斑馬魚空間記憶學習作業之不對稱行為表現－探討動物腦側化對行為的影響

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(1)國立台灣師範大學生命科學系碩士班研究生論文. 斑馬魚空間記憶學習作業之不對稱行為表現－探討動物腦側化對行為的影響 Asymmetric behavior of zebrafish in spatial memory learning program － discussing the effects of brain lateralization. 研究生：吳曜如 Yao-Ju Wu 指導教授：呂國棟博士 Kwok-Tung Lu 中華民國九十七年六月 0.

(2) 目錄壹、中文摘要 (ABSTRACT IN CHINESE ) ................................................ 2 貳、英文摘要 (ABSTRACT IN ENGLISH ) ................................................ 5 參、緒論. (INTRODUCTION) ....................................................................... 8. 一、研究背景 (STUDY BACKGROUND ) .............................................................................. 9 二、近期之斑馬魚行為研究模式(RECENTLY RESEARCH RESULTS ) .............................. 10 三、研究目的 (RESEARCH AIMS ) ..................................................................................... 14. 肆、研究材料與方法 (MATERIALS AND METHODS ) ......................... 16 一、實驗動物 (ANIMALS ) ................................................................................................ 17 二、實驗藥品 (DRUGS ) .................................................................................................... 17 三、動物分組 (ANIMALS GROUPING ) .............................................................................. 18 四、實驗分組與實驗過程名稱縮寫對照表 (THE ABBREVIATION COMPARISON TABLE OF GROUPING AND TRIALS) .............................................................................. 19. 五、空間記憶學習模式 (SPATIAL MEMORY LEARNING MODEL ) .................................... 19 六、手術破壞 (SURGERY ) ................................................................................................ 21 七、統計方法 (STATISTIC METHODS ) .............................................................................. 22. 伍、結果. (RESULTS )................................................................................... 23. 陸、討論. (DISCUSSION ) ............................................................................ 30. 一、 NAÏVE 動物的表現 .................................................................................................... 31 二、右側端腦與空間記憶學習的關連 ............................................................................. 33 三、左側端腦可能扮演的角色 ......................................................................................... 35. 柒、參考文獻 (REFERENCES ) ................................................................. 40 捌、附圖. (FIGURES ) ................................................................................... 45. 1.

(3) 壹、中文摘要 (Abstract in Chinese ). 2.

(4) 壹、中文摘要隨着基因轉殖斑馬魚製備技術及相關分生檢測技術的不斷進步，斑馬魚用於神經科學的研究日漸增多，近有證據明顯示斑馬魚具有與人類相似的腦側化現象。本研究延續前人的理論基礎，利用改良之斑馬魚 T 字形迷宮空間記憶學習模式，藉以找出學習過程中，不同學習方向所導致之學習行為差異。並且進一步利用此差異，針對可能與空間記憶有關的端腦部位，進行不可恢復的雙側或單側手術破壞，觀察其於空間記憶學習行為之影響，以探討斑馬魚端腦是否具有類似人類的腦側化現象。. 本研究中總共分為三部份實驗，第一部份利用大量未經處理之動物(naïve animal)進行測試，建立固定的標準訓練程序。此程序以訓練動物學習之方向可分為左側學習與右側學習兩種。實驗結果顯示，動物在往右側學習時，會呈現出學習曲線(p(naïve-R) < 0.0078)，但往左側學習時，並沒有如此顯著的情況(p(Naïve-L) = 0.1409)。此外，右側學習組的動物在第一次選擇的表現上，其方向的決定會自高比例選擇左側轉變為高比例選擇右側，然而往左側學習的動物則並表現出接近亂數選擇的情況。. 第二部份實驗是對動物進行全端腦的破壞手術，並依照第一部份之標準程序進行訓練。實驗結果顯示經假手術處理的 sham 組動物，其左側或右側學習結果均和第一部份的結果相似。但雙側端腦遭破壞之 lesion 組動物，右側學習組的動物並沒有呈現出學習曲線，而左側學習組的動物表現出較快的速度游入目標區，但第一次在交接處進行選擇時，動物並沒有直接選擇向左。第三部份實驗是對動物的單側端. 3.

(5) 腦進行破壞，並和第二部分一樣使用第一部份之標準程序進行訓練，藉此觀察比較動物的學習表現。結果顯示，右側端腦對右側方向的學習，扮演較左側端腦更加關鍵的角色。而左側端腦則可能與動物的情緒處理上較為相關。. 近期文獻提出之斑馬魚腦側化現象中，認為右眼系統在斑馬魚決定是否咬取食物與辨識熟悉物體時較為優先；左眼系統的功能則在觀察陌生環境或是辨認新物體。本研究結果顯示，目標區域所在的位置，亦即動物為左側學習組或右側學習組，對於動物的學習表現有其一定的影響。而斑馬魚只有在右側學習時會呈現出較接近傳統學習的模式。我們推測，這樣的差別其原因為斑馬魚的端腦具有功能性腦側化現象，而在右側學習模式，斑馬魚右側的端腦扮演了較為重要的角色。. 關鍵字：腦側化，斑馬魚，端腦，空間記憶學習，T 字形迷宮。. 4.

(6) 貳、英文摘要 (Abstract in English ). 5.

(7) 貳、英文摘要 By the proving of molecular biological technology, zebrafish has been widely used in transgenic experiments. Recently, results showed that brain lateralization exists both in the small fish’s and human’s brain. In the present study, we use modified T-maze apparatus which is symmetry and able to control opening way to examine the possible direction preference of zebrafish in the spatial memory task. In addition, we give animal irreversible surgical lesion and observe its effect on the spatial memory task.. There are three experiments in this study. In experiment-1 we use naïve animals to develop the standard training procedure. Briefly, there are two training procedure which named right-side learning and left-side learning. Animals were taught to swim direct to the right side and left side respectively. We found that only the right side learning group shows the learning curve, but similar pattern was not found in the left side learning group. Animals of the left side learning group just swam in a randomly manner and kept the speed while enter the target area.. In experiment 2, we train the animals which has been bilateral telencephalic ablation on the protocol of T-maze we has made in experiment 1. We found animals in sham group show almost the same pattern and performance with the naïve groups in experiment 1. However, animals in the lesion group, the right side learning group didn’t show the learning curve. The speed of left side group was faster than the right side group, but animal didn’t choose the left side when animals first arrived the connect area of T-maze. In experiment 3 animals were given one-side telencephalic ablation and saw the learning performance in T-maze. The 6.

(8) results showed that the right side telencephalon played an important role in the T-maze task of right side learning, and the left side was more important in emotional progressing.. Recent results showed that there were lateralize in zebrafish brain. The right eye system (RES) made decision to bite and the familiar objects. The left eye system (LES) was to use to observe the strange environment or identify new objects. And our results showed that the direction of the target reservoir will confound the learning response. Zebrafish expressed an accumulative learning response when the target reservoir settled on the right hand side. We suggest that the differential learning responses of zebrafish was resulted in the lateralization of zebrafish brain. And the right telecephalon may be play the more important on the spatial learning progress.. Key word: brain lateralization, zebrafish, telecephalon, spatial memory, t-maze.. 7.

(9) 參、緒論 (Introduction). 8.

(10) 參、緒論一、. 研究背景 (Study Background ). A. 斑馬魚的相關資料 (introduction of zebrafish) 斑馬魚，學名 Danio rerio，屬於鯉科，魚丹屬，是一種小型淡水魚，卵生。體表有黑色條紋，屬觀賞魚種，其飼養及繁殖相當容易，只需要常溫 (最佳溫度為 28.5℃)的水，一天餵食二至四次即可。繁殖週期短，從卵孵化至完全性成熟只需要三個月，且一星期可交配兩次，每次母魚可產下約三至五百顆卵。其卵徑大且透明，故早期多用於發生學或遺傳學相關研究，近年更已將斑馬魚的基因密碼已完全解讀，在神經系統構造及不同發生階段之基因調控，亦累積建立出完善之資料庫，研究人員可隨時利用資料庫做搜尋比對，故亦適用於神經科學之研究(Westerfield, 1995) 。. 斑馬魚在發育研究上最大的優點，是其胚胎發育上的機制與哺乳動物相似，而其為體外授精及孵化方式使得實驗操作相當方便，透明的胚體有利於研究者進行發育的觀察。對斑馬魚進行基因轉殖時，可利用 DNA 載體上的一段的螢光序列所發出的螢光做初期的篩選 (Halpern, et al., 2003)，因此使得斑馬魚在近年來越來越受到研究者的重視。2004 年時 Concha 更指出斑馬魚在未來基因調控與行為模式之關連性相關研究中，特別是與腦側化(cerebral lateralization)有關的研究，將會是一種非常重要的動物模式(Concha, 2004)。. B. 空間記憶學習模式空間記憶學習實驗在動物模式中相當常見，除因為其簡單且容易驗證，更因其多為連結式學習，故在訓練過後，只需進行重複測試，. 9.

