一、脊髓小腦萎縮症之分類

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壹、序論

自體顯性脊髓小腦共濟失調症 (autosomal dominant spinocerebellar ataxias， ADCA)，簡稱小腦萎縮症，是台灣罕見疾病中的最大宗一支，此家族顯性遺傳的罕見疾病，通常在青壯年時期發病，患者會因小腦萎縮退化而導致運動與平衡神經失調，患者也常因動作唐突怪異而遭人鄙視，造成身心重創，其典型症狀包括，走路東搖西晃、講話含糊不清、進餐會噴出飯粒、喝水會嗆到或從鼻孔噴出水來、眼球顫動、看物有複影口齒不清、失去平衡感、身體缺乏協調能力，因走路搖擺狀似企鵝，因此又稱為「企鵝家族」。患者最後因行動失調而缺乏正常運動，致使肌肉將逐漸萎縮，坐輪椅或躺在床上是許多病患的悲劇宿命。

小腦萎縮症的遺傳模式，多為顯性遺傳，父母一方有小腦萎縮症者，其子女將有50%的遺傳機率，因此只要親代中任何一人帶有此病的基因，就能夠遺傳至子代造成發病。多數之致病原因是由遺傳性的運動失調缺陷基因所製造出不正常的蛋白質，除了可能會造成蛋白質結構上的改變而導致失去功能之外，也有可能因蛋白質的大量累積而對神經細胞產生毒性，使神經細胞持續地退化而死亡甚至是失去功能，因而造成了肌肉對從腦部傳來的神經訊號無法同步，令肌肉、四

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肢不協調的症狀越來越明顯。所以若有一個具有SCA 疾病的家族，

則他們的後代很有可能因三核苷酸片段重複次數逐漸增加而提早出現SCA 的疾病症狀，導致無法隨心所欲的行動甚或控制軀體的情形發生。根據「中華小腦萎縮症協會」的資料顯示，國內曾有3代40人

發病的紀錄；然而小腦萎縮症也非全部來自遺傳，目前台灣的小腦萎縮症病患中，約有25%屬非遺傳性的病人 (Non-hereditary ataxias)，致病原因可能與感染毒物、藥物、外力受傷、基因突變等多種複雜因素有關。關於此疾病，目前為止仍未找到良好的解決、治療方法，僅能以藥物暫時控制症狀，延緩其病情的加遽。

一、脊髓小腦萎縮症之分類

自體顯性脊髓小腦共濟失調症 (autosomal dominant spinocerebellar ataxias， ADCA) 是臨床上由不同基因構成的一群疾病，而其中因小腦的逐漸萎縮退化 (附圖三) 而包括步態問題、講話困難、視覺模

糊、漸進式的四肢和步伐失調為其特徵甚至有嚴重的眼球震顫等特性。退化的過程可能局限於小腦 (ADCA III 類型) 或者可能另外與視網膜 (ADCA II 類型) 有關。ADCAs根據詳細的臨床和病理學的描述作分類。藉由脊髓的退化從脊髓小腦 (spinocerebellar) ，小腦 (cerebellar)，橄欖橋腦小腦 (olivo-ponto-cerebellar) 和齒狀核紅核萎

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縮 (dentato-rubral atrophies) 區分出不同的共濟失調症。Harding在 1981年根據他們的臨床特徵 (ADCA I型~III型，附表一~三) 的模式分類共濟失調症 (Schols et al., 2003)。異質性最高的一群就屬ADCA I

型，研究人員從基因座藉由另外多變的徵兆描述小腦共濟失調症，例如:眼肌麻痺、眼睛萎縮、痲痺症、錐體外的徵兆、周邊神經的病變、

智力衰退等等，此一類群包括SCA1、SCA2、SCA3、SCA8、SCA10、

SCA12、SCA13、SCA17、SCA18、SCA19、SCA20、SCA21、SCA22、

SCA23 和FGF14 等。至於以基因座描述色素斑退化 (ADCA II 類型) 的小腦共濟失調症ADCA II，除了小腦萎縮的症狀外，還會出現色素、視網膜退化的現象，包括SCA7；而以基因座描述不縮短壽命 (ADCA III 類型) 的單純小腦共濟失調症ACDC III 則在臨床症狀上則只出現單純的小腦萎縮症狀，包括SCA5、SCA6、SCA11、SCA14、

