；樣品溶於導電度跟緩衝溶液相同但不含微胞的基質中，樣品用壓力從陰極注入，分離施予負電壓，在電場的作用下，注入端的陰離子性微胞往偵測端移動，微胞遷移碰到樣品基質時，將分析物從樣品基質的前端清掃至樣品區帶的尾端。分析物與微胞作用越強在樣品區堆積效果越好37。. 24.

(34) 圖 2.17 酸性緩衝溶液下的 Sweeping 原理 37. 2.4 離線濃縮大部分的儀器無法排除複雜基質，樣品前處理通常是必要的，其前處理步驟與分析結果之準確度及再現性有密切的關係。一般離線濃縮的方式是利用萃取的方式去除干擾樣品分析時的複雜基質，依萃取的方式不同可分為固相和液相萃取。為了分析環境中之有機汙染物，同時卻使用大量有機溶劑是受到挑剔的作法，因近年來化學分析方法朝更環保、耗費極少量的溶劑與快速的分析技術邁進。. 2.4.1 液相微萃取傳統萃取方法包括液相萃取如索氏萃取法 (Soxhlet extraction)、液相液相萃取、固相萃取 38 等均有其缺點。例如：操作複雜、花費時間長、樣品和使用大量的有機溶劑、萃取步驟十分繁雜和難達成自動化等。上述的萃取方法因涉及多步驟萃取，不但浪費分析者的時間，也易使分析物流失而造成定量分析上的誤差 39。溶劑的大量使用不僅損害人體健康 25.

(35) 及造成環境污染；然而近期發展的液相微萃取技巧相較於固相萃取和液相液相萃取法而言，具有對環境較為友好的技術 40。以下將彙整近年來所發展的液相微萃取技巧進行介紹。. 2.4.1.1 單滴微萃取 (Single drop microextraction, SDME) SDME 是在液相微萃取法中最早開發、最簡單的操作手法，液滴當收集相，代替塗覆的纖維。藉由分析物在針尖上的萃取滴和水溶液間的分配達萃取平衡。分析物從大體積水質樣品中萃取至萃取液滴中，而有高的提升因子 41。SDME 分為懸掛在針尖萃取液滴直接進入水質樣品中，稱直接單滴微萃取 (direct immersion-single drop microextraction, DI-SDME)和對於氣態分析物的頂空單滴微萃取 (head space- single drop microextraction, HS-SDME)。圖 2.18 為直接單滴微萃取的示意圖。萃取時因為被動擴散現象，目標分析物從樣品中被萃取到懸掛的萃取滴上，分析物的擴散係數影響萃取效率。它的主要優點是操作簡單、低成本和減少對環境的衝擊，並與 GC 和 LC 的注射系統是可行性的，應用在多種樣品基質上。只需要不貴的 GC 注射針、少量高純度不溶於水的溶劑和攪拌磁石。相反地，SDME 也有一些缺點包括當實驗是在高攪拌速度、長萃取時間和高溫下，萃取液滴的體積會改變，影響液滴的穩定性和分析結果的再現性。HS-SDME 是分析物從樣品中揮發到樣品上方被液滴萃取，因此可避免基質干擾。SDME 已經大量的發展應用在多種樣品分析上。Jager 等人 42 使用己烷當萃取液滴萃取水中有機磷農藥，並以氣相層析儀-電子捕捉偵測器分析結果有良好的線性關係，相對標準偏差 26.

(36) 12-28%，偵測極限在 0.25 ng mL-1。Salemi 團隊在 2013 年以震盪輔助 HS-SDME，搭配氣相層析儀-氮磷偵測器檢測土壤中的有機磷農藥。相對標準偏差在 1.4-12.7%，偵測極限在 0.1-2.0 ng mL-1 ，提升因子在 1.4-12.7 倍 43。. 圖 2. 18 DI-SDME 的示意圖 40. 2.4.1.2 中空纖維微萃取 (Hollow-fiber liquid phase microextraction, HF-LPME) 為解決 SDME 萃取液滴的不穩定性，在 1999，Pederson-Bjegaard 等人 44 提出新的液相微萃取法。分析物先被萃取到含有多孔疏水性的液態薄膜上，然後再進入充滿萃取溶液的纖維腔體中，因此萃取劑不會與待測樣品直接接觸。優最大優點是待測樣品不斷攪拌也不會造成萃取劑流失。中空纖維浸泡在不混溶的有機溶液 (萃取劑)中，使得萃取劑固定在中空纖維多孔結構中。此研究中的萃取劑 (acceptor phase)通常是 10-20 μL，在中空纖維壁上形成薄層。然後再把中空纖維放到待測樣品中，攪拌加速分析物的萃取。拋棄式的聚丙烯多孔纖維可以減少分析物殘留及 27.

