不同固定度之降解性神經管對再生神經功能恢復影響之評估; Evaluation of Genipin Crosslinked Gelatin Nerve Conduits With Different Fixation Rates on Nerve Function Recovery

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(1)中國醫藥大學中國醫學研究所碩士論文編號：GICMS-279. 指. 導教授：陳悅生博士. 共同指導教授：宋信文博士. 論文題目：不同固定度之降解性神經管對再生神經功能恢復影響之評估. Evaluation of Genipin Crosslinked Gelatin Nerve Conduits With Different Fixation Rates on Nerve Function Recovery. 研究生：向士偉. 中華民國九十四年六月.

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(4) 目錄 1.. 前言........................................................................................1. 2.. 文獻回顧................................................................................3 Seddon 分類法......................................................................3. 2.1.. 2.1.1.. 神經失用（neurapraxia）..............................................3. 2.1.2.. 軸突斷傷（axonotmesis）.............................................3. 2.1.3.. 神經斷傷.........................................................................3. 2.2.. Sunderland 分類 ....................................................................4. 2.3.. 神經元受傷後之變化............................................................4 2.3.1.. 受傷害遠端之軸突部分.................................................4. 2.3.2.. 受傷害近斷之軸突部分.................................................5. 2.3.3.. 細胞體.............................................................................5. 神經元受傷後之復原............................................................5. 2.4.. 2.4.1.. 細胞體的復原.................................................................5. 2.4.2.. 軸突的重建.....................................................................6. 2.5.. 交聯處理生物組織的目的....................................................7. 2.6.. 交聯劑....................................................................................7. 2.7.. 綠梔子素（genipin）............................................................7 2.7.1.. 綠梔子素之萃取與純化.................................................8. 2.7.2.. 綠梔子素交聯生物組織之反應最適化條件.................8. 2.7.3.. 綠梔子素對神經細胞的影響.........................................8. 2.8.. 步態運動學............................................................................9. 2.9.. 坐骨神經功能指數 Sciatic Function Index（SFI） ............9. 2.10.. 神經損傷的中醫觀點..........................................................10. 2.10.1.. 神經系統在中醫學中的定位................................10. 2.10.2.. 周圍神經斷傷與相關之中醫病證........................12. 2.10.3.. 小結 ........................................................................15. 材料與方法..........................................................................16. 3. 3.1.. 製備綠梔子素交聯明膠之神經導管 .................................16 3.1.1.. 目的...............................................................................16. 3.1.2.. 主要材料.......................................................................16 iv.

(5) 3.2.. 3.1.3.. 製備方法.......................................................................17. 3.1.4.. 滅菌方式.......................................................................18. 固定指數..............................................................................18 3.2.1.. 目的（Fixation Index） ...............................................18. 3.3.. 以掃描式電子顯微鏡觀察神經導管 .................................20. 3.4.. 皮下包埋實驗......................................................................20. 3.5.. 3.6.. 3.7.. 3.8.. 3.9.. 3.4.1.. 目的...............................................................................20. 3.4.2.. 主要材料.......................................................................20. 3.4.3.. 動物分組與麻醉...........................................................21. 3.4.4.. 皮下包埋手術...............................................................21. 3.4.5.. 動物飼養環境...............................................................21. 3.4.6.. 觀察實驗大鼠外表之變化...........................................22. 3.4.7.. 生物相容性評估...........................................................22. 動物實驗..............................................................................22 3.5.1.. 目的...............................................................................22. 3.5.2.. 主要材料.......................................................................23. 3.5.3.. 實驗方法.......................................................................24. 3.5.4.. 觀察實驗大鼠外表之變化...........................................25. 3.5.5.. 統計分析.......................................................................25. 3.5.6.. 評估神經再生情形及神經導管降解情形...................26. 電生理評估..........................................................................26 3.6.1.. 電生理評估方法...........................................................26. 3.6.2.. 統計分析.......................................................................26. 神經導管降解變化觀察......................................................27 3.7.1.. 觀察重點.......................................................................27. 3.7.2.. 統計分析.......................................................................27. 再生神經組織切片評估......................................................27 3.8.1.. 組織學定量分析...........................................................28. 3.8.2.. 成熟度分析...................................................................29. 評估大鼠步態分析..............................................................30 3.9.1.. 目的...............................................................................30 v.

(6) 3.9.2.. 實驗器材.......................................................................30. 3.9.3.. 實驗方法.......................................................................30. 3.9.4.. 統計方法.......................................................................32. 3.10.. 評估大鼠感覺神經功能恢復情形......................................32. 3.10.1.. 目的 ........................................................................32. 3.10.2.. 實驗儀器................................................................32. 3.10.3.. 實驗方法................................................................33. 3.10.4.. 統計方法................................................................35. 3.11.. 觀察大鼠足印(footprint)分析............................................35. 3.11.1.. 目的 ........................................................................35. 3.11.2.. 實驗器材................................................................36. 3.11.3.. 實驗方法................................................................36. 3.11.4.. 統計方法................................................................37. 3.12.. 評估大鼠斷傷側攀爬（climb）能力 ................................38. 3.12.1.. 目的 ........................................................................38. 3.12.2.. 實驗方法................................................................38. 3.12.3.. 統計方法：............................................................38. 3.13.. 坐骨神經功能指數（Sciatic function index）（SFI） ......39. 3.13.1.. 目的 ........................................................................39. 3.13.2.. 實驗方法................................................................39. 3.13.3.. 統計方法................................................................39. 結果......................................................................................40. 4. 4.1.. 神經導管..............................................................................40 4.1.1.. 4.2.. 氨基固定度試驗..................................................................40 4.2.1.. 4.3.. 神經導管規格...............................................................40 以掃描式電子顯微鏡觀察神經導管...........................43. 皮下包埋實驗......................................................................46 4.3.1.. 實驗大鼠外表之變化...................................................46. 4.3.2.. 生物相容性評估...........................................................46. 4.4.. 神經再生情形及神經導管降解變化 .................................51. 4.5.. 電生理檢測.........................................................................57 vi.

(7) 4.5.1.. 潛時三組比較...............................................................57. 4.5.2.. 振幅三組比較...............................................................58. 4.5.3.. 波下面積三組比較.......................................................59. 4.6.. 神經導管降解變化觀察比較..............................................60. 4.7.. 神經再生成功率..................................................................60. 4.8.. 再生神經組織切片評估......................................................61 4.8.1.. 神經切片全部面積.......................................................62. 4.8.2.. 神經外膜面績...............................................................64. 4.8.3.. 神經內膜面積...............................................................65. 4.8.4.. 再生血管數目...............................................................66. 運動功能評估......................................................................68. 4.9.. 4.9.1.. 步態觀察實驗...............................................................68. 4.9.2.. 大鼠足印(footprint)分析.........................................71. 4.10.. 感覺神經實驗......................................................................75. 4.10.1.. 右側第一刺激點....................................................75. 4.10.2.. 第二刺激點............................................................76. 4.10.3.. 第三刺激點............................................................77. 4.10.4.. 第四刺激點............................................................78. 4.10.5.. 左右刺激點平均比較............................................79. 4.11.. 平板實驗..............................................................................81. 4.12.. 坐骨神經功能指數 SFI.......................................................83 討論......................................................................................85. 5. 5.1.. 長度......................................................................................85. 5.2.. 重量......................................................................................85. 5.3.. 顏色......................................................................................85. 5.4.. 以掃描式電子顯微鏡觀察神經導管 .................................85. 5.5.. 固定指數..............................................................................86. 5.6.. 皮下包埋生物相容性評估..................................................86 5.6.1.. 神經導管.......................................................................86. 5.6.2.. 異物膜...........................................................................87. 5.6.3.. 周邊組織.......................................................................88 vii.

(8) 5.7.. 神經導管降解變化觀察......................................................88 5.7.1.. 神經導管外觀...............................................................88. 5.7.2.. 再生神經組織切片評估...............................................89. 5.7.3.. 再生血管數目比較.......................................................92. 5.7.4.. 神經再生的成功率.......................................................94. 5.7.5.. 神經成熟度分析...........................................................95. 5.8.. 電生理檢測..........................................................................96. 5.9.. 形態學評估..........................................................................97 5.9.1.. 步態觀察實驗...............................................................97. 5.9.2.. 大鼠足印(footprint)分析 ..............................................98. 5.9.3.. 感覺神經實驗...............................................................99. 5.9.4.. 平板實驗.......................................................................99. 5.9.5.. 坐骨神經功能指數（Sciatic function index）（SFI） 101. 6.. 結論....................................................................................102. 參考文獻 ................................................................................................103 英文摘要 ................................................................................................112 謝詞 ........................................................................................................113. viii.