SCA15 和SCA16 等 (Singh et al., 1993)。遺傳學的分類則從1993年起

藉由共濟失調患者穩定增加的數目、地點和基因的報告而得到，是達到普遍認同的第一個分類，後來根據遺傳學的連鎖分析 (linkage analysis) 方法，從許多的病人家族中計算出了各類型脊髓小腦萎縮症的基因座位置 (gene loci)。在分子生物學上的分類，ADCAs被稱為共濟失調spinocerebellar ataxia (SCAs)，並且按照基因描述次序給予編號。所以SCA 不管在病理解剖學的發現或歸納，脊髓小腦

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(spinocerebellar) ，小腦 (cerebellar) ，橄欖橋腦小腦 (olivo-ponto- cerebellar) 萎縮以分子生物學來歸類都能獲得適用。從目前已發表的二十八型脊髓小腦失調症來看，因不同類型的脊髓小腦萎縮症和神經退化型疾病在臨床上症狀有許多重疊的部份所以臨床上我們並無法單憑症狀來區分各個類別，假如以分子層次來分類則能輔助臨床上的診斷。依據分子層次，可以將脊髓小腦運動失調症區分為三大類，第一類疾病分別在不同基因的轉譯序列上含有不同長度的CAG三核苷酸重複擴增，而這些CAG三核苷酸重複的擴增則會轉譯出帶有多麩醯胺酸 (poly-Q) 的蛋白，這些含有多麩醯胺酸的蛋白並無法由細胞所清除，在長時間累積下會增加聚集在細胞核內的量 (Zoghbi and Orr, 2000)，但其致病性影響的機制未完全明朗，此類包含SCA1、SCA2、

SCA3、SCA7和SCA17；第二類則與鈣或鉀離子通道蛋白的基因上的

突變有關，此類包含CA6、EA1 (episodic ataxia types 1) 和EA2 (episodic ataxia types 2)；第三類則是核苷酸的擴增皆在不會轉譯出蛋白的序列上，相反的這些擴增的片斷位於非轉錄區域內，然而非轉錄 區域的變異可能調控著下游基因的表現量，例如 SCA8 ( 或稱 KLHL1AS) ，是在第十三號染色體短臂3'端非轉譯區CTG三核苷擴增 所引起 (Koob et al., 1999)；而SCA10則是脊髓小腦運動失調症中第一個非因三核苷酸重複序列擴增而導致的疾病，其致病基轉為在SCA10

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基因的不會轉譯出蛋白質的序列中存在ATTCT五核苷酸重複的擴增現象 (Matsuura et al., 2000)；而SCA12的致病基轉則是因為PPP2R2B 基因的5'端產生了CAG三核苷酸重複的擴增現象 (Holmes et al., 1999)。此外仍有多種SCA其致病基因尚未被分離，包括SCA4、

SCA5、SCA9、SCA11、SCA13-16、SCA19、SCA21、SCA22等。

(參考 http://www.neuro.wustl.edu)

二、流行病學統計

流行病學研究當中，SCAs 病例估計大約在每十萬人口中大約有 0.8~3.5 人 (Silva et al., 1997)，但是在某些特定的家族族群，其罹患的比率卻是異常的高。例如在古巴的 Holuguin 當地，其 SCA2 的罹患率為 1:750；或者是在亞速爾群島上的弗洛裡斯裡的 SCA3 的比例為1︰140 (Gispert et al., 1993)。SCA 其遺傳學的類型頻率在不同的人種上也有很大量的變化。在一般的 SCAs 疾病中，SCA1、SCA2、

