生長激素-奈米鑽石複合體的開發與其應用

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(1)國立交通大學生化工程研究所碩士論文. 生長激素-奈米鑽石複合體的開發與其應用 Developing and application of the growth hormone-nanodiamond complex.. 研究生:陳佩欣指導教授:張家靖教授. 中華民國九十六年七月.

(2) 生長激素-奈米鑽石複合體的開發與其應用 Developing and application of the growth hormone-nanodiamond complex.. 研究生:陳佩欣. Student : Pei-Hsin Chen. 指導教授:張家靖. Advisor : Chia-Ching Chang. 國立交通大學生化工程研究所碩士論文 A Thesis Submitted to Institute of Biochemical Engineering College of Science National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master in Biochemical Engineering July 2007 Hsinchu, Taiwan, Republic of China 中華民國九十六年七月.

(3) 生長激素-奈米鑽石複合體的開發與其應用. 學生:陳佩欣. 指導教授:張家靖教授. 國立交通大學生化工程研究所碩士班. 摘要奈米科技是一門嶄新的科學，其主要研究奈米材料的基礎特性及應用性。當任一塊材物質逐漸的縮小其某一維度的尺寸到達 100 nm 以下，即成為所謂的奈米材料，而奈米粒子就是其中的一種。相較於一般塊材，奈米材料具有極為不同的物理及化學特性，奈米鑽石亦不例外。早期的奈米鑽石多用於機械上的工業加工或是表面處理，但有研究學者發現奈米鑽石可能具有螢光特性，因此本研究對奈米鑽石做詳加的研究，最後察覺奈米鑽石是具有螢光特性的奈米材料。也有其他實驗指出奈米鑽石可能不具有細胞毒性，因此奈米鑽石是否具有跨足生醫領域的潛能並將於本研究中詳加探討。在本實驗中，我們利用細胞活性實驗證實奈米鑽石(nanodiamond, ND)是無毒材料，並藉由其螢光特性察覺奈米鑽石具有細胞穿透性，可出現於細胞質及細胞核中。因此我們認為奈米鑽石有做為攜帶生物分子的載體的潛能，或是開發出具有生物標靶性的蛋白質-奈米鑽石複合體。本研究首先藉由比較不同物種間的親源關係來找出人類生長激素的類似物 EaGH，並利用基因重組技術取得大量的基因重組青石斑魚生長激素(rEaGH)作為活性標定奈米鑽石的生物分子。藉由基質輔助雷射脫附游離時序飛行質譜儀(MALDI-TOF)的分析得知一個奈米鑽石和兩個 rEaGH 形成一個共價結合的 cND-rEaGH 複合體。而細胞活性測試結果顯示 rEaGH、ND 和 cND-rEaGH 複合體都不具有細胞毒性，然而一但結合雷射系統與對生長激素受體具有標靶性的 cND-rEaGH 複合體，將對癌症細胞產生爆炸性的損害，我們利用掃描式電子顯微鏡可觀察到奈米鑽石的爆炸威力對細胞的損害程度，必藉由細胞活性測試量實驗量化細胞的受損情形。最終本實驗成功的藉由結合具有肺癌標靶性的 cND-rEaGH 複合體和雷射系統，建立一治療肺癌的醫療平台。. i.

(4) Developing and application of the growth hormone-nanodiamond complex.. Studuent : Pei-Hsin Chen. Advisor : Dr. Chia-Ching Chang. Institute of Biochemical Enigeering National Chiao Tung University. Abstract Nanomaterial is a materiall which size is smaller than hundred nanometers. Nanomaterials possess unique chemical and physical propertyes and they are different from bulk materials. Nano-diamond (ND) is one of the unique example. In general, ND was used as grind powder in processing industries. Recently, we found that ND may possess unique fluorescence properties. Meanwhile we also found that ND may be bio-compatible particle. This material may be a good candidate in bio-medical application. Therefore in this study, we have characterized the intrinsic properties of ND and carboxyl-ND. We found that ND is a non-toxic material for bio-system. Meanwhile, NDs can be uptake freely by cell and these ND particles can be observed by fluorescence microscopy. We have synthesized a GH-ND complex and we found that this complex can be recognized by the GH receptors which located on the cell surface. Therefore, we found that these complex can be triggered to blast on the surface of cancer cell. Therefore, we may conclude that the GH-ND complex may be used in biomedical application, such as cancer therapy. Meanwhile this nanoparticle may be used as a bio-compatible platform in many kind application of bio-system.. ii.