(9) 圖目錄圖 3.1 綠梔子素之結構式 ......................................................................17 圖 3.2 ninhydrin 與自由胺基的反應機制..............................................19 圖 3.3 步態分析跑道圖之一 ..................................................................31 圖 3.4 步態分析跑道圖之二 ...................................................................31 圖 3.5 電刺激波形示意圖 ......................................................................33 圖 3.6 電刺激器模式設定圖 ..................................................................34 圖 3.7 刺激電極圖 ..................................................................................34 圖 3.8 大鼠腳掌電刺激部位示意圖 ......................................................35 圖 3.9 足印分析示意圖 ..........................................................................37 圖 3.10 實驗用平板圖 ............................................................................38 圖 4.1 神經管圖 ......................................................................................40 圖 4.2 神經導管氨基固定度 ...................................................................42 圖 4.3 未交聯之明膠管 SEM 圖 .............................................................43 圖 4.4 浸泡 1 小時之綠梔子素明膠管 SEM 圖....................................44 圖 4.5 浸泡 3 小時之綠梔子素明膠管 SEM 圖....................................44 圖 4.6 浸泡 48 小時之綠梔子素明膠管 SEM 圖..................................45 圖 4.7 明膠管內管壁 SEM 圖 ................................................................45 圖 4.8 一小時組一周時切片圖 ..............................................................46 圖 4.9 一小時組四周時切片圖 ..............................................................47 圖 4.10 一小時組八周時切片圖 ............................................................47 圖 4.11 三小時組一周時切片圖 ............................................................48 圖 4.12 三小時組四周時切片圖 ............................................................48 圖 4.13 三小時組八周時切片圖. ...........................................................49 圖 4.14 四十八小時組一周時切片圖 ....................................................49 圖 4.15 四十八小時組四周時切片圖 ....................................................50 圖 4.16 四十八小時組八周時切片圖 ....................................................50 圖 4.17 一小時組神經管降解圖 ............................................................51 圖 4.18 三小時組神經管降解圖 ............................................................53 圖 4.19 三小時組神經管降解圖 ............................................................55 圖 4.20 潛時三組比較圖 ........................................................................57 ix.

(10) 圖 4.21 振幅三組比較 ............................................................................58 圖 4.22 波下面積三組比較圖 ................................................................59 圖 4.23 神經導管降解變化圖 ................................................................60 圖 4.24 神經切片全部面積比較 .............................................................63 圖 4.25 神經外膜面積比較圖 .................................................................64 圖 4.26 神經內膜面積圖比較圖 .............................................................65 圖 4.27 再生血管數目比較圖 ................................................................67 圖 4.28 掉落步伐數比較表 ....................................................................68 圖 4.29 滑行步伐數比較表 ....................................................................69 圖 4.30 站在網上步伐數比較表 .............................................................70 圖 4.31 左腳間距比較圖 .........................................................................71 圖 4.32 右腳間距比較圖 .........................................................................72 圖 4.33 左右腳間距比較圖 ....................................................................73 圖 4.34 左右腳角度比較圖 ....................................................................74 圖 4.35 右側第一刺激點比較圖 ............................................................75 圖 4.36 第二刺激點比較圖 ....................................................................76 圖 4.37 第三刺激點比較圖 ....................................................................77 圖 4.38 第四刺激點圖 ............................................................................78 圖 4.39 左右刺激點平均比較圖 ............................................................80 圖 4.40 平板測驗比較圖 ........................................................................82 圖 4.41 坐骨神經功能指數（SFI）比較圖..........................................84. x.

(11) 表目錄表 4.1 神經導管氨基固定度測試資料 ..................................................41 表 4.2 潛時三組比較表 ..........................................................................57 表 4.3 振幅三組比較表 ...........................................................................58 表 4.4 波下面積三組比較 ......................................................................59 表 4.5 組織學定量分析基本資料 ..........................................................61 表 4.6 神經切片全部面積比較 ...............................................................62 表 4.7 神經外膜面積 ...............................................................................64 表 4.8 神經內膜面積 ...............................................................................65 表 4.9 再生血管數目 ..............................................................................66 表 4.10 掉落步伐比較表 ........................................................................68 表 4.11 滑行步伐比較表 ........................................................................69 表 4.12 站在網上步伐數比較表 .............................................................70 表 4.13 左腳間距比較表 .........................................................................71 表 4.14 右腳間距比較表 .........................................................................72 表 4.15 左右腳間距比較表 ....................................................................73 表 4.16 左右腳角度比較表 ....................................................................74 表 4.17 第一刺激點比較表 .....................................................................75 表 4.18 第二刺激點比較表 ....................................................................76 表 4.19 第三刺激點比較表 ....................................................................77 表 4.20 第四刺激點比較表 ....................................................................78 表 4.21 左右刺激點平均比較表 ............................................................79 表 4.22 平板測驗比較表 ........................................................................81 表 4.23 坐骨神經功能指數（SFI）比較表..........................................83 表 5.1 神經全部面積比較 ......................................................................90 表 5.2 神經內膜面積比較 ......................................................................91 表 5.3 再生血管數目比較表 ..................................................................93 表 5.4 神經再生的成功率比較表 ..........................................................94 表 5.5 矽膠管中再生神經情形 ..............................................................95. xi.

(12) 不同固定度之降解性神經管對再生神經功能恢復影響之評估研究生：向士偉指導教授：陳悅生博士中國醫藥大學. 中國醫學研究所. 周邊神經斷傷在最近二十年來，已研究出許多可行的治療方式，最終目的皆希望可使神經的再生與修復更為完美，其中神經導管接合術常常使用於神經再生，而降解性的神經導管可提供避免二次手術的缺點，而明膠是最常使用製造的原料，但因為易遭受生物體的吸收而無法達到生醫材料的功用，因此由中藥梔子中的綠梔子素來增加其氨基的交聯度與固定度，本研究主要探討，以週邊神經修復為出發，探討不同交聯度之生物可吸收性之降解材料對於神經生長功能的影響，並使用運動學方面的評估，比較各組的差異性。本研究以明膠為基材、綠梔子素為交聯劑製造出長度 15 mm、重量 0.05+10%、內徑 1.96 mm、固定指數分別為 23±7％、36±2％、 51±7％之降解性神經導管。SD大鼠皮下包埋一週、四週、八週之生物相容性評估顯示八週時有第二次之異物發炎反應發生；三組的材料降解度則未達顯著差異。神經導管接合術適用性評估顯示 36±2％的神經導管在SD大鼠體內，神經再生情形優於其他兩組，引導 10 mm 間距的神經再生成功率達 100%，而固定指數 23±7％組的神經導管產生旺盛血管新生作用；三組在神經再生生長遲滯及再生神經成熟度偏低的現象，在運動評估方面，與綠梔子交聯三小時的神經導管（36± 2％）雖然與交聯四十八小時的神經導管（51±2％）相似，而在交聯四十八小時的神經導管之標準差較大，反觀組織學上之發展，交聯三小時的神經導管（36±2％）的神經內膜面積較為一致，而交聯四十八小時的神經導管（51±2％）仍有三隻大鼠無法量測，但在坐骨功能指數（SFI）、感覺功能評估上發展皆比交聯一小時之綠梔子素明膠管好，而在攀爬的實驗中發現。36±2 ％組與 48±7 ％組的大鼠比 23±7. 1.

(13) ％組的大鼠需花較多的時間。因此我們認為 36±2 ％的神經導管在生醫材料上的應用比固定指數為 23±7％與 51±7％的神經導管較為合適。關鍵字：神經再生、降解性神經導管、明膠、綠梔子素、交聯. 2.

(14) 1. 前言根據國際標準化組織（ISO）定義，生物醫學材料（biomedical materials）就是以醫療為目的，用於活體組織以形成功能的無生命材料，包括具有生物相容性或生物降解性的材料[1]。從應用的角度而言，生醫材料是對於可用於人工器官、外科修復，物理治療、診斷、檢查等醫療保健領域的一種具有特殊性能、特殊功能、滿足特殊要求的材料之總稱，由於人體生理環境的複雜性，用於人體內的生物醫學材料及其製品介入人體的生理環境後，會相互影響，因而導致一連串的生物反應，如組織、血液、免疫等方面，因此在生醫材料研製與應用的階段，皆須注意材料與生物體之間的相互作用以及可能產生的結果[1]。本研究延續本實驗室早先之研究結果，進一步探討，以週邊神經修復為出發，探討不同交聯度之生物可吸收性之降解材料對於神經生長功能的影響，並使用運動學方面的評估，比較各組的差異性。周邊神經斷傷在最近二十年來，已研究出許多可行的治療方式，最終目的皆希望可使神經的再生（regeneration）與修復（repair）更為完美，而現今神經斷傷後有以下五種修補技術[2]：斷端縫合術（endto –end suturing）；組織黏著劑黏合法（Tissue adhesives）；雷射神經縫合法（Laser neurorrhaphy）；神經移植術（Nerve grafting）；神經導管接合術（Nerve bridging）。其中神經導管接合術本研究嘗試研製以明膠為基材，以綠梔子素為交聯劑之不同交聯度可降解性神經導管，並初步評估其皮下生物降解性、生物相容性及神經導管接合術之生物適用性與形態學上的恢復情形。，其優點有：1.植入神經導管處較無結締組織增生而影響正常神經生長；2.導引再生神經生長正確的方向；3.減少神經生長因子的流失；4.將抑制神經再生因子排除於導管外[3]。理想的降解性神經導管至少須具備以下條件：1. 良好之手術縫合特性；2. 材質的機械強度足以提供神經再生之保護空間；3. 完全裂解所需時間較長，可以充分保護再生狀態下之神經軸突延伸至受傷 1.