(11) 即可藉由動物的表現而得知其是否仍保有先前學習的結果。此類測試最早可推至 1979 年 Magni 等人提出的放射狀迷宮(radial maze)，其利用不同的空間線索配合食物的引誘，進行連結學習的訓練，其可使動物學會辨識特定線索以獲到食物的獎勵(Magni, et al., 1979)。另一個常用的齧齒類動物空間學習記憶實驗為莫利斯水迷宮 (Morris water maze )，利用動物對於水的厭惡，產生在水的迷宮中逃離的動機，讓動物半強迫性地記憶水面下的平台位置，以觀察動物的空間記憶學習表現(Morris, 1984)。而魚類空間記憶學習，過去有 Salas 等人使用的鑽石型空間記憶訓練池(Salas, et al., 1996b)， Darland 等人使用的 T 字形迷宮做空間記憶的學習 (Darland & Dowling, 2001) ，以及 Williams 提出的簡易空間區辨作業(Williams, et al., 2002)，均為以魚類為動物模式之文獻常引用參考的行為模式。. 二、. 近期之斑馬魚行為研究模式(Recently research results ) 目前常用的斑馬魚學習記憶研究行為模式有兩種，分別為空間記. 憶學習(spatial learning)以及恐懼記憶學習(fear learning)。其原因是由於此兩類的模式可便於與前人建立之齧齒類動物實驗進行比較(Lu, et al., 2001; Morris, 1984; Sullivan, et al., 2004)。此外，這兩類的行為模式亦可測試動物的情境制約學習(context conditioning)或是空間線索學習能力(cue conditioning)，可分別研究其學習與記憶能力，及實驗操作後所造成的行為改變。本研究為了容易量化觀測結果，並找出相關行為模式，特採用空間記憶學習模式，於訓練過程中，將條件設定為不同視野之方向學習，以觀察不同實驗設計下，動物的行為是否具有差異。. 10.

(12) 過往類似的研究多集中在金魚身上，利用斑馬魚進行學習與記憶相關研究的只占極少數。較早的文獻為 1987 年時，Davis 與 Klinger 發現對金魚施以全端腦 (telencephalon)切除後，金魚仍可利用光線去區辨空間中的左右方向(Davis & Klinger, 1987)。此外在利用迷宮配合線索給予空間記憶的學習過程中，端腦切除動物之學習記憶表現較正常的動物為差 (Salas, et al., 1996a; Salas, et al., 1996b) 。而在 2004 年，Portavella 等人利用主動趨避學習作業(active avoidance paradigm) 成功測試了金魚在時間及空間線索的控制下之學習，並利用破壞方式找到金魚端腦中，相對於哺乳類的海馬迴及杏仁核等，負責空間記憶與恐懼記憶的部位(Portavella, et al., 2004a; Portavella, et al., 2004b) 。相似的主動趨避作業更在 2007 年由 Xu 完整的移植至斑馬魚模式上。(Xu, et al., 2007)。由於分子生物層次及基因體的研究日益進步，在硬骨魚中，斑馬魚的基因圖譜以及發生過程，均已經有非常完整的系統可供參考，故在近十年，針對利用斑馬魚作為實驗動物進行如空間記憶等行為模式測試的研究也開始增加。Swain 等人在 2004 年提出，利用麩胺酸 NMDA 型受器拮抗劑(glutamate NMDA receptor antagonist) MK-801，可干擾斑馬魚的學習過程(Swain, et al., 2004)。 Darland 等人則使用古柯鹼(cocaine)去對基因突變後之斑馬魚，在數種行為上的表現作篩選。他亦是首位利用 T 字形迷宮研究斑馬魚空間學習記憶的先驅 (Darland & Dowling, 2001)。 Williams 採用斑馬魚的幼魚進行單純的空間參照區辨作業，發現幼魚可以在食物的引誘下，進行不同顏色的區辨學習，甚至對某些顏色會有類似於偏好的行為表現(Williams, et al., 2002)。而 Colwill 進一步在讓斑馬魚學習不同顏色的區辨時，更確定了斑馬魚對於特定顏色之偏好的確存在。由上述的文獻可看得出斑馬魚已經隨著其優點，愈來愈受到學術界的重視 11.

(13) (Colwill, et al., 2005) 。. 而斑馬魚在腦側化研究方面的潛在價值在近年更是受到重視。腦側化指的是在大腦的雙側各具有不同的功能，早期研究使用剛孵化的小雞，使食物出現在小雞不同視野中進行引誘，來觀察小雞的行為表現的變化。發現小雞在不同視野看到食物時之反應並不相同，若是左眼視野看到食物出現，小雞會先觀察一陣子後，才去啄食；而在右眼視野看到食物，則小雞會迅速去啄食(Andrew, et al., 2000)。在硬骨魚 (teleost)如斑馬魚身上亦有相似的現象。文獻更指出，不論在成魚或幼魚階段，均可觀察到斑馬魚特定的優先反應行為表現，分別稱為左眼系統 (left eye system, LES) 及右眼系統 (right eye system, RES)，斑馬魚在面對不同狀況時，會優先採用左眼系統或右眼系統去進行反應。研究者利用此現象，於實驗中使刺激只出現在左側或是右側，爾後可就其反應情況，證明斑馬魚具有腦側化的現象 (Andrew, 1999; Miklosi & Andrew, 1999; Miklosi, et al., 2001; Watkins, et al., 2004)。. 除了在面對食物時，斑馬魚會優先使用特定眼睛外，Brown 更提出在面對高壓力環境下，動物也會採取一些特殊的策略應對，其中包括了利用不同的眼睛，對視覺刺激及環境進行評估和判斷。他發現魚在易被捕食的壓力環境下，除了心跳會下降之外，如果環境中存有可能的掠食者時，會採用右眼觀察之；但如沒有被捕食的壓力，則不會呈現特定的用眼偏好。而在空間記憶學習作業上，低被捕食壓力組的表現，會明顯優於高被捕食壓力組。他指出空間記憶學習作業需要極高的能量與專注力，當面對被捕食的壓力時，動物便會只針對與逃生有關的刺激進行反應(Brown & Braithwaite, 2005; Brown, et al., 2004;. 12.

(14) Brown, et al., 2005)。. Barth 則使用了較特殊的方式進一步研究此課題。他利用誘發突變方式 (ENU-induced mutations) ，篩選出特定的變異種，得到一個體內臟器左右側方向完全相反的斑馬魚品系，命名為 fsi (frequent-situs-invertus) zebrafish，利用一些簡單的測試方式，如鏡子反射法，發現一般品種的斑馬魚跟 fsi 品系斑馬魚的行為表現會剛好相反，這也間接證明了斑馬魚在行為表現上，應具有側化的現象(Barth, et al., 2005; McManus, 2005)。. 而在本研究中，為能夠在空間記憶學習作業上，進一步驗證腦側化造成的影響，故採用 Darland 等人提出的 T 字形迷宮為原型，並加以修改。Darland 之迷宮設計原理是利用了動物對於深水區域與淺水區域的喜惡，藉以訓練動物建立空間記憶之學習，並記錄動物進入目標水槽所需花費的時間。而本研究在每次測試 (trial) 時，增加記錄動物第一次進入 T 字形交接處所作的方向選擇，藉此輔助觀察及比較動物對於空間的記憶程度。迷宮本體如附圖一，為一 T 字形的構造，但修改迷宮的目標深水區域為兩側各有一個目標區，使迷宮具對稱性，以符合實驗之需求(Darland & Dowling, 2001) 。. 動物的行為成因十分複雜，故不可單獨使用一種動物行為模式便對動物的行為成因，做出推論及用以解釋動物行為的改變，需配合使用其他動物行為模式，如自發性探索行為或其他的知覺功能測試，以排除一些因實驗動物的個別差異或實驗操作，對實驗結果所造成的影響。在本研究三階段的實驗進行前，均測試動物之自發性空間探索行. 13.

(15) 為，並據其空間探索的表現進行分組，以排除動物在 T 字形迷宮中，因不願意對陌生環境進行探索，而影響整體表現的可能性。. 三、. 研究目的 (Research aims ) 由以上文獻背景中，可得知斑馬魚於腦側化的研究上，可扮演相. 當重要的角色，尤其是在分子生物領域上可提供的資訊相當完備，而其操作的便利性更是一大優點，只是對於這部分的基礎行為實驗相對缺少，略微阻礙了斑馬魚實驗的推展。本研究所建構出的行為模式，可配合斑馬魚易於進行基因轉殖技術的優勢，有效的提供其在不同行為表現上的評量，藉以區辨出一般野生種斑馬魚與手術處理斑馬魚的外顯行為模式差異，其成果將有助於斑馬魚實驗模式的推廣。. 本研究延續文獻對於斑馬魚有左右側眼睛各自優先處理訊息的觀點，目的為找出斑馬魚在空間記憶學習時之行為模式，並進一步以手術破壞方式確定動物在不同處理後之行為模式，試圖找出斑馬魚作為腦側化實驗動物模式之有效的行為量測方式。本研究推測，斑馬魚在進行空間記憶學習實驗時，面對不同方向的目標區域，動物會有不同的行為表現。而在這個基礎上，針對斑馬魚不同側的端腦進行手術破壞，觀察動物在行為表現上產生的變化，以評估斑馬魚在端腦上是否有兩側功能分化的現象。為了達到此項目的，整個研究分為兩個部分，依序進行：. A. 基本行為模式偵測方式與常模之建立因屬新行為模式的建立，故此部分將會利用實驗室現有設備建構基礎行為模式，如利用動物行為軌跡偵測系統觀察動物的自發性探索. 14.