(37) 有良好再現性；纖維壁上充滿孔洞可以避免萃取到大分子。HF-LPME 依相數不同分成兩相中空纖維液相微萃取和三相中空纖維液相微萃取。圖 2.19 為兩相中空纖維液相微萃取的示意圖。兩相中空纖維液相微萃取的萃取劑跟浸泡中空纖維的有機溶液是相同的，收集分析物的有機溶劑跟 GC 相容，適合疏水性分析物；相對地，三相中空纖維液相微萃取的萃取劑是另一個水相溶液，分析物從待測樣品中萃取經過中空纖維中的有機溶液薄層再進入倒水溶性的萃取劑當中，與 HPLC、CE 和原子吸收光譜儀 (AAS)相容，適合親水性分析物 45。在 2010 年，Barahona 團隊 46 以 HF-LPME 分別結合 CE 和 HPLC 檢測橘子汁中的殺菌劑，因 HPLC 萃取效率比 CE 好，所以選擇以 HPLC 作定量分析。回收率為 17.0-33.7%，相對標準偏差在 3.4-10.6%，偵測極限小於 0.1μg mL-1。Wu 等人 47 在 2014 年在中空纖維中加入石墨烯，提升對分析物的吸附能力，採用 HPLC 檢測牛奶中苯酚脲類的除草劑；線性範圍從 10.0-400 μg mL-1，偵測極限在 2.0μg mL-1。. 圖 2.19 中空纖維萃取的示意圖 41 28.

(38) 2.4.1.3 分散性液相液相微萃取 (Dispersive liquid-liquid microextraction) DLLME 是新型微量化的液相液相萃取法，在 2006 年由 Rezaee 團隊 48. 首先提出，以 GC-FID 分析水中的有機化合物。早期的 DLLME 是 1970. 年代 Hinze 等人 49 發展的雲點萃取法 (Cloud-point extraction, CPE)衍生而成。水溶液、與水不互溶的萃取劑和與水、萃取劑互溶的分散劑組成三相液相系統，藉由分析物在樣品和萃取間平衡常數的不同達萃取效果。 DLLME 需要萃取劑和分散劑；萃取劑的選擇是不溶於水但與分散劑混溶; 分散劑同時和萃取劑、水溶液混溶。常用的萃取劑 (密度>1)有氯仿、四氯乙烯、1,2-二溴乙烷、二氯甲烷和四氯化碳等或非鹵化溶劑，如二硫化碳；分散劑常用丙酮、甲醇、乙腈和乙醇。將萃取劑和分散劑混合快速注入待測樣品中形成雲狀現象，形成大量萃取劑液滴和待測樣品產生大表接觸面積，很快達成萃取平衡，利用離心將萃取層和水層分開，取出含有分析物的下層，所得含分析物的萃取層做後續處理或直接以儀器分析。提升因子和萃取效率的計算方式如下: F = Csed/Co R%= (Csed Vsed)/( Co Vaq) x 100 F：提升因子；Csed：最終濃度；Co: 原始濃度； Vsed：最終體積；Vaq：樣品溶液體積；R%：萃取效能 DLLME 的操作流程如圖 2.20: (A) 將萃取劑和分散劑的混合液快速打入預分析樣品中。 29.