(15) 遠端；4. 材質的生物相容性佳，不會與周圍組織產生過度免疫反應，並可提供神經軸突生長錐爬行之介面，穩定神經纖維結構。目前常用的交聯劑，主要是以化學方法合成的化學交聯劑，如戊二醛 (glutaraldehyde)等，但是以戊二醛交聯處理的生物膠在臨床應用方面，常會出現組織硬化、鈣化及纖維化等問題，其與戊二醛的毒性過高有關[4]，為了克服這個問題，Sung[5]等在 1999 年從中藥梔子果實中，萃取出一種天然的交聯劑－綠梔子素(genipin)，來交聯處理生物組織材料。Yamazaki[6]等在實驗中發現綠梔子素跟神經生長因子 (nerve growth factor, NGF)一樣，都有引發PC12 細胞株神經突分化的作用，且神經突突出的長度，隨著其濃度的上升而有增加的趨勢。然而Ozaki[7]等在實驗中發現綠梔子素對於細胞有些許的毒性存在，但一旦與胺基結合後，毒性便不存在，而Chen[8]先前之研究發現綠梔子素所交聯的明膠管在交聯度為 50 ％時，對於神經再生方面有延緩神經生長的結果。基於上述理由，本研究嘗試研製以明膠為基材，以綠梔子素為交聯劑之不同交聯度可降解性神經導管，並初步評估其皮下生物降解性、生物相容性及神經導管接合術之生物適用性與形態學上的恢復情形。. 2.

(16) 2. 文獻回顧 2.1. Seddon 分類法 Seddon在 1943[9-11]，將神經損傷分成三個不同階段：如下述：. 2.1.1. 神經失用（neurapraxia）神經失用的意義是在連續的軸突內有局部傳導阻斷的現象，而神經的應激性仍然保存。這一型的損傷相當於在擠壓受傷後產生的急性局部去髓鞘的阻斷。傳導阻斷通常持續幾星期或幾個月，直到局部髓鞘修復。根據 Seddon 的原本分類，神經失用包括完全的運動麻痺以及少量的感覺或交感神經的功能障礙。. 2.1.2. 軸突斷傷（axonotmesis）軸突斷傷的意義是軸突在受傷的階層連續性的喪失，但是神經內膜仍然完整。這一型的損傷常發生於神經受擠壓或拉傷後，軸突的連續性遭受破壞，並且使軸突的遠端發生 Wallerian 退化（Wallerian degeneration）。而神經恢復功能時間的長短取決於再生軸突再支配（reinnerveration）原來目標組織的時間。軸突斷傷後，軸突仍可沿著原本的途徑再生，並且再支配原本的目標組織，所以預後良好。. 2.1.3. 神經斷傷神經斷傷的意義為除了軸突斷傷以外，神經幹其他連續性的部分或全部的喪失。神經幹的其他部分包括神經內膜、圍神經膜、及神經外膜。神經斷傷包含了神經的斷離。神經斷傷發生後，需要手術修復。神經功能恢復的預後不佳。. 3.

(17) 2.2. Sunderland 分類 Sunderland根據神經幹不同組織的病理解剖做了更詳細的分類。Sunderland將神經損傷分為五個階段[12, 13]。第一型與第二型相當於Seddon的神經失用與軸突斷傷。Sunderland將嚴重的神經損傷，依據個別結締組織的連續與否在細分三型。第三型為軸突與神經內膜的喪失，但是圍神經膜仍然完整。其會產生Wallerian退化及神經束的紊亂。第四型是圍神經膜的連續性喪失，但神經外膜仍完整。第五型為神經幹完全斷離。本研究所採用之實驗動物模型屬於第五型之神經損傷。. 2.3. 神經元受傷後之變化由於創傷、血液供應受阻、或疾病對神經細胞體的嚴重傷害，均可引起神經元的全部退化。假如神經細胞的軸突被斷傷後，其退化性變化將發生於：1.受傷害遠端之軸突部分。2.受傷害近斷之軸突部分。3.細胞體。. 2.3.1. 受傷害遠端之軸突部分變化從損傷進行到軸突末端，此過程稱為 Wallerian 退化（Wallerian degeneration）。第一天，軸突腫大且不規則，在第三或第四天後軸突變成碎片，殘片會被 Schwann 細胞和組織巨噬細胞消化。全部的軸突將在一星期內被完全破壞。同時，髓鞘慢慢被破壞，脂質微粒在 Schwann 細胞質內出現。隨後，微粒從 Schwann 細胞釋出，在被組織巨噬細胞吞噬。Schwann 細胞從此時間開始快速成長，並在基底膜內成平行索狀排列。假如受傷的神經沒有修復，軸突和 Schwann 細胞將被局部纖維母細胞產生的纖維組織所取代。. 4.

(18) 2.3.2. 受傷害近斷之軸突部分在軸突近節中的變化和遠節發生的情況相似，但此變化僅蔓延到軸突被破壞處的最近一個蘭氏結處。. 2.3.3. 細胞體軸突受傷後，發生於細胞體的變化，叫做逆行性退化（retrograde degeneration）。最典型的變化是在受傷後的兩天內，在細胞體內發生，兩週內破壞程度達到最大，Nissl 物質會變細呈顆粒狀，分散置整個細胞質，此稱為色素溶解（chromatolysis）。色素溶解開始於軸突阜，然後遍於整個細胞體。此外，細胞核從中央位置移至細胞的周圍，細胞體腫大變圓。若受傷處愈接近細胞體，則色素溶解與細胞脹大的程度愈大。在一些神經元中，靠近細胞體軸突的損傷可能導致神經元的死亡。另一方面，傷及最遠端的軸突對細胞體來說，可能沒有造成傷害。. 2.4. 神經元受傷後之復原與逆行性退化的快速發生相較，神經細胞體的復原和修復可能需要幾個月的時間。. 2.4.1. 細胞體的復原核仁向細胞核周圍移動，多酶小體於細胞質中聚集重現。這顯示 RNA 和蛋白質的合成正加速進行，其他組織的復原包括了 Nissl 物質的重建，細胞體腫脹的減少，細胞核回到它的中央區域等。. 5.

(19) 2.4.2. 軸突的重建在周圍神經中，軸突的重建和正常功能的恢復決定於下列因素： 1.若壓傷神經軸突被分開，血液供應受阻，但內神經鞘保持完整，重建過程可能非常滿意。2.在完全切斷的神經中，恢復的機會較少，因為來自近端處的重建神經纖維和遠端的纖維不易接合。3.假如在完全切斷的神經近端和遠端的距離大於數毫米時，或神經斷端間倍增生的纖維組織或相鄰肌肉填滿，則恢復機會很小。若再生的軸突芽離開周圍的結締組織，則易形成斑狀團塊或神經瘤。在這些例子中，若於神經修護的早期，小心地利用外科方法使切斷的兩段端相互靠近，對於神經功能的恢復有很大的助益。4.當混合性神經（含有感覺、運動和自主纖維）完全被切斷，完整恢復的機會較被切斷之單獨的感覺或運動神經來得小。5.若有傷口感染，將嚴重影響神經重建的過程。假如被切斷神經之近端和遠端處緊密縫合修復，將發生下列的重建過程：1. 首先 Schwann 細胞進行有絲分裂，並填滿近端處神經內管中的空間。此細胞分裂可能發生至下一個蘭氏結，也可能遠及遠端的作用器官。當小的神經缺口存在於斷端時，分裂中的 Schwann 細胞形成一些索帶狀於此缺口之間。2. 每個近端軸突終點會產生很多細胞芽或有球狀頂部的纖絲。這些纖絲沿著 Schwann 細胞間的裂縫前進，穿過近端和遠端神經處的間隔，向遠端生長並和 Schwann 細胞接觸。明顯地，來自很多不同軸突的纖維可能進入一個內神經管中。然而，只有一個纖絲會繼續存在，其他的將退化。當此一纖維進入遠端神經後，將重新活化感覺或運動作用器官。3. 一旦軸突到達末端器官時，相鄰的 Schwann 細胞開始覆蓋此軸突並形成髓鞘。此過程在原來病變的地方開始，並向遠端擴展。藉此，蘭氏結逐漸形成。軸突到達適當的作用器官需要幾個月，視神經傷害的位置而定。軸突生長的速率約每天 2~4 mm。然而必須考慮當軸突穿過受傷的位置時，再生速度會有些延遲，約每天 1.5 mm。又再生的軸突纖維直徑至多能到達原有直徑的 80％。因此，再生軸突的傳導速率氏無法達到和原來軸突一樣的程度。. 6.

