Top PDF 克雷白氏肺炎桿菌第三型纖毛組成蛋白MrkD與MrkF之功能探討

克雷白氏肺炎桿菌第三型纖毛組成蛋白MrkD與MrkF之功能探討

致謝碩士班兩年，真正開啟了我的研究生涯，回想這兩年的生活，並不能稱得上順利，歷經大大小小的實驗瓶頸、試了各種方法卻無法克服的實驗困難，好幾次沮喪不已，真正嚐到了研究的本質-“實驗總是充滿了意外！＂。值得慶幸的是，這兩年的生活並不算太苦悶，因為在我身邊有一個很好的老師-彭老師，老師嚴格卻不嚴厲，對我們的實驗不順不但不會嚴厲責備，取而代之的是不厭其煩的和我們討論，讓我非常感激，也從老師身上學到了許許多多，包括實驗的邏輯思考以及處事態度，相信會讓我一生受用不盡。感謝口試委員張晃猷老師以及楊昀良老師給我寶貴的建議與指教，使得這本論文更加完整。

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克雷白氏肺炎桿菌CG43中第六型分泌系統-I組成蛋白質Hcp、ClpV和VgrG之功能性探討

3.3 建構 hcp、clpV、vgrG 和 vgrG - C 端變異區基因缺損突變株為了探討 Hcp、ClpV 和 VgrG 在克雷白氏肺炎桿菌 CG43 所扮演的角色，以重組基因取代方式分別建構了源自 CG43S3 的 hcp、clpV、 vgrG 基因缺損突變株；同時，為確認 VgrG - C 端變異區之功能，也建構了 vgrG - C 端變異區缺損的突變株。首先，以 PCR 增幅出各目標基因上下游約 1000 個鹼基對之 DNA 片段(圖三 A、圖四 A、圖五 A、C)，將上下游片段結合後接入自殺性載體 pKAS46，分別得到載體 pKAS46-hAB、pKAS46-cAB、pKAS46-vAB 和 pKAS46-vcAB，隨後以接合作用將各載體送入克雷白氏肺炎桿菌 CG43S3 中，藉由同源序列重組置換和抗生素篩選得到基因缺損突變株，最後以 PCR 和具專一性之引子對確認各目標基因確實遭剔除無誤。圖三 B、圖四 B、

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Fur蛋白質在克雷白氏肺炎桿菌CG43中的功能探討

由衷地感謝這兩年出現在我生命裡的所有人，沒有你們，我將不知道如何去完整這趟旅途。這本論文能夠順利完成，最重要的推手，就是我的指導老師，彭慧玲老師。感謝您如海洋一般的寬容，在這兩年的歷程中不斷地和我一起討論、修正實驗的方法及方向，總是在我迷惘的時候，提著一盞溫柔堅定的明燈指引我。還有，感謝兩位口試委員何漣漪老師和楊昀良老師，如此細心地審閱論文初稿，幫助這本論文能夠更加完整嚴謹。此外，也要感謝清大的張晃猷教授提供寶貴的建議，

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克雷白氏肺炎桿菌CG43絲胺酸/蘇胺酸激酶KpnK的功能性探討

iii 謝誌(Acknowledgement) 碩班時光，說長不長，說短不短。謝謝兩年來許多幫助過我的人，很開心有這個緣分可以加入溫暖的彭大家庭，讓我在這裡可以無憂無慮的學習。首先感謝我的指導教授─彭慧玲老師，您宛如媽媽般，指導著我實驗上邏輯的思考，每每在實驗遇瓶頸的時候，就像燈塔般引領我找到新的方向，也在一次次科學新聞討論中，教導我們該注意的許多小細節，在這些討論及指導論文修改的過程中，我總覺得老師的中文、英文以及科學邏輯都好強唷!!(希望我也可以如此)，邏輯思考對我來說是一件要想很久的事，經由老師、學長姐、同學們耐心的訓練，我很開心我進步了，這一切都要歸功於大家細心的教導。除此之外，老師也時常關心我們，尤其在我腳受傷的時候，更貼心的給了我護膝，並也給我們充分的機會，