(5) 誌謝在交通大學的這兩年，我必須感謝許多人在學業上給予許多的幫助，在此我將一一對他們致謝。首先先得感謝我的家人，因為他們支持使我來到交大就讀，使我能將全副精神投入研究中。感謝張家靖老師給予我這麼一個有趣且有前瞻性的研究課題，讓我有機會和許多不同背景的人有所接觸，使我的研究領域由生物方面擴展到光學及物理領域。感謝東華大學的鄭家良老師在奈米鑽石材料上的提供；感謝儀器科學中心的蘇建穎和陳至信博士在雷射設備及技術上的支援；也感謝張宇清學長及劉銀樟教授提供實驗所需的細胞材料；更感謝陳姿亘在數據量測和分析方面的協助。最後要感謝我們實驗室的所有成員，和我一同經歷過實驗室生活中的點點滴滴。. iii.

(6) 目錄摘要................................................................................................................................ i Abstract........................................................................................................................ ii 誌謝.............................................................................................................................. iii 目錄.............................................................................................................................. iv 表目錄.......................................................................................................................... vi 圖目錄.......................................................................................................................... vi 一、序論........................................................................................................................1 1-1. 奈米材料的介紹 .............................................................................................1. 1-2. 生物標靶性的開發 .........................................................................................2. 1-3. 多光子效應的介紹 .........................................................................................3. 1-4. 奈米鑽石針對癌症標靶性的開發 .................................................................4 1-4-1 雷射治療 ................................................................................................4 1-4-2 光動力療法 ............................................................................................5 1-4-3 標靶治療 ................................................................................................6. 二、研究動機................................................................................................................8 三、實驗架構................................................................................................................8 3-1. 奈米鑽石的羧酸化及紅外線吸收光譜儀的檢測 .........................................8. 3-2. 羧酸化奈米鑽石和蛋白質的鍵結程序 .......................................................10. 3-3. 奈米鑽石和羧酸化奈米鑽石在生物特性的檢測 .......................................10. 3-4. 青石斑魚的重組生長激素(rEaGH)和重組基因魚類生長激素-羧酸化奈米. 鑽石複合體(cND-rEaGH complex)的生物特性檢測 ........................................... 11 3-5. 多光子吸收效應對奈米鑽石的影響 ........................................................... 11. 四、實驗步驟..............................................................................................................11 4-1. 魚類和哺乳類動物生長激素的胺基酸序列與親緣關係與演化分析 ....... 11. 4-2. 紅外線光譜了解強酸氧化奈米鑽石前後的差異性 ...................................12. 4-3 UV-vis 測定奈米鑽石的濃度 .......................................................................13 4-4. 動態光散色儀測定奈米鑽石的粒徑 ...........................................................13. 4-5. 化學性結合產生蛋白質-羧酸化奈米鑽石複合體 ......................................13. 4-6. 青石斑魚生長激素是人類生長激素的相似物 ...........................................14. 4-7. 量產青石斑魚的重組生長激素 ...................................................................14. 4-8. 西方墨點法測定何種細胞適合作為 cND-rEaGH 的靶向性細胞 .............14 iv.