(20) 2.5. 交聯處理生物組織的目的生物組織材料在植入人體後，面臨的第一問題就是體內免疫系統以及酵素的攻擊，這些反應往往會造成材料被分解而無法發揮應有的功能。為了讓材料在進入人體後，可以抵抗體內免疫系統的攻擊，增加本身的機械強度[4]，以發揮本身材料的功能，以及延長材料在體內的時間，因此這些生物材料在植入人體時，最好經過交聯劑的交聯修飾[14, 15]。. 2.6. 交聯劑目前以交聯劑化學修飾生物組織的方式可分為兩種：一種是交聯劑直接與生物組織上的自由胺基型成穩固的交聯(crosslinking)鍵結，如glutaraldehyde、epoxy compound與genipin等；另一種則是交聯劑先活化組織上的基，再與另一自由胺基形成胜肽鍵結，如 carbodiimide[16, 17]。臨床上最常使用的生物組織交聯劑為戊二醛（glutaraldehyde），但是以戊二醛交聯處理的生物組織材料在臨床應用方面，會發生組織硬化、鈣化以及纖維化的問題[18-20]。這些問題可能與戊二醛的毒性過高有關[4]。而genipin交聯處理的生物組織，其交聯度、機械強度以及抗膠原酵素分解的能力皆與glutaraldehyde交聯處理的生物組織相當 [19]. ，但在細胞毒性上，比glutaraldehyde小[22]，大約只有glutaraldehyde. 交聯劑溶液的 1/5000～1/10000[23]。. 2.7. 綠梔子素（genipin） Genipin 是由中藥梔子的果實（gardinia fruit）萃取純化出來的一種天然交聯劑，genipin可以和amino acids、peptides、或proteins自然反應形成深藍色的產物，而這些深藍色的產物在食品業上，常被用來作為天然食用色素[24]。. 7.

(21) 2.7.1. 綠梔子素之萃取與純化先將梔子果實壓碎，置入Soxhlet萃取器，以氯仿洗滌，此已去除梔子果實中的油脂成份，接著到入適量的醋酸乙脂，再將soxhelt 萃取器置於加熱板上加熱循環萃取 6 小時，之後在室溫下將萃取液自然冷卻，即可得氫梔子苷的結晶粉末。萃取出來的去氫梔子苷結晶粉末經過濾及烘乾後，以pH 4.5 的醋酸緩衝溶液溶解，然後再 35 ℃以上述固定化的β-glucosidase 酵素將去氫梔子苷進行脫糖進而轉換成綠梔子素。最後再以適當的有機溶劑來萃取水相中的綠梔子素，再將此萃取液做濃縮處理，以可得到高純度的綠梔子素結晶粉末[25]。. 2.7.2. 綠梔子素交聯生物組織之反應最適化條件綠梔子素在不同溫度及pH值的水溶液裡均有降解的現象，其中又以高溫及鹼性的環境對綠梔子素的降解影響較為嚴重，因此綠梔子素交聯生物組織較適合在室溫與中性的條件下進行[25] Genipin本身在水中不會開環，但若水中存在自由胺基或是氫氧根離子等含有自由電子對的官能基時，將會對genipin做親核攻擊，使 genipin開環形成醛基。開環後的醛基，會再與geniping上的 2 級胺反應形成雜環鍵結，進而達到交聯生物組織的結果[26]。. 2.7.3. 綠梔子素對神經細胞的影響 Yamazaki[6]等在實驗中發現去氫梔子甙和綠梔子素跟神經生長因子一樣，類似有誘發PC12 細胞株神經突增長的作用，且神經突增長的長度，隨著去氫梔子甙和綠梔子素一定濃度的上升比例而有增加成長的趨勢。Ozaki[7]等在實驗中發現綠梔子素對於細胞有些許的毒性存在，對於大腸桿菌有毒殺的作用，但一旦與胺基酸結合後，如與 glycin、leucine、pheyylalanine與 methylamine，毒性便不存在。. 8.

(22) 2.8. 步態運動學神經損傷的評估模式現今大多以顯微鏡觀察神經切片，以神經軸突、細胞數、神經面積、傳導速度等為量化的依據，但這些並不一定就代表著運動功能與感覺功能的恢復[27]，因此選擇何者評估方式端視研究者所要探討的問題為何？選用適合的評估，以解決所要尋求的答案。運動學的評估早已用在各種老鼠的實驗模型，如血管疾病、關節病變和脊髓損傷的模式下[28-30]。而步態運動學的分析為一高度敏感性且為非侵入性的評估方法，在實驗的過程可避免影響神經再生的過程[31]，並且可以在對於大鼠沒有任何傷害的情況下，一再重複，對於評估長期研究的實驗而言，是一種有效的評估方法。. 2.9. 坐骨神經功能指數 Sciatic Function Index（SFI）坐骨神經功能指數簡稱SFI，最先由De Medinaceli 所提出[32]，並且經由其他研究者採用[33]。而在Weber R.A.研究下發現在做SFI的實驗時，母的SD大鼠的自殘率比公的SD大鼠的自殘率為低，若無品種的限制時，建議最好的研究老鼠為Lewis，其次為Sprague-Dawley，並且在於四週以後再從事SFI的量測，在實驗上較有意義[34]。而SFI 的判讀，其數值介於 0～-100 之間，通常正常的大鼠在SFI的測量下，數值為-10，在此情況下定義為功能恢復完全，而數值在-100 時，定義為功能完全受損[35]。. 9.

(23) 2.10. 神經損傷的中醫觀點 2.10.1. 神經系統在中醫學中的定位神經系統是近代生物醫學中的名詞，在中醫的基礎理論中並沒有神經系統此一名詞。但有關神經系統的宏觀知識，早有所論述，然名詞定位不同。從中醫的經典『黃帝內經』[36, 37]，一本對後世中醫理論發展具有舉足輕重地位的經典，在其內容中可以得知早在先秦兩漢時代，早已有解剖的概念，如『靈樞․經水』：「若夫八尺之士，皮肉在此，外可度量切循而得之，其死可解剖而視之，其藏之堅脆，府之大小，榖之多少，脈之長短，血之清濁，氣之多少，十二經之多血少氣，與其少血多氣，與其皆少血氣，皆有大數。」『素問․陰陽應象大論』：「帝曰：余聞上古聖人，論理人形，列別藏府，端絡經脈，會通六合，各從其經。氣穴所發，各有處名。谿谷屬骨，接有所起。分部逆從，各有條理。四時陰陽，盡有經紀。內外之應，皆有表里。其信然乎？」『靈樞․經水』：「黃帝曰：夫經脈之大小，血之多少，膚之厚薄，肉之堅脆，及膕之大小，可為量度乎？歧伯答曰：其可為量度者，取其中度也，不甚脫肉而血氣不衰也，若夫度之人痟瘦而形肉脫者，惡可以量度刺乎」。而其中與神經系統型態與功能的論述，可從以下四點中發現。 2.10.1.1.. 腦髓. 在顱腔與椎管中的中樞神經系統，在『靈樞․海論篇』與『靈樞․經脈篇』中稱之為腦髓。在內經中認為人體有四大“海＂，「人有髓海，有血海，有氣海，有水谷之海」。其中「腦為髓之海」「諸髓者，皆屬於腦」。腦與髓的來源與相互關係：腦髓在中醫中佔有極重要的地位。『靈樞』：「人始生，先成精，精成而腦髓生。」可見腦與髓都來源於先天之精。在『素問』中有腎藏精的論述，認為「腎生骨髓」。腎之 10.

(24) 所以能生骨髓，有賴於腎氣旺盛，精液充滿。而精之來源又靠後天的水谷所化。因此，『靈樞』說：「五谷之精液，和合而為膏者，內滲於骨空，補益腦髓」。可見得中醫當時把顱腔與椎管中的腦脊髓與長骨骨腔中的骨髓，合稱為之髓。腦與髓的功能：『素問』[36]：「髓者，骨之充也」。『素問․痿論』：「骨格而髓減，發為骨痿」此說明如果骨髓充足，能夠促進骨骼強壯；骨髓不足，便不利於骨骼的生成。此外，『素問』：「頭者，精明之府」、『靈樞』：「髓海有餘，則輕勁多力，自過其度；髓海不足，則腦轉耳鳴，脛痠眩冒，目無所見，懈怠安臥」，此段古文即說明腦之功能。腦與諸脈的關係：『靈樞』[37]：「十二經脈，三百六十五絡，其血氣皆上于面而走空竅」在中醫的觀念認為諸脈皆通於腦。所謂諸脈應該存在於周圍神經的內涵。當時的中醫，並無將血管及神經分開認識，因此，「諸脈皆通於腦」，涵蓋著中樞神經系統與周圍神經系統的思想。在其他古籍中亦有此思想，如：『千金方』：「頭者諸陽之會也」、『針灸大成』[38]進一步明確指出：「首者諸陽之會，百脈之宗，…… 百脈之皆歸於頭」。在此可以看出中醫體會中樞與周圍神經系統相互關係之思路。 2.10.1.2.. 藏府. 中醫十分重視臟腑的功能，臟腑是新陳代謝，維持生命活動的主要器官。因此，中醫把人的精神活動、某些神經系統的功能直接寄寓於臟腑，『素問』[36]：「人有五臟化五氣，以生喜、怒、思、憂、恐」。心：中醫認為「心為君主之官」，「心主神明」，「心者，五臟六腑之大主也，精神之所舍也」其大意內含著大腦的思維及意識功能。肝：「肝者，將軍之官，謀慮出焉」，此亦涵蓋大腦中思維反應。另外，「肝主疏泄」，肝的情志反應為「怒」，即肝氣的疏泄正常與否與人之精神狀況亦有關，如：肝氣過亢，可表現出易怒、急躁、失眠多夢、頭暈目眩等症狀。膽：『素問』：「膽者，中正之官，決斷出焉」，亦顯示出膽之臟象與大腦思維相關。腎：『素問』：「腎為作強之官，伎巧出焉」伎巧是指意識思維精 11.