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克雷白氏肺炎桿菌第一型纖毛和第三型纖毛交互表現的調控

目標一、建構註解為調控基因的特定基因缺損株，探討其對此二纖毛對立表現的影響：利用抗MrkA的血清進行西方墨點法分析和酵母菌凝集試驗顯示：位於此二纖毛基因組間的pecS或pecM基因缺損會提升第三型纖毛的表現；而可以轉譯成EAL功能蛋白的mrkJ（KP4551）和PilZ功能蛋白的mrkH（KP4554）基因缺損對MrkA蛋白的表現量或對克雷白氏肺炎桿菌凝集酵母菌的活性並沒有顯著的影響；然而，破壞 GerE家族的轉錄因子基因mrkI（KP4552）或csgD可以明顯提高其凝集酵母菌的能力，mrkI的缺損更阻斷了MrkA的表現，此結果顯示PecS/M可能是第三型纖毛的負向

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應用奈米技術探討克雷白氏肺炎桿菌第三型線毛的黏附與延展特性

3 圖 1-1 第三型線毛的構成要素與其三維螺旋形結構示意圖本論文中，我們以克雷白氏主要致病因子第三型線毛為樣品，利用電子顯微鏡以及原子力顯微鏡觀測線毛微結構包括直徑、長度與密度。接著，利用雷射鑷夾操控微粒子去黏附單一線毛，並且將之拉長至最大可允許移動量，藉由線毛受力伸長的數據，分析得到線毛的黏附以及延展特性。然後，比較第三型線毛與其他類型的線毛，就其結構和力學性能之間的差異，藉此模擬細菌黏附寄主細胞後受到環境剪力，及其與宿主之間的交互作用，期望未來得知克雷白氏肺炎桿菌入侵人體的方式。在第二章，我們介紹雷射鑷夾的捕捉機制，並利用光功率頻譜密度(PSD)檢測器，據此量化雷射鑷夾橫向捕捉力，

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克雷白氏肺炎桿菌中FUR的功能性分析

計畫成果自評: 本計畫在六各月的執行過程中，順利的完成各項的基因構築的工作，其中 fur 的互補株的構築完成也能進一步確認 fur 突變後對於 Kp 顯型方面的專一性影響，而在探討 Fur 對於 cps 基因啟動子調控上的影響，我們也順利跟 Dr. Hantke 拿到 H1717 來偵測大腸桿菌中 Fur 對於所構築出來的啟動子序列的結合能力，因此我們分別將 K1 和 K2 的莢膜多醣體基因組的啟動子和 rcsAB 的啟動子進行 FURTA 的分析，雖然目前發現皆為陰性反應，即沒有受到 Fur 直接結合所調控，但是我們會進一步針對不同鐵離子濃度以及構築其他與 cps 調控有關的轉錄調控子的啟動子序列來進行更深入的探討。而對於螯鐵系統中，我們也發現在我們先前分析十個具有 Fur 結合區域的啟動子中，只有六個在 FURTA 的實驗中呈現陽性反應，

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克雷白氏肺炎桿菌CG43中磷酸甘露糖異構酶磷酸化的特性探討

i 中文摘要細菌酪胺酸激酶是近年來新建立的蛋白質家族，與真核生物之酪胺酸激酶有著相似的功能。活體外磷酸化實驗證明克雷白氏肺炎菌 CG43 之酪胺酸激酶 Wzc 可以將多醣莢膜基因座上之基因產物包括 6-葡萄醣醛酸脫氫酶 Gnd、甘露糖-1- 磷酸鳥苷醯基轉移酶 ManC 及磷酸甘露糖異構酶 ManB 磷酸化，並增加 Gnd 之酵素活性。本實驗建構克雷白氏肺炎菌 CG43 突變株 Δgnd、ΔmanC 與 ΔmanB 並分析基因缺失的影響，結果發現 ΔmanC 與 ΔmanB 之多醣莢膜合成量明顯下降而生物膜生成增加，為了證實 ManB 活性與酪胺酸殘基磷酸化的關係，我們藉由比對分析選出可能受磷酸化的酪胺酸殘基做定點突變，接著回補實驗分析發現 manB 基因剔除所造成的多醣莢膜含量下降可藉轉殖 ΔmanB 予表現質體

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探討大毒性質體pLVPK在克雷白氏肺炎桿菌致病過程中扮演的角色

