以基因晶片分析中藥寒藥培養的腎細胞的基因表達; Microarray analysis of genes expressed in HEK 293 cells cultured in Scutellaria baicalensis Georgi、Coptis chinensis Franch. and Phellodendron Chinese Schneid.

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(1)以基因晶片分析中藥寒藥培養的腎細胞的基因表達第一章、前言拜今日基因微陣列科技之賜，在人類基因組工作草圖完成後，已知生物體不同的組織細胞所含的基因組是相同的，但是基因表達的格局是不同的，不同基因表達的調控有其個別性，也有其共同性 1。而人類基因多形態在闡明人體對疾病、毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現的多樣性以及對藥物治療的反應性上都起著重要的作用。近年來中醫學界提出了「中醫體質學說」的概念，並在台海兩地學者的努力下進行了許多有關中醫體質學的基礎及臨床研究。長期以來，臨床上就已認識到不同的個體對同一種病因的易感性存在著差異，而同一種疾病的患者其臨床表現、對治療的反應及預後在不同個體間也存在著顯著的差異。這就牽涉到個人的「體質」不同，才會造成個體間的差異。有人對「體質」下了定義為：「人類的體質是人群及人群中的個體在遺傳的基礎上，在環境的影響下，在其生長、發育和衰老的過程中形成的機能、結構與代謝上相對穩定的特殊狀態，這種特殊狀態往往決定著他對某些致病因子的易感性及其所產生病變類型的傾向性。」 2 中醫一向以獨特的診斷方式---「辨證論治」來診察病情，其中又以「八綱辨證」為諸多辨證理論之首，即陰陽、寒熱、表裏、虛實。醫者在四診：望、聞、問、切之後，必須接著確認病情在八綱中的屬性，才能依此做初步病情的分析。就八綱的細項而言，陰陽是區別疾病類型的總綱領，也概括了其他的六綱 3。表裏是指病變的部位，病邪先傷皮表者為表病，內傷則為裏病。虛實是指邪正的盛衰而言，正氣虛衰則屬虛證，邪氣亢盛則為實證。寒熱則是辨別疾病在人體造成陰陽偏衰或偏盛的不同屬性 45，中藥的「寒、熱、溫、涼」四氣學說也就是據此而發展，內經說「寒者熱之，熱者寒之」，說明了能治熱性病的藥就歸屬於寒藥，用在正常人的身上能引起寒性的體質；能治寒性病的藥物就歸為熱藥，用在正常人的身上能引起熱性的體質。而涼藥、溫藥也可分別歸屬於寒藥與熱藥之中，只是程度不同。人的體質大約分為正常質、陽虛質、陰虛質、痰濕質、濕熱質、氣虛質、瘀血質等七種 6。若能結合現代生物科技（基因晶片科技）來找出不同體質其基因表達有何異同，定位出不同體質的相關基因；則可說是中醫學界與西方醫學接軌的契機；唯有結合中醫體質學說與西方基因微陣列科技的同時，才能讓中醫學登上１.

(2) 國際的醫學學術殿堂 7。本研究是以黃芩、黃連、黃柏等三種寒藥分別與 HEK 293 (human embryonic kidney cell) 腎細胞一起培養，以基因微陣列觀察基因的變化，並試圖找出能影響 HEK 293 腎細胞，與寒證相關的基因。由於在動物模型之中，以黃芩、黃連、黃柏等三種寒藥所引起的寒證是屬於虛寒證型 8，我們以黃芩、黃連、黃柏三種寒藥所造成的虛寒證型比較傾向於陽虛體質，因為在八綱的分類中又以陰陽為首，而寒熱、裏表、虛實則分別屬於陰陽之下；故虛與寒都是陽氣不足的表現，可歸類為陽虛體質。而人體的陽氣又以腎陽為本，中醫認為「腎主先天」，主生長、生殖，人體先天之精氣均來自於腎，其中腎陰為人體結構組成之物質基礎；而腎陽則為人體各器官功能活動之生命表現，因此，腎陰又稱為元陰、真陰；腎陽又稱為元陽、真陽 9。所以本研究採用與此相關的 HEK 293 腎細胞做為研究對象。第二章、文獻探討第一節中醫文獻探討一、中醫體質學理論及分型研究中醫體質學說從本世紀 70 年代提出以後，近 20 多年來，許多台海兩地的學者不斷的深入研究認為，其實中醫體質學說是中醫理論體系的重要組成部分，體質一詞在歷代中醫的文獻中稱謂不一，有氣質、氣體、素質、體質等不同的名稱，直到葉天士、華岫云才直稱體質。如何對人群體質現象做出客觀的分類，建立規範化的分類方法與標準，是現代體質研究中一個必須突破的問題。大陸學者從臨床角度，根據疾病在群體中體質的變化、表現特徵及與疾病的關係等方面對體質作出分類。有王琦的七分法 10（正常質、陰虛質、陽虛質、痰濕質、濕熱質、氣虛質、瘀血質）和匡調元的六分法 11（正常質、晦澀質、膩滯質、燥熱質、遲冷質、倦晃質），另外還有九分法 12、十二分法 13 等。而部分民族醫學中亦包含了豐富的體質理論，如藏醫學認為人體由糜液、血、肉、脂肪、骨骼、髓、精七大要素所構成，並將體質分為三種基本類型，即「朗」、「赤巴」、「培根」，並以此來解釋人體的生理、病理現象；蒙醫學則根據三元學說中的「赫易」、「希日」、「達巴干」三者不同的性質特徵，將體質劃分為七種類型；西方古代希臘希波克拉底的「體液說」、德國康德的「血質說」、俄國巴甫洛夫的「高級神經類型說」、美國謝爾頓的「胚胎說」及日本古川竹三提出的「血型說」；朝鮮人則運用四象學說將人分為太陽人、少陽人、太陰２.

(3) 人、少陰人等四象人，並根據「藥乃局限於人」的學術思想，創立了藥物歸象，按象用藥，隨症加減，不可混用的獨特用藥規律；另外日本漢方一貫堂醫學將體質分類用方，熱毒症體質按年齡不同用柴胡清肝湯、荊芥連翹湯、龍膽瀉肝湯等 14. ，在體質的認識上日本較偏向於「遺傳決定論」認為體質具有不變性；而中國則. 因繼承了「內經」與清明時代的體質思想，故較具整體觀，認為體質是遺傳與後天環境共同決定的，具有可變性。以上是少數民族與中外學者對體質的看法略述，可見研究人體的差異與規律，不僅是中國有其理論依據；世界各地重視體質研究的程度也是令人不可小覲的。體質學的重要性可由預防醫學的觀點來闡明，中醫學一向注重對疾病的預防，早在「內經」中便已明確的提出「治未病」的思想，而體質學說的建立，正可以藉由積極的改善特殊體質，來阻止致病因子對人體的侵襲，並可從高危險群中篩選出病理體質的人來進行疾病的預防。這使得傳統中醫由「養生避邪」的個體預防邁入了群體預防的階段. 15-16. 。. 二、對體質的遺傳基礎研究人類白細胞抗原（HLA）系統是人類最複雜的一個遺傳多型態系統，體質形成中的先天因素是否由 HLA 系統決定，是體質遺傳基礎研究的關鍵；HLA 系統的多態性與連鎖不平衡現象等主要特徵與中醫體質學說之間有其共通性存在。駱斌對肥胖人痰濕型體質和肥胖人非痰濕型體質及正常人進行了與 HLA 關係的研究，顯示痰濕質與 HLA-B40 有關連；而肥胖人痰濕體質與 HLA-B40、 HLA-A11 有關連，表示肥胖痰濕體質有其一定的免疫學基礎 17。張偉榮由 Wistar 大鼠中選出寒體及熱體，並觀察比較兩者在能量代謝與內分泌激素的差異；結果寒體組大鼠在肝細胞活性及肝細胞 Na+-K+-ATPase 活性均低於熱體組大鼠，而 T3、T4、孕酮、睪酮的含量也較熱體組低 18。許健陽等發現，「陽虛」組大鼠基礎痛閥較正常對照組高；而「陰虛」組大鼠基礎痛閥則較正常組為低。電針可抑制創傷疼痛誘導的腎上腺 Fos/Jun 蛋白、下丘腦 Fos 蛋白的表達，其鎮痛作用具有明顯的晝夜節律性；「陽虛」大鼠電針止痛的最佳時機為卯午時；「陰虛」大鼠則在酉子時，兩者剛好互相對應 19-21。本院副院長張永賢博士則從自律神經的功能來探討中醫體質的陰陽平衡狀態，發現陽虛體質其交感神經頻譜能量較低，而副交應神經頻譜能量正常 22。. ３.

(4) 三、中醫寒熱理論探討寒與熱乃辨別病邪屬性的綱領，絕大多數的病不是屬於寒證，就是屬於熱證 23。寒證是由於外界寒邪或體內陰邪過盛而導致人體活動功能減退，出現了陽氣虛衰的現象，包括小便清長、大便溏薄、口不渴或渴喜熱飲、手足厥逆、形寒肢冷、舌苔白滑、脈沉遲；相反的，熱證可由外感熱性病所致，使得陽氣過於亢奮，或由於體內陰陽失衡，使得陽過於陰，而陰虛陽盛所致，即內經所言「陰虛則內熱」。至於寒證可再根據其他八綱的綱領，又分為表寒證和裏寒證 24。表寒證乃指外感寒邪侵襲人體之後，產生了惡寒、頭痛、項強、無汗、骨節煩痛、舌苔薄白、脈浮緊等症狀；裏寒證又可分實寒證和虛寒證，裏實寒證多見於內傷雜病的內感寒邪或過食生冷，典型證狀為四肢冷、噁心、嘔吐、下痢、腹痛、不渴、舌苔白潤、脈沈遲；裏虛寒證則多因稟賦不足或久病或寒邪所傷，典型證狀為畏冷、氣弱懶言、納差食減、四肢覺冷、心動悸、頭暈目眩、疲倦、小便清長、下痢清穀、舌胖而軟、苔薄白、脈沈遲弱，此乃氣化功能減弱，多見於久病內傷者 25-26。就現代醫學研究而言，由於寒熱證型在新陳代謝的表現有很大的不同，所以有人研究發現寒證組的大白鼠其中樞和內臟 5–HT 含量升高，尿內排出量增多 27. ，大腦中的 Norepinephine 和 Dopamin 的含量降低 28，且虛寒證時腦下垂體的. ACTH、LH、TSH 顆粒細胞數量明顯的少於對照組，說明了虛寒證時 5–HT 增多，直接或間接地抑制了 ACTH、LH、TSH 的合成及釋放，亦影響了腎上腺皮質和髓質的功能 29。在用紫外線分光光度法測定 RBC 膜上 AchE 活性，發現虛寒證組 RBC 膜上 AchE 活性高於正常組和虛熱組，可知虛寒證者其副交感神經功能是處於興奮狀態. 30-31. 。在核? 酸方面，虛寒組者其尿中 PGE2、Catacholamin 和 cAmp 排出量. 均降低， PGF2α、cGMP 增高，導致 PGE2/PGF2α、cAMP/cGMP 比值下降，顯示其與中醫寒熱辨證有其相關性存在 32。在電刺激對疼痛閥值的影響發現，寒證組其刺激的痛閥和驚厥值比對照組升高，可知寒證組動物其中樞抑制的平衡關係已被改變；熱證組其刺激的痛閥和驚厥值則比對照組降低 36。４.