(25) 巧的意思。亦與大腦思維相關。另外，『素問』：「心藏神，肺藏魄，肝藏魂，肺藏意，腎藏志」及「心在志為喜，肺在志為憂，肝在志為怒，脾在志為思，腎在志為恐」。在在說明臟腑涵蓋神經之部分功能。 2.10.1.3.. 經絡. 經絡的實質是什麼，至今仍是個謎。但是從文獻及臨床研究上顯示，經絡與神經有密切關係。或者應該說經絡的概念中包含了神經系統。在陳太羲教授「穴樹」理論中亦提及經絡的概念中涵蓋了神經系統的概念。『素問』：「夫邪客大絡者，左注右，右注左，上下左右與經相干，而布於四末，其氣無常處，不入於經俞」、『靈樞․海論』：「夫十二經脈者，內屬於臟腑，外絡於肢節」[37]、『素問․本藏』：「經脈者，所以行血氣而榮陰陽，濡筋骨，利關節者也」此經絡的概念正和涵蓋了周圍神經的分布與功能。另外，「諸脈皆通于腦」的概念在一定的程度上亦反映了周圍神經與中樞神經的聯繫關係。近代學者對經脈與周圍神經的關聯性，作了更詳細的描述。劉氏：經脈深在體內，出入於臟腑筋骨肌肉之間，遍布於全身上下，頭面四肢[39]。而陳氏更依據上下肢十二經脈特定的分布方位，將其皮下存在的血管與神經束繪製成圖譜，並用現代解剖學說明其實質[40]}。莊氏：中醫所指之腦髓為今之中樞神經系統，包括大腦、間腦、中腦、小腦、延髓及脊髓等；經脈，即今之周圍循環系統及周邊神經系統[41]。因此，周圍神經可視為經脈的一部分，出入於臟腑筋骨肌肉之間，遍布於全身上下與頭面四肢。以上三個方面所包含的神經系統功能的概念，雖然無法與西方解剖概念上一對一的相對應，但中醫的整體思維結構涵蓋西醫之神經解剖功能是不爭的事實。. 2.10.2. 周圍神經斷傷與相關之中醫病證就傳統中醫的觀點，周圍神經的損傷，大都包含於中醫骨傷科的病證中。傳統中醫並無周圍神經這個名詞，但神經損傷的症狀，卻 12.

(26) 在很多病證的描述中出現。神經斷傷在中醫的病證中，可屬於金瘡、骨折、脫位、傷筋等範疇。中醫對各種“斷＂的病證，常用“絕＂字來表示，如脈絕、筋絕、經脈絕等。 2.10.2.1.. 創傷、金瘡. 早在西周春秋時期，就已經有了“創傷＂的病名，如：『周禮․ 曲禮上』：「頭有創則沐，身有瘍則浴」。並且將外傷分為傷、創、折、斷四種不同的概念。皮膚損傷破裂曰“傷＂；皮膚與肌肉都裂開曰 “創＂；骨骼折斷曰“折＂；皮膚、肌肉、筋骨皆斷離曰“斷＂. [42]. 。. 對於創傷的治療，遠在唐朝以前，便有全身麻醉法配合縫合術治療。如：『三國志․魏書』[43]中提及華佗以麻沸散為病患去除死骨的論述。『太平廣記』[44]引『玉堂閒話』曰：「飲以乳香酒數升，則懵然無知，以利刀開其晦縫」。『諸病源候論․金瘡傷筋斷骨候』[45]及『千金要方』[46]中都有關於縫合術的記載，另外，內容中更提及對新瘡口之骨折先行整復之術後，再行清創縫合術，縫合時需層次對齊，鬆緊適當，以恢復到正常解剖位置。此記載較其他國家早了十一個世紀之久。金瘡亦屬於創傷的範疇。古文獻對於金創討論較為完整。諸如『金匱要略』[47]、『諸病源後論』[45]、『仙授理傷續斷秘方』[48]、『太『聖濟總錄』[50]、『世醫得效方』[51]、『外科正宗』[52]、平聖惠方』[49]、『外科大成』[53]、『正骨心法』、……等等，對其病因、病症、診斷、治療、及預後等均有詳細論述。其記載如『諸病源候論․金瘡腸斷候』：「夫金瘡腸斷者，視病深淺，各有死生。腸一頭見者，不可連也。若腹痛短氣，不得飲食者，大腸一日半死，小腸三日死。腸兩頭見者。可速續之。先以針縷如法，連續斷腸，便取雞血塗其際，勿令氣泄，即推內之」。此為論述金瘡腸子斷裂的症狀及預後，以及將腸兩斷端用縫合術縫合。另外在『諸病源候論․金瘡筋緊相引痛不得屈伸候』：「夫金瘡使傷之時，半傷其筋，榮衛不痛，其瘡雖癒合，後仍令痹不仁也。若被瘡截斷諸解、身軀、肘中、及腕、膝、髀若踝際，亦可連續，須急及熱其血氣未寒，碎骨便更逢連，其愈後直不屈伸。」巢氏體認金瘡 13.

(27) 癒合後仍有許多後遺症，此些後遺症與周圍神經損傷後的神經症狀相關。 2.10.2.2.. 骨折、脫位. 骨折的概念與治療在中醫骨傷科治療學上佔有相當重要地位。遠在甲骨文中便已有“疾骨＂、“疾脛＂、“疾肘＂等病名。另外，『周禮․天官』記載了“折瘍＂；『靈樞․邪氣臟腑病形篇』記載了 “折脊＂；漢代馬王堆醫書『陰陽脈死候』[54]也記載了“折骨＂。“骨折＂此一病名出自於唐代『外臺祕要』[55]。就神經而言，骨折亦可能併發神經損傷或斷傷。脫位，骨稱脫骱，又名脫臼，即關節失了正常的連接。『故堂疏義』曰：「跌體者，謂骨節錯跌，失於常處」。脫位大多為跌壓等外力所致，其他如風寒濕邪侵襲及肝腎虛衰，也可導致關節脫位。唐朝『仙授理傷續斷秘方』[48]，首先描述了肩關脫位及髖關節脫位，其各有前後脫位兩大類型，名曰“出臼＂，並詳細記載了診斷、鑑別、整復等治療方法，就世界醫學發展史來看，較其他國家早了數百年。而脫位也可併發周圍神經損傷。 2.10.2.3.. 傷筋. “筋＂一詞最早出現『足臂十一脈灸經』該書提及「臂少陰溫（脈）循筋下兼（廉）……」[54]。在『內經』對筋的論述更多，如『靈樞․經脈』：「筋為剛」。『素問․痿論』：「宗筋主束骨而利關節也」。『素問․五臟生成論』：「諸筋者，皆屬於節」。從歷代中醫文獻的記載以及長期的臨床實踐中，可發現“筋＂可從兩方面認識：其一事狹義的 “筋＂，指的是肌肉以及其延伸的部分，包括附著於骨的肌腱、韌帶與筋膜等。其二是廣義的“筋＂，其所指的是筋絡、筋膜、筋腱、肌肉及軟骨的總稱，即人體骨骼周圍的皮膚、皮下組織、肌腱、筋膜、關節囊、滑液囊、韌帶、腱鞘、血管、周圍神經、椎間盤、關節軟骨盤等軟組織。『內經』雖然把一些軟組織稱為“筋＂，除此以外還有“筋 14.