(39) (B) 萃取劑、分散劑和樣品溶液間形成雲狀現象。 (C) 離心後，萃取層在底層。 (D) 取出底層進儀器分析。. 圖 2. 20 DLLME 的操作流程 50 DLLME 具有操作簡單、高提升因子、高萃取效率、萃取時間短、低成本和有機溶劑消耗量少的優點。其中萃取效率受萃取劑種類、分散劑種類、萃取劑體積和分散劑體積影響大。與 SDME 和 HF-LPME 比較， DLLME 萃取時間大大縮短。DLLME 結合 GC、HPLC 和 AAS 已被廣泛應用於環境和食品分析上。例如 Zhou51 的團隊以 DLLME 搭配 HPLC，分析水質當中的苯甲酰脲 (Benzoylurea, BU)類殺蟲劑。線性範圍在 1.0-70μg L-1 ，偵測極限在 0.24-0.82μg L-1，相對標準偏差小於 6.5%。相對於 GC 和 HPLC，DLLME 與 CE 的結合相較少很多。 Rodriguez-Delgado52 等人在 2010 年首次將 DLLME 結合無水毛細管電泳紫外光光譜儀 (NACE-UV)，檢測水樣品中的八種 fluoroquinolone 類的抗生素；其研究使用氯仿當萃取劑，ACN 當分散劑，偵測極限在 1.63-63.3 μg L-1，回收率 89-108%。2010 年，Wang 團隊 53 第一次結合 DLLME 和 30.

(40) sweeping 的濃縮技巧，分析蘋果中六種氨基甲酸脂 (carbamate)農藥；檢量線範圍各為 6-500 ng g-1 和 9-500 ng g-1，偵測極限在 2.0-3.0 ng g-1，回收率 85.4-113%。Wang 團隊也利用 DLLME 結合 sweeping 檢測煙鹼類 (neonicotinoid)殺蟲劑，偵測靈敏度提升 4000-10000 倍 54；另外，也用相同手法檢測磺醯脲 (sulfonylurea)類除草劑 55。Gamiz-Gracia 團隊 56 利用 DLLME 結合 sweeping 的線上濃縮技巧，檢測果汁中的氨基甲酸脂農藥。再現性小於 9%，回收率範圍在 78-105%，偵測靈敏度在 1-7 μg L-1。 (一) 低密度分散性液相液相微萃取 (Low density dispersive liquid-liquid microextraction, LD-DLLME) 傳統 DLLME 使用含鹵素的高密度萃取劑對環境及人體嚴重危害， LD-DLLME 萃取劑替換成低毒性的非鹵素類萃取劑，例如：己烷、癸醇和甲苯等。2009 年，Farajzadeh 等人 57 提出 LD-DLLME，特製一尖端開口的樣品容器，以利萃取層的提取，環己烷當萃取劑，丙酮當分散劑，以 GC-FID 檢測水中的有機磷農藥，回收率在 80-91%，提升因子 110-145 倍。萃取過程跟傳統 DLLME 相似，如圖 2.21 所示，萃取劑和分散劑混合後快速打入待測樣品中，形成雲狀後，再以離心分層，取出上層含分析物地萃取層做後續的分析。除了使用離心分層，分層的方法也可使用破乳劑 58。後續衍生出外力輔助的 DLLME: 超聲波震盪 59,60、空氣輔助 61,62,63. 、震盪 64 等，也特製出多種提取低密度萃取劑的樣品容器 65，更是. 發展出自動化的 DLLME 裝置 66。. 31.

(41) 圖 2.21 LD-DLLME 的流程示意圖：(a)注入萃取劑和分散劑前(b)注入萃取劑和分散劑後(c)離心後(d)從底部打入水使得上層液面提升至窄管口(e) 將上層液取出 57 (二) 離子液體搭配分散性液相液相微萃取 (Ionic liquid-dispersive liquid-liquid microextraction, IL-DLLME) 離子液體是一種綠色化學溶劑，由有機陽離子與有機或無機陰離子所組成的有機鹽類；如圖 2.22 所示，為一般常見離子液體的陽離子及陰離子結構。在一般的情況下不易揮發而使得實驗再現性良好、廣泛的黏度範圍、低毒性、低蒸氣壓、大多非揮發性、高熱穩定性和水混溶。圖 2.23 為一般常見離子液體的物理性質。將離子液體當萃取劑，被萃取物稀釋後就可以進高效能液相層析儀分析，室溫下利用離子液體取代有機溶劑近幾年在化學分析中備受矚目。 32.

(42) Liu 團隊 67 在 2009 年以溫控 IL-DLLME 結合 HPLC-DAD 檢測水樣品中四種雜環類殺蟲劑；提升因子 209-276 倍，所得回收率是 79-110%，相對標準偏差 4.5-10.7%，偵測極限在 0.53-1.28 μg L-1。Yang 等人 68 利用 IL-DLLME 結合毛細管電泳對尿液中的黃麻素和 K 他命進行分析；使用[C4MIM][PF6]為萃取劑，黃麻素和 K 他命的提升因子分別為 28.8 和 16.9，偵測靈敏度在 0.015 和 0.03 μg mL-1，再現性小於 6.8%，回收率在 79-90%。在 2012 年 Zhou 等人 69 將酚類化合物以 IL-DLLME 萃取後再利用二次萃取將分析物與離子液體分開，最後以 CE 檢測。. 圖 2.22 常見離子液體的陰陽離子結構 70. 33.

