Wnt-EGFR訊息傳遞途徑動力學計算研究暨抑制劑效應模擬

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文 Department of Chemistry National Taiwan Normal University Master Thesis 指導教授：孫英傑博士 Advisor: Ying-Chieh Sun, Ph.D.. Wnt-EGFR 訊息傳遞途徑動力學計算研究暨抑制劑效應模擬. Modeling of Kinetics of the Wnt-EGFR Signaling Pathway and Inhibitor Effects on its Kinetic Behaviors. 研究生：陳永富 Graduate Student：Yung-Fu Chen 中華民國 101 年 6 月 June, 2012.

(2) 致謝兩年的碩士班生涯，轉眼間就過去了。在這兩年的學習過程中，首先我要感謝我的指導教授孫英傑博士的諄諄教誨。在研究和學業上的教導，使我學習如何更加嚴謹的進行科學研究。也在待人處事以及人生經驗的分享上，使我有所啟發。另外，也要感謝國立臺灣大學生命科學系阮雪芬博士與國立臺灣師範大學生命科學系沈林琥博士，能撥冗前來擔任學生的口試委員，給與寶貴的建議與指導，使我的論文更加完善。兩年來在實驗室的日子受到大家的幫助，感謝已畢業的宗儒學長、書吉學長、昭同學長、以及博士後研究員王軍博士的經驗分享與教導。感謝同學博晉、冠緯、孟璇、彥樓，研究與課業上的討論。以及，學弟興洲、育劭、嘉仁的討論與幫忙，有了大家實驗室才能充滿和樂與歡笑。同時也感謝大學同學與高中同學的鼓勵與研究上的經驗分享，總是能讓我開懷的大笑。感謝阿姨們的關心與鼓勵，讓我在假日的時候可以很放鬆的充電再出發。最後感謝我的父母、大哥、二哥，有你們的栽培與鼓勵讓我倍感溫馨，讓我擁有最溫暖的家，使我可以專心做研究，毫無後顧之憂。另外感謝總是默默陪伴與支持的女友雅榕。有了你們才能讓我順利的完成碩士學業，在此獻上衷心的感謝與祝福。. i.

(3) 中文摘要. Wnt-EGFR 訊息傳遞途徑是已知與細胞增殖、分化和凋亡有很大的相關性。在許多癌症裡，發現這些訊息傳遞路徑的異常情形。我們利用電腦模擬的方法，計算此兩個訊息傳遞路徑的動力學模型，來幫助我們了解這些訊息傳遞路徑的幾個效應。以現有的模型為基礎，根據此訊息傳遞途徑的動力學效應，以及相關的實驗數據來擴充模型。首先，我們增加一條強度合理的負回饋路徑到兩個不同模型的 EGFR 路徑中，當 ERKpp 對 Raf-1 抑制方程式中 K1 值在 0.01-10 的區間時，計算結果顯示，此路徑對兩個不同模型中的 ERKpp 濃度有不同效應。路徑中含有 Braf 的模型，此負回饋路徑在模型中無法扮演有效抑制 ERKpp 濃度的角色。反之路徑中沒有 Braf 的模型，此負回饋路徑可以有效使 ERKpp 濃度表現降低。第二，加入 EGFR 與 Wnt 路徑之間的交談(crosstalk)反應路徑，若為正回饋路徑，當β-catenin 無過度表達時，其促使未知因子 Y 的濃度大小對於 ERKpp 活化濃度扮演開關效應(switch-like)的行為。若為負回饋路徑，因較強的負回饋效應，使得 Wnt 訊號刺激期間的 ERKpp 活化濃度有大幅度震盪的行為，Wnt 訊號結束後 ERKpp 濃度迅速降回低點。. ii.

(4) 此外，我們添加蛋白激酶抑制劑，探討其對磷酸化 ERK 表現的效應。以 Wnt 訊號短暫刺激後，以及β-catenin 過度表達造成的 ERKpp 濃度失調時，其濃度被抑制的差異，比較抑制效果。加入單一抑制劑對多個蛋白激酶同時抑制，其模擬結果顯示，同時對多個蛋白激酶抑制且抑制強度相同時，因為數個被抑制者會競爭抑制劑的濃度，所以其抑制效果比單一抑制劑對 Raf-1 單獨抑制時差，效應差距最大時，減少的 ERKpp 濃度為單獨抑制 Raf-1 時的 1/6 倍。單一抑制劑單獨抑制 Raf-1 為較佳抑制效果，可以利用模擬結果探討抑制劑選擇性問題。加入多個抑制劑時，兩個抑制劑分別抑制 Raf-1 及 MEK 時，對 Raf-1 與 MEK 的抑制劑兩者濃度比例大於 1.5 倍時(濃度總合同單一抑制劑的濃度時)，比起單一抑制劑同時抑制 Raf-1 與 MEK 且強度相同時，有較好的抑制效果使 ERKpp 表現有明顯的降低。因此兩個抑制劑分別抑制 Raf-1 及 MEK，且增加 Raf-1 抑制劑的濃度時有較佳的抑制效果。這些結果使我們加深了解兩訊息傳遞路徑，同時對未來多目標蛋白激酶抑制劑的設計是有幫助的。關鍵字：訊息傳遞路徑、抑制劑、模擬. iii.

(5) ABSTRACT. The Wnt and EGFR signaling pathways are known to relate to cell proliferation, differentiation, and apoptosis. Deregulation of these signaling pathways were found in various kinds of cancers. Toward better understanding of these two pathways, we used computer modeling method to model kinetics of these pathways. Based on currently available models, we expanded the model in order to include more effects in kinetics of these pathways and correlate with available experimental data. First, we added a negative feedback loop on the EGFR pathway which has inhibition effect on Raf-1 by ERKpp. When the K1 value of Raf-1 inhibition reaction was set in the range of 0.01 to 10, the computations gave that addition of this loop results in two different effects in the two models we used. The negative feedback loop has a little effect on ERKpp level in the model which includes Braf. In contrast, the negative feedback loop makes the level of phosphorylated ERK go down in the model without Braf. Second, a crosstalk between EGFR and Wnt pathways was added and kinetic modeling gave that：in the case this is a positive feedback loop, it induces the switch-like behavior of ERKpp expression by varying the concentration of the added factor Y when the β -catenin was not overexpressed. In the case it is a negative feedback loop, due to the stronger iv.

(6) negative feedback effect, that during Wnt signal stimulate the concentration of ERKpp has an oscillation behavior with larger amplitude during the period of Wnt signal stimulation. After that, concentration of ERKpp falls back to low level quickly. In addition, we investigated effect of adding kinase inhibitor(s) on the level of phosphorylated ERK (ERKpp) under the condition of β-catenin overexpression plus undergoing a wnt signal transient stimulation. In the case of adding one kinase inhibitor, the modeling gave that：kinase inhibitor of multiple-targets of the same strength have less inhibitory effect than inhibitor of singlet-target of Raf-1 kinase. Reduction of concentration of ERKpp was as small as to 1/6 fold only compared with the case of singlet-target in the examined model. Furthermore, we investigate effects of multiple-target inhibitors inhibiting Raf-1 and MEK kinases. It was found that in the case the ratio of Raf-1 inhibitor concentration to MEK inhibitor concentration is larger than 1.5, the inhibitor effect is better than one inhibitor of multiple-target with the same inhibition strengths. These results deepen our understanding of these two pathways and should be useful for future multiple-target kinase inhibitor design. Key word：signaling pathway、inhibitor、modeling. v.

(7) 目錄(CONTENTS). 口試委員會審定書 ....................................................................................... # 致謝 ................................................................................................................ i 中文摘要 ....................................................................................................... ii ABSTRACT ................................................................................................. iv 目錄(CONTENTS) ...................................................................................... vi 圖目錄 (LIST OF FIGURES) ................................................................... viii 表目錄 (LIST OF TABLES) ....................................................................... xi Chapter 1 緒論(Introduction) .................................................................. 1 1.1. 前言 (Preface) .............................................................................. 2. 1.2. Wnt pathway ................................................................................. 4. 1.3. EGFR pathway .............................................................................. 8. 1.4. 回饋效應(Feedback Loop) ......................................................... 13. 1.5. 研究目標 (Research Objective)................................................. 15. Chapter 2 實驗方法 (Experimental Methods) .................................... 18 2.1. 實驗理論 (Theories) .................................................................. 19 2.1.1 軟體介紹 (Software Introduction) .................................... 21 2.1.2 參數探討(Parameter Scan) ................................................. 24 vi.

(8) 2.1.3 控制係數介紹(Control Coefficient) .................................. 26 2.1.4 回饋機制介紹 (Feedback Loop) ....................................... 27 2.2. 模型檢測/再現 (Model Reproduction) ..................................... 28. Chapter 3 結果與討論 (Results and Discussions) ............................... 37 3.1. ERK-Raf 負回饋效應在較大模型中的表現 ............................ 38. 3.2. 模型外加新迴圈效應................................................................. 47. 3.3. 模擬單一抑制劑進入訊息傳遞路徑 ........................................ 56. 3.4. 模擬多個抑制劑同時進入訊息傳遞路徑 ................................ 79. Chapter 4 結論 (Conclusion) ................................................................. 84 Chapter 5 附錄與參考文獻(Appendix & Reference)........................... 87. vii.

(9) 圖目錄 (LIST OF FIGURES) 圖 1 Wnt 訊號途徑簡圖引自 Eisenmann, D. M., Wnt signaling (June 25, 2005), WormBook, ed............................................................. 5 圖 2. EGFR-ERK 訊號主要途徑簡圖 ................................................. 9. 圖 3. COPASI 操作介面 ...................................................................... 21. 圖 4. COPASI 進行模擬時的介面 ...................................................... 22. 圖 5. Parameter Scan 操作圖 .............................................................. 24. 圖 6. Parameter Scan 模擬結果圖 ...................................................... 25. 圖 7. 2009 年文獻圖四(A) .................................................................... 29. 圖 8. 再現 2009 年文獻圖四(B)濃度圖 ............................................... 29. 圖 9. 2009 年文獻圖四(B) .................................................................... 30. 圖 10. 再現 2009 年文獻圖四(C) ......................................................... 30. 圖 11. 2009 年文獻圖四(C) .................................................................. 31. 圖 12. 再現 2009 年文獻圖四(D) ......................................................... 31. 圖 13. 2009 年文獻圖四(D) .................................................................. 32. 圖 14. 再現 2007 年文獻圖三 ............................................................... 34. 圖 15. 2007 年文獻圖三 ........................................................................ 34. 圖 16. 再現 2007 年文獻圖六 ............................................................... 35. 圖 17. 2007 年文獻圖六(B)、(C) ......................................................... 36 viii.