(5) 四、寒證動物模型在中醫臨床上辨明寒熱是選用熱藥與寒藥的根據，而在治療的同時，也會發生患者服用寒涼藥可導致虛寒，服用溫熱藥過久導致虛熱 37。標明了使用寒熱藥物來研究寒證與熱證的動物模型的可能。近年來隨著醫學的進展，中醫辨證的動物模型也已展開研究。當然，研究動物的寒熱模型至為複雜，但其主要的特徵仍有寒證對中樞的興奮性降低，交感神經緊張性低下，及副交感神經偏亢，腎上腺皮質、髓質功能低下及能量代謝降低等; 熱證則相反地等造成中樞的興奮性增強，交感神經緊張性增強，腎上腺皮質、髓質功能增加，能量代謝增高等. 37-38. 。而寒證的動. 物模型則包括了實寒證和虛寒證兩大類。在理論上，陰盛（寒）必會傷及陽氣，陽盛（熱）亦會損及陰液，所以，寒證模型必然會演化成虛寒證模型；熱證模型必然會演化成虛熱證模型，但如造模時間不足或強度不夠，虛證階段仍有可能達不到。故在實寒證的造模方面便顯得資料較為不足，文獻上以探討虛寒證的動物模型較多見。虛寒證：目前虛寒證模型在寒證上可被公認接後受，但仍有二個環節須再加強：一是可能未能在寒證的基礎上達到寒邪傷陽而致虛；二是虛證上未能達到「精氣奪則虛」 39。材枓和方法： 1. 虛寒證模型的早期製作，是先使其動動模型被製成熱證，而後再轉化為寒證的方法；即先注射疫苗使動物發熱，再以龍膽草、黃連、黃柏、金銀花、連翹、石膏等灌食三週,製成虛寒證模型 36。 2. 另一種方法則只灌服寒性中藥來製成虛寒證模型，常用的藥物及方法：選用雌性 wistar 大鼠，按體重隨機配對，再按照動物寒熱體質分組，以知母：生石膏：黃柏：龍膽草=1.5:2:1:1.2，製成水煎劑餵食，使其出現納差、腹瀉、神萎、乏力、疲倦、消瘦、毛枯、舌偏淡嫩、淡白，苔少等狀態，此方並無瀉下藥，只是利用寒涼藥使動物出現腹瀉而造成元氣之損傷. 40. 。或以黃連：黃芩：黃柏. =1:1:1 38；或由大黃、黃芩、黃連以 1:1:1 的組成比例 41；或以知母、石膏、黃柏、龍膽草按 1.5:2:1:1 的組成比例；或由知母、石膏按 1.5:227 或石膏：知母按 4:342 的比例組成給予大鼠灌食，使之產生虛寒證的表現。 3. 也有人對於虛寒及虛熱證老鼠做神經、內分泌、免疫與血液流變學的研究，這是以石膏、知母 (4:3) 和附子、乾薑 (1:1) 分別餵食不同的小老鼠，造成虛５.

(6) 寒及虛熱證型，再將其血清、內臟神經、免疫細胞、抗體、纖維蛋白原等進行測定，結果發現虛寒證時神經、內分泌、免疫功能均降低，纖維蛋白原增多；虛熱證時交感神經興奮，腎上腺皮質素分泌增多，自然殺傷細胞活性降低，血中纖維蛋白原增多更明顯 42。 4. 另有人以黃芩、黃連、梔子和肉桂、附子、乾薑分別餵食不同的小老鼠，造成不同的寒熱證型，再以過敏原誘發過敏性氣喘，發現熱證氣喘老鼠呼吸道內細胞激素 IFNr 和? -Ca2+-CaM 的濃度增加，明顯高於寒證組和對照組 43。五.三種寒藥在傳統中醫的應用，三種寒藥均採自順天堂科學中藥（一）黃芩---唇形科黃芩的乾燥根 (採用 Scutellaria baicalensis. Georgi). 黃芩在「神農本草經」列為草根藥的中品 44。性味歸經：性寒味苦無毒；歸肺、膽、胃、大腸經 45。神農本草經：主治諸熱黃疽，腸澼瀉痢，逐水下血閉，惡瘡疽蝕火瘍。本草別錄：療痰熱、胃中熱、小腹絞痛，消穀利小腸，女子血閉，淋露下血，小兒腹痛。本草備要：苦入心，寒勝熱。瀉中焦實火，除脾家濕熱。現代功用：清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎。現代主治：濕溫、黃疸、瀉痢、氣分實熱、肺熱咳嗽、癰腫瘡毒、血熱吐、 Q 咳血、便血、崩漏、胎熱不安 45。（二）黃連----毛艮科植物黃連的乾燥根莖 (採用 Coptis chinensis Franch. ) 黃連在「神農本草經」列為草根藥的上品 44。性味歸經：性寒味苦無毒；歸心、肝、胃、大腸經 45。神農本草經：氣苦味寒，無毒。主治熱氣，目痛，毗傷泣出，明目，腸澼，腹痛下痢，婦人陰中腫痛。久服令人不忘。本草別錄：主五臟冷熱，久下瀉澼，膿血，止消渴驚，除水，利骨調胃，厚腸，益膽，療口瘡。本草備要：大苦大寒，入心瀉火，鎮肝涼血，燥濕開鬱，解渴除煩，益肝膽，厚腸胃，消心瘀，止盜汗，治腸澼瀉痢，痞滿腹痛，心痛伏樑，目痛毗傷，癰疽疥瘡，酒毒胎毒，明目定驚，止汗解毒，除疳殺蛔。現代功用：清熱燥濕、瀉火解毒。６.

(7) 現代主治: 濕熱下痢、痞滿、嘔吐、泄瀉、胃火牙痛、消渴、肝火脅痛、心火煩燥不得寐、神昏譫語、吐. Q下血、癰腫瘡毒、耳目腫痛 45。. (二)黃柏----芸香科植物黃樹皮的乾燥樹皮 (採用 Phellodendron Chinese Schneid.) 黃柏在「神農本草經」列為草根藥的中品 44。性味歸經：性寒味苦無毒；歸腎、膀胱、大腸經 45。神農本草經：主治五臟腸胃中結熱，黃疸腸痔，止瀉痢，女子漏下赤白，陰陽蝕瘡。本草別錄：療驚風在皮間，肌膚熱赤，目熱赤痛，口瘡。本草備要：瀉相火，補腎水，苦寒微辛，沈陰下降。瀉膀胱相火，補腎水不足，堅腎潤燥，除濕清熱。療下焦虛，骨蒸勞熱，諸痿癱瘓，目赤耳鳴，消渴便閉，黃疸水腫。水瀉熱痢，痔血腸風，漏下赤白，諸瘡痛瘡，頭瘡口瘡，殺蟲安蛔。現代功用：清熱燥濕、瀉火解毒、清退虛熱。現代主治: 瀉痢、黃疸、帶下、熱淋、足膝腫痛、瘡瘍腫毒、燒傷、濕疹、陰虛發熱 45。六、三種寒藥在現代醫學文獻的探討（一）黃芩 1.黃芩可抑制氧自由基的形成，同時對氧自由基 46 及超氧陰離子 47 亦有清除之作用。另外，研究發現黃芩可抑制小老鼠及支氣管哮喘的病人血清 IgE 的產生，有抗過敏性哮喘的作用 48。 2. 黃芩可通過免疫調節作用來激活巨噬細胞、促進 IL-1 產生，增強 NK 細胞的活性 49，研究證實，黃芩可有效的抑制膽固醇對單核細肥、巨噬細胞的影響，提高小老鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數，增強中性粒細胞的 H2O2 的釋放及細胞內的氧化殺菌能力。其亦可激活 T 淋巴細胞（有殺傷效應和調節抗腫瘤應答的雙重作用），提高淋巴轉化率，誘導γ干擾素的生成，從而發揮其對單核巨細胞、B 淋巴細胞等的調節作用 50。其亦有促進 IL-2 的產生，促進細胞免疫的作用 51。 3.黃芩可通過誘導 TGF-β1（轉化生長因子），一種可抑制細胞增殖的自分泌因子而發揮其抑制某些癌細胞的增殖。黃芩可通過降低血液凝固性，抑制血小板聚集過程來抑制腫瘤轉移 52。黃芩素對 IL-2 和 TNF 有增強作用 53。 4.黃芩的抗菌譜很廣，有人曾報導其對 HIV-1 病毒逆轉錄和細胞病變有抑制７.

(8) 作用. 54-57. 。. 5.黃芩能影響大鼠神經細胞內 Ca2+ 釋放和細胞外 Ca2+ 內流，有效保護神經元免受興奮性毒性作用 58；可激活兒茶酚胺代謝及單胺的氧化 59，使下丘腦中發熱介質 5-HT 減少 60。 6.以阿司匹林和肝素作對照，黃芩素可抑制膠原誘導的大鼠血小板凝聚作用，抑制凝血誘導的纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，對花生四烯酸誘導的血小板聚集也有抑制作用，並可防止由內毒素誘導的 DIC 及大鼠血小板和纖維蛋白原的減少。黃芩素能抑制 PAI-1 的合成，其抗凝血作用可能是透過降低 Ca2+ 的上升 62。 7.黃芩對平滑肌有雙重調節的作用，可能是在低濃度時是透過抑制內皮細胞的一氧化氮的合成或釋放而引起血管收縮；高濃度時則可抑制收縮而引起血管擴張 63。 8. 黃芩? 可通過阻斷平滑肌細胞膜上的電壓依賴型鈣通道和受體操縱型鈣通道，抑制 Ca2+的增高，可能透過此機轉來達到降壓 64；另外，研究發現黃芩? 具有類似鈣離子阻斷劑之作用 65。黃芩? 亦能影響細胞內 Ca2+ 釋放及細胞外 Ca2+ 內流，從而有效的保持神經元免受興奮性毒性的作用 58。（二）黃連 1.黃連有很廣的抗菌譜，英國學者研究從脫脂的蓖麻子粉和脫脂的黃連粉混合物中提取有效成分，其中以含黃連素不含蓖麻子白蛋白和蓖麻鹼為最好，此有效成分具有抗 HIV 的抗病毒活性 66。以小檗鹼 1mg/kg 靜注可提高實驗性金黃葡萄球菌敗血症者巨噬細胞吞噬金黃葡萄球菌的能力，並使實驗動物免於死亡 67。 2.黃連對心臟具有雙向調節作用，小檗鹼（黃連的有效成份）小劑量時可興奮心臟，大劑量時則呈抑制作用，其並有抗心肌缺血的作用 68，小檗鹼低濃度能興奮貓離體心臟，並增加冠狀動脈的血流量 20%-40% ；在貓和大鼠的冠狀動脈結紮實驗性心肌梗塞模型上，小檗胺（黃連的有效成份）能明顯減輕梗塞的面積，抑制急性缺血造成的游離脂肪酸升高。小檗鹼和四氫小檗鹼能使心肌梗塞範圍和程度顯著減輕，其可使毛地黃的用量減少而達到強心的效果；或使毛地黃用量適當加大以提高療效而不致於中毒，其作用機理與降低心肌耗氧量有關. 69-70. ; 實驗顯示黃連素能. 阻止血小板和紅血球細胞聚集，降低血液粘稠度，可能有助於抗缺血性心律失常，其可阻滯鈣內流是抗心律失常的機轉 71。 3.實驗觀察發現黃連能明顯降低高胰島素依賴性糖尿病大鼠血糖、血脂，並有抗氧化作用；另外，小檗鹼可能通過抑制糖原異生或促進醣酵解而產生降血糖作用 72. 。８.