SCA3、SCA6、SCA7 是最為常見的形式，並且佔所有 ADCA 家庭的比例高達50%~80%，SCA10 只在墨西哥的家庭被描述過。目前至少有20%的 ADCA 的家庭無法鑑定出致病的 SCA 基因。

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三、 SCA12的病理、病徵與致病原因

於臨床的診斷上，可利用電腦斷層掃瞄 (CT) 或磁振造影 (MRI) 的方法，對腦部進行觀察，可以判定是否有可能得到SCA。由 (附圖八) 中能夠發現病人在於小腦、腦幹等處，明顯見到了因萎縮和退化的現象所造成小腦的溝紋變的比正常人來的更明顯。另一方面，使用顯微鏡觀察小腦、腦幹和神經組織的切片，也可發現神經元數目的減少與萎縮的情形。SCA12是在已知基因PPP2R2B基因5’端CAG擴增所 造成的自體顯性遺傳疾病脊髓小腦共濟失調症 (附表六)，在一群德裔的美國家族中首先被鑑定出來 (Holmes et al., 1999; Holmes et al., 2001)，後來也在14個印度裔的族群中發現此疾病的發生 (Fujigasaki et al., 2001; Srivastava et al., 2001; Bahl et al., 2005)。印度罹患小腦共濟失調症的77個家族中做系統性的評估發現，有6.5%的病人有SCA12 的變異性，因此在這些印地安裔的族群中SCA12佔所有小腦共濟失調

症的第三名 (SCA1 15.6%, SCA2 24.7%, SCA3/MJD 2.6%, SCA7 2.6%) (Srivastava et al., 2001)，然而在美國或歐洲家族遺傳性小腦共濟失調症卻沒有發現到SCA12的病例 (Holmes et al., 1999; Schols et al., 2000; Cholfin et al., 2001; Fujigasaki et al., 2001; Brusco et al., 2002;

Maruyama et al., 2002; Silveira et al., 2002)，這也暗示著SCA12在這些族群之發生率非常的低。正常個體CAG重複的片段已經在歐洲、法

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國、印度地區裡被確定(Holmes et al., 1999; Fujigasaki et al., 2001;

Srivastava et al., 2001)，在這些例子中，正常的重複片段大約是7–32 triplets，但是印地安裔的人種之大眾重複次數卻比其他族群多出12 triplets (Fujigasaki et al., 2001)，如同SCA12一般，其他的SCAs疾病的發生頻率在某特定族群下也可能會與正常發生SCAs的頻率相當。

正常SCA12其三核苷酸重複數目的閾值至今仍未決定，但現在知道假如擴增的片段在55–78 triplets，則會影響到個體的表現，在家族性和自發性的共濟失調症的933個歐洲病患裡，40和41 triplets的擴增在自發性晚發型的小腦共濟失調症 (IDCA) 中被發現，也有49 triplets重複

片段的患者其病徵類似 SCA12 的表現型或庫賈氏症 (Creutzfeld-Jakob disease)，而中等長度重複片段也在不確定表現型之病人發現，然而45 triplets重複片段也在一位28歲的印地安人中被鑑定出來，但其本身並沒有家族病史和精神方面的疾病 (Fujigasaki et al., 2001)，這種長度的重複已經超越正常人的重複片段，這可能意味著不同的個體有不同罹患SCA12的風險。

四、PP2A (phosphatase 2A)

在所有真核細胞中磷酸化的產生對轉譯後調控的機制非常重要、而磷酸化的產生主要決定細胞裡面磷酸激酶 (kinase) 和去磷酸

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(phosphatase) 者之間的平衡狀態，雖然磷酸激酶已經在很多的文獻報導中被提起，其功能牽涉細胞裡面一連串的訊息傳遞，但是比較有關於去磷酸酶的了解仍然非常的少。PP2A (phosphatase 2A) 在演化上是一種非常保守的去磷酸酶 (phosphatase)，是細胞內具 serine/threonine