(43) 表 2.3 常見離子液體的物理性質 41. 34.

(44) 第三章. 實驗步驟與樣品分析. 3.1 實驗藥品與儀器設備 3.1.1. 實驗藥品表 3.1 本實驗使用的藥品廠牌. 純度. 124.1. TEDIA. 99.96. Na2B4O7. 201.2. Merck. ≧98. C12H25NaO4S. 288.4. TCI. -. NaOH. 40.0. Merck. 1N. Acetonitrile. ACN. 41.1. J.T.Baker. 99.9. Hydroxy chloride. HCl. 37.5. Riedel-deHaen. 37. Methanol. MeOH. 32.0. J.T.Baker. HPLC. Chemicals and. 分子式. 分子量 (g / mole). reagents Tris. (HOCH2)3CN. (hydroxymethyl). H2. aminomethane Di-Sodium tetraborate Sodium Dodecyl Sulfate Sodium hydroxide. grade 2-Propanol. C3H8O. 60.1. MACRON. 99.5. Toluene. C6H5CH3. 92.1. J. T. Baker. 99.95. 1-Octanol. CH3(CH2)7OH. 130.2. J. T. Baker. 99. 35.

(45) 1-Decanol. C10H22O. 158.3. Alfa Aesar. > 98. Acetone. CH3COCH3. 58.1. ECHO. 99.5. Testosterone. C19H28O2. 288.4. TCI. GR. Medroxyprogeste. C22H32O3. 344.5. TCI. GR. Androstenedione. C19H26O2. 286.4. TCI. GR. Progesterone. C21H30O2. 314.5. TCI. GR. rone. 表 3.2 農藥標準品純度. Peak 藥品名. 分子量. 廠牌. assignment. (%). 1. Carbendazim. 191.2. Fluka. 99.2. 2. Pirimicarb. 238.3. Riedel-deHaen. 90.0. 3. Metalaxyl. 279.3. Riedel-deHaen. 99.9. 4. Pyrimethanil. 199.3. Fluka. 99.6. 5. Nuarimol. 314.7. Riedel-deHaen. 99.9. 6. Procymidon. 284.1. Riedel-deHaen. 99.9. 7. Azoxystrobin. 403.4. Fluka. 99.9. 8. Fenarimol. 331.2. Riedel-deHaen. 99.9. 9. Tebufenozid. 352.5. Fluka. 99.4. 10. Benalaxyl. 325.4. Riedel-deHaen. 99.9. 11. Penconazol. 284.2. Riedel-deHaen. 99.9. 36.

(46) 12. 3.1.2. Tetradifon. 356.1. Riedel-deHaen. 99.5. 儀器設備. 1. 毛細管電泳儀 : Agilent Capillary Electrophoresis G 1600/Beckman Coulter MDQ 2. 毛細管柱 : Polymicro TECHNOLOGIES，熔融態的二氧化矽 (fused silica)，外層塗覆聚醯亞胺 (polyimide) 3. 紫外燈光源: Agilent Technologies / Beckman Coulter 4. 酸鹼測定儀 : EZDO / PL-500 5. 超音波震盪器 : BRANSON / 3510 6. 去離子水製造機 : Thermo Scientific / Barnstead D7401 7. 電子天秤 : METTLER TOLEDO / AB204-s/FACT 8. 導電度計 : Thermo Orion 145 A + 9. 吸量管 : Transferpipette Brand，100 / 1000 / 5000 μL 10. 離心機: Beckman Coulter / Avanti J-E. 3.2 實驗步驟 3.2.1. 農藥分析. 3.2.1.1 標準溶液製備 (a) 標準樣品製備將Pirimicarb、Pyrimethanil、Metalaxyl、Procymidon 、Nuarimol 、 Tebufenozide、Fenarimol、Azoxystrobin、Benalaxyl、 Penconazol各取0.010 37.