(9) 4.以 mRNA 差異顯示技術研究益氣解毒片（黃連為主藥之複方黃連片）對鼻咽癌細胞基因干預作用，從基因選擇性表達來探討其抗鼻咽癌細胞的機轉；結果發現益氣解毒片在體外能抑制鼻咽癌細胞的基因表達，同時誘導一些特異基因的表達，從而抑制鼻咽癌細胞的增殖 73。（三）黃柏 1. 黃柏亦含有小檗鹼，但因含量較黃連少，故其抗菌、消炎、解熱等作用較弱 74-75；另外，黃柏可抑制磷酸脂? 的活性 76、調節免疫功能 77 以及影響醣的代謝作用 78。 2. 黃柏的水提取物和醇提取物可清除超氧陰離子自由基 (O2´) 和氫自由基（·OH）以及抑制氫自由基誘導的小鼠肝勻漿組織上清液的脂質過氧化作用，顯示黃柏具有抗氧化能力 79。 3. 黃柏鹼能抑制乙醯膽鹼引起的收縮，有輕度箭毒樣作用 80。 4. 所含小檗鹼除降壓外，還可擴張冠狀動脈；對心臟有雙向調節作用：小劑量時興奮，大劑量時抑制 80。 5. 小檗鹼能興奮網狀內皮系統，增強白血球吞噬能力，並保護血小板免受破壞 80。第二節基因晶片文獻探討一. 簡介：基因晶片是生物晶片的一種，生物晶片是泛指以微小化技術將生物有機分子作為探針 (probe) ，以大量矩陣的方式，置於一個指甲大小的矽晶片、玻璃片或尼龍薄膜上面，用以檢測標的分子 (target) 。這是微處理晶片和生物科技融合的結晶，將生物科技帶向體積小、超高速、高通量的資訊處理時代。理論上，所有種類的生物分子都可放置於晶片上做探針，例如 : DNA、 RNA 、蛋白質、醣類、脂類、抗體等等，目前是以 DNA 晶片(又稱基因晶片)發展最為成熟，蛋白質晶片也正在研發之中。除了這類分子探針矩陣型生物晶片之外，國內外廠商也致力於處理型生物晶片，(即 Labs-on-a-chip) ，整合若干實驗儀器的功能於一張晶片上，以完成樣品檢測與分析，類似於一個實驗室，例如在門診，醫生用一滴血當場就可以檢測出血糖數值、肝功能、腎功能高低… … 。. ９.

(10) 二. 歷史背景隨著人類基因體計劃的研究開展之後，舊的檢測方式和技術已不敷要求，傳統的核酸分子雜交技術 (Northern blot 和 Southern blot) 所耗的時間和人工與效率早已不足以應付大量基因信息的產生。隨著半導體技術的進步，人們也提出了結合生化科技和半導體技術的構思。早在 1980 年代， Bains 就將短的 DNA 片段固定在支持物之上，藉由雙股 DNA 分子雜合 (hybridization) 方式進行序列測定 81。1990 年代 Stephen Foder 首先製造出世界上第一張基因晶片，它結合了探針固相原位合成技術 (in situ synthesis) 和原先用於製做半導體晶片上的微型電子線路的方法— 照相平版印刷技術 (Photolithography)82，可以一次同時分析大量的基因資訊，解決了傳統操作技術的繁雜、耗時耗工、低效率之不足。三.基因晶片類型依據基因探針點印固定於晶片表面方法的不同，可分成兩種基因晶片，一種是原位合成(in situ)的基因晶片，又稱寡核? 酸晶片 ( oligonucleotide chip) 83，在晶片的特定部位合成寡核? 酸而製成，可用於檢測鹼基的突變 84。第二種是晶片外 (off-chip) 事先合成 DNA，再由機器點印 (printing) 到晶片上，在醫學中廣泛地應用於研究基因的表達。第一種:原位合成技術又分成兩類： (一) 光引導原位合成技術 (light-directed in situ synthesis) 85 這是由前述的 Stephen Foder 所發明，由 Affymetric 公司採用，結合了半導體業的照相平版印刷技術和傳統核酸合成技術。其製作方法乃 1.首先使晶片氫基化，表面活性基連接著光敏性保護基。 2.不需聚合的部份用光罩 (light mask) 掩蔽起來，需要合成的部分則無光罩遮蔽。 3.照射特定光線，去除無遮蔽該部份的光敏性保護基，使得表面活性基游離出來而被激活。 4.然後，加入另一個帶有光敏性保護基的去氧單核? 酸 (如，dAMP，dGMP， dCMP，dTMP) ，如此則完成了第一步循環，之後再用光罩遮蔽新的確定區域，在晶片的其他部位重複上述步驟，因此每次光罩的遮蔽區決定了哪些區域被活化，最後在晶片的不同區域合成了寡核? 酸矩陣列。１０.

(11) 此方法的好處: 1.能得到高密度的微陣列 2.步驟很少，並不繁雜 3.合成速度快但是其缺點是: 1.探針長度較短，僅適用於合成寡核? 酸晶片，不適用於合成長達數百到數千鹼基的互補 DNA 晶片。 2.合成反應產率較低，不到 95%。 3.每次去保護不徹底會導致雜合信號模糊。 (二) 壓電打印法 (piezoelectric printing) 由美國 Incyte pharmaceutical 公司所採用進行原位合成。其方法是用噴墨打印機將特定種類的四種鹼基合成試劑噴印到晶片的預定區域上，然後再沖洗、去保護，進行寡核甘酸合成的下一個步驟，每步產率可達 99%以上 86。第二種: 晶片外合成生物探針這是先用常規的分子生物學技術合成探針，再點印到晶片上去，這種方法可以適用於製作各種不同的探針。包括寡核? 酸，DNA、 RNA、PNA. (peptide nucleic. acid) 或蛋白質晶片。中研院白果能博士實驗室的晶片即是使用此方法製成。至於基因探針的備製常用的是 PCR ，RT-PCR 等方法，以期使晶片上點出來的矩陣排列基因皆是品質良好的單一基因 87。晶片探針製成之後，再利用機械打點法 (Mechanical microspotting)，藉由打點針與樣品接觸而載入基因佈放機 (Arrayer) ，再由打點針在晶片上打點，當打點針上面樣品點印完之後，(有些針尖具細縫，如 Split Pin ，載入一次樣品可以打 400 點次) 會徹底沖洗乾淨，以免交叉污染，然後再載入新的樣品打點 88。其優點是: 1. 成本較低 2. 操作迅速 3. 用途廣泛 4. 可備製各式的生物探針 5. 適合實驗室使用缺點是:樣品合成需一系列的純化及儲存，需一套完善的基因庫管理系統辦法，以確保基因的品質，過程繁複。１１.

(12) 四.基因晶片的操作: 至於利用基因晶片的實驗步驟大致如下: 1. 首先萃取出兩種待比較的檢體的 RNA(mRNA)，由於 mRNA 非常不穩定，所以要將它反轉錄成互補 DNA(cDNA)，此時實驗組已標記了 Digoxigenin，而對照組已標記了 Biotin。 2. 然後，將此不同顏色的 DNA 與晶片上的探子點 DNA 進行雜合反應 (Hybridization)。 3. 接下來用兩種酵素呈色 (有的實驗是用螢光物質方法，而用 Cye3 與 Cye5 標記) 。兩種未知的互補 DNA 呈現不同的顏色，某一特定點所呈現的顏色強度，可反應出該檢體 DNA 的相對量多寡，而且探子點的 DNA 是已知的，根據 A 與 T ，C 與 G 互補鍵結的原理，也可知道標的 DNA 是何組合。呈色是以抗體酵素受質結合的方法，實驗組的 Digoxigenin 由 Anti-dig phosphatase Streptavidin. alkaline. Fast Red TR 和 AS-MX 受質反應成紅色。對照組的 Biotin 由 β -galactosidase. X-gal 受質反應成藍色。. （本研究是利用單色酵素呈色法，實驗組與對照組的 mRNA 均以 Biotin-16-dUTP 來標定，分別與雜交膜進行雜交反應後，進行酵素呈色反應，再以彩色掃描器截取雜交膜的呈色強度，每一個基因點影像均以灰階顯示，因為實驗組與對照組都是標以相同的顏色，所以每個灰階影像點的強度代表每一個基因的表現量。） 4. 影像掃描電腦分析，將這些影像的強度資料做出有意義的判別。 5.就一片 9600 探子點的晶片而言，每次分析都可得到近兩萬筆的資料，工程不可謂不大。五.基因晶片的應用基因晶片的特點是可以同時進行兩種生物樣本的實驗。基因晶片的強大功能在於它可同時觀察很多基因的表現或抑制程度，而且對照組和治療組的兩兩比較，可同一時間完成，讓人們得以一窺生命最基礎的活動情況。例如可以比較有病的樣本和健康的樣本，以了解疾病在基因層面的表現，並可依此來篩選診斷疾病 ;可比較用藥前後的樣本，如此可以明暸藥物對基因表現的影響及其作用機轉，可用以縮短開發新藥的時間 ;可用於癌症基因的檢測 ;致病病毒的檢驗等等，應用無窮 89-94。. １２.