(16) 行為，並藉此排除部分表現較差的動物，以配合本研究將進行之空間記憶學習實驗，減少因為動物本身表現不佳而影響實驗結果。由於空間記憶學習實驗需要動物對環境有正常的主動探索行為，進而可讓動物學習其空間座標，故在此部分會藉此篩選出表現正常的動物進行空間記憶學習作業，進而建立出標準的實驗程序，提供後續手術處置的動物可用以比對參考之依據。. B. 使用手術方式進行腦部之破壞一般咸認硬骨魚類的端腦與空間記憶學習有高度之關聯，且在過往魚類的腦側化研究中，也發現魚會有左眼或是右眼優先的情況，故於本研究採用不同方式的破壞，首先是針對全端腦的破壞，看動物在這樣處理之後，再進行訓練，觀察其學習過程是否會受到手術破壞的影響。再接著進行左側與右側端腦的破壞，希望試著延伸前人左眼優先與右眼優先的理論基礎，觀察其端腦是否也存在對應空間的關係。. 在實驗中採取的手術過程簡述如下。先使用麻醉劑 (0.2% MS-222)進行麻醉，讓動物完全麻痺後，放置到手術台上，降低麻醉劑的劑量 0.1% 持續灌流，使動物保持在麻痺狀態。再將其端腦上方之頭蓋骨打開進行破壞。手術過後將頭蓋骨蓋回，並使用生物手術膠水覆蓋傷口以減少感染，並給予其高溶氧之清水讓動物恢復。手術後讓動物休息五天，再進行後續的行為實驗。. 15.

(17) 肆、研究材料與方法 (Materials and Methods ). 16.

(18) 肆、研究材料與方法一、. 實驗動物 (Animals ) 斑馬魚之種魚來自中研院細胞與個體生物學研究所吳金冽老師. 實驗室。將種魚帶回臺師大生命科學系動物房之斑馬魚房養殖，並自行繁殖子代。飼養環境內光照週期為日 / 夜 = 14 / 10 ，日照開始於早上十點，熄燈於晚上十二點。水溫保持為 28.5 ℃。飼養方式參考斑馬魚手冊 (The Zebrafish Book) (Westerfield, 1995) 。. 本實驗均使用年齡 3 ~ 6 個月之動物，在實驗前均成群飼養，一單位 (30 x 60 x 30 cm3)的魚缸約共同飼養 80 - 100 隻魚。實驗前一週會進行編號分缸作業，將動物隨機挑選放入編號後的缸中進行馴養，動物實驗過程中，均在其編號缸中飼養。每日餵食兩次，每週更換清水一次。所有行為實驗均在動物之光週期中進行。動物房與魚缸之清潔維護以及實驗動物之照料皆由專屬人員負責。本研究所採用的研究方法經由國立台灣師範大學實驗動物管理委員會審核通過後進行，並符合農委會所訂定之實驗動物使用規章。. 二、. 實驗藥品 (Drugs ) 本實驗使用之水族專用麻醉藥物. MS-222 (Tricaine. Methanesulphonate) 藥品，購自美國 Sigma 藥廠，以 200 ppm 之濃度給予動物浸泡其中，讓動物吸收並達到麻醉之目的。在手術過程中使用較低濃度 100 ppm 與高曝氣水之口部灌流供給，使動物可保持於麻醉狀態且免於缺氧。. 17.

(19) 三、. 動物分組 (Animals grouping ) 實驗動物總共分為五大組，每一組再各自分為左側學習組 (代表. 符號為：組別-L )與右側學習組 (代表符號為：組別-R ) ，一共十小組。六大組分別進行以下處理： (手術處理對應部位如附圖二) A. 實驗控制組 (naïve)：動物完全沒有經過任何處理，於編號及分缸飼養後，馴化一週後即開始進行實驗。 B. 偽手術組(sham)：動物編號及分缸飼養後馴化五天，將動物的頭蓋骨經手術打開至可以清楚看到端腦，便蓋回頭蓋骨，並使用生物膠水協助閉合傷口。放回飼養缸中，休息五天後開始進行實驗。 C. 全端腦破壞組(lesion)組：動物編號及分缸飼養後馴化五天後，將動物的頭蓋骨經手術打開至可以清楚看到端腦，並將動物吻端向前時的整個端腦部位以吸取的方式吸出後蓋回頭蓋骨，並使用 3M 生物膠水協助閉合傷口。放回飼養缸中，休息五天後開始進行實驗。 D. 左側端腦破壞組(L-lesion)：動物編號及分缸飼養後馴化五天後，將動物的頭蓋骨經手術打開至可以清楚看到端腦，並將動物吻端向前時的左側端腦部位以吸取的方式吸出後蓋回頭蓋骨，並使用 3M 生物膠水協助閉合傷口。放回飼養缸中，休息五天後開始進行實驗。 E. 右側端腦破壞組(R-lesion)組：動物編號及分缸飼養後馴化五天後，將動物的頭蓋骨經手術打開至可以清楚看到端腦，並將動物吻端向前時的右側端腦部位以吸取的方式吸出後蓋回頭蓋骨，並使用 3M 生物膠水協助閉合傷口。放回飼養缸中，休息五天後開始進行實驗。 18.

(20) 四、. 實驗分組與實驗過程名稱縮寫對照表 (The abbreviation. comparison table of grouping and trials) Tameness：馴服階段，讓動物在新環境中適應 5 至 7 天以減少焦慮。 Acclimation：馴化階段，此階段 T 字形迷宮兩側出口均未開放。 Train-1：第一次訓練，此階段動物會看到迷宮左／右側其中一側會開放。 Train-2：第二次訓練，此階段動物會看到迷宮開放與 train-1 同側之出口。 Test：測試階段，此階段動物會看到迷宮開放與 train-1 同側之出口。 Naïve-L：完全沒有經過任何處理的動物，進行左側學習。 Naïve-R：完全沒有經過任何處理的動物，進行右側學習。 Sham-L：單純打開頭蓋骨，而未破壞端腦的動物，進行左側學習。 Sham-R：單純打開頭蓋骨，而未破壞端腦的動物，進行右側學習。 Lesion-L：將全部的端腦破壞後，進行左側學習。 Lesion-R：將全部的端腦破壞後，進行右側學習。 L-lesion-L：將左側的端腦破壞後，進行左側學習。 L-lesion-R：將左側的端腦破壞後，進行右側學習。 R-lesion-L：將右側的端腦破壞後，進行左側學習。 R-lesion-R：將右側的端腦破壞後，進行右側學習。. 五、. 空間記憶學習模式 (Spatial memory learning model ) T 字形迷宮使用純白色壓克力製作，壓克力厚度為 5 mm ，整體. 外觀為倒梯形，中間有一個 T 字形的通道，T 字形正下方為開始區， T 字形兩側為出口，分別接往目標區深水水槽，深水水槽較 T 字形部分深 6 cm ，T 字形與水槽交接出口處可採用隔版遮擋使動物時無法通過 (如附圖一) 。T 字形下方為保溫用儲水空間，安置兩組空間位置相對的同型 100 W 石英加熱管，提供實驗過程中迷宮的溫度穩. 19.

(21) 定。迷宮上方架設一攝影機 (Unibrain Fire-i 1.2，1394a 介面攝影機) ，連接至電腦上，用以監看並錄影動物在儀器中的行為表現以供後續分析用。迷宮周圍採用淡色系布幕遮蓋，使動物在迷宮中看到的周圍環境均為一致的顏色，進而減少系統性誤差。以下為本研究中三部分實驗共同的空間記憶訓練作業之標準實驗流程：完整流程共分為四階段，分別有一次的適應期(acclimation) ，三次的測試 (trial) ，過程為四天。在適應期的前一天，會對動物進行自發性空間探索行為實驗，利用動物在五分鐘內的總移動距離以確定動物進入陌生環境的表現並無異常。第一 (train-1) 、第二 (train-2) 及第三次 (test) 測試分別於適應期結束後各間隔一天進行。主要觀察動物花費多少時間從開始區游動到目標區深水區域，以及動物在每次測試時，第一次進入 T 字形交接處時所做的方向選擇。第一次進入迷宮時，給予實驗動物一段時間的馴化，不給予任何刺激，但也不開啟迷宮 T 字兩側的水槽口，只讓動物在 T 字形部分自由的移動。而在接下來第二到第四次的測試中，動物先是被放置於 T 字下方的開始區，並配合開啟 T 字形右側的水槽，一般而言，斑馬魚並不喜歡待在較淺的水中，故一旦發現 T 字右側有一個水深比起 T 字形部分深了 6 公分的水槽時，斑馬魚會較為傾向於離開開始區而游向並停留在深水區域之中。如此便會使得實驗動物會在往後加快自開始區移動至水槽的時間，故可以藉由第二次到第四次進入水槽中所花費的時間來推論實驗動物學習的情況。 Tameness. Locomotor Activity. 4 days. Acclimation. Trial 1. 1 day 1 day. Test. Trial 2. 1 day 1 day. 實驗過程流程圖。. 20.