(47) 克至10毫升的定量瓶中而Carbendazim和Tetradifon各取0.0025 g至10毫升的定量瓶中，以4:1 (v/v) 的甲醇和水溶解至刻線，分別配成1000 ppm和 250 ppm的母液，冷藏在4°C下，之後以此稀釋成所需的樣品濃度。 (b) 內標物製備取Androstenedione標準品0.010克至10毫升的定量瓶中，溶於4:1 (v/v) 的甲醇和水中，配成1000 ppm的母液，放置在常溫下，以此稀釋所需的樣品濃度。 (c) Tris儲備緩衝溶液取1.240克Tris至100毫升的定量瓶中，加DI water至刻線，成100 mM。 (d) Borate儲備緩衝溶液取2.010克Borate至100毫升的定量瓶中，加DI water至刻線，成100 mM。 (e) SDS儲備液取5.767克SDS至100毫升的定量瓶中，加DI water至刻線，成200 mM。. 3.2.1.2 緩衝溶液的製備 (1) Tris的緩衝溶液: 取2 mL的100 mM Tris溶液、2.5 mL的200 mM SDS溶液與5.5 mL的 DI water，均勻混合後，以1 M的HCl將pH值調整在8.0，再取出1.7 mL的上述水溶液，最後加入適當的乙腈，配成含17%乙腈的10毫升緩衝溶液。 38.

(48) (2) Tris緩衝溶液中添加不同有機修飾劑取2 mL的100 mM Tris溶液、2.5 mL的200 mM SDS溶液與5.5 mL的 DI water，均勻混合後，以1 M的HCl 將pH值調整在8.0，取出上述水溶液1.2 mL再加適當的甲醇，成為12%甲醇或取出上述水溶液0.8 mL再加適當的異丙醇，成為8%異丙醇的緩衝溶液。 (3) 不同Borax濃度的緩衝溶液: 各取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL的100 mM Na2B4O7 溶液至25 mL的樣品瓶中，再各加入1.25 mL的200 mM SDS溶液，最後以 DI water達10 mL的體積量; 均勻混合後，以0.1 M或1 M的HCl 將pH值調整在9.2，配成含SDS 25 mM，各10、20、30、40、50、60、70 mM的硼酸鹽緩衝溶液。 (4) 不同SDS濃度的緩衝溶液: 各取0.5 mL、21 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL、3.5 mL的200 mM SDS溶液至25 mL的樣品瓶中，再各加入1 mL的100 mM Na2B4O7溶液，最後以DI water達10 mL的體積量; 均勻混合後，以0.1 M或1 M的HCl 將pH 值調整在9.2，配成含10、20、30、40、50、60、70 mM 的SDS，Na2B4O7 10 mM的硼酸鹽緩衝溶液。 (5) Borax緩衝溶液取1 mL 100 mM Na2B4O7溶液至25 mL的樣品瓶中，再各加入2.5 mL 的200 mM SDS溶液，最後以DI water達10 mL的體積量；均勻混合後，以 0.1 M或1 M的HCl 將pH值調整在9.2，再取出1.8 mL的上述水溶液，最後加入適當的乙腈，配成含18%乙腈的10毫升緩衝溶液，並且每天現配新 39.

(49) 鮮的緩衝溶液。 (6) 檢量線線性濃度的製備以 100 ppm 含 10 種農藥的混合液各取 25、50、100、200、600 μL，再各加入 50 μL 的 1000 ppm Androstenedione 內標物，最後以工作用的緩衝溶液稀釋至體積為 1 mL，最終檢量線濃度分別為 2.5、5、10、20、60 ppm。定量的計算除 Pirimicarb 以 240 nm 觀看，其它農藥皆以 214 nm 觀看。 (7) 回收率的濃度用(6)配好的10 ppm樣品，分別與5 ppm、20 ppm等體積添加成可測定回收率的濃度。. 3.2.1.3 毛細管的處理 (a) 新毛細管的前處理毛細管的材質是熔融態的二氧化矽 (fused silica)，為以防斷裂，外層塗覆聚亞醯胺 (polyimoide) 來增加其韌性，在使用前先在偵測點燒出大概2-3 mm的窗口。 (b) 新毛細管的活化尚未使用過的毛細管要先進行活化，先洗60分鐘的NaOH再洗30分鐘的DI water，使得矽醇基得以開始作用。 (c) 每次實驗前毛細管的清理在25°C下，先洗10分鐘的NaOH再洗10分鐘的DI water，最後洗實驗所需的緩衝溶液5分鐘。 40.