(13) 第三章、材料與方法本實驗所用的 9600 點晶片是由中研院白果能博士所提供，基本的實驗步驟亦參照其方法 45: 材料 : cDNA 備製之材料與裝備 Heat block Spectrophotometer Centrifuge Water bath Heat sealer (封口機 ) Umax PowerLook3000 (掃描器) Roller machine (LABQUAKE® Barnstead/Thermolyne) TRIzol® Reagent (Invitrogen; #15596-018) Dynabeads® mRNA DIRECT Kit Hybridization Bags. (DYNAL; #610.11). (GibcoBRL; #18278-010). Aerosol Resistant Tips Random hexamer primer. (ART tip) (molecular BIO-Products,#2139) (GibcoBRL; #48190-011). Reverse transcriptase and 5 × buffer. (GibcoBRL; #18064-014). RNasin® RNase inhibitor (Promega; #N2511) Biotin-16-dUTP. (Roche; #1093070). Blocking powder for hybridization (Roche; # 1096176) Bovine serum albumin 20X SSC SDS. (Sigma; #A2153). (Amresco). (Sigma). Salmon sperm DNA (GibcoBRL; # 15632-011) Human Cot-1 DNA (GibcoBRL; #15279-011) Poly d(A) 10. (10 mer of dA, any primer synthesis company). Dextran Sulfate. (Sigma; # D6001). Streptavidin-ß-galactosidase X-gal. (GibcoBRL; #19536-010). (GibcoBRL; 15520-018). Maleic acid. (Sigma; #M1125) １３.

(14) N-lauroylsarcosin. (Sigma; #L 5777). Fast red TR/AS-MX substrate kit. (cat. No. 34034, PEIRCE). 備製化學溶劑 Purify RNA : 1.TRIzol Reagent (Invitrogen; #15596-018) 2.Chloroform 3.Isopropanol 4.75% ethanol 5.DEPC treated water Purify mRNA: Dynabeads® mRNA DIRECT Kit (DYNAL; #610.11) 1×hybridization buffer: 20 ×SSC. 16 ml. 1% N-lauryolsarcosine. 8 ml. 10% SDS. 160λ. ddH2O. 52 ml. Filter (0.22μm) BM blocking powder. 0.8 g. total. 80 ml. 置於 65OC 使其溶解後，存放於 -20 OC 冰箱中 50% PEG PEG-8000. 10 g. add water to. 20 ml. 置於 65 OC 使其溶解，高溫高壓滅菌後，存放於 -20 OC 冰箱中 10 ×TBS (PH 7.4) 滅菌後即可使用 Tris base. 12.11 g. NaCl. 87.66 g １４.

(15) add ddH2O to. 1000 ml. 120 mM X-gal X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly 100 mg l D-galactopyranside) DMF. 2 ml. 存放於 -20 OC 冰箱中 X-gal Subtrate Buffer 10 ×TBS(PH7.4). 50 ml. 3 mM Potassium Ferrocyanaide. 0.6335 g. K3 Fe(CN)6 3 mM Potassium Ferricyanide. 0.4939 g. K4 Fe(CN)6 1 mM MgCl26H2O. 0.10165 g. add H2O to. 500 ml. 過濾後儲存於 -20 OC 冰箱中 BM Blocking Dilution Buffer. PH 7.5. 1 M Maleic acid. 100 ml. 5 M NaCl. 30 ml. NaOH. 7.5 g. add H2O to. 1000 ml. 滅菌後即可使用 10% Blocking Reagent Blocking powder. 10 g. Blocking Dilution Buffer. 100 ml. 置於 70 OC 中使其溶解，高溫高壓滅菌後存放於 4 OC 冰箱中 20% Dextran Sulfate 滅菌後存放於 -20 OC 冰箱中 Dextran Sulfate. 2g １５.

(16) add H2O to. 8 ml. DEPC H2O Diethyl pyrocarbonate (store in 4 400 µl O. C). H2O. 800 ml. 置於 37 OC 中溫和的搖晃 4 小時，然後放在 37OC 中到第二天，高溫高壓滅菌後，存放於室溫環境即可準備藥品: 1. 將 0.3 g 的順天堂科學中藥粉末加入 30 ml 的培養液 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium， Hyclone)，以超音波震盪 60 分鐘，使粉末溶解均勻. （黃芩及黃柏的濃度為 1 mg/ml，黃連為 0.5 mg/ml，因黃連濃度太高細胞會產生凋亡。） 2. 以 3000 rpm 的轉速離心 15 分鐘，將沉渣去除. 3. 用濾紙過濾藥液. 4. 再用 0.45 μm 孔徑的過濾膜過濾藥液. 5. 在無菌操作檯中用 0.22 μm 孔徑的過濾膜過濾藥液. 6. 此培養液即可用來處置細胞，或是儲存在 -20oC. 培養 HEK 293 細胞: 1. 使用直徑 150 mm 的培養盤及 20 ml 的培養液培養 HEK 293 細胞. 2. 待細胞達預定數量時，吸掉培養液. 3. 加入 18 ml 的 DMEM 及 2 ml 已加入中藥之培養液. 4. 最後的藥品濃度為 : 1 mg/ml 5. 在 37 oC 的恆溫箱中培養兩天. 純化 RNA: 1. 吸掉培養液 2. 加入 2 ml 的 TRIzol reagent. 3. 使 reagent 在培養盤表面平均分佈，與細胞混合，並儘快將與細胞混合好之 TRIzol 吸到小型離心管中. １６.

(17) 4. 將離心管放置冰上 5 分鐘. 5. 每 1 ml 的 TRIZOL 加入 0.2 ml 的 chloroform，震盪 15 秒使其混合均勻. 6. 置於冰上 5 分鐘. 7. 以 13000 rpm 的轉速，4 oC 離心 15 分鐘. 8. 液面會分為兩層，上層為 aqueous. phase，小心的吸出上層液體，移至新的離. 心管. 9. 加入 isopropanol (份量與吸出液體總體積為 1:1 ). 10.震盪使混合均勻. 11. 置於冰上 5 分鐘. 12. 以 13000 rpm 的轉速，4 oC 離心 15 分鐘. 13.用 75% 酒精 1 ml 清洗沉澱之 RNA pellet，離心後倒掉上清液. 14.重覆步驟 13 再洗一次. 15.置於無菌操作檯空氣中乾燥(約 3~5 分鐘). 16.加入 DEPC water 100 μl 即得 total RNA 溶液，另取少量樣品測 O.D. 260 得 RNA 濃度. 純化 mRNA using Dynal beads: 1. 取含有 75μg 的 total RNA 溶液，將此溶液體積以 DEPC water 調整至 100μl 2. 取 100 μl Binding buffer 加入此 RNA 溶液，混合均勻後置於 65oC 2 分鐘，再迅速置於冰上. 3. 此時取 200 μl (約含有 1 mg) 的 Dynabeads Oligo (dT) 25 移至一新的離心管，將此管置於 Dynal. MPC 磁座上.. 4.30 秒後，待 Dynabeads 均被磁附在管底，移除上清液，取下離心管並加入 100 μl Binding buffer，混合均勻，將此管置於 Dynal. MPC 上.. 5. 重複步驟 4，移除上清液，取下離心管再加入 100 μl Binding buffer，取步驟 2 之 RNA 溶液混合均勻，並將此管置於 roller machine 上，在室溫下轉動 5 分鐘，使 mRNA 吸附於 Dynabeads 上. 6. 將離心管置於 Dynal. MPC 上，待 Dynabeads 均被磁附在管底，移除上清液，. 加入 200 μl Washing Buffer B ，混合均勻，將此管置於 Dynal. MPC 上.. 7. 重複步驟 6，移除上清液，加入 20 μl DEPC water，與 Dynabeads 混合均勻，將離心管置於 75oC 水浴中 2 分鐘，迅速置於 Dynal MPC 上，待 Dynabeads 均被磁附在管底，即可移出純化之 mRNA 溶液(估計約 2 μg). １７.

(18) cDNA. 標記:. 1. 混合 2μg 的 mRNA 與 Random hexmer(50μM) 6λ，並補水至總體積為 28.5λ. 2. 置於 70 oC 10 分鐘使其變性，然後置於冰上 5 分鐘. 3. 標記: 混合以下成份步驟 2 之 RNA 混合物共 28.5μl 5 倍緩衝液 10μl 0.1M 的 DTT 5μl dATP，dCTP，dGTP(25mM) 1μl dTTP (2mM) 1μl Biotin-16-dUTP(1mM) 2μl RNAsin(40U/μl)1μl Superscript Ⅱ(200U/μl)1.5μl Total: 50μl 4. 將步驟 3.的混合溶液置於 25 oC 的環境中 10 分鐘，再放到 42 oC 中 90 分鐘 5. 將溶液置於 94 oC 中 5 分鐘，以終止反應 6. 加入 3M 的 NaOH 溶液 5.5μl，並置於 50 oC 中 30 分鐘 7. 加入 3M 的 CH3COOH 溶液 5.5μl，並置於 50 oC 中 30 分鐘 8.將下列成份加入溶液中: H2O. 38μl. Ammonia acetate Glycogen EtOH. (7.5M) 50μl. (20μg/μl) 1μl. 380μl. 9.置於 -80 oC 中至少 30 分鐘之後，以 13000 rpm 的轉速離心 15 分鐘 10.小心的吸掉上清液，加入 75% 的酒精清洗沉澱物，以 13000 rpm 的轉速離心 10 分鐘 11.吸掉上清液後，以真空乾燥 2 到 3 分鐘 12.加入 20μl 的水溶解沉澱物. 雜交反應: 1. 準備雜交膜:將 Salmon sperm DNA (10μg/μl) 10μl 放在 95 oC 中 5 分鐘使１８.

(19) 其變性，再加入 5ml 的 1×hybridization buffer 中混合，把雜交膜放入，置於 63 oC 中 1.5 小時以上 2. 準備 cDNA 樣品:將溶於水的 cDNA 加入以下成份: poly d(A) (10μg/μl) 2μl human Cot-1 DNA (10μg/μl) 2μl 2×hybridization buffer 25μl total:50μl 將上列混合物放入 95 oC 中使其雙股分開，靜置冰上 5 分鐘， 3.將混合溶液加在雜交膜正面，然後密封，置於 95 oC 中 5 分鐘，再放置於 63 oC 水浴中約 16 ~ 18 小時，進行雜交反應 4.在反應之後，取出雜交膜，以 5 ml 的 2 ×SSC + 0.1% SDS 溶液在室溫環境下輕輕震盪清洗 2 次，每次 5 分鐘 5.然後以 5 ml 的 0.1 ×SSC + 0.1% SDS 溶液在 63oC 環境下輕輕震盪清洗 3 次，每次 15 分鐘 6.將雜交膜置入以下成份的混合溶液中，在室溫中輕輕震盪 1 小時 blocking dilution buffer 4 ml 20%dextran sulfate 0.5 ml 10%blocking reagent 0.5 ml total: 5 ml 7.將雜交膜置入以下成份的混合溶液中，在室溫中輕輕震盪 1.5 小時 1 ×TBS + 0.3% BSA (PH 7.4) 4.6 ml 10% blocking reagent 0.5ml 50% PEG-8000 0.4ml Streptavidin β -galactosidase (1.38U/ml) 7.2μl Total: 5 ml 8.將雜交膜以 5 ml 的 1 ×TBS. buffer 在室溫狀態下清洗 3 次，每次 5 分鐘. 9.呈色(使呈藍色): 將雜交膜置入以下成份的混合溶液中，在 37oC 中避光溫和搖晃 45 分鐘 X-gal substrate buffer 4.85ml X-gal (20mg/ml) 150μl Total: 5 ml 10.以 mini-Q water 清洗乾淨１９.