(22) 六、. 手術破壞 (Surgery ) 第二部分與第三部分之實驗會針對動物的端腦進行全面或單側. 的破壞，除了需先編號處理外，迷宮與訓練作業流程均和上述第五點相同。因手術破壞增加的流程如下：首先將動物分編號飼養，讓其在新環境中適應五到七天，手術前一天，讓動物進行第一次的自發性空間探索實驗。並在空間訓練學習作業開始前一天進行第二次的自發性空間探索行為測試，利用動物在五分鐘內的總移動距離以確定動物在手術前後的表現並無變化。手術進行當天，先給予餵食，在動物吃完食物後三小時，進行手術。麻醉動物使用 200 ppm 之 MS-222 ，而在手術過程則是以濃度為 100 ppm 之 MS-222 的曝氣水自動物口部灌流，使動物保持麻醉狀態，以方便進行手術。手術過程均在自製的手術台上讓動物保持頭背部向上、吻端(anterior)向前的姿勢（如附圖二），手術台放置在解剖顯微鏡上。由於此麻藥是麻醉動物的肌肉組織，故手術完成後，需盡快將動物自手術台上移入高曝氣水中，使麻醉效果儘速解除，以免造成動物在手術後因缺氧而死亡。手術過後給予動物五天的恢復期，即開始進行同上述五之空間記憶學習模式。. Tameness. Locomotor Surgery Acclimation Activity. 4 days. 1 days. 4 day. Locomotor Activity. 1 day. Train-1. 1 day. 第二部分與第三部分實驗過程流程圖。. 21. Train-2. 1 day. Train-3. 1 day.

(23) 七、. 統計方法 (Statistic methods ) 在自發性空間探索行為的結果，對各組在手術前後的表現，進行. 配對 t 檢定(pair t test)，確定各組在手術前後的自發性空間探索均沒有受到影響，使用 p ≦ 0.05 為顯著標準。. 而在全部的空間記憶學習實驗中，對各組均採取 one way ANOVA 觀察動物組內在兩次的訓練與一次測試中花費的時間，是否可達到統計上的顯著，即我們實驗定義之「習得」。另配合 Tukey’s HSD Test 作後設多重比較，看各個訓練間是否有組內差異。. 在組間比較方面，三部份均採用 one factor with one repeated measured ANOVA，看左側學習組與右側學習組間是否有差異，並配合 Tukey’s HSD Test 或 student’s t-test 進行後設檢定，看左右側學習組各個訓練間是否有組內差異。. 第三部份與第二部分一樣利用 sham 組作為對照組，亦採用 one factor with one repeated measured ANOVA，，分別針對左側學習組與右側學習組的組別看 sham 與 L-lesion 與 R-lesion 組之間是否有差異。另外在第二部分使用並配合 Tukey’s HSD Test、第三部分使用 student’s t-test 作後設檢定，看左右側學習組各個訓練間是否有組內差異。. 所有的統計結果均以 p ≦ 0.05 作為是否具統計上顯著的辨別依據。. 22.

(24) 伍、結果 (Results ). 23.

(25) 伍、結果第一部份本實驗想找出動物在 T 字形迷宮中向左側或是向右側學習時，其表現情況是否具有差異。藉以建立行為常模供後續實驗作為參考。. A. 實驗設計說明前人的研究結果顯示，斑馬魚在進行 T 字形迷宮空間記憶學習作業時，向右側學習時，會有明顯的學習曲線出現，且在其第二次進入迷宮時的表現就會有統計上的顯著。本實驗使用共 72 隻完全未經處理的實驗室飼養共同品系的斑馬魚進行空間記憶學習實驗，在分編號缸過程中損耗 1 隻動物，其餘動物隨機分配至兩組，其中 35 隻為左側學習組， 36 隻為右側學習組。實驗中試圖確定動物在空間環境條件不同處理 (左側／右側開放)下，動物的行為是否會有不同的表現。. B. 實驗結果說明首先自發性空間探索行為在左側學習組與右側學習組之間沒有存在顯著差異的 (p = 0.6456) (如附圖三)。而在空間記憶學習實驗中 (如附圖四) ，右側學習組的動物表現出了學習曲線 (p(naïve-R) < 0.0078 )，且動物在訓練的三次測試中， train-2 及 test 的成績均顯著地快於 train-1 進去的時間 (by Tukey’s HSD test, p < 0.05) ，這樣的結果跟過去文獻是相符的；而在左側學習組上，並沒有這樣的現象 (p(naïve-L) = 0.1409 ) ，在 train-2 及 test 的速度雖較為減少，但並沒有達到統計上的顯著差異。. 24.

(26) 另外則是在每次測試時動物第一次面對 T 字形迷宮的 T 字形交接處時所做之選擇，亦即每次測試時動物是向左側轉或是向右側轉的決定偏好度，以向左側轉定義為正 1，右側為負 1，結果可發現到一個現象 (如附圖五) 。兩組動物在馴化階段，並沒有呈現出偏好左側或右側的現象，也就是接近亂數挑選。但右側學習組別的動物，在 train-1 時，有極高的比例 (77.78%) 會先向左側選擇，在 train-2 時，此比例略微下降至 66.67%，但在 test 時，只有 27.78% 的動物會向左側選擇；這樣的現象在左側學習組別的動物並沒有發現。. 25.

(27) 第二部份過去的文獻指出魚的端腦對空間與情緒記憶扮演重要的角色。本部分實驗試圖直接利用破壞的方式，證明端腦在動物進行空間記憶學習作業上，扮演了關鍵的角色。. A. 實驗設計說明本實驗使用 64 隻 3 – 5 個月大之動物，隨機分配至各組，動物手術後死亡或是運動明顯障礙而不予使用。左側或右側是指，動物吻端朝前時的左右方向。各組說明與數目如下： Sham-L 組：單純打開頭蓋骨，術後休息五天，訓練其向左側學習。共 15 隻動物。 Sham-R 組：單純打開頭蓋骨，術後休息五天，訓練其向右側學習。共 15 隻動物。 Lesion- L 組：端腦破壞，術後休息五天，訓練其向左側學習。共 11 隻動物。 Lesion-R 組：端腦破壞，術後休息五天，訓練其向右側學習。共 6 隻動物。. B. 實驗結果說明首先可看到各組在自發性空間探索行為的表現上並沒有特別的差異( p(sham-L) = 0.3587 , p(Lesion-L) = 0.9153 , p(Sham-R) = 0.6000 , p(Lesion-R) = 0.3317 ) (如附圖六與附圖七) 。. 進而比較 T 字形迷宮的表現 (如附圖八與附圖十) ，可以看到不論左側或右側方向學習的動物，sham 組的表現均與第一部份的結果. 26.

(28) 相當接近 (p(sham-L) = 0.4325，p(sham-R) = 0.0201) ， sham-R 組的 train-1 分別對 train-2 與 test 均達到顯著差異 (by Tukey’s HSD test, p < 0.05) 。. 端腦破壞處理組 (Lesion-L 與 Lesion-R) 的動物，其訓練時及測試時的表現，各自均沒有達到統計的顯著 (p(lesion-L) = 0.7726，p(lesion-R) = 0.2025) ，顯示其空間學習記憶的能力應受到大小不一的損傷 (如附圖八與附圖十)。其中，Lesion-R 組在三次測試均花費較多的時間，並沒有表現出學會進入目標區；而 Lesion-L 組，在第一次訓練 (train-1) 時顯著的較 Sham-L 組的動物以較快的速度進入目標區 (by Tukey’s HSD test, p < 0.05) 。. 在第一次選擇的方向表現上，Lesion-L 組在進行 T 字形交接處的第一次選擇時，則是顯示出較先選擇右側 (如附圖九) ，並非直接到目標區所在的左側。Lesion-R 組則是均呈現較接近亂數分配選擇的情況 (如附圖十一) 。. 27.