(50) (d) 實驗間毛細管的清理在25°C下，3分鐘的DI water→3分鐘的ACN→3分鐘的DI water→3分鐘的NaOH→3分鐘的DI water→5分鐘的緩衝溶液。 (e) 每次實驗後毛細管的清洗為確保管柱的分離再現性，實驗後須將殘留在管壁上的帶電荷物質徹底清理乾淨。在25°C下，10分鐘的ACN→15分鐘的DI water→5分鐘的空氣在945 mbar下。 (清洗管柱的時間依實驗的狀況而增加或減少). 3.2.2. 實驗操作條件. 3.2.2.1 濃縮前的優化將十種農藥分別從母液 (1000 ppm)中各取 20 μL 再加入 800 μL 緩衝溶液，配成 20 ppm 混合農藥溶液。設定好毛細管電泳的參數後，表 3.3 為優化完的參數。. 3.2.2.2 REPSM 的優化將十種農藥分別從母液 (1000 ppm) 中各取 10 μL 再加入 900 μL 甲醇水溶液 (甲醇:水=4:1)，配成體積 1 mL 的 10 ppm 混合農藥溶液。再以不同的樣品基質取 450 μL，10 ppm 的混合農藥溶液取 50 μL 配成 1 ppm 混合農藥溶液，設定好毛細管電泳的參數後，表 3.4 為優化完的參數。. 3.2.2.3 Sweeping 的優化將50 ppm混合農藥溶液取100 μL，再加入900 μL甲醇水溶液 (甲醇: 41.

(51) 水=4:1)，配成5 ppm混合農藥溶液。再以不同的樣品基質取450 μL，5 ppm 的混合農藥溶液取50 μL配成0.5 ppm混合農藥溶液，設定好毛細管電泳的參數後，表3.5為優化完的參數。以內標法進行定量評估，檢量線濃度配置五個濃度點，為 0.8、2、4、 6、8 ppm 分別含內標物 (Androstenedione) 0.5 ppm。回收率計算濃度以含 0.5 ppm 內標物、2 ppm 的九種農藥混合液分別加入等體積含 0.5 ppm 內標物、0.8 ppm 和含 0.5 ppm 內標物、8 ppm 的九種農藥混合液，配成各含 0.5 ppm 內標物、1.4 ppm 的九種農藥混合液和含 0.5 ppm 內標物、5 ppm 的九種農藥混合液做回收率的評估工作。定量的計算除 Pirimicarb 以 240 nm 觀看，其它農藥皆以 214 nm 觀看。. 表 3.3 濃縮前的優化條件毛細管材質. 未塗覆的熔融矽毛細管 58.5 cm x 50 μm i.d. (偵測窗口有效長度 50. 毛細管規格 cm) 溫度. 25°C. 正電壓. +20 kV. 波長. 214 nm except for Pirimicarb at 240 nm. 緩衝溶液. [Borate 10 mM, SDS 50 mM, pH 9.2] with 18% ACN. 進樣方式. hydrodynamic. 進樣量. 50 mbar for 1.5 s. 42.

(52) 表 3.4 REPSM 的優化條件. 毛細管材質. 未塗覆的熔融矽毛細管 58.5 cm x 50 μm i.d. (偵測窗口有效長度. 毛細管規格 50 cm) 溫度. 30°C. 負電壓. -15 kV (0.5 分鐘轉正電壓). 正電壓. +20 kV. 波長. 214 nm except for Pirimicarb at 240 nm [Borate 10 mM, SDS 50 mM, pH 9.2]. 緩衝溶液 with 18% ACN 進樣方式. hydrodynamic. 進樣量. 50 mbar for 100 s. 表 3.5 Sweeping 的優化條件毛細管材質. 未塗覆的熔融矽毛細管 48.5 cm x 50 μm i.d. (偵測窗口有效長度 40. 毛細管規格 cm) 溫度. 30°C. 正電壓. +20 kV. 波長. 214 nm except for Pirimicarb at 240 nm. 緩衝溶液. [Borate 10 mM, SDS 60 mM, pH 9.2] with 18% ACN 43.