(20) 11.將雜交膜置入 5 ml 的 1 ×PBS + 20 mM EDTA，在室溫下搖晃 20 分鐘以終止反應 12.空氣乾燥 13.掃瞄 14.分析資料微陣列影像處理及數據資料分析 1. 以彩色掃描器 Umax. PowerLook 3000 (最高解析度 3048 dpi) 擷取呈色影. 像，檔案傳至 photoshop 軟體處理，將原本 8 bit 的影像轉成 16 bit，並將影像轉成灰階形式. 2. 以 Genepix 擷取每一個影像點的呈色強度，然後將每一片各點資訊在 EXCEL 處理.. 步驟與流程 Seeding 293 cell on 15 cm dishes and incubate overnight. Discard the medium then PBS wash and add fresh complete DMEM( contain chinese herbal medicine extract, conc. 1 or 0.5 mg/ml). Incubate 48 hrs in 37 °C, 5% CO2. Wash the cell with PBS then purify the RNA using TRIzol reagent. QA and QC the RNA then purify the mRNA using Dynal beads. Reverse transcriptate the mRNA into cDNA(labeled with Biotin-16-dUTP). Hybridization and color development. Data analysis ２０.

(21) 本研究嘗試將黃芩、黃連、黃柏等三種寒藥分別與 HEK 293 (human embryonic kidney cell) 腎細胞一起培養，從腎細胞中抽取 mRNA，反轉錄成 cDNA 後，再與白果能博士實驗室的晶片上的已知探子基因晶片進行雜合反應，並利用單色酵素呈色法呈色後（為藍色），放入彩色掃瞄器中進行掃瞄及影像資料分析，因本研究的控制組與黃芩、黃連、黃柏組均各做三片基因晶片，故先將控制組三片平均後再自行校正，而黃芩、黃連、黃柏各組亦同樣取三片的平均與校正後的控制組作校正，（本研究中每一片呈色的雜交膜都對 1107 CBe 作校正），之後由每一片同一點間不同程度的色差來得知某一已知基因被不同程度的上調或下調，再由此找出被這三種寒藥上調或下調最多的基因分別為何？（本研究之 House-keeping gene 為 GAPDH 以及 Ubiquitin C，見 P55）第四章、. 結. 果. 控制組的晶片雜合後呈色圖（圖 A），黃芩組的晶片雜合後呈色圖（圖 B），實驗組-對照組/對照組的基因點狀分布圖（圖 C）。黃連組的晶片雜合後呈色圖（圖 D），實驗組-對照組/對照組的基因點狀分布圖（圖 E）。黃柏組的晶片雜合後呈色圖（圖 F），實驗組-對照組/對照組的基因點狀分布圖（圖 G）。由黃芩組的晶片雜合後呈色圖（圖 B）、黃連組的晶片雜合後呈色圖（圖 D）及黃柏組的晶片雜合後呈色圖（圖 F）可看出晶片以單色酵素呈色法呈色（藍色），且其與控制組色度的比值強弱代表基因被上調或下調的程度，與控制組比較後，藍色比控制組深者表上調的基因，藍色愈深者上調量愈多；藍色比控制組淺者表下調的基因，藍色愈淺者下調量愈多。由黃芩的實驗組/對照組的基因點狀分布圖（圖 C）、黃連的實驗組/對照組的基因點狀分布圖（圖 E）及黃柏的實驗組/ 對照組的基因點狀分布圖（圖 G）可看出負 Y 值的比例多於正 Y 值的比例，可知下調的基因遠多於上調的基因。至於黃芩的實驗組-對照組/對照組的基因點狀分布圖（圖 C）為何會在 X 軸下方出現一條帶狀分布，可能是因為黃芩的值經過校正調整後，會有部分本來顯色較弱的點，經由調整而獲得較大的值，但是此值和相對應的對照組的值比起２１.

(22) 來還是很小，所以實驗組-對照組會接近對照組，而形成一條斜率約等於-1 的帶狀分布。黃芩處理後的細胞基因表達，大於 2 倍標準差的共有 21 個基因，小於負 2 倍標準差的共有 386 個；黃連處理後的細胞基因表達，大於 2 倍標準差的共有 17 個基因，小於負 2 倍標準差的共有 112 個；黃柏處理後的細胞基因表達，大於 2 倍標準差的共有 103 個基因，小於負 2 倍標準差的共有 108 個。（表 A 至表 F 分別列出黃芩、黃連、黃柏個別上調或下調之前、後 30 名的基因名稱。）而在大於 2 倍標準差上調的基因中並無三種中藥均出現上調者，不過在兩兩比較之後卻發現在大於 2倍標準差上調的基因中黃連和黃柏有 12個上調基因相同 (表 G) ，黃芩和黃柏有 3 個上調基因相同 (表 H) ，而黃芩和黃連則沒有交集；在小於負 2 倍標準差下調的基因中黃芩、黃連、黃柏三組中藥均下調的基因有 18 個 (表 I) ；而在兩兩比較之下發現下黃連和黃柏有 34 個下調基因相同 (表 J) ；黃芩和黃柏有 14 個下調基因相同 (表 K) ，而黃芩和黃連則有 12 個下調基因相同 (表 L) 。另外，筆者就本研究的三種寒藥取 log2 後，分別取上調及下調者之前、後 30 名基因，上網至 PubMed 及 NCBI 作搜尋，再與古籍中三種寒藥個別之主治及歸經做整合，列舉出其可能之相關基因名稱（表 M-P），此表僅供參考。. ２２.

(23) 表 A、黃芩前 30 名大於 2 倍標準差者(2*SD=9381.852) HsID Hs.20725. Title Homo sapiens cDNA FLJ20814 fis, clone ADSE01064. AVET-AVE C. 32096.92. Hs.278605 ER-associated DNAJ; ER-associated Hsp40 co-chaperone; hDj9; ERj3. 20118.06. Hs.195851 Actin, alpha 2, smooth muscle, aorta. 17959.62. Hs.136010 EST. 17510.08. Hs.179661 Tbulin, beta polypeptide. 17353.08. NA. 16769.96. NA. Hs.180920 Ribosomal protein S9. 14092.28. Hs.42644. Thioredoxin-like. 13922.73. Hs.20644. Branched chain alpha-ketoacid dehydrogenase kinase. 13544.80. Hs.20580. Sterol O-acyltransferase 2. 13452.12. Hs.1706. Interferon-stimulated transcription factor 3, gamma (48kD). 12845.94. Hs.7155. ESTs, Weakly similar to 2115357A TYKi protein [M.musculus]. 12300.84. Hs.79387. Proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, ATPase, 5. 11588.29. Hs.153436 N-acetyltransferase, homolog of S. cerevisiae ARD1. 11363.14. Hs.55781. Hypothetical protein FLJ20604. 10937.26. Hs.79748. Solute carrier family 3 (Activators of dibasic and neutral amino acid transport), member 2. 10884.60. Hs.429. ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit c (subunit 9) isoform 3. 10807.27. Hs.77665. KIAA0102 gene product. 10145.25. Hs.1288. Actin, alpha 1, skeletal muscle. 9897.99. Hs.251064 High-mobility group (nonhistone chromosomal) protein 14. 9825.60. Hs.274416 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 6 (14kD, B14). 9764.70. Hs.1706. Interferon-stimulated transcription factor 3, gamma (48kD). 8987.39. Hs.69855. NRAS-related gene. 8883.76. Hs.75914. Coated vesicle membrane protein. 8797.87. Hs.55823. SMC (mouse) homolog, X chromosome. 8574.98. Hs.165843 Casein kinase 2, beta polypeptide. 8546.87. Hs.7345. 8345.25. MAD1 (mitotic arrest deficient, yeast, homolog)-like 1. Hs.177766 ADP-ribosyltransferase (NAD+; poly (ADP-ribose) polymerase). 8323.11. Hs.182248 Sequestosome 1. 8261.94. Hs.190703 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide. 8118.32. 最後 9 名表前 30 名但未大於 2 倍標準差者。２３.

(24) 表 B、黃芩後 30 名小於負 2 倍標準差者 HsID. Title. AVET-AVE C. Hs.129953 Ewing sarcoma breakpoint region 1. -29136.4. Hs.211914. NADH dehydrogenase (ubiquinone) (NADH-coenzyme Q reductase). Fe-S. protein. 7. (20kD). Hs.82065. Interleukin 6 signal transducer (gp130, oncostatin M receptor). -29802.9. Hs.76437. Ribosomal protein L36. -30076.2. -29237.7. Hs.249495 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1. -30472.9. Hs.182447 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C (C1/C2). -30738.9. Hs.89399. ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit c (subunit 9), isoform 2. -30957.1. Hs.157777. Homo sapiens mRNA; DKFZp434G0118). -31183.9. cDNA. DKFZp434G0118. (from. clone. Hs.131255 Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein. -31733.0. Hs.180946 Ribosomal protein L5. -32032.2. Hs.84981. X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5 (Double-strand-break rejoining; Ku autoantigen, 80kD). -32185.4. Hs.3463. Ribosomal protein S23. -32239.7. Hs.111515. CGI-43 protein. -32809.6. Hs.74497. Nuclease sensitive element binding protein 1. -33187.6. Hs.196177 Phosphorylase kinase, gamma 2 (testis). -33468.9. NA. NA. -33475.8. Hs.77039. Ribosomal protein S3A. -33582.1. Hs.197116. Solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 4. -33583.6. Hs.78771. Phosphoglycerate kinase 1. -33723.2. Hs.174131 Ribosomal protein L6. -34103.5. Hs.6315. Acetylserotonin O-methyltransferase-like. -35287.7. Hs.56. Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1. -35582.7. Hs.163593 Ribosomal protein L18a. -35710.1. Hs.180920 Ribosomal protein S9. -35910.8. Hs.179718 V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog-like 2. -36646.0. NA. NA. -36754.3. NA. NA. -37028.3. Hs.111782. ESTs,Weakly similar to ALU1 human ALU subfamily J sequence contamination warning entry [H.sapiens]. -37357.5. Hs.75607. Mristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MARCKS, 80K-L). -37644.0. NA. NA. -38362.9 ２４.