(29) 第三部份魚的端腦對空間與情緒記憶扮演重要的角色。而本部分實驗想試圖利用直接破壞方式，找到不同側之端腦在動物進行空間記憶學習作業上，是否各自扮演了不同的角色。. A. 實驗設計說明本實驗使用 64 隻 3 – 5 個月之動物，隨機分配至各組，但動物手術後，有部分動物因死亡或是運動明顯障礙而不予使用。左側或右側是指，動物吻端朝前時的左右方向。各組說明與實驗用數目如下： L-lesion- L 組：左側端腦破壞，術後休息五天，訓練其向左側學習。共 8 隻動物。 L-lesion-R 組：左側端腦破壞，術後休息五天，訓練其向右側學習。共 9 隻動物。 R-lesion-L 組：右側端腦破壞，術後休息五天，訓練其向左側學習。共 14 隻動物。 R-lesion-R 組：右側端腦破壞，術後休息五天，訓練其向右側學習。共 8 隻動物。. B. 實驗結果說明我們在此使用第二部份的 sham 組作為控制組進行比較。從自發性空間探索行為表現中，可看到各組在手術前後沒有顯著的差異 ( p(L-lesion-L) = 0.6579 , p(R-lesion-L) = 0.5275 , p(L-lesion-R) = 0.1281 , p(R-lesion-R) = 0.7737) (如附圖十二、十三)。. 而在 T 字形空間學習表現上，單側端腦破壞的左側學習組. 28.

(30) (L-lesion-L 與 R-Lesion-L) 與 sham-L 組比較(如附圖十四)，左側與右側端腦破壞的左側學習組在空間記憶學習表現上，均沒有達到統計上顯著的差異 (p(L-lesion-L) = 0.2755 , p(R-lesion-L) = 0.9731 )。. 此三組的第一次方向選擇結果(如附圖十五) ，則 L-lesion-L 與 R-lesion-L 組的表現與 sham-L 組均有所差別。L-lesion-L 組對於在 train-2 時，會高比例的選擇左側；而 R-lesion-L 組則均會較高度選擇向右側。. 在右側學習部分 (如附圖十六) ，L-lesion-R 和 R-lesion-R 兩組均未達到學習曲線之顯著表現 (p(L-lesion-R) = 0.1980 , p(R-lesion-R) = 0.2236 ) (如附圖十五) ，但 L-lesion-R 組在 train-1 時的表現即顯著快於 Sham-R 組 (by student’s t-test, p < 0.05)。. 在第一次選擇方向的表現上， R-lesion-R 組均略偏向左側；而 L-lesion-R 組則是高度偏向選擇右側 (如附圖十七) 。. 29.

(31) 陸、討論 (Discussion ). 30.

(32) 陸、討論一、. Naïve 動物的表現根據文獻所述，2001 年 Miklosi 等人的研究指出，斑馬魚的腦側. 化現象可定義為左眼系統 (LES) 與右眼系統 (RES) 兩種，它們分別掌控了不同的功能。在 LES 部分，主要在用以對於陌生環境的摸索，以及對於新出現的事物的記憶、學習上；而在 RES 則是用以在進行決策判斷，特別是對於是否要開口咬食物的這個決定上，扮演重要角色，另外一個功能則是在魚看到另一隻魚時，辨認其是否為同類或是性別相同與否(Andrew, 1999; Miklosi, et al., 2001)。但在過去進行 T 字形迷宮的文獻中，提及的多是右側的學習，並沒有太多提及左側的學習表現。在本研究中第一部份的實驗結果，明顯發現斑馬魚在進行空間記憶學習時，只在右側學習時會有明顯的學習曲線出現，且幾乎一次學習即可達到統計的顯著差異，雖然其優先選擇右側的機會要在第三次進入迷宮時才會明顯的提升，但這種行為可視作動物對於環境的再度探索與確認安全區域的位置。然而左側學習時，並不會觀察到這樣的現象。. Watkins 在 2004 年時指出，斑馬魚在左側或右側視野均出現新刺激的時候，在新的刺激辨識上，動物明顯的使用左側較右側優先。然而若在動物的左側出現的景物為動物曾經看過或經驗過的，右側出現的為新刺激時，動物反應常會傾向左側 (Watkins, et al., 2004) 。這或許就解釋了在第一部份中，naïve 組的動物在 train-1 時的表現。在第一次的 acclimation 過程中，動物出了 T 字形時，左右看到的視野都是一樣的，所以基本上的左右選擇其實是接近亂數分配的，然而在 train-1 時，右側學習組看到的視野，右側是與前一天不一樣的 (隔版 31.

(33) 拿開) ，而左側保持一樣，這就可以解釋為何在第一次選擇時，動物會傾向選擇左側，但經過訓練後，就會較直接選擇右側與以較快的速度進入目標區。而在左側學習組，由於左側出現的是新刺激，對於動物來說，感覺上就像是對新環境的探索，有部分動物可能會因先前的學習經驗，習慣性的進入右側較熟悉的區域，而有部分則會選擇前往探索新的左側目標深水區。. 而接著在 train-2 時，由於已經是第二次進入迷宮，所以右側開放空間的目標區對動物來說，已經有過先前的經驗，且該經驗為實驗操作給予的正面學習經驗，亦即讓動物在較深的水中停留至少三分鐘自由探索，故深水區域對於動物來說是一個安全的區域，動物在面對兩側進行決策時，會較優先使用右眼系統，也就是進行計畫性行為的規劃，當然還是有些動物會採取保守策略而選擇左側，這樣自然 train-2 選擇向右的比例就不會那麼明顯，但是表現上由於前往左側即可確定沒有出口，故即使是向左側的動物也會在一定時間內決定探索左側，而前往右側目標深水區。左側學習組則會利用先行判斷整個視野並無太大變化，左眼系統會讓動物去試著對環境進行更詳細的環境探索行為。. 到 test 時，由於已經是第三次進入迷宮，對於右側學習組的動物而言，一進去就很自然的瞭解到該往右側前進，亦會以較快的速度進入目標深水區域。而對於左側學習組的動物，其會重複 train-2 時的情況，由左眼系統讓動物繼續對環境進行更詳細的環境探索行為。故可知在前兩次的訓練中，兩組均對於目標深水區有過探索跟空間的記憶，但從進行第一次轉向的選擇時，左側學習組並未特別選擇向左. 32.

(34) 側，每次測試進入迷宮時，也都採取左眼觀察策略，其表現便不會與右側學習組類似。而右側學習組則是有很明顯的學習曲線，以及在第一次選擇方向從 train-1 到 test 時的大幅度變化。故針對一般未經處理之動物可發現在右側學習上才會有學習的行為表現(Andrew, 1999; Miklosi, et al., 2001)。但左側學習組可能由於其左眼系統優先對於空間環境進行進一步的探索，故使得動物不會表現出明顯的學習行為。此結果未出現在前人的文獻中，但已可表示動物在 T 字形迷宮中，左右側的學習確實存有差異，不只表現在游進目標區的時間上，更在動物做出抉擇時，呈現某種程度的影響。. 二、. 右側端腦與空間記憶學習的關連根據前人的文獻，我們可推論若是對端腦進行破壞，將會影響動. 物的空間學習記憶表現，換而言之，即會對動物進入深水區的學習產生障礙。在本研究第一部份的結果發現，只有向右側學習比較接近傳統的學習表現。而如同預期，在第二部分實驗中，我們將全端腦破壞後，右側學習組的表現亦的確受到了影響，除了需花費較多的時間才能進入目標區外，在每次測試中第一次的方向選擇亦呈現出接近亂數分配的情況。根據文獻指出，魚在端腦被移除後，會對於空間記憶的表現形成障礙(Portavella, et al., 2004a)，在這個部分的實驗中，可得到類似結果的證據。. 為了確定單側的端腦與這樣的學習行為是否有關，在第三部份，我們藉由手術破壞的方式，分別對左側或右側的端腦進行破壞後，再進行空間記憶的學習實驗。過去文獻指出左眼系統與右眼系統的功能差別，其中，右眼系統的功能是在決定路線規劃方面，這部份可以在. 33.

(35) 左側端腦破壞後，向右側學習的組 (L-lesion-R) 上看到可能的證據。 L-lesion-R 組在進入目標深水區所用的時間均相當快速，在 train-1 跟 test 時更表現出低於 30 秒的表現；而在第一次方向選擇的表現上， L-lesion-R 組直接表現出對右側的高度偏好，有較高的比例在面對選擇時會選擇右側。但是並非左側端腦破壞後的動物會有較高比例向右側選擇的傾向，比對同樣為左側端腦破壞後，向左側學習的組 (L-lesion-L) 時，可以看到這一組在馴化與 train-1 時的偏好是維持 50%，但是到 train-2 時會高度向左側，故動物並非在左側端腦破壞後就會有向右側高度偏好現象，而是跟他受訓練的方向會有關。. 而在右側端腦破壞後，向右側學習組 (R-lesion-R) ，每次測試進入目標深水區的時間，並沒有達到統計上的顯著；其第一次的選擇略微偏向左側，但最多只有六成，這點與 Lesion-R 組的動物表現較為類似。與左側端腦破壞的組比較，可看到左側破壞後，動物對於選擇進入的方向似乎並沒有太多的困難，所以均會以較快的速度進入目標區，但是右側端腦破壞後，動物卻對於要學習右側這件事情產生了障礙，此現象可提供右側端腦在右側的學習中扮演重要角色的一個證據。亦即若是往右側的學習可視為動物需要做出路線規劃的學習行為，所以需要進行訓練才能學會，在我們對右側端腦單獨進行破壞後，可以看到動物便顯示出學習上的困難，故也證明了，右側端腦與右眼系統有高度相關。. Aizawa 在 2005 年曾試著利用染色與切片方式，找到從端腦開始，分別會有一條神經路徑，會經由松果體傳遞到中腦，由於松果體在斑馬魚腦中屬於不對稱器官，故這條神經路徑也被視作是可能的側. 34.