(28) 膜＂、“經筋＂、“宗筋＂等名稱，但一樣統稱為“筋＂。在『靈樞 ․經筋』稱為十二經筋，其行走路線與周圍神經循行路線相似，但非完全相同。此篇中亦提及：「經筋之病，……陰痿不用」、『素問․常刺節論』：「病在筋，筋攣節痛，不可以行，名曰筋痹」、『素問․痹論』: 「痹……在於筋，則屈不伸」。由此可見傷筋的病證與周圍神經損傷之症狀有一定相關性。 2.10.2.4.. 痿病與神經斷傷. 早在春秋戰國時期，『內經』首先提出“痿＂的概念。『素問․ 生氣通天論』：「因于濕，首如裹，濕熱布攘，大筋軟短，小筋弛長，軟短為拘，弛長為痿」。『素問․陰陽別論篇』：「三陰三陽發病，為偏枯萎易，四肢不舉。」此“痿＂乃指四肢弛軟、無力升舉之症狀。其表現的症狀與神經斷傷之臨床表現有許多相似處。廣義的痿病也包含了“癱瘓＂這個疾病。其乃指肢體軟弱無力，肌肉弛緩不收，難於活動或完全不能活動而言。『聖濟總錄』[50]釋曰：「攤澤懈惰而不能收攝，緩則弛縱而不能制物，故其證四肢不舉，筋脈關節無力，不可動者，謂之攤；其四肢雖能舉動，而肢節緩弱，憑物方能轉動者，謂之緩，或以左為攤，又為緩」。在中醫名詞內容上與西醫之中樞神經病變或斷傷及周圍神經的病變斷傷皆有關。. 2.10.3. 小結從歷代中醫文獻中可以發現，傳統中醫典籍中無“神經斷傷＂這個名詞，但在其他病證如：金瘡、骨折、脫位、傷筋、痿證中可發現，其涵括了神經斷傷的症狀。而治療方式亦是多方面治療，但由於中醫之外科技術失傳已久，若能與現代之外科相配合，能讓神經斷傷之治療更趨完整。. 15.

(29) 3. 材料與方法 3.1. 製備綠梔子素交聯明膠之神經導管 3.1.1. 目的本研究以周邊神經修復為出發點，試圖研發出一種生物可吸收性的降解性神經引導管，以明膠為主要基材，利用綠梔子素為交聯劑，主要以浸泡交聯劑之時間長短以期製造不同交聯程度的神經導管，並經由動物實驗觀察在生物體內的影響。. 3.1.2. 主要材料 3.1.2.1. 矽膠管實驗用之矽膠管為 Helix Medical Silicone Tube，內徑為 1.5 mm，外徑 1.96 mm，購自 Helix Medical, Inc (USA)。 3.1.2.2. 明膠 (gelatin) 為 Type A，自猪皮萃取，300 Bloom number，購自 Sigma Chemical Co, St Louis, MO(USA)。 3.1.2.3. 綠梔子素 (genipin) 購自嘉年股份有限公司 (Challenge Bioproducts Co., Taichung, Taiwan)。圖 3.1 為綠梔子素 (genipin)之結構式。. 16.

(30) 圖 3.1 綠梔子素之結構式. 3.1.3. 製備方法 3.1.3.1. 製備 10%明膠取 300 bloom number 的明膠 10 g 加入 90 ml 的逆滲透水，將溶液加熱至 60 ℃使完全溶解均勻，再降溫至 31～32 ℃備用。. 17.

(31) 製備 0.5 ％的綠梔子素取 0.05 g 的綠梔子素在室溫下溶解於 9.95 m1 的逆滲透水，再以超音波振盪一小時助溶。 3.1.3.2. 製管步驟以矽膠管為模，將其浸泡於 10 ％明膠中，第一次浸泡的時間為 5 分鐘，之後每次浸泡時間均 1.5 分鐘即可，兩次浸泡時間間隔 30 分鐘，讓剛附著的明膠可風乾而成型。反覆浸泡和風乾 6 次後，最後一次風乾時間拉長為 1 個小時，讓明膠成型且稍硬。再將附著有明膠的矽膠管充份浸泡於 0.5 ％綠梔子素溶液中，每管矽膠管浸泡 12 ml 綠梔子素溶液，分別浸泡 1 小時、3 小時、48 小時進行交聯。交聯後明膠顏色由透明變成藍紫色。取出交聯後明膠管，以逆滲透水沖洗 2 次後，用 95％酒精脫水 10 分鐘，最後在室溫中風乾七天，至管子變得乾硬且重量恆定後再抽出中間的矽膠管即得到中空的長管，切割成長度為 1.5 cm 的短管後，稱重並選取重量介於 0.45～0.549 mg，管壁厚度均勻的管子為實驗可用之人造神經導管。. 3.1.4. 滅菌方式因考慮使用 γ-ray 滅菌方式可能導致交聯程度的提高，因此在動物實驗中使用的明膠管採取使用 75 ％酒精潤濕滅菌後備用。. 3.2. 固定指數 3.2.1. 目的（Fixation Index）固定指數代表了生物組織上自由胺基被交聯劑反應掉的百分率，此指數是利用ninhydrin assay來測量生物組織上未反應的自由胺基含量，再以下列式子來計算的[56]：. 18.

(32) Fixation Index (％) =. [(NHN reactive amine) fresh - (NHN reactive amine) fixed] ×100 (NHN reactive amine) fresh. 其中(NHN reactive amine) fresh為組織交聯前所含的自由胺基含量，而(NHN reactive amine) fixed則是組織在交聯後所剩餘的自由胺基含量。因為ninhydrin與自由胺基反應後會產生藍紫色的產物，我們利用了此顏色在 570 nm波長的吸收度(OD值)與產物濃度成正比的關係，可以ninhydrin與生物組織內自由胺基的反應量[57]，進而求得固定指數。反應機制如圖 3.2 所示[56]。. 圖 3.2 ninhydrin 與自由胺基的反應機制. 19.

(33) 在執行 ninhydrin assay 時，取適量的樣品稱重(約 3 mg)，然後加入水將乾燥的組織浸泡約 1 小時，再加入 ninhydrin 試劑在 100 ℃ 下加熱約 20 分鐘，之後再使用 Microplate Reader (Model MRX, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, Virginia, USA)在波長 570 nm 下，定量被處理過後生物組織內的自由胺基含量。. 3.3. 以掃描式電子顯微鏡觀察神經導管掃描式電視顯微鏡提供了光學或穿透式電子顯微鏡所無法觀察到之顯微資料，對於評估明膠神經導管結構有所幫助。主要觀察神經導管的內側、外側與神經導管的切面，檢查神經導管的結構是否光滑，因為神經導管的表面粗糙與否影響神經再生的預後狀況。. 3.4. 皮下包埋實驗 3.4.1. 目的以綠梔子素交聯明膠所製造之神經導管包埋在大鼠皮下一週、四周、八週生物相容性之評估(光學病理顯微觀察)。. 3.4.2. 主要材料 3.4.2.1. 製備綠梔子素交聯明膠為基材之人造神經導管如前所提，製備 0.5 ％浸泡 1 小時、3 小時、48 小時之綠梔子素明膠管及未交聯明膠管，挑選長度 1.5 cm 重量介於 0.45～0.55 g 之神經導管（各三管），經滅菌後備用。. 20.

(34) 3.4.2.2. Hematoxylin 與 eosin Hematoxylin 是一種天然染料，組織學上廣為使用，並通常選用 eosin 來做對比染色。實驗所用的 Hematoxylin、eosin 購自 Sigma (Germany)。. 3.4.3. 動物分組與麻醉 3.4.3.1. 實驗動物分組雌性 Sprague-Dawley（SD）大白鼠 6 隻，重量為 280-350 g，周齡為十二週，隨機分為 3 組，以觀察（犧牲）時間點的不同為別為：一週組、四周組、八週組，每組 2 隻。 3.4.3.2. 麻醉、消毒手術前須先將大鼠麻醉，將大鼠置於透明麻醉箱中，利用氣體麻醉機（Forawick Vaporizer, Muraco Medical Co., Japan）麻醉，麻醉劑為 AErrane（Baxter, USA）。. 3.4.4. 皮下包埋手術與脊柱兩旁皮膚分別標記出 6 個將植入管子的位置，使用 Betadine 消毒三次，再用 15 號皮刀平整劃開 0.5 ㎝傷口，傷口平整透至皮下，以器械分離傷口部位之皮下組織，每切口分別植入滅菌後之神經導管一管，以 4-0 Nylon 線縫合皮膚，縫合後以碘酒消毒，手術後，將大鼠置回籠子，照光維持體溫，等待動物甦醒，每天注意是否有發炎現象產生。. 3.4.5. 動物飼養環境實驗動物之飼養環境為空調房間，一隻大鼠使用一個籠子，溫 21.

(35) 度為 22±3 ℃，相對溼度為 55±5％，半日照環境，自由飲水及餵養標準大鼠實驗飼料（福壽公司，台灣）. 3.4.6. 觀察實驗大鼠外表之變化動物犧牲前，在上述飼養環境中飼養大鼠，並觀察大鼠的飲食、大小便、傷口、毛色、活動情形等。. 3.4.7. 生物相容性評估 3.4.7.1. 病理切片分別在手術後一週、四周、八週進行傷口切片採樣（各二隻），沿埋管周圍約 0.5 公分距離減下包埋神經導管之皮膚及皮下組織，用 10％ neutral-buffered formalin solution 固定二天後，取樣本中間部分做切片，以 paraffin wax 包埋，切片厚度為 12μm，再以 hematosylin and eosin 染色。 3.4.7.2. 光學病理組織之觀察將切片至於 25～1000 倍之光學顯微鏡（Olympus 1×70，Olympus Optical Co. Ltd., Japan）下觀察異物膜（foreign body capsule, FBC）的厚度（thickness）以及平整性（uniformity）、炎性細胞、周圍組織發炎反應、導管降解情形。. 3.5. 動物實驗 3.5.1. 目的以綠梔子素交聯明膠製造可降解性神經導管於修護截斷大鼠坐骨神經再生影響之評估：1. 觀察實驗大鼠外表之變化；2. 觀察神經再生情形；3. 觀察神經導管降解情況；4. 再生神經之電生理評估； 22.