(25) 表 C、黃連前 30 名大於 2 倍標準差者 (2*SD =4804.05) HsID. Title. Hs.226795 Glutathione S-transferase pi Hs.9280. AVE L-AVE C 10649.73. Proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 9 (large multifunctional protease 2). 9340.82. Hs.116577 Prostate differentiation factor. 8265.17. Hs.129913 DNA-damage-inducible transcript 3. 8066.13. NA NA. 7636.48. Hs.108380 Rhesus blood group, D antigen. 7617.40. Hs.117729 Keratin 14 (epidermolysis bullosa simplex, Dowling-Meara, Koebner). 7354.01. Hs.99029. CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), beta. 7317.34. Hs.73798. Macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibiting factor). 6857.61. Hs.129811. Pleckstrin homology, Sec7 and coiled/coil domains 3. 6157.18. Hs.281434 Sialyltransferase. 6106.18. Hs.184582 Ribosomal protein L24. 6034.62. Hs.143554 ESTs, highly similar to B45036 pur beta - human [H.sapiens]. 5974.64. Hs.11147. 5777.46. KIAA0467 protein. Hs.154332 KIAA0212 gene product. 5761.77. Hs.77221. Choline kinase. 5434.82. Hs.62813. ESTs, Moderately similar to IA1_human zinc finger protein IA-1 [H.sapiens]. 5319.71. Hs.160786 Argininosuccinate synthetase. 4424.56. Hs.77929. Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 3 (xeroderma pigmentosum group B complem. 4239.66. Hs.66718. RAD54 (S.cerevisiae)-like. 4234.41. Hs.169832 Zinc finger protein 42 (myeloid-specific retinoic acid- responsive). 4003.45. Hs.104114 H.sapiens HCG I mRNA. 3625.65. Hs.251664 Insulin-like growth factor 2 (somatomedin A). 3386.82. Hs.7570. Hypothetical protein FLJ11230. 3121.71. Hs.89436. Cadherin 17, LI cadherin (liver-intestine). 2779.98. Hs.81994. Glycophorin C (Gerbich blood group). 2692.25. Hs.240062 Hypothetical protein. 2507.38. Hs.45514. V-ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene related. 2491.35. Hs.85885. ESTs. 2475.75. Hs.84981. X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5 (double-strand-break rejoining; Ku autoantigen, 80kD). 2350.36. 最後 13 名表前 30 名但未大於 2 倍標準差者。２５.

(26) 表 D、黃連後 30 名小於負 2 倍標準差者 HsID. Title. AVE L-AVE C. Hs.5120. Dynein, cytoplasmic, light polypeptide. -11539.1. Hs.68756. ESTs, Moderately similar to similar to smoothelin [H.sapiens]. -11642.4. Hs.166011. Catenin (cadherin-associated protein), delta 1. -11709.3. Hs.216354. Ring finger protein 5. -11736.2. Hs.82793. Proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 3. -11916.5. NA. NA. -11933.0. Hs.1074. Surfactant, pulmonary-associated protein C. -11988.5. Hs.2934. Ribonucleotide reductase M1 polypeptide. -12320.4. Hs.183800. Ran GTPase activating protein 1. -12393.7. Hs.7678. Cellular retinoic acid-binding protein 1. -12399.3. Hs.251064. High-mobility group (nonhistone chromosomal) protein 14. -12454.8. Hs.2012. Transcobalamin I (vitamin B12 binding protein, R binder family). -12989.6. Hs.146354. P-peroxiredoxin 2. -13172.0. Hs.64797. Amyloid beta (A4) precursor-like protein 2. -13172.3. Hs.278317. KIAA0632 protein. -13177.2. Hs.75061. MARCKS-like protein. -13294.7. Hs.2706. Glutathione peroxidase 4 (phospholipid hydroperoxidase). -13487.3. Hs.141011. Calmodulin 3 (phosphorylase kinase, delta). -13507.7. Hs.184693. Transcription elongation factor B (SIII), polypeptide 1 (15kD, elongin C). -13710.9. Hs.78996. Proliferating cell nuclear antigen. -14110.4. Hs.17775. p75NTR-associated cell death executor; ovarian granulosa cell protein (13kD). -14531.2. NA. NA. -14625.6. Hs.929. Myosin, heavy polypeptide 7, cardiac muscle, beta. -15243.9. Hs.1288. Actin, alpha 1, skeletal muscle. -15447.1. Hs.3712. Ubiquinol-cytochrome c reductase, Rieske iron-sulfur polypeptide 1. -15634.1. NA. NA. -15669.5. Hs.250879. ESTs. -16116.4. Hs.30738. Hypothetical protein FLJ10407. -17609.8. Hs.75061. MARCKS-like protein. -17896.6. Hs.69855. NRAS-related gene. -18316.3 ２６.

(27) 表 E、黃柏前 30 名大於 2 倍標準差者 (2*SD =4232.796) HsID. Title. AVE B-AVE C. Hs.75789. N-myc downstream regulated. 12580.00. Hs.79748. Solute carrier family 3 (activators of dibasic and neutral amino acid transport), member 2. 11698.31. Hs.226795. Glutathione S-transferase pi. 10579.50. Hs.108380. Rhesus blood group, D antigen. 10465.84. Hs.184582. Ribosomal protein L24. 9427.54. Hs.166456. ESTs, Highly similar to HPPD_human 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase [H.sapiens]. 9264.16. Hs.182248. Sequestosome 1. 9207.99. Hs.80731. Autocrine motility factor receptor. 9060.58. Hs.1438. Gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor, rho 1. 9028.35. NA. NA. 8992.23. Hs.15243. Nucleolar protein 1 (120kD). 8838.21. Hs.155712. Follistatin-like 1. 8717.89. NA. NA. 8471.43. Hs.73798. Macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibiting factor). 8446.25. Hs.270845. Kinesin-like 5 (mitotic kinesin-like protein 1). 8306.61. Hs.22559. KIAA0197 protein. 8158.26. Hs.3254. Ribosomal protein L23-like. 8068.53. Hs.3069. Heat shock 70kD protein 9B (mortalin-2). 7993.99. Hs.16001. Sema domain, immunoglobulin domain (Ig), short basic domain,. 7984.47. Hs.129811. Pleckstrin homology, Sec7 and coiled/coil domains 3. 7904.52. Hs.278268. Homolog of mouse MAT-1 oncogene. 7857.03. Hs.7879. Interferon-related developmental regulator 1. 7808.98. Hs.697. Cytochrome c-1. 7573.47. Hs.15251. Homo sapiens chromosome 14 clones RP11-111O16 and RP11-61F4 containing genes for nuclear receptor coactivator NCoA-62. 7525.34. Hs.6101. Bone morphogenetic protein 6. 7484.10. Hs.76244. Spermidine synthase. 7393.66. Hs.146393. KIAA0025 gene product; MMS-inducible gene. 7359.31. Hs.82173. TGFB inducible early growth response. 7319.87. Hs.116577. Prostate differentiation factor. 7094.56. Hs.28491. Spermidine/spermine N1-acetyltransferase. 6980.09. ２７.

(28) 表 F、黃柏後 30 名小於負 2 倍標準差者 HsID. Title. AVE B-AVE C. Hs.141011. Calmodulin 3 (phosphorylase kinase, delta). -9426.60. Hs.78040. KDEL (Lys-Asp-Glu- Leu) endoplasmic reticulum protein retention receptor 1. -9432.65. Hs.84981. X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5 (double-strand-break rejoining; Ku autoantigen, 80kD). -9455.27. Hs.50732. Protein kinase, AMP-activated, beta 2 non-catalytic subunit. -9686.01. NA. NA. -9879.51. Hs.167421. ESTs, Highly similar to DOC2_human differentially expressed protein 2 [H.sapiens]. -9932.40. Hs.75807. Carboxy terminal LIM domain protein 1. -10201.99. Hs.108327. Damage-specific DNA binding protein 1 (127kD). -10216.47. Hs.28914. Adenine phosphoribosyltransferase. -10331.03. Hs.17775. p75NTR-associated cell death executor; ovarian granulosa cell protein (13kD). -10600.12. Hs.180714. Cytochrome c oxidase subunit VIa polypeptide 1. -10697.56. Hs.184693. Transcription elongation factor B (SIII), polypeptide 1 (15kD, elongin C). -11097.21. Hs.64797. Amyloid beta (A4) precursor-like protein 2. -11118.24. Hs.73980. Troponin T1, skeletal, slow. -11482.27. NA. NA. -11601.06. Hs.146409. Wingless-type MMTV integration site family, member 4. -11604.79. Hs.7678. Cellular retinoic acid-binding protein 1. -11667.04. NA. NA. -11841.17. Hs.1074. Surfactant, pulmonary-associated protein C. -11918.08. Hs.17775. p75NTR-associated cell death executor; ovarian granulosa cell protein (13kD). -12094.41. Hs.2012. Transcobalamin I (vitamin B12 binding protein, R binder family). -12194.34. Hs.146354. Peroxiredoxin 2. -12244.98. Hs.278317. KIAA0632 protein. -12412.01. Hs.64797. Amyloid beta (A4) precursor-like protein 2. -13480.28. Hs.197116. Solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 4. -13768.00. Hs.3712. Ubiquinol-cytochrome c reductase, Rieske iron-sulfur polypeptide 1. -13879.53. Hs.30738. Hypothetical protein FLJ10407. -14705.59. Hs.929. Myosin, heavy polypeptide 7, cardiac muscle, beta. -15311.57. Hs.73454. Troponin T3, skeletal, fast. -15517.86. Hs.250879. ESTs. -16910.51 ２８.

(29) 表 G:黃柏、黃連共同出現上調之基因大於２倍標準差者如下： (1)CCAAT / enhancer binding protein (C/EBP) , beta (2)Choline kinase (3)DNA-damage-inducible tanscript 3 (4)Gtathione s-transferase Pi (5)Kratin 14 (6)KIAA 0467 (7)Mcrophage migration inhibitor factor (glycosylation-inhibiting factor) (8)Peckstrin homology , Sec7 and coiled/coil domains 3 (9)Prostate differentiation factor (10)Rhesus blood group , D antigen (11)Riosomal protein L24 (12)Sialyltansferase. 表 H:黃柏、黃芩共同出現上調之基因大於２倍標準差者如下： (1)Branched chain α-ketoacid dehydrogenase kinase (2)Solute carrier family 3 (3)Thioredoxin-like. 表 I:黃柏、黃連、黃芩共同出現下調之基因小於負２倍標準差者如下： (1)Cytochrome C oxidase , subunit Vla , polypeptide 1 ; COX6A1 (2)Metallothionein 1L ; MT1L (3)Camodulin 3 ; CALM3 (4)Dystrophia-myotonica –containting WD repeat motif (5)Interferon-induced transmembrane protein 1 ; IFTM1 (6)Hepatocyte growth factor receptor ; HGFR (7)Chromosome-associated polypeptide C (8)High mobility group nucleosomal binding protein 1 ; HMGN1 (9)Endoplasmic reticulum KDEL receptor (10)Peroxiredoxin 2 (11)Amyloid beta(A4) precursor-like protein 2 ２９.