(10) 圖 18. 2009 模型修改後示意圖 ............................................................ 40. 圖 19. 修改 2009 年模型後 ERKpp 活化濃度圖 ............................... 40. 圖 20. 2007 年模型修改後示意圖........................................................ 42. 圖 21. 2007 年模型修改後 ERKpp 活化濃度圖 ................................ 42. 圖 22. 2007 年模型添加未知因子 Y 示意圖(正回饋) ........................ 48. 圖 23. 添加未知因子 Y 後 ERKpp 活化濃度圖................................. 49. 圖 24. Y 初始濃度差異 ERKpp 活化濃度圖...................................... 50. 圖 25. ERKpp 與 Y 起始濃度相對圖.................................................. 51. 圖 26. 添加未知因子 Y 示意圖(負回饋路徑) ..................................... 53. 圖 27. 添加負回饋路徑參數組合估計圖(A) ....................................... 54. 圖 28. 添加負回饋路徑參數組合估計圖(B) ....................................... 54. 圖 29. 負回饋路徑強度差異 ERKpp 活化濃度比較圖 ..................... 55. 圖 30. ERKpp 濃度與 β -catenin 生成速率相對圖........................... 57. 圖 31. 抑制劑在模型中對蛋白激酶抑制示意圖................................. 60. 圖 32. 單一抑制劑 ERKpp 濃度與β-catenin 生成速率相對圖 ...... 61. 圖 33. 同時抑制，Raf-1 為主時 ERKppm 與 β -catenin 生成速率相對圖 ................................................................................................. 63. 圖 34. 同時抑制，MEK 為主時 ERKpp 與 β -catenin 生成速率相對圖 ..................................................................................................... 64 ix.

(11) 圖 35. 同時抑制 Raf-1、MEK 強度差異結果比較圖 ....................... 65. 圖 36. 本圖取自文獻 41Table.3 ............................................................. 67. 圖 37. 模擬文獻 41 兩種化合物抑制情形 ............................................ 69. 圖 38. 模型加入 Y 因子及抑制劑組合時，ERKpp 與 β -catenin 相對圖 ..................................................................................................... 71. 圖 39. 添加未知因子 Y 時抑制 Raf-1、MEK 強度組合，ERKpp 與 β -catenin 相對圖 ...................................................................... 72. 圖 40. 加入負回饋路徑同時抑制蛋白激酶，ERKpp 與 β -catenin 相對圖 ................................................................................................. 74. 圖 41. 添加負回饋路徑同時抑制 Raf-1、MEK 時 ERKpp 與 β -catenin 相對圖 ......................................................................................... 76. 圖 42. 多個抑制劑同時進入模型示意圖............................................. 80. 圖 43. 多個抑制劑同時抑制時 ERKpp 與 β -catenin 相對圖 ......... 80. 圖 44. 多個抑制劑不同濃度組合，同時抑制 Raf-1、MEK 時 ERKpp 與 β -catenin 相對圖 ................................................................. 82. x.

(12) 表目錄 (LIST OF TABLES) 表 1. 2009 年文獻模型 control coefficient 計算 ................................. 45. 表 2. 2007 年文獻模型 control coefficient 計算 ................................. 45. 表 3. 抑制劑單獨抑制時 ERKpp 濃度值 ........................................... 58. 表 4. 單一抑制劑抑制多個目標時 ERKpp 濃度值： ....................... 61. 表 5. 抑制劑抑制 Raf-1 為主或 MEK 為主時 ERKpp 濃度值 ........ 65. 表 6. 本表取自文獻 41Table.4 ............................................................... 68. 表 7. 本表取自文獻 41Table.5 ............................................................... 68. 表 8. 模擬文獻中兩種化合物抑制時 ERKpp 濃度值 ....................... 69. 表 9. 添加未知因子 Y 抑制強度組合改變時 ERKpp 濃度值 .......... 73. 表 10. 加入負回饋路徑抑制強度組合改變時 ERKpp 濃度值 ......... 74. 表 11. 2007 年文獻模型與添加其他路徑 control coefficient 計算 ... 78. 表 12. 各個抑制劑濃度組合，ERKpp 的濃度值 .............................. 82. xi.

(13) Chapter 1. 緒論(Introduction). 1.1. 前言(Preface). 1.2. Wnt pathway. 1.3. EGFR pathway. 1.4. 回饋效應(Feedback Loop). 1.5. 研究目標(Research Objective). 1.

(14) 1.1. 前言 (Preface). 「Systems Biology」系統生物學，可定義為對生物系統進行系統化的研究。用來描述一個生物系統中的運動、變化趨勢。藉由研究生物系統中不同部分之間的相互關係、連結與作用，期望最終能夠建立一套可以理解的系統化模型。透過此模型來預測細胞、器官、系統，甚至一個完整的生物體表現。以系統與模型的觀念，來分析與解釋生命的奧秘。早期著重於生物實驗及實驗數據的結果分析上，因此耗費較大量的時間及成本，近年來結合實驗結果及數據的分析，透過化學動力學的輔助及最佳化方式，例如：遺傳演算法。建構細胞網絡，發展模型進行細胞行為的預測。人體細胞內的蛋白質估計約有數萬個，一般情況下，正常的細胞增值與凋亡受到生長因子與激素的影響，細胞增殖與凋亡的情形是處在一個平衡的狀態下。當此平衡被打破時，就可能造成生物體內的細胞不當的增生或者減少，因此可能會造成癌細胞的出現。癌細胞的出現意味著細胞不斷的接受外來的訊號而增殖，但卻缺乏凋亡。細胞平衡受到破壞，大部分都是因為訊號蛋白質，出現基因的突變，增強了細胞不當的增殖和生存。 2.

(15) 腫瘤發生是一個複雜的過程，需要積累多個基因和途徑的改建，以大腸癌為例子。超過 80%的結腸腺瘤和結腸腺瘤樣息肉(adenomatous polyposis coli)產生突變，APC 功能的喪失導致激活 Wnt 信號 1,2。而表皮生長因子受體 3 的過度表達，也是近代研究的目標，有文獻. 4-6. 指出. 此與大腸癌有很大的關係。整個細胞的反應中，有許多途徑是與細胞生長、增殖和生存有關。當這些途徑的過度表達，可能會有各種疾病的產生。每一個途徑也可能有彼此交互作用的情形產生。因此藉由系統生物學的方式，來了解細胞的反應。透過這樣的一個機制，找出引起疾病的因素。借此我們可以找出可能的藥物來進行抑制。細胞中訊息傳遞的過程，有許多回饋機制的存在。這些回饋機制與細胞中的交談(crosstalk)反應路徑影響有相當的關係。抑或者回饋機制扮演著類似開關的角色，調控系統中各個蛋白或者激素的活化濃度表現。因此回饋機制的探討是近期研究發展的要點之一。藥物的發展過程中，有許多不可預知的情形，例如抗藥性的產生。如果能夠透過較為完善的模型，來預測更多我們不知道的情形。那麼對於藥物設計的過程，會更加的快速且節省成本。. 3.

(16) 1.2. Wnt pathway. Wnt 信號蛋白是一類分泌型糖蛋白，它透過活化信號通路(signal transduction pathway)參與了細胞的增殖、分化和凋亡。 Wnt 信號途徑能引起細胞內β-連鎖蛋白(β-catenin)積累。β -catenin 是一種多功能的蛋白質，從文獻. 7,8. 我們得知β-catenin 的濃度. 與癌症的產生有一定關聯。因此我們專注研究與β-catenin 有關的部分。 β-catenin 在細胞連接處它與鈣粘素互相作用，參與形成粘合帶，而游離的β-catenin 可以進入細胞核 9，進而調節基因表達。Wnt 訊號是動物胚胎發育中的重要作用，其異常表達或者激活可能引起腫瘤的發生。 Wnt 的受體是卷曲蛋白(frizzled，Frz)，結構類似於 G 蛋白偶聯型受體，能與 Wnt 結合。引起 Frz 激活細胞質內的蓬亂蛋白(Dishevelled， Dsh 或 Dvl)，Dsh 能切斷β-catenin 的降解途徑，從而使得β-catenin 在細胞質中積累，並進入細胞核，與 T 細胞因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)相互作用，調節靶基因的表達。TCF/LEF 是一類具有雙向調節功能的轉錄因子，它與 Groucho 結合抑制基因轉錄，但與β-catenin 結合則促進基因的轉錄 9,10。. 4.

(17) 圖 1. Wnt 訊號途徑簡圖引自 Eisenmann, D. M., Wnt signaling (June 25,. 2005), WormBook, ed 圖的左半部為 Wnt 訊號還沒進入訊息傳遞途徑時，β-catenin 降解複合體少部分進入細胞核多數降解。右半部為 Wnt 訊號進入訊息傳遞途徑，β-catenin 在細胞質中積累，進入細胞核。. Wnt 訊號途徑(圖 1)可以簡化成：Wnt → Frz → Dsh → β-catenin 的降解複合體解散→β-catenin 積累，進入細胞核→TCF/LEF→基因轉錄 9,10。 β-catenin 的降解複合體，主要由 APC、Axin、GSK-3β、CK1 等構成。 GSK-3β：是一種蛋白激酶，在沒有 Wnt 信號時，GSK-3β能將磷酸基團加到β-catenin 胺基端的絲胺酸/蘇胺酸殘基上，磷酸化的β 5.