在 pLVPK 之中，發現兩個相似的轉錄因子 rmpA 與 rmpA2。過去研究已知在克雷白氏肺炎桿菌 CG43 中，轉錄因子 rmpA2 的缺失會造成莢膜多醣體生合成減少，此現象與另一個轉錄因子 rcsB 無關。本實驗首先利用 RT-PCR 以及南方墨點法證明與 rmpA2 核酸相似度高達 78% 的 rmpA 基因是個活化基因。為了進一步研究 rmpA 基因的功能，我們建構 rmpA 缺失突變株。比較 rmpA 以及 rmpA2 缺失突變株，發現此兩種突變株具有類似的表現型，例如在黏性、莢膜多醣體合成能力均會下降，而生物膜形成的能力會上升。此外，利用 LacZ 報導蛋白，分析莢膜多醣體基因的啟動子在這些突變株的表現差異。

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RcsB蛋白質在克雷白氏肺炎桿菌CG43中抗酸能力所扮演的角色

中文摘要已知 Rcs 雙分子訊息傳導系統參與調控細菌體中許多的生理反應；如同許多腸內菌，此雙分子系統的反應調控蛋白 rcsB 的基因缺損，會明顯的降低克雷白氏肺炎桿菌 CG43 莢膜多醣體的生合成。我們在此研究中探討：是否如同近期報導的大腸桿菌 RcsB 蛋白，克雷白氏肺炎桿菌 CG43 的 RcsB 也具有抗酸調控的功能，並進一步研究其調控機制。我們發現：克雷白氏肺炎桿菌 CG43 在弱酸 (pH 4.4)適應一小時後，其抗酸逆境 (pH 3)能力大幅提高，而 rcsB 基因的缺損會降低其抗酸能力，但 rcsB 的啟動子活性並不受弱酸的誘導。同時，

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克雷白氏肺炎桿菌CG43中 RcsFCDB訊息傳遞所扮演的角色

RcsC 及 RcsD 位於內膜，分別具有組氨酸激酶和組氨酸轉移酶活性； RcsB 是細胞質中的反應調節蛋白。前期實驗室成員的研究發現克雷白氏肺炎桿菌 CG43 其 rcsB 基因缺損會降低莢膜多醣體含量、酸性逆境存活率、膜間質扮隨蛋白 YfdX 及第三型線毛單位蛋白 MrkA 的生成量，本論文探討 RcsF、RcsC 及 RcsD 蛋白對此磷酸根傳遞途徑下游的 RcsB 調控功能的影響。首先，我以同源互換原理建構了克雷白氏 肺炎 桿菌 CG43rcsC 、 CG43rcsD 、 CG43rcsD-hk 、 CG43rcsD-hpt、CG43rcsF 、 CG43rcsCrcsF 突變株，並進一步分析比較這些突變菌株與 CG43rcsB 表現型的差異後發現：CG43rcsD 與 CG43rcsB 有相同的表現型，而 CG43rcsC 與 CG43rcsF 的莢膜多醣與 MrkA 的生成量沒有明顯變化；過度表達 RcsC 會增加莢膜多醣生成量；rcsF 基因缺失會使細菌失去偵測多黏菌素壓力的能力，

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克雷白氏肺炎桿菌 DNA adenine methylase (Dam) 與致病力相關性的研究(1/2)

在致病力調控機轉上的重要性已被證實，去氧核醣核酸腺核? 甲基化? 基因突變之沙門氏桿菌菌株，致病力顯著下降。但去氧核醣核酸腺核? 甲基化? 在克雷白氏肺炎桿菌致病力調控機轉的角色則尚未有人研究。本研究的目的即為探討去氧核醣核酸腺核? 甲基化? 與克雷白氏肺炎桿菌致病力的相關性。我們目前已成功的選殖出克雷白氏肺炎桿菌的去氧核醣核酸腺核? 甲基化? 基因。先利用由 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 網站所搜尋到的 E. coli K12 的去氧核醣核酸腺核? 甲基化? 基因序列為模本，將其基因的 5’及 3’端序列設計為引子對。以在臺灣已知為高毒力的克雷白氏肺炎桿菌原始型菌株