(36) 5. 再生神經之組織學定性與定量分析；6. 評估大鼠步態分析；7. 觀察大鼠 Withdraw reflex 之運動功能；8. 觀察大鼠足跡分析；9. 評估大鼠斷傷側攀爬能力；10. 坐骨神經功能指數（Sciatic function index）（SFI）。. 3.5.2. 主要材料製備綠梔子素交聯明膠為基材之人造神經導管製備 0.5 ％浸泡 1 小時、3 小時、48 小時之綠梔子素明膠管，挑選長度 15 mm，重量介於 0.45～0.55 g 之神經導管（各十管），經滅菌後備用。 3.5.2.1. Toluidine Blue Toluidine blue 化學式為C15H16SCl＋ZnCl2 。他對於神經組織中蛋白質的碳氧基有高度的親合力，因此被廣泛用來當作神經髓鞘的染色劑，當以Toluidine blue染色時，髓鞘被染成深藍色，而髓鞘環內的軸突則呈現淡白色。實驗用Toluidine blue購自Sigma(USA) 3.5.2.2. 9-0 Nylon 縫線用於將斷傷神經固定於神經導管。實驗所用的 9-0 縫線購自 Mani Z010064000 (Japan)。 3.5.2.3. BetadineⓇAntiseptic Solution 用於實驗過程動物及器械消毒。實驗所用的BetadineⓇAntiseptic Solution 購自Mundipharma（Germany）。. 23.

(37) 3.5.2.4. AErrane 氣體麻醉劑，用於手術過程中減低動物痛苦。手術前須先將大鼠麻醉，將大鼠置於透明麻醉箱中，利用氣體麻醉機（Forawick Vaporizer, Muraco Medical Co., Japan）麻醉，麻醉劑為AErraneⓇ （Isoflurane）購自（Baxter, USA）。 3.5.2.5. 4-0 Catgut chrom 縫線用於縫合大鼠肌肉及皮膚。購自 B.Braun（germary）. 3.5.3. 實驗方法雌性 Sprague-Dawley （SD）大白鼠 30 隻，重量為 220-280 g，週齡為 3 周。依照植入浸泡不同時間之綠梔子素明膠管分為三組：一小時組 (A 組)、三小時組 (B 組)、48 小時組 (C 組)，每組各十隻 SD 大白鼠。 3.5.3.1. 麻醉、消毒手術前先將大鼠以氣麻機麻醉，後將大鼠自透明麻醉箱中取出，利用塑膠管輸送麻醉機，此時麻醉劑量改為 2 litter/kg．min 且將此塑膠管套於大鼠口鼻中，持續給於麻醉。將大鼠擺以右側躺及右膝蓋彎曲，以股骨頭（femur）的位置為中心，上下各約 3 ㎝處，將大鼠臀部及大腿的毛剔除，剃毛區以 BetadineⓇ （Mundipharma, Germany）自中心開始由內向外消毒。 3.5.3.2. 坐骨神經導管結合術大鼠消毒完成後，術者先以拇指及食指找到大鼠右側之股骨頭上之大轉子（greater trochanter of femur）及外側豆狀骨（lateral fabella）予以定位，並用 15 號皮刀沿此兩點之連線劃開皮膚，鈍性分離股二頭肌（biceps femoris muscle）與筋膜，游離出長約 2.5 cm 24.

(38) 之坐骨神經，在距梨狀肌（pirifemoris）下緣 8 mm 處，用剪刀整齊剪斷坐骨神經，取出以滅菌之神經導管，以 9-0 Nylon 縫線於神經導管後端 5 mm 處孔洞入針，然後再穿過一方斷端之神經外膜，接至自神經導管後端 2.5 mm 處孔洞穿出，最後於神經導管外以單結固定，經多次事前的縫合試驗證實，斷端神經會滑至兩端外側孔洞位置，而製造 10 mm 的間距。神經與神經導管縫合完畢後，將麻醉劑之流量改為 1 litter/kg． min，並以 4-0 Catgut chrom 縫合肌肉及皮膚。手術完畢後，測量大鼠體重，並將大鼠置回籠子，照光維持體溫，等待動物甦醒。再以抗生素PamoxicillinⓇ （內含Amoxicillin trichydrate 1.5 gm/60 ml）1 g溶解於 100 ml逆滲透水中，當作 2 天份之水給于自由飲水，預防傷口感染。 3.5.3.3. 動物飼養環境實驗動物之飼養環境為空調房間，一隻大鼠使用一個籠子，溫度為 22±3 ℃，相對溼度為 55±5 ％，半日照環境，自由飲水及餵養標準大鼠實驗飼料（福壽公司，台灣）. 3.5.4. 觀察實驗大鼠外表之變化觀察重點動物犧牲前，在上述飼養環境中飼養大鼠，並觀察大鼠的飲食、大小便、傷口、毛色、活動情形等。. 3.5.5. 統計分析將各組大鼠的體重變化，是否存活、是否存在足部傷口，做統計分析，利用 SAS 6.12 版統計套裝軟體，採用卡方檢定（Chi-Square），探討各組資料在於此次實驗中有無統計上的差異，檢定過程中若發現任何一細格內的理論次數少於五，則採用費雪爾精確概率檢定（Fisher’s exact test），本實驗統計上檢定的第一誤差設在 25.

(39) 0.05，若 P＜0.05 則認定有統計上的明顯差異。. 3.5.6. 評估神經再生情形及神經導管降解情形八周後將大鼠犧牲收成，犧牲前先將大鼠麻醉、剃毛、Betadine Ⓡ消毒後，定位出大鼠右側之股骨頭上大轉子及外側豆狀骨，沿此兩. 點之連線用刀片劃開皮膚，鈍性分離股二頭肌與筋膜，以肉眼觀察神經導管降解情形，縫線是否脫落，拍照後再進一步將附於脛骨（tibia）上肢股二頭肌及腓腸肌（gastrocnemius）鈍性分離出來，進行電生理評估。. 3.6. 電生理評估 3.6.1. 電生理評估方法分離出附於脛骨之股二頭肌、腓腸肌以及附著於坐骨神經分支周圍之脂肪層，並以誘發電位儀（Neuropack Four Mini, Nihon Kohden Co. Japan）作為神經肌肉複合動作電位之誘發，其步驟先以正負紀錄電極（recording electrode）分別插入神經導管遠端之脛前肌肌腱及肌腹處，另將刺激電極（stimulating electrode）置於神經導管近端，在刺激電極釋放出相同電流刺激（6 mA）後，經過再生神經組織的傳導，於誘發電位儀上可顯示神經肌肉複合動作電位波形，紀錄並計算出其產生肌肉複合動作電位之波下面積、傳導速度、振幅、波期之值。. 3.6.2. 統計分析利用 SPSS 10.0 版統計套裝軟體，採單因子變異數分析（One-way ANOVA），探討各組資料數據在統計上有無差異，本實驗統計上檢定的第一誤差設在 0.05，若 P＜0.05 則認定有統計上的明顯差異。當三組的顯著差異存在時，再以 Tukey 法做事後比較，檢定顯著差異存在哪 2 組之間。 26.

(40) 3.7. 神經導管降解變化觀察 3.7.1. 觀察重點 SD 大鼠犧牲前，手術觀察管內神經再生情形。手術方法與麻醉方式如前，使植入大鼠的神經導管暴露出來。觀察導管及神經導管周邊組織變化。. 3.7.2. 統計分析利用 SPSS 10.0 版統計套裝軟體，採單因子變異數分析（One-way ANOVA），探討各組資料數據在統計上有無差異，本實驗統計上檢定的第一誤差設在 0.05，若 P＜0.05 則認定有統計上的明顯差異。當三組的顯著差異存在時，再以 Tukey 法做事後比較，檢定顯著差異存在哪 2 組之間。. 3.8. 再生神經組織切片評估經過八週後，犧牲大鼠，將神經導管內再生的神經組織連同神經導管取下，浸泡於 2.5％ glutaraldehyde 水溶液一週，取出內有再生神經組織之神經導管，將其分為三等分，利用刀片分別去除前後三分之一，留下中間三分之一的部份置於 2.5％ glutaraldehyde 水溶液中，再將再生神經組織以含 2.5％ glutaraldehyde、4％ paraformaldehyde 及 0.1 M cacodehyde 混合液固定 1-2 日，隨即將神經以 1％ OsO4 後固定約 2 小時，之後以 50～95％酒精脫水，再以樹脂包埋，並將函再生神經組織之樹脂置入 60～70 ℃烤箱中約 16 小時，等待樹脂硬化。隨後將包埋之再生神經組織作橫向 1 μm 切片後，以 Toluidine blue 染色，當組織切片染色後，髓鞘與 Schwann cell 會明顯成色。. 27.