(18) -catenin 在結合到β-TRCP 蛋白上，受泛素的共價修飾，被蛋白酶體 (proteasome)降解。β-catenin 中被 GSK-3β磷酸化的胺基酸序列稱為破壞盒(destruction box)，此序列發生變異可能引起某些癌症。 CK1：酪蛋白激酶(casein kinase 1)，能將β-catenin 的 Ser45 磷酸化，隨後 GSK-3β將β-catenin 的 Thr41、Ser37、Ser33 磷酸化。 APC：是一種抑癌基因，其突變引起良性腫瘤(結腸腺瘤樣息肉， adenomatous polyposis coli)，但隨著時間的推移，可能發生惡變。APC 蛋白的作用是增強降解複合體與β-catenin 的親和力。 Axin：是一種支架蛋白，具有多個與其他蛋白作用的位點，能將 APC、GSK-3β、β-catenin、CK1 結合在一起。此外它還能與 Dishevelled、 PP2A(protein phosphatase 2A)等成分結合，其中 Dsh 與 Axin 結合能使降解複合體解體。 Wnt 信號途徑的其他成分： GBP：GSK-3β結合蛋白(Frat 基因的產物)，對 Wnt 信號途徑起正調控作用，GBP/Frat 抑制 GSK-3β的活性。 Dickkopf1(DKK1)：是一種分泌蛋白，其與 Wnt 受體 LRP5/6 及另一類穿膜蛋白 Kremen1/2 結合，形成三聚體，誘導快速的細胞內吞，減少細胞膜上的 LRP5/6，由此阻斷了 Wnt 信號向胞內的傳遞。. 6.

(19) sFRP：分泌行 Frz 相關蛋白(secreted frizzled-related proteins)，含有一個 CRD 結構域，但缺少七次跨膜域，它可能與 Frz 競爭結合 Wnt 蛋白。其它抑制蛋白還有 Sizzled、WIF-1 和 Cerberus，他們也直接與 Wnt 蛋白結合，從而拮抗 Wnt 信號。. 7.

(20) 1.3. EGFR pathway. 表皮生長因子受體(EGFR，Epidermal Growth Factor Receptor)它會與其 ligand3 結合，引起訊號的傳遞。此訊號的傳遞與腫瘤細胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移和抑制凋亡有關 11。以非小細胞肺癌為例，從文獻 12 得知當產生過量的 EGFR，促成癌症的快速生長、轉移與抗藥性，進而使得患者的病況加速惡化。 EGFR-ERK 訊息傳遞主要途徑示意圖(圖 2)。此途徑主要為，生長因子 3 結合於受體後，使得受體二聚化，激活特異的受體酪胺酸激酶，而使受體上相應的酪胺酸殘基磷酸化。磷酸化的酪胺酸被含有 SH2 的 Grb2-Sos 蛋白複合物所結合，Sos 可使與 Ras 結合的 GDP 轉變為 GTP 因而使 Ras 活化，活化的 Ras 進一步激活 Raf-1。Raf-1 被激活後繼續激活其下游的絲裂素活化蛋白激酶 (MEK)和絲裂素活化蛋白激酶 (MAPK；ERK)最終通過對轉錄調節因子表達的影響，而將細胞增殖信號傳遞到細胞核內 13,14。. 8.

(21) 圖 2. EGFR-ERK 訊號主要途徑簡圖. 生長因子结合於受體後，使受體二聚化、自我磷酸化。Grb2-SOS 蛋白複合物會與 EGFR 結合，結合後 SOS 可使與 Ras 活化，活化的 Ras 進一步激活下游的激酶 Raf、MEK，最终通過對轉錄調節因子的表達影響而將细胞增殖信號傳遞到细胞核内。. EGFR-ERK pathway 主要成員有：Ras、Raf、MEK、ERK。 Ras：Ras 基因產物參與了控制基因轉錄(transcription)的蛋白激酶信號傳導路徑。從而調節細胞的生長與增生(proliferation)。為了“打開”這條路徑，Ras 蛋白必須與細胞內的 GTP 分子結合。為了“關閉” 這條路徑，Ras 蛋白必須裂解 GTP 分子。Ras 基因的改變使 Ras 蛋白質發生變化，其結果 Ras 蛋白不再具有裂解 GTP 分子和釋放 GTP 分子的能力。這樣的改變導致這條信號傳導路徑始終處於“開通”的狀態。 9.

(22) 這種“開通”的信號導致細胞的生長和增生。因此 Ras 的過度表達與擴增導致持續的細胞增殖，這是腫瘤發生的關鍵一步。細胞分裂由“正” 與“負”信號的平衡來調控。當 Ras 轉錄增加時，過多的基因蛋白積蓄在細胞內。此時，細胞分裂的“正“信號則強於“負”信號。Ras 基因的點突變(point mutation)通常導致 Ras 從原 proto-oncogene 向癌基因(oncogene)的轉化。這樣的功能改變，對細胞影響是多方面的，因為 Ras 參與了許多控制細胞分裂與死亡的信號傳導路徑。 Raf：Raf-1 又稱 c-Raf(絲胺酸蛋白激酶)，能磷酸化 MEK。主要被 Ras-GTP 活化。B-Raf 在文獻上已知與許多癌症有關，而 B-Raf 通常在 V600E 的位置有突變發生。當生長因子的訊號藉由 Ras 和 Src 的傳遞，Raf-1 和 B-Raf 都會被強烈的活化。相較之下 a-Raf 活化的程度比較小，但是三種異構體都被認為是致癌的(oncogenic)蛋白激酶。 MEK：MEK(絲裂原活化蛋白激酶)是 MAPKK 的一種，因為它可以磷酸化 ERK。然而 MEK 是目前已知唯一可以對 ERK 磷酸化的激酶。 ERK：ERK 是傳遞絲裂原信號的信號轉移蛋白，ERK 家族包含 ERK1~ERK5 其中 ERK1 和 ERK2 是 ERK 家族中被研究最徹底的。它們表達廣泛的涉及調節在不同細胞內，包含減數分裂、有絲分裂、有絲分裂後期的功能等一系列生理過程。ERK 是多種生長因子(EGF、 NGF、PGDF 等)的下游蛋白，其信號途徑在腫瘤侵襲和轉移的過程中， 10.

(23) 起仲介和放大訊號的作用。一方面接受來自生長因子、絲裂原、環境刺激等的信號，另一方面通過 ERK 信號聯級反映作用於轉錄因子，如 AP-1、NF-κB 等，調控基因的表達。在許多人類的癌症(如口腔癌、黑色素瘤、乳癌等)中都可以發現 ERK 的過度激活。 EGFR-ERK pathway 其餘成員： RKIP：Raf kinase inhibitor protein(Raf 激酶抑制蛋白)的簡稱，許多組織中 RKIP 定位在細胞質及質膜上。有絲分裂原激活蛋白激酶訊號通路(MAPK pathway)，在細胞的增殖、分化、轉移、凋亡中扮演重要的角色，其失調與人類的癌症或其他疾病有關。磷酸化的 RKIP 結合中期染色體的中心體以及著絲點區域，從而可能參與調節染色體的分割和有絲分裂的進行。RKIP 可以做為前列腺癌轉移的標誌物類上皮細胞卵巢癌的轉移抑制基因. 15,16. ，且是人. 17,18. 。RKIP 的功能下調可能影響腫. 瘤轉移、血管增生、抗凋亡能力及染色體的完整性，也可能影響心臟、神經系統的功能。 Akt：又稱 PKB(蛋白激酶 B)，是一種絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶，在細胞存活和凋亡中起重要作用。胰島素、表皮生長因子等生長和存活因子，均可激活 Akt 信號途徑。其參與了細胞的生存途徑，通過抑制細胞凋亡過程。也能誘導蛋白質的合成途徑，因此成為細胞通路中的. 11.

(24) 一種關鍵信號蛋白，導致骨骼肌肉肥厚和一般組織的生長。其可阻止細胞凋亡，促進細胞生存，成為影響癌症的主要因素 19,20。 PI3K：Phosphatidylinositol 3-kinases，其參與了細胞中的許多作用，例如：細胞生長、增殖、分化。PI3K 在細胞轉移及癌症細胞中發生突變。PI3K-Akt 訊息傳遞通路 21，顯著影響細胞增生及生存。PI3K 抑制劑能有效抑制 PIP3(Phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate)的生成，阻斷 Akt 的活化。. 12.

(25) 1.4. 回饋效應(Feedback Loop) Erbb-Wnt 訊息傳遞路徑為癌症研究之重要細胞訊息傳遞路徑。其. 中 ErbB1 (又名 EGFR)-wnt 訊息傳遞路徑，對一些癌症如：肺癌、大腸癌、直腸癌等特別重要。然而在這訊息傳遞路經中，存在許多的回饋效應. 17,22. (feedback. loop)，這些回饋效應，各自擁有其效應，影響細胞中各濃度值。我們整理了幾個回饋效應，文獻. 17. 中提到了 7 條回饋機制，這些. 回饋機制都被認為與某些癌症有關。有五條正回饋路徑及兩條負回饋路徑分別為：正回饋路徑(→：催化；⊣：抑制). 1. β-Catenin/TCF complex →Ras →ERK ⊣ GSK-3β⊣β-catenin/TCF complex 與結腸癌、肝癌有關。 2. ERK ⊣ GSK-3-β ⊣ PKCδ → ERK 與結腸癌、前列腺癌有關。. 3. ERK ⊣ RKIP ⊣ MEK → ERK 與結腸癌有關。. 4. ERK → Snail ⊣ RKIP ⊣ MEK → ERK 與前列腺癌有關。. 13.

(26) 5.. ERK ⊣ GSK-3β ⊣ Snail ⊣ RKIP ⊣ MEK → ERK 與前列腺癌. 有關。負回饋路徑： 1. ERK ⊣ Ras → ERK 與皮膚癌有關。. 2. β-Catenin/TCF complex → Axin ⊣ β-catenin/TCF complex 與結腸癌肝癌有關。這些研究提供我們對於正負回饋路徑的認識，然而這些交談路徑效應，在細胞中是複雜且難以發現的。建立細胞中蛋白質與蛋白激酶之間的關聯性，建立起可靠的網絡。進而觀察這些正負回饋路徑存在何種細胞之中，和其調控的效應。文獻中 17 即可解釋 RKIP 在多個轉移性的腫瘤細胞中所扮演的重要角色。. 14.

