【11】證書號數：I461541
【45】公告日： 中華民國 103 (2014) 年 11 月 21 日
【51】Int. Cl.： C12Q1/68 C40B40/06
(2006.01) (2006.01)
C12Q1/70 (2006.01)
發明 全 6 頁
【54】名 稱：檢測動物或植物病原之引子組、方法及套組
PRIMER SET, METHOD AND KIT FOR DETECTING PATHOGEN IN ANIMALS OR PLANTS
【21】申請案號：101126506 【22】申請日： 中華民國 101 (2012) 年 07 月 23 日
【11】公開編號：201404884 【43】公開日期： 中華民國 103 (2014) 年 02 月 01 日
【72】發 明 人： 李國賓 (TW) LEE, GWO BIN；張文馨 (TW) CHANG, WEN HSIN；王志宏 (TW) WANG, CHIH HUNG；陳宗嶽 (TW) CHEN, TZONG YUEH；王廷瑜 (TW) WANG, TING YU；李龍湖 (TW) LEE, LONG HUW；楊佳玲 (TW) YANG, JIA LING；王惠亮 (TW) WANG, HUI LIANG；王怡瑾 (TW) WANG, I CHIN；莊智傑 (TW) CHUANG, CHIH CHIEH；詹富智 (TW) JAN, FUH JYH；李品臻 (TW) LI, PING CHEN
【71】申 請 人： 國立成功大學 NATIONAL CHENG KUNG UNIVERSITY
臺南市東區大學路 1 號
【74】代 理 人： 蔡東賢
【56】參考文獻：
TW 201224152A1 US 20060115820A1
US 005607835A
Wataru Yamazaki et al., “Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using a loop-mediated isothermal amplification”, BMC Microbiology 2008, 8:94, pp.
1-7.
Wataru Yamazaki et al., “Development of a loop-mediated Isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus”, BMC
MicrobiologySeptember 2008, 8:163, pp.1-7.
Siyi Chen et al., “Development of a toxR-based loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio
parahaemolyticus”, BMC Microbiology 2010, 10:41.
Feifei Han et al., “Detecting Potentially Virulent Vibrio vulnificus Strains in Raw Oysters by Quantitative Loop-
Mediated Isothermal Amplification”, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Apr. 2011, p. 2589–2595.
審查人員：蔡付樺
[57]申請專利範圍
1. 一種適用於圈環形核酸擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)反應之套組，
其包含第一引子組及第二引子組，其中：第一引子組包含 SEQ ID Nos.1 至 4 或其互補股 之引子；及第二引子組包含 SEQ ID Nos.6 至 9 或其互補股之引子。
2. 根據請求項 1 之套組，其另包含選自第三引子組至第十四引子組之至少一引子組，其中 第三引子組包含 SEQ ID Nos.11 至 14 或其互補股之引子；第四引子組包含 SEQ ID Nos.
16 至 19 或其互補股之引子；第五引子組包含 SEQ ID Nos.21 至 24 或其互補股之引子；
第六引子組包含 SEQ ID Nos.26 至 29 或其互補股之引子；第七引子組包含 SEQ ID Nos.
31 至 34 或其互補股之引子；第八引子組包含 SEQ ID Nos.36 至 39 或其互補股之引子；
第九引子組包含 SEQ ID Nos.41 至 44 或其互補股之引子；第十引子組包含 SEQ ID Nos.
46 至 49 或其互補股之引子；第十一引子組包含 SEQ ID Nos.51 至 54 或其互補股之引 子；第十二引子組包含 SEQ ID Nos.56 至 59 或其互補股之引子；第十三引子組包含 SEQ ID Nos.61 至 64 或其互補股之引子；及第十四引子組包含 SEQ ID Nos.66 至 69 或其互補 股之引子。
3. 根據請求項 2 之套組，其中該第三引子組另包含 SEQ ID No.75 之輔助正向引子及 SEQ ID No.76 之輔助反向引 子；該第五引子組另包含 SEQ ID No.77 之輔助正向引子及 SEQ ID No.78 之輔助反向引子；該第六引子組另包含 SEQ ID No.79 之輔助正向引子及 SEQ ID No.80 之輔助反向引子；該第十一引子組另包含 SEQ ID No.71 之輔助反向引子；該第 十二引子組另包含 SEQ ID No.72 之輔助反向引子；該第十三引子組另包含 SEQ ID No.