(36) 化相關路徑。他在文章中清楚指出該神經路徑在左側或右側的中腦投射的部分有著不一樣的空間區域 (Aizawa, et al., 2005) 。所以若是從神經路徑判斷，可能右眼系統從右眼接收到訊息後，會送至兩側端腦，但是較主要由右側端腦進行運作處理，然後再向後傳遞，故在這邊我們進行單側破壞後，右側破壞組的動物對於學習就產生了一定程度的障礙，但是左側破壞組的動物由於右側端腦並沒有直接受到損傷，在學習表現上雖有改變，但是仍然不能否認動物應該對於目標區域有一定程度的學習。. 三、. 左側端腦可能扮演的角色在上述第二點中，我們經過不同部位的破壞確定了右側端腦與右. 眼系統的關連，並且其存在對於空間記憶學習上的影響。但是同樣的方式不能運用在左側學習的部分，由於 naïve-L 組在學習表現上，從頭到尾並沒有一個明顯的學習曲線出現，在每次測試的第一次方向選擇亦無明顯的變化，所以在手術破壞對於學習行為影響的評估上，就沒有辦法直接看出明顯的差別。. 但是在觀察各組的表現，可以看到在左側端腦破壞後的左側學習組 (L-lesion-L) ，這一組的結果與其他各組相比較，有一些較不尋常的地方出現。首先，在馴化 (acclimation) 期與 train-1 時，面對第一次的方向選擇時，動物的表現均接近 50%的亂數分佈狀態，但在 train-2 時，動物表現出高比例直接選擇往左側前進。過去文獻對於 LES 與 RES 之功能區分主要可分為，LES 為面對新刺激時的學習、記憶，而 RES 則是在辨認過去經驗以及決策、空間記憶之路徑計畫等方面有較高度的表現。(Andrew, 1999; Miklosi & Andrew, 1999;. 35.

(37) Miklosi, et al., 2001; Watkins, et al., 2004)。在本研究中，從左側被破壞的組別中，我們看到動物由於右側端腦仍然存在，故動物的確可以清楚的決定方向，除了每次測試完成的時間均較其他組略快之外，對於向右側或向左側的學習，特別是在左側的學習上，L-lesion-L 組的動物比起 naïve-L 組的動物更明顯表現出對於目標區域的記憶，這和文獻提到的右側端腦進行決策與判斷是類似的。然而，記得不代表就會很快的進入目標區域，其使用較少的時間進入目標深水區，亦可能因為左側端腦對於情緒性記憶有一定程度的影響，在破壞之後，動物表現出類似焦慮的情況，進而在左側的學習上產生影響。由於在 LES 部分對於陌生環境的摸索與記憶除了表現在第一次進入後，還有對於細節的記憶，可是動物在左側端腦被破壞後，便不會進行細節記憶，使得右側端腦直接記憶了左側位置，配合同為左側學習組，在右側端腦破壞的組 (R-lesion-L) ，動物的表現便與 naïve-L 組與 sham-L 組類似，並未表現出學習曲線，但不一樣之處在於每次測試中，第一次方向選擇的情況，動物表現出高比例選擇向右側，由此可推測此組進入目標區的行為表現，應類似於是每一次都進行了整個空間的探索之後，才進入左側的目標深水區，故對於左側的學習並為表現出習得情況，反而對於右側有高比例偏好，這可視作動物每次進入迷宮時，均重複進行了空間探索（亦即運用了左眼系統的功能），所以才出現高比例選擇向右側轉。這種向右側轉的情況，對於動物來說亦屬於其天性，因為根據文獻，動物在正常情況下，如果有受到驚嚇之類的，是會偏向往右側前去，因為右側肌肉收縮可以讓左眼看到更多視野 (Watkins, et al., 2004)。. 這個現象其實可以在右側端腦破壞後的組 (R-lesion-R) 看到類. 36.

(38) 似的表現，前面提到這一組的動物相對於 naïve-R 與 sham-R 組，表現除了略慢以外，其實還算是有稍微學會的情況，差別可能在於 R-lesion-R 組的動物即使訓練兩次，在 test 時的第一次方向選擇上，並沒有高度的偏向右側，而還是保持在 50%左右，其實這點與 naïve-L 和 sham-L 其實反而是類似的。 R-lesion-R 組的動物，由於右側端腦被破壞，只剩下左側端腦運作時，對於右側學習這種需要右側端腦運作才能學習表現的情況，自然就不能正常表現，且由於只剩下左側的端腦，在進行第一次選擇時，其選擇的情況便會類似左側學習的組別，除了選擇的方向相反，可推論只有左側端腦仍有可能性學會向右側學習的作業，因為端腦兩側均有類似的構造，只是 RES 的決策功能可使得學習情況會更加明顯，故 RES 遭到破壞會造成學會的速度較慢，但進行每次的方向選擇時，由於只有 LES 運作，故表現反而與 LES 有高度相關的 naïve-L 與 sham-L 組等左側學習之選擇模式類似。. 總而言之，從右側端腦破壞組的整體表現可以發現，動物對於視野有改變的方向，的確表現出一定程度的排斥 (雖然沒有顯著差異) 。特別是 R-lesion-L 組，幾乎都選擇向右側前進，而 R-lesion-R 組則是類似於 Lesion-L 組的表現，但這些組的動物共同表現出的行為均出現了較快速進入目標區域，以及傾向選擇較馴化期時，視野中變化較少的方向（即 R-lesion-L 組與 Lesion-L 組選擇向右，而 R-lesion-R 組略微偏向選擇左側）前進，這種現象與在一定壓力下較高焦慮的動物，會在找到出口或是安全區域後，比較快速學會其空間位置的情況類似，故可推測左側端腦對於情緒性記憶有一定程度的影響，但是在本實驗中，可能是需要其他的行為表現作輔助的證明，故並沒有顯著. 37.

(39) 的差異可證明這個影響的存在。. 綜合以上結果，可知，斑馬魚在進行 T 字形迷宮之空間記憶學習時，右側學習是比較接近傳統的學習行為表現，而在全端腦以及右側端腦被破壞後，動物在進行右側學習時，均表現出較不會直接進入目標區，會花費更多時間才可達成學習要求，但從動物進入深水目標區後就會停留於深水區中，不會離開這點可確定，動物應該並不是討厭深水區域，而是對於目標區的位置並沒有辦法明確記得，特別是在缺少了右側端腦後，在右側學習上，其學習表現就會顯示出遲緩的情況，而缺少左側端腦則沒有這樣的現象，可見得在右側學習時，較為高度需要右側端腦運作才可對於右側空間的位置形成準確的空間地圖並加以運用。這與文獻中提到的 RES 會對動物在空間中移動時進行路徑規劃的功能一致。如果動物缺少了左側端腦，動物似乎只有除游動速度會較快，行為並不會表現出類似於向右側學習之學習曲線，由於左側端腦在陌生環境會進行辨識並記憶到腦中，缺少了左側端腦，雖然可能會干擾到一開始環境的辨識，但是由於右側端腦仍可運作，在右側的決策中心仍然可以正常的記憶安全區域的位置，且這個記憶可以保留於右側端腦中 (Miklosi & Andrew, 2006) 。而動物在左側學習時並沒有出現明顯的學習曲線，故在本研究中並沒有辦法明確指出左側學習與端腦之間直接的關係，但從動物的行為中可以看到左側端腦相對於右側端腦，在情緒性記憶部分更有高度相關。. Aizawa 在 2005 年找到之神經路徑，指出該神經路徑最終投射至中腦 (Aizawa, et al., 2005) 。而本研究進行手術破壞的位置，極有可能就是這個路徑的起源處，而單側的破壞使得路徑有經過的相關腦區. 38.

(40) 的功能可能也受到干擾，而中腦在斑馬魚其實還包括了運動調控的功能，這可能也是我們在手術過程中發現部分動物在手術破壞後，其運動功能表現會有類似痙攣的情況的原因之一。. 在本研究中，我們試圖利用一個單純的空間記憶學習模式，去觀察動物的腦側化可能造成的影響，而在往後若是可以使用其他方式，如投予藥物或是使用斑馬魚的強項－基因轉殖的方式，去改變或是影響動物的側化現象時，可以直接利用這個模式進行測試，由於本實驗設計為非懲罰性的學習，不需擔心會造成生理或是心理創傷之類的後遺症，可以直接觀察是否產生差異，進而在成魚階段可以驗證或腦側化可能帶來的影響或是藉此繼續研究腦部特定部位可能具有的功能。. 39.