(53) 進樣方式. hydrodynamic. 進樣量. 50 mbar for 90 s. 3.2.2.4 DLLME 結合 Sweeping 將樣品經過分散性液相液相微萃取後，再以上述優化完的 Sweeping 參數進行毛細管電泳的測量。圖 3.1 是 DLLME 的整個操作流程: 萃取劑和分散劑混合後快速打入待測樣品中  形成雲狀現象  離心  取出上層 吹乾 回溶 Sweeping 的樣品基質  進行 CE 量測。優化 DLLME 的過程在 25°C 下，以 5 mL 含有九種各 20 ppb 農藥的 DI 水，離心條件 5000 rpm 5 分鐘，回溶體積 70μL，探討不同參數對萃取效率的影響。適當的萃取劑和分散劑的種類跟體積是整個 DLLME 過程中影響最大的參數，所以必須先探討及優化。將優化完的 LD-DLLME 條件導入 IL-DLLME，將萃取劑換成離子液體，如圖 3.2 流程進行實驗。. 圖 3. 1 LD-DLLME 的操作過程 44.

(54) 圖 3. 2 IL-DLLME 的操作流程. 3.2.2.5 實際樣品處理實驗中當中以飲用水、自來水和池水當實際樣品，其中取得的池水充滿懸浮物及藻類；利用 0.45 μm 孔洞大小的過濾膜過濾三次再進行 LD-DLLME。而飲用水和自來水取得後直接進行萃取。以內標法進行定量評估，檢量線濃度配置五個濃度點，為 8、20、80、 250、800 ppb 分別含內標物 10 ppb。回收率計算濃度，以含 10 ppb 內標物、30 ppb 的九種農藥混合液分別等體積加入含 10 ppb 內標物、20 ppb 的九種農藥混合液和含 10 ppb 內標物、100 ppb 的九種農藥混合液，配成各含 10 ppb 內標物、25 ppb 的九種農藥混合液和含 10 ppb 內標物、65 ppb 的九種農藥混合液做回收率的評估工作。。定量的計算除 Pirimicarb 以 240 nm 觀看，其它農藥皆以 214 nm 觀看。. 45.

(55) 第四章. 結果與討論. 4.1 偵測波長的選擇實驗上使用的毛細管電泳偵測器，是光二極陣列偵測器 (Photo Diode Array Detector, DAD)，觀測波長從 190-600 nm。在樣品分析前，首先要知道分析物最大吸收波長在哪個波段，由圖 4.1 可知，除了 Pirimicarb (204-210 nm 和 240-250 nm)和 Pyrimethanil (204-214 nm 和 265-275 nm)有兩個波段，其它八種樣品皆在 204-210 nm 有最大吸收。因此，本實驗上的波長選定 Pirimicarb 在 240 nm 觀看，其它在 214 nm 觀看。. Absorbance. 1 0.9. Pirimicarb. 0.8. Pyrimethanil. 0.7. Metalaxyl. 0.6. Procymidone. 0.5. Nuarimol. 0.4. Tebufenozide. 0.3 0.2. Fenarimol. 0.1. Azoxystrobin Benalaxyl. 0 200. 220. 240. 260. 280. 300. Wavelength (nm) 圖 4.1 十種農藥的 UV 吸收光譜. 46. Penconazol.

(56) 4.2 毛細管區帶電泳分別以 Tris 10 mM 到 100 mM，pH 值在 8.5 的緩衝溶液，實驗結果得到層析圖上只看到 EOF 出現，表示分析物是不帶電荷，跟隨 EOF 通過偵測器。必因此須藉由微胞電洞層析進行樣品的分離，並提高選擇性。. 4.3 微胞電動層析微胞電動層析是在緩衝溶液中添加界面活性劑，提高分析物的選擇性，因為界面活性劑的臨界微胞濃度 (CMC)會依照溶液離子強度、溶液 pH 值、碳氫鏈長度、溫度等條件而不同。本實驗中以不同的緩衝溶液系統及組成、緩衝液 pH 值、緩衝溶液濃度、界面活性劑濃度做探討; 另外也探討解析度的影響而改變管柱長度。使用的界面活性劑為 SDS，屬於陰離子性界面活性劑的一種，結構如圖 4.2。因為具有低臨界微胞濃度 (8.2 mM)、低紫外光吸收和水溶性高等優點，因此常被當作微胞電動層析的界面活性劑 71。藉由樣品跟 SDS 所形成的微胞之間不同的作用力，達到分離的效果。. 圖 4.2 SDS 的結構. 4.3.1 添加不同的有機修試劑添加有機修飾劑在實驗中，目的在其能與毛細管壁作用而降低 EOF 47.