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克雷白氏肺炎桿菌中第三型纖毛的特性分析

JM109 為表現載體構築了表現第三型纖毛的重組質體，分別帶有mrkD V1 ， mrkD V2 ，mrkD V3 和mrkD V4 基因型。而藉穿透式電子顯微鏡來觀察這些重組大腸桿菌表現的纖毛，我們發現mrkD基因型的變異會影響第三型纖毛的長度和型態。同時，測試這些重組細菌黏附第四型和第五型膠原蛋白的能力、生物膜的形成與黏附細胞的活性，結果顯示，E. coli JM109[pMrkABCD V3 F]在這些測試中，活性皆高於帶有其他三種黏附蛋白基因型的大腸桿菌。我們也發現MrkDv3 黏附蛋白上的RGD序列可以決定E. coli JM109[pMrkABCD V3 F]黏附HCT-8 細胞的專一性。其次，我們也探討第三型纖毛在克雷白氏肺炎桿菌CG43 中的表現調控：核酸序列分析顯示第一型纖毛和第三型纖毛的基因群相連。在LB或GCAA培養液中，都可以偵測到第三型纖毛的表現；相反的，只有在mrkA缺損或是fimB大量表現的情況下，才能偵測到第一型纖毛的表現。而在fimB大量表現時，第三型纖毛的表現會明顯下降，這樣的結果暗示著這兩種纖毛的表現有互相調控的關係。而在第一型纖毛和第三型纖毛基因群之間，我們發現有兩個基因和 Erwinia chrysathemi調控毒性因子的pecS和pecM相似，分別命名為phgS和phgM。在測量

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克雷白氏肺炎桿菌中纖毛表現之分析

的活性在添加葡萄糖或甘油的培養環境下皆有顯著上升的情形。相對地，在高滲透壓力、過氧化物的存在，或偏鹼環境的刺激下，都造成活性的降低。另一方面，我們在 kpd 基因組上游找到一個未知功能的基因，經由胺基酸序列比對（BLAST），我們認為其轉譯蛋白可能以雙分子訊息傳遞系統中調控子

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克雷白氏肺炎桿菌CG43中PecS與PecM在調控第三型纖毛所扮演的角色

24 四、討論 4.1 PecS 與 PecM 先前研究顯示 PecS 會參與許多致病因子之調控(Hommais et.al 2008)，且藉由直接與受調控基因之啟動子結合以達到調控目的。本研究證實 PecS 的確會與 pecO 序列結合且為特異性結合(specific binding)，亦證實 PecS 可與 mrkA 啟動子中 pecO-like 序列結合，因此推測第三型纖毛可能直接受到 PecS 之負向調控。但本次研究結果發現若將 pecS 剔除後，無論是在第三型纖毛之蛋白質表現層次或其啟動子之活性皆無明顯上升，甚至可能有些微下降，推測可能 PecM 抑制第三型纖毛之表現，且相較於 PecS，PecM 對第三型纖毛的負向調控更為顯著，而啟動子活性測試發現 pecM 啟動子之活性受到 PecS 之負向調控。由上述實驗數據推測若將 pecS 剔除，PecM 可大量表現，進而展現對第三型纖毛表現之抑制，然而剔除 PecS 雖可以增加第三型纖毛表現，但因 PecM 大量增加抑制了 MrkA 的表現，反而在將 pecS 剔除後第三型纖毛之表現並無增加。

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克雷白氏肺炎桿菌CG43 Fur、RcsB及cyclic di-GMP 對第三型纖毛表現之調控探討