(30) (12)GTPase-activating protein RAN,1 (RAN GAP1) (13)Solute carrier family 7 member 4 ; SLC7A4 (14)Thyroid hormone receptor interactor 13 ; TRIP13 (15)Ubiquinol-cytochrome C reductase binding protein ; UQCRB (16)X-ray repair , complementing defective in CHINESE hamaster 5 (17)Macrophage migration inhibitory factor (18)MHC CLASSI , A. 表 J:黃柏、黃連共同出現下調之基因小於負２倍標準差者如下： (1)Actin, α1 skletal muscle (2)Adenine phosphoribosyltansferase (3)Aldo-keto reductase family7 , membe A2 (4)Bone morphogenetic protein receptor , typeIA (5)Brain-derived neurotrophic factor (6)Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 A (pz1,cip1) (7)Cytochrome C oxidase , subunit Ⅶa , polypeptide 2 (8)Damage-specific DNA binding protein 1 (127KD) (9)Dystrophia- myotonica-containing WD repeat motif (10)Ephrin-B3 (11)Eukaryotic translation initiation factor 2 B , subunit 2 (12)Glutathione S-transferase M 4 (13)Human clone 23745 mRNA , complete cds (14)Hypothetical protein FLJ 10407 (15)KIAA 0632 protein (16)KIAA 0750 gene product (17) Macrophage migration inhibitory factor (18) MHC classI, A (19)MARCKS-like protein (20)Matrin 3 (21)Myosin , heavy polypeptide 7 , cardiac muscle , beta (22)p75NTR-associated cell death executor , ovarian granulosa (23)Peroxisome proliferative activated receptor , delta (24)Phospholipase C , gamma 2 (25)Purkinje cell protein 4 (26)Putative protein (27)S100 calcium-binding protein A 13 (28)Surfactant , pulmonary – associated protein C (29)Transcobalamin 1 ３０. cell protein..

(31) (30)Transcription elongation factor B , polypeptide 1 (31)Tripeptidyl peptidase Ⅱ (32)Tropomodulin 3 (33)Troponin T1 , skeletal , slow (34)Ubiquinol-cytochrome C reductase , Rieske iron-sulfar polypeptide. l. 表 K:黃柏、黃芩共同出現下調之基因小於負２倍標準差者如下： (1)Annexin A 5 (2)Casein kinase 2, beta polypeptide (3)CGI-43 protein (4)CGI-88 protein (5)Excision repair cross – complementing rodent repair deficiency , complementation group 6 (6)H3 histone , family 3 A (7)Insulin-like growth factor 2 (somatomedin A) (8)Interferon induced transmembrane protein 3 (1-80) (9)Macrophage migration inhibitory factor (10)Mouse double minute 2 , human homolog o f ; p53-binding protein (11)NRAS-related gene (12)Polymerase (DNA directed) , alpha (13)SHC (Src homology 2 domain-containing ) transforming protein (14)Wingless-type MMTV integration site family , member 4. 表 L:黃芩、黃連共同出現下調之基因小於負２倍標準差者如下： (1)Annexin A 1 (2)Bromodemain-containing protein, 140 KD (peregrin) (3)Cellular retinoic acid-binding protein 1 (4)CTP synthase (5)Dynein , cytoplasmic , light polypeptide (6)Glutathione s-transferase Pi (7)Low molecular mass ubiguinone-binding protein (8)NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1α subcomplex 4 (9KD , MLRQ) (9)NADH dehydrogenase (ubiquinon) Fe -s protein 7 (10)Phosphoglycerate kinase l (11)Putative human HLA ClassⅡ associated protein 1 (12)Thioredoxin ３１.

(32) 第五章、討. 論. 在小於負 2 倍標準差方面黃芩、黃連、黃柏三組中藥均下調的基因有 cytochrome c oxidase, subunit VIa, polypeptide 1 、 ubiqunol-cytochrome c reductase-binding protein、calmodulin 3 、interferon-induced transmembrane protein 1、chromsome-associated polypeptide C、high mobility group nucleosomal binding protein 1、endoplasmic reticulum KDEL receptor、GTPase-activating protein RNA, 1、 amyloid beta(A4) precursor-like protein 2、peroxiredoxin 2、solute carrier family 7 member4、 thyroid hormone receptor interaction 13、X-ray repair, complementing defective, in Chinese hamster 5、 metallothionein 1L、dystropic myotonica-containing WD repeat motif、hepatocyte growth factor receptor、macrophage migration inhibitor factor、MHC classI, A 共 18 個基因。其中 ubiqunol-cytochrome c reductase-binding protein 及 cytochrome c oxidase, subunit VIa, polypeptide 1 為粒腺體內膜上，電子傳遞鏈的成員，電子傳遞鏈有四個複合體，ubiqunol-cytochrome c reductase 是第三個複合體，cytochrome c oxidase 是第四個複合體，由於電子傳遞鏈是藉由質子梯度來驅動 ATP 的合成，一旦此過程中任何一個複合體被抑制則 ATP 將無法產生，而 ATP 是人體能量的來源，ATP 的製造一旦減少則機體的能量便下降。（圖 1）（圖 1:請參考 2000 W.H. Freeman and Company.Molecular Cell Biology. Figure 16-17.）. ３２.

(33) 就中醫理論來看，八綱辨證中以陰陽為首，寒證與熱證分屬其下，寒證的定義為感受寒邪或機體陽虛陰盛，機體活動衰減所表現的證候，臨床包括口不渴或渴而不喜飲，喜熱飲，手足冷，面色蒼白，小便透明而長，大便下痢而稀，舌苔白滑，脈遲等；而熱證的定義為感受熱邪或陽盛陰虛，機體活動亢進時表現的證候，臨床包括口渴引飲，喜冷飲，潮熱煩燥，面紅目赤，小便短赤，大便秘結，舌苔黃而糙，脈數等；若機體的產能不足，便會使機體的活動能力衰減，以寒熱來看是屬於寒症，而此三種中藥均出現抑制電子傳遞鏈中第三及第四個複合體，阻斷 ATP 的產生，故使機體能量的產生降低，頗符合寒藥導致寒證的中醫理論 96(附表如下)。. 寒證. 熱證. 寒熱喜惡. 惡寒喜熱. 惡熱喜寒. 口渴. 不渴. 渴喜冷飲. 面色. 白. 紅赤. 四肢. 冷. 熱. 大便. 稀溏. 秘結. 小便. 清長. 短赤. 舌象. 舌淡、苔白潤. 舌紅、苔黃. 而鈣調素(calmodulin，CaM)是細胞內另一個重要的信號傳導分子，介導 Ca2＋－CaM－CaMK（Calcium/Calmodulin dependent protein kinases，CaMK）的信號傳導。CaM 和 Ca2+有很高的親和力，一個 CaM 分子可與四個 Ca2+結合。CaM 本身沒有活性，但和 Ca2+結合後，再與? 結合，會形成? -Ca2+-CaM 複合體，出現活性。? -Ca2+-CaM 複合體可與細胞中的 Ca2+-ATP ? 、NAD 激? 、磷酸? 、蛋白質激? 和 ß-葡聚糖合成? 結合，使這些? 活化，從而調節細胞的許多代謝過程。我們發現黃芩、黃連、黃柏共同下調的 Calmodulin 是 Calmodulin 3， Calmodulin 分成 Calmodulin 1、Calmodulin 2及 Calmodulin 3，但三者間其 nucleotide ３３.

(34) 約有 80%是相同的 97，因目前單獨對 Calmodulin 3 的了解並不多，且大多以 Calmodulin 來統稱，故我們試著藉由當今西方醫學對 Calmodulin 這個基因的了解，嘗試來解釋這三種寒藥的可能機轉。 Calmodulin 在科學的驗證上有以下功能：一. 調節鈣離子濃度。二. 協調神經系統。三. 激活酵素系統。四. 能量的啟動器。五. 活化巨噬細胞。一. 調節鈣離子濃度：在竇房結(SA node)pacemaker cells 自發性去極化時 (圖 2)，竇房結 pacemaker cells 自發性去極化需要 Ca2+/CaM-dependent protein kinase 的活化。 (圖 2:請參考 www.cardioliving.com/consumer/Heart/ElectricalActivating.sht 及 paralia.com/athina/Heart/Exicitatory Conductive.htm ). 熱證病人表現出來的脈數，寒藥可藉由調降調鈣素(Calmodulin)的基因活動，抑制 Ca2+/CaM-dependent protein kinase 的活化，來減緩竇房結 pacemaker cells 自發性去極化的速度，因而可使心跳速度減慢，這或許是寒藥可治療熱症的一項佐證。在血管平滑細胞中，當 angiotensin II、endothelin 或腎上腺素與其 receptor 結合時，會活化在細胞膜上的酵素 phospholipase C ( PLC )，它可以催化 phosphatidylinosital bisphosphate ( PIP2 )水解成 diacylglyceral ( DAG )及 Inositol triphosphate ( IP3 ， ) 而 IP3 會經由 foot protein 與 IP3 受體結合後，啟動 Ca2+通道(圖 3)，使 Ca2+從內質網中進入胞漿，增加細胞內 Ca2+之濃度。細胞內之 Ca2+和 calmodulin 結合後，將 phospholamban 磷酸化，抑制 phospholamban 對 Ca2+ pump 的抑制作用，因而使 Ca2+流入內質網中，如此可使細胞內 Ca2+之濃度降低，讓血管擴張。(圖 4:請參考 www.neuro.wust.edu/neuromuscular/pathol/diagrams/chan.htm) ( 圖. 3: 請參考 :www.psych.ufl.edu/~rowland/neurochem3/sld012.htm. www.rpi.edu/… /molbiochem/MBWeb/mbl/part 2/casignal.htm). ３４. 及.

(35) 熱證病人表現出來的面紅目赤，其機制乃是由於周邊血管擴張，血液充滿在周邊血管造成面紅(flushing)，寒藥可調降鈣調素(Calmodulin)的基因活動，降低周邊血管擴張，或許也可以此來解釋寒藥治療熱症的可能原因。二. 協調神經系統：在腦神經細胞中，許多的神經傳遞物質如 dopamine、norepinephrine、 serotonin 等，均是經由 G protein 活化後再經由產生二級訊號傳遞因子 (second messenger) cAMP、Ca2+、IP3，進一步活化蛋白激脢，使蛋白受質磷酸化而產生不同的調節作用及生理反應(圖 5)。. 當神經傳遞物連上接受器，促使 G 蛋白質去活化 phospholipase C ( PLC )，而使磷脂分解而產生 IP3，這種 IP3 是水溶性物質，可從產生的位置(細胞內膜) 擴散到細胞質，當 IP3 在細胞內的濃度增加時，與內質網的膜上 IP3 接受器結合，孔道就會打開，促使 Ca2+ 從內質網釋放出來；此外神經細胞的內質網膜尚有一種叫做 ryanodine receptor 的接受器，當細胞內的 Ca2+ 增加時，就會促使 ryanodine receptor 的孔道打開。因此，當一個神經細胞因電壓升高而打開 Ca2+ 孔道讓 Ca2+ 進入時，細胞內 Ca2+ 濃度會增加，如此就會活化 ryanodine receptor/channel，使 Ca2+ 從內質網釋出，另一方面藉由 IP3 作用於 IP3 receptor/channel，促使 Ca2+ 從內質網釋出，這些 Ca2+又進一步作用在 ryanodine receptor，促使細胞內的 Ca2+更多。只要細胞內 Ca2+濃度增加，就會將外界訊息轉變為化學訊息，引起一連串化學變化 (圖 6)。. 細胞質裡的 Ca2+濃度一旦增加，這些 Ca2+主要是連在 CaM 上，然後才進一步影響細胞內許多蛋白質的活性，例如依靠調鈣素的蛋白質激活酵素 (Ca2+/CaM-dependent protein kinase，共有四種這樣的 kinase，其中有一種全３５.