(41) 3.8.1. 組織學定量分析對再生神經組織切片先以接於顯微鏡的數位相機（Nikon Coolpix 950, Japan）拍下數位影像，再利用彩色影像分析軟體（Image-Pro Lite Version 3.0, Media Cybemestics, USA）作計算，並以試算軟體 Microsoft Excel XP 做分析。計算與分析切片的再生神經的全部面積、神經內膜面績、再生血管數目、再生血管總面積、再生血管面積百分比。 3.8.1.1. 拍攝照片顯微鏡 40 倍下，拍攝再生神經組織切片全景。顯微鏡 400 倍下，可清楚看到血管，其適合影像分析軟體與計算再生神經組織中血管數。 3.8.1.2. 神經全部面積計算方式將切片置於 40 倍顯微鏡下，以數位相機拍攝影像，再以電腦圈選神經外膜周圍，電腦會自動計算出整個神經全部面積。 3.8.1.3. 神經內膜面積的計算方式將切片置於 40 倍顯微鏡下，以數位相機拍攝影像，再以電腦圈選神經內膜周圍，電腦會自動計算出整個神經內膜全部面積。 3.8.1.4. 神經內膜面積佔再生神經全部面積百分比將神經內膜面積除以神經全部面積。 3.8.1.5. 再生血管數目的計算方式將切片置於 400 倍顯微鏡下，以數位相機拍攝所有再生神經組織型態，再逐一計算出所有圖片所含之血管數目。 28.

(42) 3.8.1.6. 再生血管總面積的計算方式將切片置於 400 倍顯微鏡下，以數位相機拍攝所有再生神經組織型態，再逐一計算出所有圖片所含之血管之面積。 3.8.1.7. 再生血管面積百分比的計算方式將再生血管總面積除以神經全部面積，再換算為百分比。 3.8.1.8. 統計分析利用 SPSS 10.0 版統計套裝軟體，採單因子變異數分析（One-way ANOVA），探討各組資料數據在統計上有無差異，本實驗統計上檢定的第一誤差設在 0.05，若 P＜0.05 則認定有統計上的明顯差異。當三組的顯著差異存在時，再以 Tukey 法做事後比較，檢定顯著差異存在哪 2 組之間。. 3.8.2. 成熟度分析 3.8.2.1. 觀察重點對再生神經組織切片的觀察重點：再生神經整體結構是否完整，神經外膜，圍神經膜以及神經內膜是否形成？在神經內膜中是否有髓鞘化軸突生成，或者大部分組織中仍只有纖維母細胞或 Schwann 氏細胞？血管於再生神經組織中是否已形成？ 3.8.2.2. 統計方式利用 SPSS 10.0 版統計套裝軟體，採克-瓦單因子等級變異數分析（Kruskal-Wallis test），探討各組資料數據在統計上有無差異，本實驗統計上檢定的第一誤差設在 0.05，若 P＜0.05 則認定有統計上的明顯差異。 29.

(43) 3.9. 評估大鼠步態分析 3.9.1. 目的評估大鼠運動能恢復狀況。. 3.9.2. 實驗器材壓克力透明盒 × 2 （75 cm × 15 cm× 20 cm）間距 5 cm 鐵網（75 cm × 15 cm） ×2 捲尺 × 2 鏡子 200 × 50 cm2 DV 攝影機（Sony TCR19）. 3.9.3. 實驗方法先讓大鼠禁食三天，後將大鼠放入全長 150 cm的壓克力透明盒的跑道中，跑道中鋪以間隔為 5 cm 之鐵網（圖 3.3、圖 3.4），末端放置飼料，攝影機對面放置 200 × 50 cm2之鏡子，以拍攝大鼠往反方向行走時的步態，全程使用DV拍攝錄影，拍攝停止時間以大鼠咬到飼料後即停止攝影，之後分析影片中術側肢體每十步掉落網底的步伐次數。. 30.

(44) 圖 3.3 步態分析跑道圖之一. 圖 3.4 步態分析跑道圖之二. 31.

(45) 3.9.4. 統計方法利用 SAS 6.12 版統計套裝軟體，採用卡方檢定（Chi-Square），探討各組資料在於此次實驗中有無統計上的差異，檢定過程中若發現任何一細格內的理論次數少於五，則採用費雪爾精確概率檢定（Fisher’s exact test），本實驗統計上檢定的第一誤差設在 0.05，若 P ＜0.05 則認定有統計上的明顯差異。. 3.10. 評估大鼠感覺神經功能恢復情形 3.10.1. 目的評估大鼠術側腳掌對於感覺功能的恢復情形，利用小電流的電刺激器，刺激大鼠的腳底，而大鼠在刺激後，若有感覺則會產生縮回反應（withdrawal response）。. 3.10.2. 實驗儀器功能電刺激器 Trio 300，frequency：10 Hz；Width：5 ms；Current： 20～750 μA，圖 3.5 為波形示意圖。其中[f+]=[f-]=f(脈波頻率)； [pw+]=[pw-]=pw(波寬)；(50KΩ 負載下)；f 為脈波頻率；pw 為波寬； Vp 為輸出電壓；Ip 為輸出電流；*IP=Vp/50kΩ。. 32.

(46) 圖 3.5 電刺激波形示意圖. 3.10.3. 實驗方法先將大鼠固定，將電刺激器調整如圖 3.6 所示之模式下，刺激電極間距為 5 mm (如圖 3.7 所示)，將刺激電極放置於大鼠手術側的腳掌上，整個腳掌共分為 4 個刺激點(如圖 3.8) [56]，電流強度從 20 μA 開始，每次增加 10 μA，直到大鼠腳掌產生縮回反射(withdraws reflex)，通常正常大鼠在剛刺激時，即產生縮回反射，而觀察重點在於刺激電流的閾值大小，產生反射時的電流值定義為該點反應的閾值，將各組數值紀錄以利統計分析。. 33.

(47) 圖 3.6 電刺激器模式設定圖. 圖 3.7 刺激電極圖. 34.

(48) 圖 3.8 大鼠腳掌電刺激部位示意圖[56]. 3.10.4. 統計方法利用 SAS 6.12 版統計套裝軟體，採用卡方檢定（Chi-Square），探討各組資料在於此次實驗中有無統計上的差異，檢定過程中若發現任何一細格內的理論次數少於五，則採用費雪爾精確概率檢定（Fisher’s exact test），本實驗統計上檢定的第一誤差設在 0.05，若 P ＜0.05 則認定有統計上的明顯差異。. 3.11. 觀察大鼠足印(footprint)分析 3.11.1. 目的經由觀察分析大鼠的四肢行走的步伐，評估大鼠步態的角度與間距，以了解大鼠步態的改變。 35.

(49) 3.11.2. 實驗器材壓克力透明盒 × 1 （75 × 15 × 20 cm）裁取 75×15 cm2白紙數張鐵盆 × 1 墨水 100 cc (開明墨水，台灣). 3.11.3. 實驗方法先將白紙平鋪於壓克力透明盒中，以確保大鼠在透明盒中行走，將墨水倒入鐵盆中，後將大鼠四肢腳掌置入鐵盆中，使四隻腳掌皆能沾取墨水，再將已沾墨的大鼠放入壓克力透明盒中行走，印下足印痕跡。再計算足印痕跡上右前腳與右後腳的間距，左前腳與左後腳的間距，前腳偏轉角度(中指與腳跟聯成一直線延伸，計算左右交叉的角度)如圖 3.9 所示. 36.

(50) 圖 3.9 足印分析示意圖. 3.11.4. 統計方法利用 SAS 6.12 版統計套裝軟體，採用卡方檢定（Chi-Square），探討各組資料在於此次實驗中有無統計上的差異，檢定過程中若發現任何一細格內的理論次數少於五，則採用費雪爾精確概率檢定（Fisher’s exact test），本實驗統計上檢定的第一誤差設在 0.05，若 P ＜0.05 則認定有統計上的明顯差異。. 37.

(51) 3.12. 評估大鼠斷傷側攀爬（climb）能力 3.12.1. 目的評估大鼠神經截斷側運動攀爬的情形，藉以量化運動功能恢復程度。. 3.12.2. 實驗方法先將大鼠前腳置於平板上距邊緣 5 cm 處，使大鼠雙側後腳自然懸空，再讓大鼠自行攀爬，全部過程皆由 DV 拍攝記錄，並紀錄後腳攀爬至平板上所需之時間。平板如圖 3.10 所示。. 圖 3.10 實驗用平板圖. 3.12.3. 統計方法：利用 SAS 6.12 版統計套裝軟體，採用卡方檢定（Chi-Square），探討各組資料在於此次實驗中有無統計上的差異，檢定過程中若發現任何一細格內的理論次數少於五，則採用費雪爾精確概率檢定（Fisher’s exact test），本實驗統計上檢定的第一誤差設在 0.05，若 P ＜0.05 則認定有統計上的明顯差異。. 38.