20 四、討論鐵離子是生物體內重要的一個金屬離子，對而言，鐵離子也扮演許多酵素或蛋白質的重要輔助因子，多以二價鐵離子來控制許多重要生理反應。環境中鐵離子多以三價型態存在，細菌以運鐵系統將三價鐵離子運進細胞內再以氧化還原方應轉成二價鐵離子，同時釋放氧化自由基。所以，在細胞內堆積過多的鐵離子反而造成氧化壓力，細菌以 Fur 轉錄因子來壓制運鐵系統而達到調節細胞內鐵離子平衡的目的；不同菌種或不同環境表現的 Fur 可以不同型式來調控下游基因，已知有四大類調控型式：一、Fur 與二價鐵離子結合使構型改變形成二聚體，進而抑制下游基因的表現，當鐵離子濃度降低時，沒有鐵離子結合的 Fur 離開其標的基因的啟動子而使基因表現；二、Fur 與二價鐵離子結合後形成二聚體，進而活化下游基因的表現；三、Fur 不需鐵離子結合就可形成二聚體，apo-Fur 即可抑制下游基因的表現；四、apo-Fur 活化下游的基因表現。在大腸桿菌中，有關第一種方式的調控型式被研究最多；幽門螺旋桿菌的 Fur 則可以四種方式來分別調控不同的下游基因表現[106]；克雷白氏肺炎桿菌與大腸桿菌親緣關係相近，但是，Fur 以何種方式調控基因的研究不多。

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克雷白氏肺炎桿菌NTUH-K2044中纖毛的功能性分析

在研究所的兩年當中，讓我覺得成長許多且收獲豐富的兩方面，做事的態度以及實驗的技巧。這有太多太多都必須感謝彭老師了，在討論的時候很尊重我們的想法，卻又不辭辛苦的仔細教導，非常仔細的修改我的論文，然而最讓我佩服和感謝的是老師那認真的教學態度，更是我常常努力想要達到的目標，我覺得這是老師給我最珍貴的寶藏。非常感謝口試委員林志生老師和鄧文玲老師撥空參加，並且花了許多的時間巨細靡遺的修改了我的論文以及提供許多寶貴的建議，

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克雷白氏肺炎桿菌線毛的分佈與表現

謝誌 (Acknowledgement) 1999 年，我離開從小居住的台北來到新竹，轉眼間已經過了 11 年了。現在回想起這一段日子，許多經過的事、遇見的人，心裡有感慨萬千，要感謝的人也實在太多。在這本論文完成同時，我想起大二升大三的暑假，我進入了實驗室進行專題研究，那是我大學生活的轉捩點，而後就這麼一路沒有間斷地直到現在。在這段過程中，首先我要感謝我的指導教授彭慧玲老師，給予我機會在實驗室進行研究。彭老師總是充滿耐性、細心地教導並且關心我的感受。我還記得當我是專題生時，老師每週都會撥空與我討論，從很基本的實驗細節與原理、學術論文的撰寫，以至於研究方向的邏輯，可以說是一點一滴、一字一句地指導我。彭老師總是給予學生很大的空間自由發展與嘗試。而開始專題研究後，過去認為枯燥無聊的教科書內容，變成了實際應用於研究的原理基礎，讓我重拾學習的興趣，可以說改變了我的人生。

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全基因體化分析克雷白氏肺炎桿菌纖毛基因組的表現(I)

3. 為了瞭解克雷白氏肺炎桿菌調控如何這九種纖毛的表現，我們已分別將這九套纖毛基因子的起使子轉殖到LacZ通報系統，以及製備了九種Balb/c小鼠抗體，可分別偵測九種纖毛的主要結構蛋白質。 4. (1) 九套纖毛基因組已分別自克雷白氏肺炎桿菌 NTUH K-2044中選殖出來，並且以不會生成纖毛的大腸桿菌為宿主，分別表現於大腸桿菌表面。

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全基因體化分析克雷白氏肺炎桿菌纖毛基因組的表現(III)

我們也將七套纖毛基因組自克雷白氏肺炎桿菌 NTUH K-2044中選殖出來，並且以不會生成纖毛的大腸桿菌為宿主，分別表現於大腸桿菌表面，以SDS-PAGE 分析可以偵測到 kpb 和 kpc纖毛的表現，目前在準備製造 KpbA和KpcA抗體，未來將以免疫螢光顯微鏡觀察來確認二者的表現；另外，我們還把八套纖毛的黏附蛋白基因選殖置換第三型纖毛表現載體上的 mrkD黏附蛋白基因，以血球凝集測試發現KpbD和KpfD會凝集未經單寧酸處理的兔子和天竺鼠紅血球，以KpcD 或FimH取代MrkD黏附蛋白時會減少第三型纖毛的單元聚合；最後，我們還製備了MrkA、MrkD、MrkF 及 FimA 多株抗體，可分別第一、三型纖毛的表現。

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