(27) 1.5. 研究目標 (Research Objective). 在近幾年的研究中，已有利用實驗數據發展 EGFR-ERK pathway 的數學模型文獻 23，以及顯示 Wnt pathway 與 EGFR-ERK pathway 兩條途徑有所關聯文獻. 24. 。因此希望藉由文獻中已發表的模型為基礎，. 進行反應途徑的修改，或者添加新的蛋白質或激素，讓模型能夠更加貼近生物體細胞的真實情形。本次研究是利用 2007 年由 D Kim...等人發表的文獻. 24. 以及 2009. 年 R. J. Orton…等人發表的文獻 23 這兩篇文獻的模型為基礎。進行模型的探討、修改及預測。本次研究分成幾個重要部分進行探討：第一部分：在較小模型中的效應，其效應表現是否存在較大的模型。為了探討途徑中幾個重要的回饋效應，文獻. 25-27. 中的模型會經過. 簡化，因此探討此效應是否存在較大模型中，其可能會較貼近真實情形，小模型效應添加到大模型中，必須考慮到，其效應連結的目標為何，以及連結的目標對於欲觀察的目標物相關性為何。並且釐清此效應的必要性。幫助我們對於建構訊息傳遞路徑模型，了解哪些路徑是必然存在，哪些路徑在某些模型中是可以簡化的。. 15.

(28) 第二部分：了解重要動力學行為參數。模型中觀察濃度變化，會有一些不同的現象產生。例如：開關效應(switch-like)或者震盪現象。我們透過調控參數，了解造成這些行為的參數。第三部分：模型中加入正負回饋路徑，強度為何？是否造成 ERKpp 濃度的失調。訊息傳遞的過程中，正負回饋路徑常造成路徑中的蛋白或者蛋白激酶濃度的累加或者減少，因此添加正負回饋路徑，可以讓我們更清楚這些效應的影響。第四部分：外加新的迴圈效應。細胞中訊息傳遞的通路多且複雜，從文獻. 17. 可以了解許多回饋路徑產生的影響，以及和疾病的關聯。除. 了這些已知的路徑之外，細胞中還有許多未知的情形。這些情形大大的增加我們利用藥物來治療疾病的困難，例如：抗藥性的產生，抑或者細胞中某個蛋白或者激素的突變所產生的干擾。這些情形都增加模型的預測的困難性。我們認為在細胞中除了這些被研究及證實的路徑外，存在著還沒被證實的路徑。因此我們大膽的假設，在模型中還有未知的迴圈效應存在，我們將模型加入新的迴圈效應，探討此效應對模型造成的影響或改變。以期望可以解釋一些細胞中還未經證實的情形。第五部分：抑制劑的添加，模擬抑制劑組合以及探討選擇性問題。系統生物學模型建構最終目標，期望可以透過模擬的方式預測藥物進 16.

(29) 入生物體後，在細胞中運作的情形，以及其所發揮的效果。因此我們模擬抑制劑進入模型後產生的效應。一般來說為了簡化模型模擬抑制劑後的情形，舊有的研究其模擬抑制劑抑制的方式，是從訊息傳遞路徑的催化過程，將催化的速率 K 值做降低的調整 28。其方式若對多目標抑制，會有加成效應，無法探討其選擇性問題。我們期望模擬抑制目標物對於抑制劑濃度做競爭的行為，提供我們模擬抑制劑的選用。以達一種藥物抑制多目標情形，對未來多目標蛋白激酶的抑制劑設計是有幫助的。. 17.

(30) Chapter 2. 2.1. 2.2. 實驗方法 (Experimental Methods). 實驗理論(Theories) 2.1.1. 軟體介紹(Software Introduction). 2.1.2. 參數探討(Parameter Scan). 2.1.3. 控制係數介紹(Control Coefficient). 2.1.4. 回饋機制介紹(Feedback Loop). 模型檢測/再現(Model Reproduction). 18.

(31) 2.1. 實驗理論 (Theories). 由於生物系統之間的關係十分錯綜複雜，生物學家會對生物系統假設一個數學模型。期望藉由解出此模型，推導出生物系統之間的交互作用關係。此數學模型的建立以下面的八個步驟來完成。一、定義目標與期望：哪裡是目標，模型所要表達的目標。二、定義假設：什麼是重要的，哪些是要研究的蛋白質與激素，需要或不需要。三、定義變量：選擇相關實體建立模型。四、定義系統變量之間的連接：途徑如何形成。五、定義函數關係和方程：連通後的變化。六、確定參數值常微分方程：量化關係。七、運行電腦模擬來獲得趨勢：可視化連接。八、驗證模型：定性和定量的確認。依照上述的步驟，可以逐漸的把生物系統轉換成數學模型。而生物系統之間的關係會逐漸的由數學模型中的方程式、變數與參數所取代。最後藉由解出此數學模型的解，對照由實驗得到的數值，來驗證他們所假設的關係是否正確。. 19.

(32) 通常在系統生物學中所建立的數學模型，因為一些特性的考量，都需要解微分方程式。利用穩定狀態(steady state)的特性來進行微分方程的求解。因此在求解參數估計問題時，會先利用最適化方法，去決定這些參數的數值。再經過解微分方程的步驟去得到答案，此時再把答案和實驗的觀測值相比較，如果兩個數值是很相近，也就是數值差異很小，便可以把猜測的參數當成解。而這些參數就能提供一些訊息給生物學家參考，否則就必須回到最適化方法的步驟，重新調整參數，在解一次微分方程式得到答案，如此循環下去直到找出最合適的參數為止。. 20.

(33) 2.1.1. 軟體介紹 (Software Introduction). 本次研究使用的數學軟體為 COPASI 4.6.33 版本 29-31，COPASI 是一個功能強大的軟體，能夠解微分方程與進行參數的估計。操作時需要了解生化分子的組成與反應方程式。COPASI 可以在不同的作業系統下進行安裝運算，可以自行評估運算量大小選擇不同的作業系統。 COPASI 的操作介面(圖 3)，操作介面可以對模型進行建構。. 圖 3. COPASI 操作介面. 圖的左半部可以進行路徑及種類的添加，右半部可以設定所添加路徑的數值及參數。 21.

(34) 圖 4. COPASI 進行模擬時的介面. 模擬時對輸入的設定進行運算，運算結束後輸出所有的數據資料。. 模型建構完成後可進行模擬，COPASI 進行模擬時介面(圖 4)， COPASI 利用建構模型時，設定的訊息傳遞路徑以及各個反應方程式的參數，進行解微分方程的運算。運算完成之後 COPASI 可將模型中，各個目標物在預設的模擬時間內所表現出的數值變化。透過此輸出的數值變化結果，可以得到模擬的最終結果。本軟體能夠運用同質化函數分析，以及控制係數求和定裡. 32. 者透過高精確隨機模擬的方式，模擬化學系統中多個通道的連結 22. ，或 33. 。.

(35) 也可以使用遺傳演算法將曲線做優化的程序，預估的參數做回歸，建構合適的模型。此軟體也能夠對生物系統，計算出其隨時間的變化關係。生物體為維持生命，必須讓細胞內各物質的濃度大約保持一種定值。當外界干擾細胞內各物質濃度時，細胞會利用交錯複雜的迴饋 (feedback)網絡來調節各生化反應，以抵銷外界的干擾。所以大致上細胞經常處於穩定狀態(steady state)。因此本篇研究所列的濃度數值均代表系統處於穩定狀態。. 23.

(36) 2.1.2. 參數探討(Parameter Scan). 系統生物學的模型建構及探討，每一項反應方程的參數與估計都有其困難性，利用最佳化的方式，再現實驗所得的數據曲線，以期望可以成為可信的模型。然而在模型中每個路徑的探討，我們需要利用到 Parameter Scan 的輔助，找出其路徑參數的改變或者新途徑的添加與修改，對於模型的行為有何新的效應。其操作方式(圖 5)，先選定模型中要探討的路徑參數，或者欲添加的新路徑參數，進行參數範圍設定(極大、極小值)。再選定其間隔組數進行模擬。. 圖 5. Parameter Scan 操作圖. 24.

(37) 模擬結果(圖 6)，結果顯示對此參數的大小區間，以相同的間隔進行模擬。我們可藉由結果來判斷，此路徑參數在一定的區間內，對欲觀察的濃度變化曲線，產生了何種效應。也可以藉由此方法，判斷此路徑中的參數為何，較能貼近現實情況。此為 Parameter Scan 方法在研究上的幫助。. 圖 6. Parameter Scan 模擬結果圖. 可顯示各個參數模擬的結果。. 25.

(38) 2.1.3. 控制係數介紹(Control Coefficient). 控制係數(control coefficient)的計算，可以測量系統中的某一變量，相對於系統中某種類穩定狀態時的變化情形。例如：模型中某反應路徑參數改變量，相對於模型中某蛋白的濃度變化。其係數指標可以輔助我們，判斷其路徑參數對於要觀察的目標濃度，為正相關或者負相關。舉例來說欲觀察 EGFR-ERK pathway 中某反應速率常數對 ERKpp 濃度值的影響。我們可以利用以下公式進行計算。公式：本次研究中，進行的 control coefficient 計算，均將反應速率 K 值上調 1% 進行實驗的探討。透過 control coefficient 的計算，可以輔助我們判斷模型中，哪些路徑是相對重要的。也可以用來對於模擬結果的驗證，增加我們經過模擬所得結論的可信度。. 26.