專一性的去磷酸酶中的其中一種。在細胞內平衡的調控中，我們知道 kinas 和 phosphatase 對調控細胞生長非常的重要，雖然細胞中的 phosphatase 是以 PP1 表現量最高，但是 PP2A 已經被證實調控多種細胞功能，包括細胞生長、分化、去氧核醣核酸的複製、細胞型態、

細胞質的分裂、離子孔道、神經傳導物質的釋放、微管的組成和細胞自戕等。

PP2A主要包含三個次單元分別為A (結構次單元)，B (調控次單元)，C (催化單元)(附圖四)；在哺乳動物中，PP2A的調控單元主要有四個基因家族的基因調控其蛋白質的表現，他們分別是B (or PR55), B’ (PR61, B56)，B’’ (PR48, PR59, PR72/130)和B’’’ (striatin,SG2NA) (Gotz et al., 1998; Kong et al., 2004; Strack et al., 2004) (附圖五)；這些

不同調控次單元的基因家族的功能可能包括調控催化次單元的活性、受質的特異性和PP2A在細胞內存在的位置。而PP2A其B次單元家族有四個成員，分別為Bα、Bβ、Bγ及Bδ。而B’家族的五個成員：

B’α、B’β、B’γ、B’δ及B’ε。B’’家族包含四個蛋白來自三個基因，它

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們分別是 (PR72/130, PR48, PR59)，而B”次單元是種能結合鈣離子的

核蛋白，也有文獻報導指出此蛋白能調控細胞G1/S 的進行 (Voorhoeve et al., 1999; Yan et al., 2000; Stevens et al., 2003)。最近用 RNAi的方式在果蠅細胞內也觀察到B次單元的家族調控活化有絲分裂蛋白質激酶的訊號，而B’次單元家族能保護其細胞，避免自戕的現象發生 (Li et al., 2002; Silverstein et al., 2002)。

五、PP2A之B次單元表現的位置

Bα是在B次單元中含量最高者，在很多不同的細胞都會表現，可調控著PP2A對tau和vimentin兩種蛋白的去磷酸化 (Sontag et al., 1995;

Sontag et al., 1996; Turowski et al., 1999)。最近發現Bδ次單元表現在很多組織 (Strack et al., 1999)，非常類似Bα次單元。Bβ和Bγ次單元是B 次單元家族中使PP2A表現神經特異性的成員，因此能使PP2A在腦部表現。強力表現Bγ次單元能促使PC12細胞的分化，此影響可能是藉由活化在serine/threonine kinase B-Raf上游的MAPK整個一連串的訊號所造成 (Strack et al., 2002)。雖然A，Bα，C基因所表現的蛋白質在很多組織都有表現，但Bβ、Bγ卻只能在腦中被偵測到，因此不同的B 次單元或許調控著不同時期腦部神經的發育，或神經與神經之間的連結。在PP2A B次單元中的Bβ基因中又藉由交替剪裁的方式做出Bβ1

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與Bβ2兩種不同的mRNA (Dagda et al., 2003)，兩次單元protein有相異 N端，而此不同氨基酸構成的蛋白質也間接影響到整個酵素的活性 (附圖六)。最近Dr. strack團隊的報告指出Bβ1的表現量在不同的組織中較Bβ2高出甚多，且Bβ2的量在神經發育過程中多集中在細胞粒線體上 (Dagda et al., 2003)，這似乎暗示經由不同交替剪裁的兩個蛋白質在生物發育與演化的調控扮演著不同的角色。