73 之輔助反向引子；及該第十四引子組另包含 SEQ ID No.74 之輔助反向引子。
4. 根據請求項 1 之套組，其另包含一種探針，其係選自由 SEQ ID Nos.5、10 及其互補股所 組成之群。
5. 根據請求項 2 之套組，其另包含一種探針，其係選自由 SEQ ID Nos.15、20、25、30、
35、40、45、50、55、60、65、70 及其互補股所組成之群。
6. 根據請求項 4 之套組，其另包含一磁珠，且該磁珠係連結該至少一探針。
7. 根據請求項 5 之套組，其另包含一磁珠，且該磁珠係連結該至少一探針。
8. 根據請求項 1 至 7 任何一項之套組，其另包含圈環形核酸擴增反應所需之試劑。
9. 根據請求項 1 至 7 任何一項之套組，其另包含一微流體晶片。
10. 根據請求項 1 至 7 任何一項之套組，其另包含膠體電泳系統、吸收光偵測系統(absorbance detection system)或螢光偵測系統(fluorescence detection system)以檢測圈 環形核酸擴增反 應之產物。
11. 根據請求項 1 至 7 任何一項之套組，其另包含裂解緩衝液，以使一檢體裂解。
12. 一種檢測動物或植物病原之方法，其包含使用至少一根據請求項 1、4、6 及 8 至 11 任何 一項之套組與待測樣品中之核酸進行圈環形核酸擴增反應，如有至少一擴增反應發生，
則該待測樣品包含動物或植物病原。
13. 根據請求項 12 之方法，其另包含使用至少一根據請求項 2、3、5 及 7 任何一項之套組與 待測樣品中之核酸進行圈環形核酸擴增反應。
14. 根據請求項 12 之方法，其中：如該待測樣品係源自於魚體，且該待測樣品中之核酸與該 第一引子組產生擴增反應，則該魚體係經感染，且表現抗病毒蛋白(Mx)；及如該待測樣 品中之核酸與該第二引子組產生擴增反應，則該病原包含弧菌(Vibrio spp.)。
15. 根據請求項 13 之方法，其中：如該待測樣品係源自於魚體，且該待測樣品中之核酸與該 第一引子組產生擴增反應，則該魚體係經感染，且表現抗病毒蛋白(Mx)；如該待測樣品 中之核酸與該第二引子組產生擴增反應，則該病原包含弧菌(Vibrio spp.)；如該待測樣品 中之核酸與該第三引子組產生擴增反應，則該病原包含傳染性喉頭氣管炎病毒(Infectious
Laryngotracheitis virus，ILTV)；如該待測樣品中之核酸與該第四引子組產生擴增反應，
則該病原包含新城雞病病毒(newcastle disease virus，NDV)；如該待測樣品中之核酸與該 第五引子組產生擴增反應，則該病原包含家禽里奧病毒(avian reovirus，ARV)；如該待測 樣品中之核酸與該第六引子組產生擴增反應，則該病原包含禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)；如該待測樣品中之核酸與該第七引子組產生擴增反應，則該病原包含黃瓜 花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)；如該待測樣品中之核酸與該第八引子組產生擴 增反應，則該病原包含煙草鑲嵌病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)；如該待測樣品中之 核酸與該第九引子組產生擴增反應，則該病原包含細菌性軟腐病菌(Pectobacterium
carotovorum subsp.Carotovorum)；如該待測樣品中之核酸與該第十引子組產生擴增反應，
則該病原包含瓜類細菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)；如該待測樣品中之 核酸與該第十一引子組產生擴增反應，則該病原包含蘭花惠蘭嵌紋病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)；如該待測樣品中之核酸與該第十二引子組產生擴增反 應，則該病原包 含齒舌蘭輪斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)；如該待測樣品中之核酸與該第 十三引子組產生擴增反應，則該病原包含番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，
TSWV)；及如該待測樣品中之核酸與該第十四引子組產生擴增反應，則該病原包含番椒 黃化病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)。
16. 根據請求項 12 之方法，其另包含使用至少一探針與待測樣品中之核酸進行雜合反應，其 中該至少一探針係選自由 SEQ ID Nos.5、10 及其互補股所組成之群。