(57) 的效應，因此延長微胞遷移時間；此外有機溶劑對 EOF 的影響主要決定於黏度、介電常數與 Zeta 電位的改變。緩衝溶液的組成發生變化，也會改變分析物質在微胞與緩衝液之間的作用，因而提高分析物質的選擇性 72. 。實驗上分別添加甲醇、異丙醇、乙腈，比較分析物間解析度的影響。. 由圖 4.3 所示，添加異丙醇的緩衝溶液解析度最好，整個遷移時間較長，但因為含異丙醇的緩衝溶液的日間遷移時間再現性差；接著增加解析度次之的甲醇濃度達到 20%時仍只有 11 個農藥訊號，且過高含量的有機溶. Absorbance. 劑會減少微胞數量，最後以改變乙腈濃度做調整。 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 -0.5 -1.5 -2.5 -3.5 -4.5. 1 2. 3. 5 6. 4. 7 8 9 12 10 11. 1 2 3. 0. 5. 10. 15. 20. Time (min) 圖 4.3 20 mM 的 Tris 緩衝溶液 (pH 8.0)，含 SDS 50 mM，各添加 8% (1) 乙腈(2) 甲醇(3) 異丙醇的電泳圖。樣品：12 種農藥各 20 ppm；注射量： 50 mbar,1 s；偵測波長：214 nm；溫度: 25°C；電壓: 20 kV；(1) Carbendazim, (2) Pirimicarb, (3) Pyrimethanil, (4) Metalaxyl, (5) Nuarimol, (6) Procymidon, (7) Azoxystrobin, (8) Fenarimol, (9) Tebufenozide, (10) Benalaxyl, (11) Penconazol, (12) Tetradifon 48.

(58) 4.3.2 ACN 含量 (%) 在緩衝溶液 Tris 20 mM, SDS 50 mM (pH 8.5)中添加不同量的 ACN，有機修飾劑的加入會改變緩衝溶液和分析物的淌度；越多有機修飾劑的量，遷移時間越長。如下圖 4.4 所示，ACN 添加量分別占緩衝溶液總體積的 8、11.6、13、15、18%，發現到 18%反而比 15%的時間短，因為當有機溶劑達到一定量時，會破壞或減少微胞的數量，使得微胞和分析物之間的作用力變小。實驗一開始是同時分析 12 種農藥，如圖 4.3，爾後發現 1 和 12 號訊號的農藥，在母液 250 ppm 下在冷藏 4°C 下仍然會產生沉澱，檢量線濃度範圍會受限於母液 250 ppm 以及定量分析時的誤差，後續實驗中 (Borax 緩衝溶液系統下) 選擇剔除這兩個農藥。. 圖 4.4 Tris 20 mM, SDS 50 mM (pH 8.5)的緩衝溶液中，添加不同的 ACN 量 (%)。樣品：12 種農藥各 20 ppm；注射量：50 mbar,1 s；偵測波長： 214 nm；溫度: 25°C；電壓: 20 kV；(1) Carbendazim, (2) Pirimicarb, (3) 49.

(59) Pyrimethanil, (4) Metalaxyl, (5) Nuarimol, (6) Procymidon, (7) Azoxystrobin, (8) Fenarimol, (9) Tebufenozide, (10) Benalaxyl, (11) Penconazol, (12) Tetradifon. 4.3.3 Na2B4O7 緩衝溶液的優化 4.3.3.1 改變 Borax 濃度固定 SDS 為 25 mM，pH 值調整在 9.2，Borax 10、20、30、40、 50 mM，濃度越大遷移時間越長；因為濃度越大，溶液中離子強度也越大，Zeta 電位越小，EOF 會越小，遷移速度會變慢。如圖 4.5 所示： Borax 濃度持續的增加，分析物 3 和 4、8 和 9 間的解析度並未獲得明顯的改善，因此選擇 Borax 10 mM 進行後續實驗。. 圖 4.5 固定 SDS 濃度和 pH 值，改變 Borax 濃度的電泳圖. 4.3.3.2 改變 SDS 濃度由圖 4.6 得知，SDS 濃度越大，樣品遷移時間越往後移動;因為微胞是帶負電，攜帶分析物移動，微胞數量越多越易帶領樣品往陽極遷移， 50.