(39) 2.1.4. 回饋機制介紹 (Feedback Loop). 細胞中反應的關聯，其運作方式就像是電子電路圖，將每個關鍵的因素串連起來。我們不全然的了解這其中的物理機制，因此我們透過統計的方式，利用類似工作途徑般的動力學模型，歸納、推論出不同細胞中的運作方式。系統生物學中的關鍵問題，解決這些電路在細胞中的運作情形，以及連結的狀態，然而這些連結可能形成迴圈，產生正回饋路徑及負回饋路徑的組合，這些組合會造成訊息傳遞通路的一些動力學行為。包括開關樣的行為(switch-like)或者分岔點的特性。正負回饋路徑的組合，可能產生雙穩態、震盪行為，在細胞中這些行為都是控制訊息傳遞的因素。以 EGFR 路徑為例，從訊號的傳遞直到 ERKpp，如何讓 ERKpp 的表現處於平穩狀態，負回饋路徑(NFL) 就能使其保持在低的狀態。找出這些路徑所產生的行為是我們研究的一個要點。文獻. 34. 作者. Tyson 研究細胞分裂數學模型，討論正負回饋機制的組合造成的行為。回饋機制的探討使我們了解，細胞是如何自我複製維持穩定。. 27.

(40) 2.2. 模型檢測/再現 (Model Reproduction). 本次研究是利用 2007 年由 D Kim 等人發表的文獻 24 以及 2009 年 R. J. Orton 等人發表的文獻 23 這兩篇文獻提供的模型為基礎。因此我們先從文獻中提供的連結下載其建構的模型。為了確認此模型與文獻中所探討的要點是相符合的，我們進行模型檢測以及再現的動作。此次的再現分別為，對 2009 年文獻. 23. 圖四的再現、對 2007 年文獻 24 圖三. 以及圖六的再現。 2009 年文獻 23 是參考 2004 年文獻 35 對於降解回饋機制做修改。文獻中圖四為主要現象的探討。文獻主要模擬的狀態為，EGF 受體因子刺激 EGFR，進而進行訊息傳遞。經過 EGF 的刺激後，ERKpp 濃度上升至高濃度位置。在經由訊息傳遞路徑中的降解機制，以及負回饋機制，抑制 ERKpp 濃度的上升，使其保持在低濃度的位置。本文獻模擬，訊息傳遞路徑中的效應與 ERKpp 活化濃度的表現關係。利用實驗結果 ERKpp 濃度與時間關係，所做的濃度與時間關係曲線，與模擬的結果對照(圖 7)，兩曲線結果相近，為可接受範圍。. 28.

(41) 圖 7. 2009 年文獻圖四(A). 透過實驗值 ERKpp 的濃度與時間關係，與模擬後之曲線相近，為可接受範圍。. 圖 8. 再現 2009 年文獻圖四(B)濃度圖. 模擬時間 60 分鐘，Ras 和 Rap1 活化濃度圖. 29.

(42) 圖 9. 圖 10. 2009 年文獻圖四(B). 再現 2009 年文獻圖四(C). 分別將模型中 EGFR 降解機制及負回饋機制移除，模擬在此情形下 ERK 活化濃度的變化與正常狀態之比較，模擬時間 60 分鐘。. 30.

(43) 圖 11. 2009 年文獻圖四(C). 圖 12. 再現 2009 年文獻圖四(D). 分別將模型中 Rap1 及 Ras 移除，模擬在此情形下 ERK 活化濃度的變化與正常狀態之比較，模擬時間 60 分鐘。. 31.

(44) 圖 13. 2009 年文獻圖四(D). 結果顯示(圖 8)，模型中 Ras 活化濃度相較於 Rap1 活化濃度較快回到低點的位置，提供爾後模擬結果的判斷。結果顯示(圖 10)，在正常狀態下，ERK 活化濃度會在一定的時間內(約 10 分鐘)開始降回低點。若移除此模型的負回饋機制，則 ERK 活化濃度開始下降時間延後(約 15 分鐘)。若將 EGFR 降解機制移除，則 ERK 活化濃度會停留在高濃度的位置無法降回低點。此圖形的模擬結果顯示 EGFR 降解機制與負回饋機制在模型中所佔的影響因素。結果顯示(圖 12)，將模型中 Ras 和 Rap1 移除，ERK 活化濃度無法達到最高點的位置。且移除 Rap1 時 ERK 活化濃度上升與下降，都較. 32.

(45) 移除 Ras 來的快速，且 ERK 最高的活化濃度點也較高。此結果可與圖 8 相呼應。圖 8、10、12 的再現結果，均符合原文獻模擬的結果。因此我們可以判定，下載的模型與文獻相符，確認此再現步驟後可利用此模型進行研究。 2007 年發表的文獻. 24. 中，圖三與圖六為模型主要模擬之結果，因. 此我們進行模型的檢測，依照文獻設定的條件進行模型的再現。本文獻主要進行的模擬設定為，透過 Wnt 訊號的刺激，使得原本在低濃度狀態的 ERKpp 濃度值上升至高濃度，在 Wnt 訊號結束後 ERKpp 回到低濃度的位置。根據文獻及實驗結果的顯示，訊息傳遞路徑中某些因素發生改變後，會使得 Wnt 訊號結束後 ERKpp 活化濃度仍然停留在高濃度位置，進而產生失調的情形。本次的研究也利用到 Wnt 的短暫刺激後，觀察 ERKpp 濃度的最終表現情形。. 33.

(46) 圖 14. 再現 2007 年文獻圖三. 探討模型中參數的調整對β -catenin/TCF 及 ERKpp 濃度的影響；β -catenin：β -catenin 生成速率增加 20 倍。SB：Gsk-3β 磷酸化速率降為百分之一。OA：MEK 及 ERK 磷酸化速率降為二分之一。OA+SB：同時調整 OA 及 SB 的設定。. 圖 15. 2007 年文獻圖三. 34.

(47) 結果顯示(圖 14)，β -catenin 生成速率的增加、MEK 和 ERK 磷酸化速率同時降為二分之一以及 Gsk-3β 磷酸化速率同時降為百分之一時，都會造成 ERKpp 濃度最後停留在高濃度位置。由此可以了解這幾個參數對於 ERKpp 濃度的影響。. 圖 16. 再現 2007 年文獻圖六. β -catenin：為β -catenin 生成速率增加為兩倍。PP2A：為 ERK 及 MEK 磷酸化速率調為四分之三。500 分鐘時進行 Wnt 訊號刺激，1000 分鐘時結束 Wnt 刺激。. 35.

(48) 圖 17. 2007 年文獻圖六(B)、(C). 結果顯示(圖 16)，正常的狀態下，ERKpp 的濃度處於低濃度的位置，在 Wnt 訊號進入模型後，會產生震盪的情形，在模擬時間 1000 分鐘時，結束 Wnt 訊號，ERKpp 濃度回到低點。模擬模型中β-catenin 突變後(β-catenin 過度表達)，β-catenin 的生成速率為正常狀態的兩倍， ERKpp 濃度在經過 Wnt 訊號進入模型以及結束後，最後濃度不會降回低點。PP2A 突變的情形也有相同的狀況，而且在 Wnt 訊號進入的中間也沒有震盪的情形產生。透過再現兩篇文獻中提供的模型，我們可以確認此模型與文獻中的結果相符合。因此我們可以利用這兩個模型，進行研究及探討。. 36.

(49) Chapter 3. 結果與討論 (Results and Discussions). 3.1. ERK-Raf 負回饋效應在較大模型中的表現. 3.2. 模型外加新迴圈效應. 3.3. 模擬單一抑制劑進入訊息傳遞路徑. 3.4. 模擬多個抑制劑同時進入訊息傳遞路徑. 37.

(50) ERK-Raf 負回饋效應在較大模型中的表現. 3.1. 透過文獻. 18. 我們對 2009 年文獻模型，建立 Raf 到 ERK 之間回饋. 的完整性，利用 RKIP 的特性建立正回饋路徑。實驗證據顯示 36,37RKIP 亦能降解 Braf 因此我們先將模型建立起兩條正回饋路徑。分別為：ERK ⊣ RKIP ⊣ Raf-1 → MEK → ERK 以及 ERK ⊣ RKIP. ⊣ BRaf → MEK → ERK。加入的反應方程為：(*為磷酸化的符號) 1. MEK → MEK* ; Raf-1* RKIP(MEK 磷酸化被 Raf-1*催化 RKIP 抑制) 公式：. 2. RKIP → RKIP* ; ERK*(ERK*催化 RKIP 的磷酸化) 公式： 3. RKIP* → RKIP(RKIP 自我去磷酸化) 公式： 4. MEK → MEK* ; BRaf* RKIP(MEK 磷酸化被 BRaf*催化 RKIP 抑制) 公式：. 38.

(51) 文獻 25-27 指出 EGFR-ERK 訊息傳遞路徑中，存在 ERK 對 Raf-1 的直接抑制，形成一條負回饋的路徑，文獻. 26. 特別指出 ERK 除了透過. RKIP 對 Raf-1 形成正回饋，也存在 ERK 對 Raf-1 的直接抑制。這些文獻認為此負回饋路徑，能使得 ERKpp 活化濃度保持低濃度狀態，負回饋的存在能有效抑制 ERKpp 的活化濃度，使得其經過一段時間後濃度降回低點。我們藉由此論點，將模型建立負回饋路徑。此路徑為：ERK. ⊣ Raf-1 → MEK → ERK。加入的反應方程式為： 1. Raf-1* → Raf-1; ERK*(ERK*抑制 Raf-1 的磷酸化) 公式：反應路徑的添加及參數的設定，均參考文獻. 18. 。以文獻中的參數. 與其它路徑的相對參數，做倍率的調整，再將幾組較為合理的參數做範圍間的估計，找出較為合理的數值。模型修改後的示意圖(圖 18)，圖中 F1、F2 為正回饋路徑，F3 為負回饋路徑。我們以 ERKpp 的濃度曲線圖，比較原始模型以及添加幾個回饋路徑後的表現，進行效應的推論。此模擬的時間與模擬的設定均與原文獻模型的設定相同。. 39.

(52) 圖 18. 2009 模型修改後示意圖. F1(正回饋路徑)、F2(正回饋路徑)、F3(負回饋路徑). 圖 19. 修改 2009 年模型後 ERKpp 活化濃度圖. F1(原始模型加入 F1 路徑)、F2(原始模型加入 F2 路徑)、F1+F2(原始模型同時加入 F1、F2 路徑)、F1+F2+F3(同時加入三條回饋路徑). 40.