(41) 柒、參考文獻 (References ). 40.

(42) 柒、參考文獻 Aizawa, H., Bianco, I.H., Hamaoka, T., Miyashita, T., Uemura, O., Concha, M.L., Russell, C., Wilson, S.W., & Okamoto, H. (2005). Laterotopic representation of left-right information onto the dorso-ventral axis of a zebrafish midbrain target nucleus. Curr Biol, 15, 238-243. Andrew, R.J. (1999). The differential roles of right and left sides of the brain in memory formation. Behav Brain Res, 98, 289-295. Andrew, R.J., Tommasi, L., & Ford, N. (2000). Motor control by vision and the evolution of cerebral lateralization. Brain Lang, 73, 220-235. Barth, K.A., Miklosi, A., Watkins, J., Bianco, I.H., Wilson, S.W., & Andrew, R.J. (2005). fsi zebrafish show concordant reversal of laterality of viscera, neuroanatomy, and a subset of behavioral responses. Curr Biol, 15, 844-850. Brown, C., & Braithwaite, V.A. (2005). Effects of predation pressure on the cognitive ability of the poeciliid Brachyraphis episcopi. Behav. Ecol., 16, 482-487. Brown, C., Gardner, C., & Braithwaite, V.A. (2004). Population variation in lateralized eye use in the poeciliid Brachyraphis episcopi. Proc Biol Sci, 271 Suppl 6, S455-457. Brown, C., Gardner, C., & Braithwaite, V.A. (2005). Differential stress responses in fish from areas of high- and low-predation pressure. J Comp Physiol [B], 175, 305-312. Colwill, R.M., Raymond, M.P., Ferreira, L., & Escudero, H. (2005). Visual discrimination learning in zebrafish (Danio rerio). Behav Processes, 70, 19-31.. 41.

(43) Concha, M.L. (2004). The dorsal diencephalic conduction system of zebrafish as a model of vertebrate brain lateralisation. Neuroreport, 15, 1843-1846. Darland, T., & Dowling, J.E. (2001). Behavioral screening for cocaine sensitivity in mutagenized zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 11691-11696. Davis, R.E., & Klinger, P.D. (1987). Spatial discrimination in goldfish following bilateral tectal ablation. Behav Brain Res, 25, 255-260. Halpern, M.E., Liang, J.O., & Gamse, J.T. (2003). Leaning to the left: laterality in the zebrafish forebrain. Trends Neurosci, 26, 308-313. Lopez, J.C., Broglio, C., Rodrguez, F., Thinus-Blanc, C., & Salas, C. (2000). Reversal learning deficit in a spatial task but not in a cued one after telencephalic ablation in goldfish. Behavioural Brain Research, 109, 91-98. Lu, K.T., Walker, D.L., & Davis, M. (2001). Mitogen-activated protein kinase cascade in the basolateral nucleus of amygdala is involved in extinction of fear-potentiated startle. J Neurosci, 21, RC162. Magni, S., Krekule, I., & Bures, J. (1979). Radial maze type as a determinant of the choice behavior of rats. J Neurosci Methods, 1, 343-352. McManus, C. (2005). Reversed bodies, reversed brains, and (some) reversed behaviors: of zebrafish and men. Dev Cell, 8, 796-797. Miklosi, A., & Andrew, R.J. (1999). Right eye use associated with decision to bite in zebrafish. Behav Brain Res, 105, 199-205. Miklosi, A., & Andrew, R.J. (2006). The Zebrafish as a Model for Behavioral Studies. Zebrafish, 3, 227-234. Miklosi, A., Andrew, R.J., & Gasparini, S. (2001). Role of right hemifield in visual control of approach to target in zebrafish. Behav Brain. 42.

(44) Res, 122, 57-65. Morris, R. (1984). Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods, 11, 47-60. Portavella, M., Torres, B., & Salas, C. (2004a). Avoidance response in goldfish: emotional and temporal involvement of medial and lateral telencephalic pallium. J Neurosci, 24, 2335-2342. Portavella, M., Torres, B., Salas, C., & Papini, M.R. (2004b). Lesions of the medial pallium, but not of the lateral pallium, disrupt spaced-trial avoidance learning in goldfish (Carassius auratus). Neurosci Lett, 362, 75-78. Salas, C., Broglio, C., Rodriguez, F., Lopez, J.C., Portavella, M., & Torres, B. (1996a). Telencephalic ablation in goldfish impairs performance in a 'spatial constancy' problem but not in a cued one. Behav Brain Res, 79, 193-200. Salas, C., Rodriguez, F., Vargas, J.P., Duran, E., & Torres, B. (1996b). Spatial learning and memory deficits after telencephalic ablation in goldfish trained in place and turn maze procedures. Behav Neurosci, 110, 965-980. Sullivan, G.M., Apergis, J., Bush, D.E., Johnson, L.R., Hou, M., & Ledoux, J.E. (2004). Lesions in the bed nucleus of the stria terminalis disrupt corticosterone and freezing responses elicited by a contextual but not by a specific cue-conditioned fear stimulus. Neuroscience, 128, 7-14. Swain, H.A., Sigstad, C., & Scalzo, F.M. (2004). Effects of dizocilpine (MK-801) on circling behavior, swimming activity, and place preference in zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicol Teratol, 26, 725-729. Watkins, J., Miklosi, A., & Andrew, R.J. (2004). Early asymmetries in the. 43.

(45) behaviour of zebrafish larvae. Behav Brain Res, 151, 177-183. Westerfield, M. (1995). The Zebrafish BooK: A Guide for Laboratory Use of the Zebrafish (Brachydanio Rerio). University of Oregon Press. Williams, F.E., White, D., & Messer, W.S. (2002). A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behav Processes, 58, 125-132. Xu, X., Scott-Scheiern, T., Kempker, L., & Simons, K. (2007). Active avoidance conditioning in zebrafish (Danio rerio). Neurobiol Learn Mem, 87, 72-77.. 44.

(46) 捌、附圖 (Figures ). 45.

(47) 捌、附圖 (a) 左側目標深水區. 右側目標深水區. 開始區. (b). 圖一： T 字形迷宮結構與實際裝置架設圖。 (a)為結構設計圖；(b)為實體架設之照片。. 46.

(48) Right TEL. (a). (c). Right TEL. (b). Left TEL. Left TEL (c). 圖二：斑馬魚端腦破壞手術破壞區域示意圖與組織照片。圖中之箭頭處表示端腦在腦區中相對之位置。 (a)為側面圖；(b)為俯視圖與左側與右側端腦之位置； (c)為頭蓋骨掀開後之情況。左方為斑馬魚吻端； (d)為實際破壞後取出的腦組織，虛線區域為破壞後不存在之組織位置。左側為 naïve 與 Lesion 組，中間為破壞位置比對圖，右側為 sham 組、R-lesion 組與 L-lesion 組。 TEL: 端腦，telecephalon。. 47.

(49) 圖三： Naïve 組之自發性空間探索行為結果。使用 student’s t-test 進行統計比較，以 p < 0.05 為統計比較之標準。結果可看到 naïve 的左側學習組 ( naïve-L ) 與右側學習組 ( naïve-R ) 並無達到統計上的顯著差距 ( p = 0.6456 )。 Navie-L 組的 n 值為 35，naïve-R 組的 n 值為 36。. 48.

(50) ＊. ＊. 圖四： Naïve 組之 T 字形迷宮學習作業三次測試之學習表現結果。縱座標之 latency time 表示從開啟閘門到動物進入目標深水區域所花費的時間，單位為秒。各組各自使用 repeated-ANOVA 判定是否學會深水區之空間位置，以 p < 0.05 為顯著差異標準。Naïve 的左側學習組 ( naïve-L ) 結果並無達到顯著 ( p = 0.1409 )。Naïve 的右側學習組 ( naïve-R ) 則是達到顯著 ( p < 0.0078 ) ，且 train-1 對 train-2 與 test 進行多重比較檢定均達統計上之顯著 (by Tukey’s HSD test ， p(＊) < 0.05) 。 Navie-L 組的 n 值為 35 ， naïve-R 組的 n 值為 36 。. 49.

(51) Left. Right. 圖五： Naïve 組之動物在 T 字形迷宮作業的每一次測試中，動物第一次進入 T 字交接處之第一次方向選擇左側之百分比結果。不論何組，若是動物向左即視為 1，可看到動物在面對不同訓練條件下時，其對於左側的偏好情況。在此可看到，在 acclimation 時，動物的向左／右的偏好接近於 0.5，即動物一開始並沒有特殊偏好何方向，但在第一次的訓練時，naïve-R 組的動物顯示出高度選擇向左側的行為，不過在 train 3 時因學會而高度下降。這個現象在 naïve-L 組並不會看到，反而是接近持平於 0.5 的情況。 Naïve-L 組的 n 值為 35，naïve-R 組的 n 值為 36。. 50.