17. 根據請求項 13 之方法，其另包含使用至少一探針與待測樣品中之核酸進行雜合反應，其 中該至少一探針係選自由 SEQ ID Nos.、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、
65、70 及其互補股所組成之群。
18. 根據請求項 16 之方法，其中該至少一探針係連結至一磁珠上。
19. 根據請求項 17 之方法，其中該至少一探針係連結至一磁珠上。
20. 根據請求項 12 至 19 任何一項之方法，其另包含：(a)以該磁珠純化一檢體中之核酸；(b) 以該引子組與由步驟(a)之核酸進行圈環形核酸擴增反應；及(c)檢測圈環形核酸擴增反應 之產物。
圖式簡單說明
圖 1 為包含微流體控制模組及核酸擴增模組之整合式微流體 LAMP 系統圖，測得微流體 晶片之尺寸為 44 mm×22 mm。
圖 2 為根據本發明之 LAMP 偵測出三種易感染石斑魚之病原微生物與一種抗病毒蛋白結 果圖。(a)神經壞死病毒，泳道 1：75 分鐘；泳道 2：60 分鐘；泳道 3：45 分鐘；泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；(b)抗病毒蛋白；泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：負向控制組(dd H2 O)；泳道 2：樣品組；(c)弧菌；泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：負向控制組(dd H2 O)；泳道 2：樣品組。
圖 3 為根據本發明之利用 LAMP 或 RT-LAMP 偵測出四種 易感染禽類之病原微生物結果 圖。(a)傳染性喉頭氣管炎病毒；泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：負向控制組(dd H2 O)；泳道 2 及 3：樣品組(DNA)；(b)新城雞病病毒；泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：
負向控制組(dd H2 O)；泳道 2：樣品組；(c)家禽里奧病毒；泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；
泳道 1：樣品組(RNA)；泳道 2：負向控制組；(d)禽流感病毒；泳道 L：100 bp DNA 階梯標 記；泳道 1：負向控制組(dd H2 O)；泳道 2：樣品組(RNA)。
圖 4 為根據本發明之利用 LAMP 或 RT-LAMP 偵測出四種易感染植物種苗之病原微生物 結果圖。(a)黃瓜花葉病毒；泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：傳統負向控制組；泳道 2：傳統樣品組；泳道 3：微流體負向控制組；泳道 4：微流體樣品組；(b)細菌性軟腐病菌；
泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：Aa 負向控制組(dd H2 O)；泳道 2：Aa 樣品組；泳道 3：Pcc 負向控制組(dd H2 O)；泳道 4：Pcc 樣品組；(c)瓜類細菌性果斑病菌泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：負向控制組；泳道 2：樣品組 1；泳道 3：樣品組 2；(d)煙草鑲嵌病 毒泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：負向控制組；泳道 2：樣品組。
圖 5 為根據本發明之利用 LAMP 或 RT-LAMP 偵測出四種易感染蘭花之病原微生物結果 圖。(a)蘭花惠蘭嵌紋病毒；泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：DEPC-H2 O；泳道 2：
健康組織之 RNA；泳道 3：於 67℃進行雜合反應；泳道 4：於 63℃進行雜合反應；泳道 5：
於 60℃進行雜合反應； 泳道 6：於 57℃進行雜合反應；(b)齒舌蘭輪斑病毒；泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：健康組織之 RNA；泳道 2：感染 ORSV 之組織；(c)番茄斑萎病毒；
泳道 L：100 bp DNA 階梯標記；泳道 1：ddH2 O(微流體)；泳道 2：健康組織之 RNA(微流 體)；泳道 3：感染組織之 RNA(微流體)；泳道 4：ddH2 O(傳統)；泳道 5：健康組織之 RNA (傳統)；泳道 6：感染組織之 RNA(傳統)；(d)番椒黃化病毒；泳道 L：100 bp DNA 階梯標 記；泳道 1：ddH2 O(微流體)；泳道 2：健康組織之 RNA(微流體)；泳道 3：感染組織之 RNA (微流體)；泳道 4：ddH2 O(傳統)；泳道 5：健康組織之 RNA(傳統)；泳道 6：感染組織之 RNA(傳統)。