(53) 結果顯示(圖 19)，加入兩條正回饋路徑，均使得 ERKpp 活化濃度相較於 normal 狀態在高濃度位置時間延長。尤其從 ERK → RKIP → Braf 的效應更為明顯，這裡呼應原文獻 23，認為影響 ERKpp 濃度 Braf 比 Raf-1 較為重要。因此同時加入兩條正回饋路徑時，以 F2 為主要影響因素(圖中綠色與紫色線幾乎重疊)。驗證小模型在大模型中的表現，我們將 F3 加入模型中，同時也存在 F1、F2，發現加入負回饋效應 F3 沒有明顯的影響(圖中青色只比紫色線略為偏低)。在此模型中不同於小模型所得到的結論 25-27。因此我們推論，ERK → Raf-1 直接抑制形成的負回饋路徑，在此模型中對於 ERKpp 的濃度降低是影響較小的。我們持續探討此問題利用 2007 年文獻. 24. 模型，原模型已有 ERK. → RKIP → Raf-1 的正回饋路徑，因此我們只添加 ERK 對 Raf-1 直接抑制的負回饋路徑。此路徑為：ERK ⊣ Raf-1 → MEK → ERK。反應方程式為： 1. Raf-1* → Raf-1 ; ERK*(ERK*抑制 Raf-1 的磷酸化) 公式：. 41.

(54) 圖 20. 2007 年模型修改後示意圖. F1(負回饋路徑). 圖 21. 2007 年模型修改後 ERKpp 活化濃度圖. F1：原模型加入 F1 負回饋路徑。F1+β mutation：原模型加入 F1 負回饋路徑及β -catenin 生成速率增加為兩倍。β mutation：原模型β -catenin 生成速率增加為兩倍。 42.

(55) 與原始的文獻模型進行同樣的設定，Wnt 訊號進入刺激時間為 (500-1000min)。結果顯示(圖 21)，比較原始模型 normal 和加入負回饋狀態(藍線與紅線)，可以發現加入負回饋後，在 Wnt 訊號進入模型期間，震盪次數增多，震盪過後 ERKpp 濃度上升速度較為緩慢。可以觀察到加入此負回饋路徑，有將 ERKpp 濃度稍微抑制使其降低。接著在比較β -catenin 突變後的情形，將β -catenin 生成速率增加成兩倍(綠線與紫線)。原本模型因為β -catenin 突變，所造成的 ERKpp 活化濃度在 Wnt 訊號結束後停留在高點的現象。再加入負回饋路徑後，有明顯的抑制效果，此負回饋路徑造成 ERKpp 活化濃度的下調，且在 Wnt 訊號進入模型期間的震盪次數也增多，與小模型所得的結論 25-27 可以吻合。因此我們推論，ERK → Raf-1 直接抑制形成的負回饋路徑，對於 ERKpp 的濃度下調佔重要的因素。比較 2009 年模型及 2007 年模型，在結果的表現上有明顯的差異，因此我們對於兩個模型的差異性進行探究。兩者在 EGFR-ERK 的路徑上有差異，2009 年模型影響 ERKpp 活化濃度除了 Raf-1 的路徑外還有 Braf 路徑，2007 年模型則較為單純。透過 control coefficient 的計算，我們可以觀察到 2009 年模型與 2007 年模型，其模型中的參數，對於 ERKpp 的影響。進而可以使我們驗證我們推論的結果。 43.

(56) 2009 年文獻模型的 control coefficient 計算(表 1)，從結果我們可以觀察，幾個重點影響 ERKpp 的參數。C3G → Rap1 → Braf→ MEK，三者的控制系數均在 0.7 至 0.8 之間，全都為正相關。另一條路徑 Ras → Raf-1→ MEK 兩者的控制系數均不到 0.1。此結果顯示，影響 ERKpp 活化濃度的因素對於兩路徑之間有很大的差異，因此我們在添加小模型效應，負回饋機制於 2009 年模型時，其效應不明顯。此效應的添加在於 ERKpp 對於 Raf-1 的直接抑制，因此其影響由 control coefficient 的結果進行推論。 2007 年文獻模型的 conntrol coefficient 計算(表 2)，從結果觀察到，其影響 ERKpp 活化濃度的路徑，Ras → Raf-1 → MEK，以及其之間的 RKIP，control coefficient 的計算數值在 1.4 至 2.1 之間不等。顯示這幾個路徑對於 ERKpp 活化濃度的影響程度相近，且均是重要的路徑參數。因此當我們添加負回饋路徑進入模型時，此負回饋的效應就有其作用產生。從 control coefficient 的計算結果，與我們實驗模擬的結果呈現正相關，因此我們再觀察小模型在大模型中的效應時，control coefficient 能夠輔助我們，對於模擬結果的判斷。. 44.

(57) 表 1. 2009 年文獻模型 control coefficient 計算. Kinetic parameter. control coefficient. sos→Ras. 0.164. C3G→Rap1. 0.715 -0.148. ERK→sos Rap1→Braf. 0.715. Ras→Braf. 0.099. Braf→MEK. 0.829. Raf-1→MEK. 0.065. PI3K→Akt. -0.012. AKT→Raf-1. -0.027 0.043. Ras→raf1. 表 2. 2007 年文獻模型 control coefficient 計算. Kinetic parameter. control coefficient. Ras→Raf-1. 2.139. MEK→ERK. 1.905. ERK→RKIP. 0.217. Raf-1→MEK:RKIP. 1.452. 因此我們推論，小模型擁有的效應，要在較大模型中依舊有相同的表現是相對困難的，主要取決於不同模型中所建立的要素，以及其路徑形成的方式。一般來說大型模型路徑較為複雜，小模型的效應有可能因此被減弱，以 2009 年模型為例。但也有可能成為模型中的一個. 45.

(58) 新的關鍵效應，以 2007 年模型為例，負回饋路徑成為 ERKpp 濃度下調的因素之一。文獻 38,39 指出 ERK 對於 Braf 不會有直接的抑制形成負回饋路徑。因此我們觀察到 2009 年的模型，其 Braf 對 MEK 磷酸化的催化效應較 Raf-1 來得強，進而對 ERKpp 活化濃度影響也較強烈。造成負回饋路徑效應不顯著，我們推論在此模型中 Braf 與 Raf-1 存在著競爭的效應。若細胞中 Braf 的表現較 Raf-1 顯著，那麼此負回饋路徑所產生的效應影響就相對不明顯。反之 Raf-1 在細胞中的表現較 Braf 顯著，此負回饋路徑就扮演對 ERKpp 活化濃度下調的關鍵。 Braf 與 Raf-1 在訊息傳遞路徑中的競爭關係，扮演負回饋路徑使得 ERKpp 下調的關鍵。. 46.

(59) 3.2. 模型外加新迴圈效應. 本次研究利用 2007 年文獻 24 模型為基礎，除了文獻中的回饋路徑，我們認為在 EGFR-Wnt 訊息傳遞路徑中，仍然有新的路徑存在。因此加強 EGFR 和 Wnt 訊息傳遞路徑的連結是我們的目標。我們在模型中加入未知因子 Y，假設未知因子 Y 可能為訊息傳遞路徑中，未被發現的蛋白質或者蛋白激酶，透過 Y 當中繼點，連結 EGFR 路徑及 Wnt 路徑形成正回饋路徑或者負回饋路徑，且對於兩種不同的回饋路徑進行其行為的探討。如何連結兩個路徑是第一個重要的課題，我們利用原始模型中 ERK 磷酸化能催化 GSK-3β的磷酸化這樣的一個特性，將 GSK-3β做為對未知因子 Y 連結的起始點，再透過 Y 連結到 EGFR 路徑上的其中一個目標。在選定目標前我們進行測試，分別對路徑中的 Ras、Raf-1、 MEK 進行連結分析，最後發現對 Raf-1 所形成的回饋路徑，會造成結果有顯著的影響。因此我們選擇 Raf-1 為未知因子 Y 所要連結的目標。以下的研究過程我們分為正回饋路徑及負回饋路徑探討：正回饋路徑： ERK → GSK-3β → Y → Raf-1 → MEK → ERK 加入的反應方程為：(*為磷酸化的符號) 47.

(60) 1. Y →Y*；GSK-3β* (Y 的磷酸化被 GSK-3β磷酸化催化) β. 公式：. β. 2. Raf-1 → Raf-1*； Y* (Raf-1 的磷酸化被 Y 磷酸化催化) 公式：以上參數的選擇與估計，均與模型中其它相似催化途徑的參數相去不遠，再透過多個參數的組合估計(Parameter Scan)找出合理的參數，並且將未知因子 Y，預設其濃度為 5nm。比模型中其餘重要激素的濃度(GSK-3β：50nm、Raf-1：300nm、MEK：397nm、ERK：300nm) 來得小，使其成為模型中較難發現的因子，提高假設的合理性。. 圖 22. 2007 年模型添加未知因子 Y 示意圖(正回饋). 48.

(61) 圖 23. 添加未知因子 Y 後 ERKpp 活化濃度圖. Y：添加未知因子 Y 的正回饋路徑；β mutation：β -catenin 生成速率增加為兩倍； Y+β mutation：添加 Y 正回饋路徑且β -catenin 生成速率增加為兩倍。(模擬時間 3000 分鐘). 結果顯示(圖 23)，添加正回饋路徑後(紅線)，在 Wnt 訊號結束後 ERKpp 濃度短暫的下降，又上升到高濃度位置。在比較原始模型調整 β -catenin 生成速率(綠線)，添加正回饋路徑使得 ERKpp 濃度更高。若兩者情形同時存在(紫線)，其擁有加成的作用，使得 ERKpp 濃度居於高點，在 Wnt 訊號進入模型時，其濃度震盪情形也減少。加入 Y 因子(正回饋路徑)，使得 ERKpp 處於高濃度位置。. 49.