六、Neuron specific enolase

Neuron specific enolase (NSE)是一種在大鼠中表現的glycoprotein，

並在肝臟與肌肉不同組織有不同的isoenzyme，在各種不同類型的神

經細胞亦皆有表現，不論在體內或體外的培養環境中，都被拿來當做一個神經細胞的分子標記蛋白 (Schmechel et al., 1980)。假如以神經細胞的發育來看，在胚胎時期或剛出生的階段non-neuronal enolase (NNE) 的表現量會比較高，在神經發育開始之後NSE的表現量會跟著提高，因此NSE可以廣泛的當做神經細胞的分子標記蛋白，也可以作為正在分化中的神經細胞突觸連結的指標 (Schmechel et al., 1980)。

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七、研究策略

目前SCA12基因之CAG三核苷擴增，被認為可提高PPP2R2B之Bβ1 之轉錄效率，再進而促進其後續去磷酸酶的反應，因此去磷酸酶和磷酸激酶比例之變化可能會影響到整個細胞內訊息調控進而牽涉細胞的存活。因此我們計畫採neuron-specific-enolase (NSE) 啟動子來大量表現SCA12的致病基因PPP2R2B的兩種蛋白，Bβ1及Bβ2。NSE是一

種醣蛋白，在許多不同類型的神經細胞均有表現，常被拿來作為神經細胞的分子標記蛋白。利用NSE的啟動子，來表現SCA12的蛋白於多種神經細胞組織，應該是較可以模擬臨床SCA12病人之情形，而得到較近似於病人表徵的動物模式。之後除了以特定染色方式觀察轉殖基因鼠腦組織切片型態和是否有不正常蛋白沉澱外也可使用電子顯微鏡或免疫染色經共軛焦顯微鏡觀察細胞特定胞器層次的異常表現。因 SCA12病人小腦、腦幹等處，明顯見到了因萎縮和退化的現象，所以我們預測小鼠的腦部可能會出現病變，然而小腦位於大腦的後下方，

正是主要接受感覺訊息的輸入，做出反應使動器能做出恰當的回應之處。小腦的功能有維持平衡、無意識運動、意識運動和肌肉的協調等四項；而測試這些姿勢與步伐有幾種方式，最常用來測試運動協調 (motor Co-ordination) 的是滾輪測試 (rotarod test)(Bogo et al., 1981;

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Campana et al., 2003)，此外我們我們也加入測試運動所需的技巧如運

動平衡 (beam test) 分析判斷是否有運動失調 (ataxia)、步伐異常 (gait abnormality)(Carter et al., 1999)。此實驗我們利用小鼠建立疾病動物模式更是當前在探討疾病成因及尋求可能治療方式的重要工具。其主要原因在於我們對小鼠的基因體之了解最多，而且大部分之基因在序列及功能上和人類相似度非常高，利用基因轉殖技術，所建立之各種人類相關疾病模式，的確提供臨床上許多珍貴的資料和數據。以神經退化性疾病為例，亨丁頓氏舞蹈症，阿茲海默症，帕金森症及數型小腦共濟失調症等，小鼠模式也已經被建立，而且已被用來篩選相關之治療藥物。

八、研究的重要性

人類疾病的發生，多少都和遺傳因子有關。因此，從這些稀有的，

單一原因的遺傳疾病研究，不僅可以增進民眾之健康，提高人口之品質，達成優生保健之目的，更可以因此讓我們對人類疾病的分子及生理基礎有所瞭解和闡明。由於教育之普及和醫學知識之先進，在台灣地區的脊髓小腦萎縮症病患已意識到基因檢查和生涯規劃的重要性。一般來說，基因轉殖鼠之建立因轉殖基因插入小鼠的基因組位置及數量之不同，將使轉殖基因有不同的表現量，因此，我們可以藉由

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PPP2R2B蛋白表現量與小鼠表現行的型態做相關的比較，以了解是否

蛋白質的表現量即為致病之關鍵所在。當然，藉由此小鼠模式，我們 可以進一步了解PPP2R2B之相關的作用分子機制，並從而探討可能之 致病基因或是藥物的治療途徑，以便加惠實際的臨床患者。