(52) Sham-L. Lesion-L. 圖六：第二部分中向左側學習之各組組之自發性空間探索行為結果。使用 student’s t-test 進行統計比較，以 p < 0.05 為統計比較之標準。統計結果顯示各組在手術前後之自發性空間探索行為表現無顯著差異( p(sham-L) = 0.3587 , p(Lesion-L) = 0.9153 )。 Sham-L 組的 n 值為 15，lesion-L 組的 n 值為 11。. 51.

(53) ＃. Sham-R. Lesion-R. 圖七：第二部分中向右側學習之各組組之自發性空間探索行為結果。使用 student’s t-test 進行統計比較，以 p < 0.05 為統計比較之標準。統計結果顯示各組在手術前後之自發性空間探索行為表現除了 lesion-R 組外，無顯著差異( p(Sham-R) = 0.6000 , p(Lesion-R) = 0.3317 )。 Sham-R 組的 n 值為 15，lesion-R 組的 n 值為 6。. 52.

(54) ＃. 圖八：第二部分中向左側學習之組別在 T 字形迷宮學習作業中，三次測試之學習表現結果。縱座標之 latency time 表示從開啟閘門到動物進入目標深水區域所花費的時間，單位為秒。各組各自使用 repeated-ANOVA 判定是否學會深水區之空間位置，以 p < 0.05 為顯著差異標準。此處之 naïve-L 組使用第一部份數據做為與 sham-L 組比較之參考。各組之結果均無達到顯著 ( p(sham-L) = 0.4325， p(lesion-L) = 0.7726)。全部數據使用 one factor with one repeated ANOVA 進行比較，兩組表現在統計上有顯著差異 ( p < 0.0001)，進行後設檢定可知 naïve-L 組與 lesion-L 組在 train-1 有顯著差異 (by Tukey’s HSD test， p(#) < 0.05) 。 Navie-L 組的 n 值為 35，sham-L 組的 n 值為 15，lesion-L 組的 n 值為 11。. 53.

(55) Left. Right 圖九：第二部分中向左側學習的組別於 T 字形迷宮作業的每一次測試中，動物第一次進入 T 字交接處之第一次方向選擇左側之百分比結果。不論何組，若是動物向左即視為 1，可看到動物在面對不同訓練條件下時，其對於左側的偏好情況。在此可看到，在 acclimation 與 train-1 時，偽實驗組 (sham-L) 與全端腦破壞組 (Lesion-L) 與之動物有向右偏好外，其餘測試時之偏好均接近於 0.5，即動物沒有特殊偏好何方向。 Navie-L 組的 n 值為 35，sham-L 組的 n 值為 15，lesion-L 組的 n 值為 11。. 54.

(56) ＊. ＊. ＊. 圖十：第二部分中向右側學習之組別在 T 字形迷宮學習作業中，三次測試之學習表現結果。縱座標之 latency time 表示從開啟閘門到動物進入目標深水區域所花費的時間，單位為秒。各組各自使用 repeated-ANOVA 判定是否學會深水區之空間位置，以 p < 0.05 為顯著差異標準。此處之 naïve-R 組使用第一部份數據做為與 sham-R 組比較之參考。結果 sham-R 組有達到顯著， lesion-R 組則否 ( p(sham-R) = 0.0201，p(lesion-R) = 0.2025 ) ，進行後設檢定得知 sham-R 組在 train-1 與 test 間有顯著差異 (by Tukey’s HSD test， p(＊) < 0.05) 。除了 naïve-R 組以外，全部數據使用 one factor with one repeated ANOVA 進行比較，結果顯示 sham-R 與 lesion-R 兩組表現有顯著差異 ( p < 0.0001)。 Navie-R 組的 n 值為 36，sham-R 組的 n 值為 15， lesion-R 組的 n 值為 8。. 55.

(57) Left. Right 圖十一：第二部分中向右側學習的組別於 T 字形迷宮作業的每一次測試中，動物第一次進入 T 字交接處之第一次方向選擇左側之百分比結果。不論何組，若是動物向左即視為 1，可看到動物在面對不同訓練條件下時，其對於左側的偏好情況。此處之 naïve-R 組使用第一部份數據做為與 sham-R 組比較之參考。在此可看到，sham-R 組的表現趨勢和 naïve-R 組大致上接近，在 test 時均有下降的趨勢；而在 lesion-R 組的部分，全部都維持在 50%-57%之間。 Navie-R 組的 n 值為 36，sham-R 組的 n 值為 15，lesion-R 組的 n 值為 8。. 56.

(58) 圖十二：第三部分中向左側學習的組別於自發性空間探索之行為結果。使用 student’s t-test 進行統計比較，以 p < 0.05 為統計比較之標準。統計顯示各組在手術前後之自發性空間探索行為表現無顯著差異 ( p(L-lesion-L) = 0.6579 , p(R-lesion-L) = 0.5275 ) 。 L-lesion-L 組的 n 值為 8，R-lesion-L 組的 n 值為 14。. 57.

(59) L-lesion-R. R-lesion-R. 圖十三：第三部分中向右側學習的組別於自發性空間探索之行為結果。使用 student’s t-test 進行統計比較，以 p < 0.05 為統計比較之標準。T-test 顯示各組在手術前後之自發性空間探索行為表現無顯著差異 ( p(L-lesion-R) = 0.1281 , p(R-lesion-R) = 0.7737 ) 。 L-lesion-R 組的 n 值為 9，R-lesion-R 組的 n 值為 8。. 58.

(60) #. #. 圖十四：第三部分中向左側學習的組別於 T 字形迷宮學習作業中，三次測試之學習表現結果。縱座標之 latency time 表示從開啟閘門到動物進入目標深水區域所花費的時間，單位為秒。各組各自使用 repeated-ANOVA 判定是否學會深水區之空間位置，以 p < 0.05 為顯著差異標準。此處之 sham-L 組為沿用第二部分的數據做為對照組進行比較。各組之結果均無達到顯著 ( p(L-lesion-L) = 0.2755，p(R-lesion-L) = 0.9731)。全部數據使用 one factor with one repeated ANOVA 進行比較，以 student’s t-test 進行後設檢定，結果 L-lesion-L 組與 R-lesion-L 組在 test 時的結果亦有顯著差異 ( p(#) < 0.05 ) 。 Sham-L 組的 n 值為 15，L-lesion-L 組的 n 值為 8，R-lesion-L 組的 n 值為 14。. 59.

(61) Left. Right 圖十五：第三部分中向左側學習的組別於 T 字形迷宮作業的每一次測試中，動物第一次進入 T 字交接處之第一次方向選擇左側之百分比結果。不論何組，若是動物向左即視為 1，可看到動物在面對不同訓練條件下時，其對於左側的偏好情況。在此可看到，在 acclimation 時，除了右側端腦破壞組之動物有特殊向右偏好外，其餘各組動物向左側或右側的偏好均接近於 0.5，即動物一開始並沒有特殊偏好何方向。整體來說， R-lesion-L 組幾乎都向右側高度偏好，而 L-lesion-L 組則是在 train-2 時高度偏好左側，train-3 時又下降回復到接近 0.5。 Sham-L 組的 n 值為 15，L-lesion-L 組的 n 值為 8，R-lesion-L 組的 n 值為 14。. 60.

(62) #. #. #. #. ＊. 圖十六：第三部分中向右側學習的組別於 T 字形迷宮學習作業中，三次測試之學習表現結果。縱座標之 latency time 表示從開啟閘門到動物進入目標深水區域所花費的時間，單位為秒。各組各自使用 repeated-ANOVA 判定是否學會深水區之空間位置，以 p < 0.05 為顯著差異標準。此處之 sham-R 組為沿用第二部分的數據做為對照組進行比較。各組使用 repeated measure ANOVA 之結果均無達到顯著 (p(L-lesion-R) = 0.1980，p(R-lesion-R) = 0.2236)。全部數據使用 one factor with one repeated ANOVA 進行比較，可得到在 train-1 與 train-2 時， L-lesion-L 組均顯著地較 sham-R 組與 R-lesion-R 組來得快 (by student’s t-test ， p(#) < 0.05)。 Sham-R 組的 n 值為 15，L-lesion-R 組的 n 值為 9，R-lesion-R 組的 n 值為 8。 61.

(63) Left. Right 圖十七：第三部分中向右側學習的組別於 T 字形迷宮作業的每一次測試中，動物第一次進入 T 字交接處之第一次方向選擇左側之百分比結果。不論何組，若是動物向左即視為 1，可看到動物在面對不同訓練條件下時，其對於左側的偏好情況。在此可看到，在 acclimation 時，除了 sham-R 組之動物有特殊向左偏好外，R-lesion-R 組偏向於向右側，其餘兩組動物向左側或右側的偏好均接近於 0.5。整體來說，naïve-R、sham-R 以及 L-lesion-R 三組在訓練過程中的表現趨勢接近。但 L-lesion-R 組幾乎完全都向右側高度偏好，直到結束甚至可低於 0.2。 Sham-R 組的 n 值為 15，L-lesion-R 組的 n 值為 9，R-lesion-R 組的 n 值為 8。. 62.

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