(62) 圖 24. Y 初始濃度差異 ERKpp 活化濃度圖. Y：添加正回饋路徑 Y 濃度 5nm；Y@：添加正回饋路徑 Y 濃度 1nm。(模擬時間 3000 分鐘). 在進行正回饋路徑添加的過程(圖 24)，可以發現未知因子 Y 濃度的大小，可以影響此正回饋效應對於 ERKpp 活化濃度的大小。低濃度 1nm 時 ERKpp 活化濃度降至低點(綠線)，高濃度 5nm 時 ERKpp 活化濃度留在高點(紅線)。因此未知因子 Y 的濃度大小，可能扮演調控 ERKpp 的關鍵角色。. 50.

(63) 圖 25. ERKpp 與 Y 起始濃度相對圖. 模擬時間 3000min。. 了解未知因子 Y 是否為調控 ERKpp 的關鍵因素，我們將 Y 的初始濃度設定在 0nM 到 10nM 的區間，觀察其在這區間的影響。結果顯示(圖 25)Y 起始濃度在 0~3nM 時其 ERKpp 濃度會在低點的位置，但是在超過 3nM 時，其濃度會跳升到高濃度的位置。因此 Y 因子的起始濃度在此模型中扮演了類似開關的角色(switch-like)。它調控了 ERKpp 最終濃度的大小。結合圖 23、24、25 的結果，可以解釋 Y 因子在模型中佔有重要的地位。若有 ERKpp 失調的情形產生，可能為訊息傳遞路徑中存在某未知因子，在很小的濃度區間內(0~10nM)產生變化。. 51.

(64) 負回饋路徑： ERK → GSK-3β → Y ⊣ Raf-1 → MEK → ERK 加入的反應方程為：(*為磷酸化的符號；Y 初始濃度：10nm) 1. Y →Y*；GSK-3β* (Y 的磷酸化被 GSK-3β磷酸化催化) β. 公式：. β. 2. Raf-1* → Raf-1； Y* (Raf-1 的磷酸化被 Y 磷酸化抑制) 公式：以上參數的選擇及估計，因其為負回饋路徑，主要作用為抑制 ERKpp 活化濃度，與原始模型的一般狀態接近，最終濃度會回到低點的位置。因此較難直接觀察其差異性，所以我們將分為三個步驟進行估計。分成第一及第二個反應方程參數組合估計(Parameter Scan)以及 Y 因子初始濃度區間選定。結果顯示(圖 27)，左圖在一個參數區間模擬 11 組 ERKpp 活化濃度曲線，沒有明顯的差距，在這個區間裡對 ERKpp 的濃度影響很小。右圖未知因子 Y 濃度，在濃度區間內模擬 11 組曲線圖，也沒有造成明顯的動力學行為，只在 ERKpp 濃度大小表現上有些微的變化。綜合兩者，可推論添加負回饋路徑時，反應方程 1 以及 Y 因子濃度大小，對 52.

(65) 於 ERKpp 濃度表現影響較小。主要影響 ERKpp 濃度行為表現，為反應方程 2 的參數調整上，反應方程 2 參數調整模擬 11 組曲線圖(圖 28)。可以發現，ERKpp 濃度曲線，在 Wnt 訊號進入時(500 到 1000 分鐘)有明顯的差異性。原始模型震盪一段時間後，震盪幅度變小 ERKpp 濃度達到高點，Wnt 訊號結束後降回低點。模擬 11 組數據中，Wnt 訊號進入時間內呈現以下幾種不同情形。濃度大幅度震盪且有規律、震盪幅度減小 ERKpp 最高濃度降低、失去震盪效應 ERKpp 濃度均處於低濃度狀態。. 圖 26. 添加未知因子 Y 示意圖(負回饋路徑). 53.

(66) 圖 27. 添加負回饋路徑參數組合估計圖(A). (Parameter Scan)左圖：反應方程 1 參數調整，模擬 11 組結果。右圖：未知因子 Y 濃度調整，模擬 11 組結果。. 圖 28. 添加負回饋路徑參數組合估計圖(B). 反應方程 2 參數調整，模擬 11 組結果。. 54.

(67) 圖 29. 負回饋路徑強度差異 ERKpp 活化濃度比較圖. Y：添加負回饋路徑；Y$：負回饋路徑抑制強度調為兩倍。. 確認參數大小後，我們進行負回饋路徑抑制強度大小討論(圖 29)。加入負回饋路徑後，能有效的抑制 ERKpp 的活化濃度(紅線)，使得在 Wnt 訊號進入時，濃度曲線有劇烈的震盪現象，負回饋路徑使得震盪時間延長幅度加大，盡可能的抑制 ERKpp 活化濃度。若將抑制強度增加為兩倍(藍線)，效應更趨明顯。從結果得知，此負回饋路徑調控 ERKpp 活化濃度，使其能有效的保持在低濃度的位置。降低了 ERKpp 受外界干擾後可能失調的情形，因此我們認為此負回饋路徑，對於抑制 ERKpp 的過度表達是正面的。. 55.

(68) 3.3. 模擬單一抑制劑進入訊息傳遞路徑利用 2007 年文獻模型 24，模擬當抑制劑進入訊息傳遞路徑時，其. 抑制的效果。本次研究主要探討的目標是蛋白激酶(kinase)的抑制劑，因此模型模擬的抑制對象均為蛋白激酶，2007 年模型中有三個蛋白激酶，分別為 Raf-1、MEK、GSK-3β。我們利用 ERKpp 的活化濃度表現，來區分抑制劑的抑制效應強弱，本研究在比較抑制劑的抑制效應強弱時，均透過 Wnt 訊號對訊息傳遞路徑的短暫刺激(500-1000 分鐘)，再透過β-catenin 的過度表達情形(增加β-catenin 的生成速率 K 值)，使得 ERKpp 濃度上升至高濃度狀態(失調情形)，原文獻的β-catenin 的生成速率 K 值為 0.423，我們以 0.423 為基準，以相同的倍率間隔去調整β-catenin 的生成速率 K 值，再觀察其對應的 ERKpp 濃度數值。本研究所觀察的 ERKpp 濃度均為其在 Wnt 短暫刺激後的 steady state 濃度值。模擬抑制劑對蛋白激酶進行抑制，將模型添加新的反應方程，主要的概念為抑制劑與蛋白激酶形成複合體. 40. 。首先進行單一抑制劑對. 單一蛋白激酶的抑制模擬。將模型分別添加三條不同路徑：. 56.

(69) 1. Inhibitor. Raf-1. Inhibitor/Raf-1. MEK. Inhibitor/MEK. 公式：. 2. Inhibitor 公式：. 3. Inhibitor 公式：. 圖 30. GSK-3β. Inhibitor/ GSK-3β. β. β. ERKpp 濃度與β -catenin 生成速率相對圖. Raf-1：抑制劑單獨抑制 Raf-1；MEK：抑制劑單獨抑制 MEK；GSK-3β ：抑制劑單獨抑制 GSK-3β 57.

(70) 表 3. 抑制劑單獨抑制時 ERKpp 濃度值. 抑制狀態列為抑制目標，β-catenin 生成速率(nM/min)設定為 0.847。. 抑制狀態 normal Raf-1 MEK GSK-3β. ERKpp 濃度(nM) 257 3.28 217 263. 將三條不同的抑制路徑分別加入模型中，其抑制劑濃度為 100nM，再調整β-catenin 的生成速率 K 值，觀察 ERKpp 活化濃度，在不同的 β-catenin 生成速率中有何表現(模擬時間 4000 分鐘)。從結果(圖 30)，原始模型預設的β-catenin 生成速率 K 值為 0.423，觀察到正常狀態(藍線)，ERKpp 活化濃度約在β-catenin 生成速率 K 值到了 0.6 開始急速的上升到高濃度位置，類似開關效應(switch-like)。抑制劑加入模型後，抑制 Raf-1 可以看到(紅線)，β-catenin 生成速率 K 值超過 1 之後才開始上升至高濃度的位置，而且上升的斜率較小。抑制 MEK(綠線)，β-catenin 生成速率 K 值約在接近 0.8 的時候，準備上升到高濃度的位置。從兩者的結果(紅、綠線)，抑制劑分別抑制 Raf-1、MEK 時，均能有效抑制 ERKpp 濃度，使其較不易上升至高濃度位置，欲使 ERKpp 活化濃度失調至高濃度位置，必定要使得β -catenin 生成速率 K 值較原先來得高。然而抑制 GSK-3β時(紫線)，可. 58.

(71) 以看見β-catenin 生成速率 K 值在 0.4 時，ERKpp 活化濃度即開始上升至高濃度位置，因此抑制 GSK-3β會有反效果的情形產生。從表 3，當β-catenin 生成速率 K 值為 0.847 時，原始模型 ERKpp 最後濃度為 257nM，單獨抑制 Raf-1 及 MEK 時，均能使 ERKpp 濃度降低，抑制 Raf-1 時效果尤佳。反之抑制 GSK-3β使得 ERKpp 濃度為 263nM，濃度升高為反效果。綜合其結果，我們可以了解在此模型中，哪些目標是可以有效抑制 ERKpp 活化濃度上升到高濃度的位置。顯然抑制 Raf-1 及 MEK 均能有效的使得 ERKpp 濃度不易升高，且抑制 Raf-1 效果更為明顯。 GSK-3β則不是一個好的標的，抑制 GSK-3β反而使 ERKpp 活化濃度較原始狀態來得容易升高。單一蛋白激酶的抑制劑，同時很可能是其他蛋白激酶的抑制劑。因此我們將模擬，單一抑制劑同時對多個蛋白激酶進行抑制。並且討論抑制強度的大小組合，以期望可以找出此模型中，有效抑制 ERKpp 活化濃度的抑制劑。將模型同時加入抑制路徑，並且調整抑制的強度大小做組合。以公式為例：. 。. 59.