(36) 名是 multifunctional calcium/calmodulin-dependent protein kinase；簡寫為 Ca2+/CaM kinase)，這種激活酵素廣泛存在於突觸前與突觸後神經細胞內。. 另外 Ca2+/CaM kinase 活化後，誘導了腺? 酸環化? (adenylate cyclase, ACase)的活化。 ACase 通過水解 ATP ? 生環腺? 酸(cAMP)而提高了細胞內的 cAMP，cAMP 在細胞內的含量可因以下兩種機制而降低：一是 cAMP 被分泌到細胞外，ACase 可能介導了這一過程 98；二是 cAMP 被水解成腺? 5′-磷酸，環腺? 磷酸二酯? (cAMP-dependent phosphodiesterase)催化了這一反應，Ca2+ CaM kinase 則調節了該酯? 的活性 99。在 80 年代初發現 Dopamine 經由活化 D1 受體，造成細胞內 cAMP 增加後會引起某些蛋白分子的磷酸化，Greengard 的實驗室分離出其中一個蛋白分子，定名為 DARPP-32100 （代表由 dopamine 及 cAMP 所活化之磷酸蛋白， 32 是分子量 32,000 daltons）當細胞內 cAMP 因為 dopamine 活化而增加之後，其活化 protein kinase A(PKA)，PKA 再將 DARPP-32 磷酸化成 pDARPP，而 pDARPP 是很強的 PP-1 phosphatase 抑制劑。因為 PP-1 在神經細胞內主要負責磷酸化蛋白分子的去磷酸化(dephosphorylation) 的工作，若是 PP-1 受到抑制，則許多下游的酵素及離子通道的磷酸化程度會增加，DARPP-32 PP-1 之訊息傳遞鏈與精神亢奮劑或抗精神分裂藥物之藥理機轉可能有關。在前面第二章第三節中醫寒熱理論探討中的寒證現代醫學研究便曾提到，寒證其 dopamine 的含量是降低的，對照圖 7 所示，當 dopamine 作用在 D1 受體時，可以增加 cAMP，造成精神亢奮；反之，dopamine 一旦下降則精神亢奮的狀態便可緩解。（圖 7）在 dopamine 作用的神經細胞中，DARPP 是一個關鍵性蛋白分子，它可以調節許多受體或離子通道的磷酸化。DARPP-32 PP-1 在某些神經中扮演著很重要的訊息傳遞工作。未打”X”代表興奮，打“X”代表抑制之步驟。dopamine 可以增加 cAMP，造成精神亢奮。大腦中的神經傳導物質如 dopamine、serotonin、 norepinephrine 均會影響情緒，左右著人的知覺和思考；例如當腦部釋放 serotonin 可使壓力獲得舒解；當腦部釋放 dopamine 或 norepinephrine 可使我們的思路和行動更敏捷，但過量時３６.

(37) 將會造成話會變多話、情緒欣快、活動量大增、坐立難安、煩躁不安等 101。本研究發現這三種寒藥均可下調 Calmodulin，或許是藉由影響 adenylate. cyclase、. phosphodiesteras、calcineurin 等綜合作用，而改善熱證患者煩躁不安之症狀，但因此作用之機轉複雜，故仍須更進一步研究。三. 激活酵素系統： Ca2+與 CaM 結合生成 CaM-Ca2+複合物,導致 CaM 的構象改變而被活化，啟動 CaM-Ca2+蛋白激? ，繼而促使某些蛋白質或? 的磷酸化，引起相應的生物學效應，如磷酸化? 磷酸化、促醣原分解、肌球蛋白輕鏈激? 磷酸化以促使平滑肌收縮等。CaM-Ca2+複合物也可直接識別啟動細胞內某些蛋白質或? ，如其可直接引起肌鈣蛋白 C （troponin C）的構象改變，而導致肌肉收縮。本研究發現此三種寒藥均可下調 Calmodulin，或許可藉由此機制來減少熱證病人體內酵素系統的活動，使身體一切機能減緩，來減少熱量產生，《本經》提出“療熱以寒藥” 。《素問· 至真要大論》謂：“熱者寒之” 。似乎可由此得到間接的證明。四. 能量的啟動器：肌肉在靜止狀態時，調鈣素(CaM)會阻礙肌凝蛋白(myosin)與肌動蛋白 (actin)之間的聯結。當神經衝動傳導到肌肉時，細胞內肌質網的膜蛋白發生構型改變，對鈣離子（Ca2+）通透性大大增加，貯存在肌質網內的 Ca2+大量釋出；當胞漿內 Ca2+濃度升高至一定程度即與調鈣素(CaM)結合，使調鈣素自身發生構型變化，與無活性的肌凝蛋白輕鏈激?. 102. 結合形成有活性的複合物。通過 ATP 水解，. 促使肌凝蛋白輕鏈磷酸化，引起肌凝蛋白與肌動蛋白的結合，兩者之間發生相對活動即表現出肌肉收縮現象。當神經衝動停止，肌質網膜蛋白對 Ca2+通透性降低，胞漿中的 Ca2+通過內質網的 Ca 泵（具 ATP ? ATPase，adenosine triphosphatase 活性的蛋白質）輸回內質網貯存；當 Ca2+濃度恢復到收縮前時，調鈣素與肌凝蛋白輕鏈激? 分離。另有一種磷酸? 將肌凝蛋白輕鏈上的磷酸根分開，使肌凝蛋白輕鏈去磷酸化；而肌凝蛋白輕鏈激? 本身在依賴 cAMP 的蛋白激? 作用下磷酸化，明顯降低了對調鈣素的親和力，從而肌肉又恢復到鬆弛狀態。３７.

(38) 本研究發現這三種寒藥均可下調調鈣素(Calmodulin,CaM)，且有可能藉此機制來減少熱證病人身體肌肉的活動，以減少熱之產生。五. 活化巨噬細胞：炎症反應吸引免疫系統部分進入損傷或感染部位並表現? 血流供應增加和血管通透性提高，嗜中性細胞和單核細胞離開血管而進入組織，微生物被吞噬細胞(嗜中性細胞和巨噬細胞)吞噬，力圖使感染局限於最小範圍。炎症反應包括在微生物? 物的趨化作用下，吸引吞噬細胞，使其向炎症部位移動，與微生物接觸並吞噬微生物。炎症是機體對外來刺激? 生的一種病理反應過程，症狀表現? 局部的紅腫熱痛，病理檢查可發現有大量炎症細胞如粒細胞、巨噬細胞的局部浸潤和組織壞死，在此一過程中，主要由巨噬細胞和活化的淋巴細胞? 生的 cytokines 來參與特異性免疫反應，不管是局部或全身感染，這些炎症 cytokines(白介素-1,白介素 -6,腫瘤壞死因子,?-干擾素)活化了宿主非抗原特異性的急性期反應，並可直接刺激發熱中樞引起全身發燒，發熱是急性期最顯著的症狀。目前對於熱原的本質一致認? 它就是細菌內毒素（脂多糖），多年來的研究表明，熱原進入人體血液循環系統後，並不直接引起發熱和其他毒性反應，但它可使單核細胞釋放「內源性熱原」，它們包括了白介素-1、腫瘤壞死因子和干擾素等。這種內原性熱原可直接作用於下丘腦體溫調節中樞，刺激體溫中樞使機體發熱；發熱會誘導血管內皮活化，促進單核球和中性粒細胞對血管內皮細胞粘附，進而跨過血管壁到達感染部位，發揮吞噬抗感染作用；或直接刺激吞噬細胞和其他各種細胞釋放炎症介質(如前列腺素等)及炎性蛋白，而引起炎症反應。 Mechanism of Fever. PMN leukocyte、Monocyte Macrophages、Kupffer cells. x. Endoxin ，Inflammation Other pyrogenic stimuli. Endogerous. Preoptic area of the hypothalamus. Fever ３８. (圖 11)發燒的機轉.

(39) 目前已知巨噬細胞(macrophage)分泌內原性熱原，如白介素-1、腫瘤壞死因數和干擾素等，可能與 G proteins 的活化有很大的關係，而 Calcium 在此一分泌功能上扮演一重要角色. 103. 。 Macrophages 是由 Monocytes 分化而來，在. Monocytes 分化成 macrophages 的過程中，不同的 phosphodiesterase isoform(PDE) 包括 PDE1 表現會增加，phosphodiesterase isoform 表現增加意義為何目前尚未清楚，PDE1 乃是 Ca2+/CaM 所調節之 PDE。危北海在體外實驗中發現，由黃連、黃芩、木通、大黃、甘草組成之方藥，對內毒素誘導之小鼠腹腔巨噬細胞分泌的 TNF、IL-1、IL-6,有明顯的抑制效應；另外，對內毒素誘導而產生的人外周血單核細胞分泌上述的 cytokines 亦呈顯著抑制作用. 104. 。. 本研究發現三種寒藥均可下調 Calmodulin ，而 Ca2+/CaM 可活化 phosphodiesterase 1，是否藉由此一機制來抑制內原性熱原的分泌而對抗內毒素所致機體發熱等多種熱象（圖 11），以達清熱解毒目的，可能尚需進一步研究。由結果得知，大於 2 倍標準差上調的基因中並無三種中藥均出現上調者，不過在兩兩比較之後卻發現在大於 2 倍標準差上調的基因中黃連和黃柏有 12 個上調基因相同，黃芩和黃柏有 3 個上調基因相同，而黃芩和黃連則沒有交集；在小於負 2倍標準差下調的基因中兩兩比較之下發現下黃連和黃柏有34個下調基因相同；黃芩和黃柏有 14 個下調基因相同，而黃芩和黃連則有 12 個下調基因相同。可知黃連與黃柏在基因的表達方面似乎較接近。在中醫的藥理上，這三種藥均有清熱燥濕、瀉火解毒的作用，可療瘡瘍腫毒，並可治濕熱痢及黃疸 105；但黃芩則較偏於上焦，即機體的上半部位，黃連則偏於中焦，即機體的中半部位，黃柏則偏於下焦，即機體的下半部位，不論在中醫古籍的歸經或主治項目，可以發現黃芩和黃連比較接近，但在我們的結果中卻發現在基因晶片的表現上反而是黃連和黃柏有較多共同上調或下調的基因，這或許是因為黃連與黃柏在現代的藥理研究中發現二者之主要成分均為小檗鹼（黃連素），黃連另含黃連鹼、甲基黃連鹼棕櫚鹼及非洲防己鹼３９. 106. 等；而黃柏則另含.