(72) 我們利用抑制劑與蛋白激酶的結合速率 K 值大小，來區分抑制劑同時對蛋白激酶抑制時的強度。當 K1 值為 2.42 時，我們稱其抑制強度為 5，當 K1 值為 0.484 時，我們稱其抑制強度為 1，以此倍數類推，將抑制強度分為 0~5 不等(0 為無抑制效果)。藉此將抑制劑的抑制強度做區分，並且進行抑制強度的組合。抑制劑在模型中對蛋白激酶抑制(圖 31)，箭號方向表示抑制劑與蛋白激酶結合成複合體。. 圖 31. 抑制劑在模型中對蛋白激酶抑制示意圖. 60.

(73) 圖 32. 單一抑制劑 ERKpp 濃度與β-catenin 生成速率相對圖. R：抑制 Raf-1；M：抑制 MEK；G：抑制 GSK-3β。R*5M*5G*1：同時抑制三者。*5：抑制強度為 5；*2：抑制強度為 2；*1：抑制強度為 1。. 表 4. 單一抑制劑抑制多個目標時 ERKpp 濃度值：. 狀態列為抑制強度組合。β-catenin 生成速率(nM/min)設定為 0.95。. 抑制狀態 normal R*5M*5G*1 R*5M*2G*1 R*5M*1G*1. ERKpp 濃度(nM) 262 218 138 4.22. 抑制強度組合結果顯示(圖 32)，在模型中同時抑制三個蛋白激酶，以不同強度做組合，由結果(圖 30)得知單獨抑制 Raf-1 為最好的抑制效果，因此組合方式，先將 Raf-1 的抑制強度設定為 5。抑制結果最差的 GSK-3β則設定為 1，再透過此抑制劑對 MEK 的不同抑制強度組合。此三組抑制組合，均能有效的抑制 ERKpp 活化濃度的上升，其明顯較藍色線結果來得好。此抑制劑對 Raf-1 與 GSK-3β為固定的抑制強 61.

(74) 度，在 MEK 有不同抑制強度時，三條曲線有明顯的差異性。由圖 32 可以知道，當抑制劑對於 Raf-1 與 MEK 有相同的抑制強度 5 時(紅線)，其抑制效果較其他兩者略差(綠線、紫線)。從表 4，當β-catenin 生成速率 K 值為 0.95 時，我們觀察 ERKpp 濃度值，可以發現當固定 Raf-1 與 GSK-3β抑制強度且 MEK 的強度越小時，其抑制效果越好。因此我們對結果進行推論，模型中抑制劑的濃度固定為 100nM。當抑制劑同時對三個目標蛋白激酶進行抑制時，抑制劑總濃度固定，從模型的結構來觀察，三個目標蛋白激酶同時競爭抑制劑的濃度。所以當抑制劑對 Raf-1 與 MEK 的強度同為 5 時，此時兩者競爭抑制劑濃度的效應最為明顯。我們觀察模擬結果，Raf-1、MEK、GSK-3β三者之間濃度關係，可以確認在不同抑制強度組合下，會有競爭抑制劑的情形產生。由此結果可以推論抑制劑的選擇性問題。藥物設計的過程，一般來說期望設計一個選擇性高的抑制劑，以避免其抑制到訊息傳遞路徑中其餘未知的標的。因此模擬的結果對於，選擇性(專一性)問題是持正面的態度。我們模擬 Raf-1 及 MEK 抑制劑的選擇性問題，討論若 Raf-1 的抑制劑同時抑制 MEK 或者 MEK 抑制劑也對 Raf-1 有抑制效果，兩者之間的比較。進而得知什麼情況下，選擇性問題是第一考量的因素。 62.

(75) 對於兩種情況進行模擬，首先將抑制劑對 Raf-1 抑制強度設定為 5，再同時抑制 MEK，強度從 0~5 不等(0 為無抑制效果)，探討其差異。另外抑制劑對 MEK 抑制強度設定為 5，再同時抑制 Raf-1，強度從 0~5 不等。綜合兩者的結果，對選擇性問題進行討論。. 圖 33. 同時抑制，Raf-1 為主時 ERKppm 與β -catenin 生成速率相對圖. R*5M*5：同時抑制 Raf-1、MEK 強度同為 5；*4~*1：強度分別為 4~1。. 63.

(76) 圖 34. 同時抑制，MEK 為主時 ERKpp 與β -catenin 生成速率相對圖. M*5R*5：同時抑制 MEK、Raf-1 強度同為 5；*4~*1：強度分別為 4~1；。. 從結果(圖 33)，抑制劑抑制 Raf-1 的選擇性問題。當抑制劑同時對 Raf-1 及 MEK 抑制強度為 5 時，相較於抑制劑只單獨對 Raf-1 抑制且強度為 5 時，抑制效果來得差。由六條 ERKpp 對β -catenin 生成速率相對圖，其曲線走勢觀察，我們可以得知，當抑制劑對於 MEK 的抑制強度增加時，整體的抑制效果不會有加成的作用。反而抑制劑對 MEK 的抑制強度越弱時，抑制效果越佳。以 MEK 為主要的抑制劑(圖 34)，其結果顯示，此抑制劑如果能同時對 Raf-1 也能抑制時，抑制效果較佳。比較其 ERKpp 對β -catenin 生成速率相對圖，其曲線走勢觀察，抑制劑對於 Raf-1 抑制強度增強時，抑制效果也增強。. 64.

(77) 圖 35. 表 5. 同時抑制 Raf-1、MEK 強度差異結果比較圖. 抑制劑抑制 Raf-1 為主或 MEK 為主時 ERKpp 濃度值. 抑制狀態列為抑制強度組合。β-catenin 生成速率(nM/min)設定為 0.95。. 抑制狀態 normal R*5M*5 R*5M*4 R*5M*3 R*5M*2 R*5M*1 R*5. ERKpp 濃度(nM) 262 220 215 206 162 3.86 3.58. β-catenin 生成速率(nM/min)設定為 0.847。. 抑制狀態 normal M*5 M*5R*1 M*5R*2 M*5R*3 M*5R*4 M*5R*5. ERKpp 濃度(nM) 257 217 210 184 3.72 3.68 3.69 65.

(78) 結果顯示(圖 35)，抑制劑主要抑制目標為 MEK 時，其主要的曲線圖落在，β -catenin 生成速率 K 值為 0.7~0.85 的區間。也就是抑制 MEK 的同時，對 Raf-1 的抑制強度差異，這些結果均在β -catenin 生成速率 K 值為 0.7~0.85 的區間 ERKpp 活化濃度值，會開始跳升至高濃度的位置。抑制劑主要抑制目標為 Raf-1 時，其主要的曲線圖落在，β -catenin 生成速率 K 值為 0.85~1.1 的區間。也就是抑制 Raf-1 的同時，對 MEK 的抑制強度差異，這些結果均在β -catenin 生成速率 K 值為 0.85~1.1 的區間 ERKpp 活化濃度值，會開始跳升至高濃度的位置。從表 5，當β -catenin 生成速率 K 值為 0.95 時，以抑制 Raf-1 為主的抑制劑，固定 Raf-1 抑制強度，對於 MEK 的抑制強度越小時，其抑制效果越好。以抑制 MEK 為主的抑制劑，當β -catenin 生成速率 K 值為 0.847 時，固定 MEK 抑制強度，對 Raf-1 抑制強度越大時，其抑制效果越好。綜合此結果，有助於我們釐清抑制劑的選擇性問題。根據模擬結果，可得到一個結論。抑制劑要達到最好的抑制效果時，其抑制的目標應該為，模型中最有效的抑制標的。以模型為例，蛋白激酶抑制劑最好的抑制目標應為 Raf-1。且此抑制劑應有良好的選擇性，不應該同時對其他的蛋白激酶有抑制效果，若有則降低其抑制效果。模型中最主要的抑制目標，選擇性越高抑制效果越好。 66.

(79) 若抑制劑抑制的目標非模型中最主要的抑制標的，以模型為例，若 MEK 的抑制劑，其選擇性不佳，能同時對 Raf-1 有抑制的效果。那麼對其選擇性的要求，就不若 Raf-1 抑制劑來得高。如能在抑制 MEK 的同時，對於 Raf-1 也有些微的抑制，此抑制效果來得佳。因此我們推論，抑制劑的選擇性問題，對於訊息傳遞路徑中對於最重要的目標，選擇性(專一性)越強越好。其餘的則要觀察，抑制劑在訊息傳遞的路徑中，還對哪些目標有抑制效果。此模擬抑制劑進入模型的結果與方法，可利用來判斷，在藥物的設計過程中哪些抑制劑能有較佳的結果。以文獻. 41. 為例(表 6、表 7)，其提供了藥物設計的過程中，化合物. 對 pERK 的抑制效果，以及化合物對其他蛋白激酶的選擇性比較(IC50 值)。利用文獻結果，模擬 26、27 號化合物抑制情形。將 IC50 值做為抑制強度的參考，依其比例強度進行模擬，主要以同時抑制 Raf-1 及 MEK 來進行，觀察其模擬結果與文獻結果是否吻合。. 圖 36. 本圖取自文獻 41Table.3. 化合物 26 號及 27 號結構。 67.

(80) 本表取自文獻 41Table.4. 表 6. 化合物 26 號及 27 號對 pERK 的抑制情形比較。hour postdose：抑制劑抑制時間。 pERK：pERK 被抑制後剩餘的百分比。plasma concentration：測量後的濃度。. hour postdose 26 4 8 24 27 4 8 24. pERK(%inhibitor) 93±2 92±1 72±6 87±4 90±2 83±7. plasma concentration(μM) 28±7 29±5 0.4±0.1 23±4 27±3 3.0±0.6. 本表取自文獻 41Table.5. 表 7. 化合物 26 號及 27 號對於其他蛋白激酶的選擇性比較。. IC50(nM). 26. 27. V600E. 2.7. 2.1. wt B-Raf. 4.7. 4.2. C-Raf. 2.2. 2.5. Abl-1. 1.2. <0.5. DDR2. 2.6. 7. EGFR. 4900. 190. EPHA2. 18. 11. KDR. 59. 6.2. LCK. 610. 170. MEK. >10000. 1400. p38α. 91. 42. PDGFR. 1100. 47. RET. 1.6. 0.8. △B-Raf. 68.