(7) 4-9 cND-rEaGH 的接合效率評估 ......................................................................15 4-10. cND-rEaGH 的檢定 ....................................................................................15. 4-11 cND-rEaGH 的毒性測試 ............................................................................15 4-12. 奈米鑽石的特性 .........................................................................................15. 4-13. cND-rEaGH 在癌症治療上的應用 ............................................................16. 五、結果......................................................................................................................16 5-1. 魚類和哺乳類動物生長激素的胺基酸序列比對和其親源演化關係 .......16. 5-2. 奈米鑽石的濃度測定 ...................................................................................17. 5-3. 確認市售奈米鑽石的粒徑大小 ...................................................................17. 5-4. 比對人類和青石斑魚的生長激素 ...............................................................17. 5-5. 青石斑魚重組生長激素的取得與表現 .......................................................17. 5-6. 西方墨點法偵測細胞是否帶有生長激素受體 ...........................................18. 5-7 cND-rEaGH 的接合效率 ..............................................................................18 5-8 cND-rEaGH、rEaGH 和 cND 的粒徑大小 .................................................19 5-9 cND-rEaGH 的基質輔助雷射脫附游離飛行質譜儀檢測 ..........................19 5-10. cND-rEaGH、cND 和 rEaGH 的細胞毒性檢測 .......................................19. 5-11. 奈米鑽石具有螢光特性..............................................................................20. 5-12. 多光子效應對 5 nm 奈米鑽石的型態影響 ...............................................20. 5-13. cND-rEaGH 在癌細胞上的應用 ................................................................21. 5-14. 經 cND-rEaGH 和雷射轟炸前後的細胞型態 ...........................................21. 六、討論......................................................................................................................44 6-1. 奈米鑽石具有生物相容性、螢光特性和多光子激發的爆炸效應 ...........44. 6-2. 了解細胞表面的受體種類有助於標靶治療的發展 ...................................44. 6-3. 人類生長激素相似物的開發 .......................................................................45. 6-4 cND-rEaGH 的特性與應用 ..........................................................................46 6-5. 奈米鑽石的發展潛力 ...................................................................................46. 七、結論......................................................................................................................47 參考文獻......................................................................................................................48 附錄..............................................................................................................................57 附錄一蛋白質復性緩衝液的配方.......................................................................57. v.

(8) 表目錄表 1-1 光敏藥劑所對應對的波長及使用特性 ...........................................................5 表 1-2 針對上皮生長激素受體所開發出的標靶治療藥物及適用時間 ....................7 表 3-1 常見的官能基在紅外線光譜所對應的特定吸收頻率 ...................................9 表 5-1 不同濃度的奈米鑽石對應在 589 nm 的吸光數值 .......................................25 表 5-2 cND-rEaGH 的接合效率評估 .........................................................................30 表 6-1 正常細胞及癌細胞所具有的受體種類 ..........................................................44. 圖目錄圖 1-2 上皮生長激素受體的結構。 ...........................................................................6 圖 4-1 5 nm 及 100 nm 的奈米鑽石在氧化前及氧化後的紅外線光譜 ...................12 圖 4-2 1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯胺鹽酸使羧酸基分子和胺基分子進行共價性的胜肽鍵結合..........................................................................................................14 圖 5-1 原子力顯微鏡的探針掃描奈米鑽石時的示意圖 .........................................20 圖 5-2 魚類和哺乳類動物生長激素的胺基酸序列比對 .........................................23 圖 5-3 魚類和哺乳類的親源演化樹 .........................................................................24 圖 5-4 不同濃度的 5 nm 奈米鑽石在 200 ~ 900 nm 的吸收圖譜 ...........................25 圖 5-5 濃度為 1×10-1 ~ 1×10-3 mg/mL 的 5 nm 奈米鑽石在 589 nm 吸光值和其濃度的線性關係..................................................................................................................26 圖 5-6 利用動態光散射儀量測 5 nm 奈米鑽石的粒徑大小 ...................................26 圖 5-7 人類和青石斑魚的生長激素的胺基酸序列比對 .........................................27 圖 5-8 青石斑魚生長激素的胺基酸序列及其重組生長激素的 DNA 及胺基酸序列 ......................................................................................................................................28 圖 5-9 大腸桿菌在不同階段所含的蛋白質電泳分析圖 ..........................................29 圖 5-10 西方墨點法免疫呈色結果 ...........................................................................29 圖 5-11 是 cND-rEaGH、rEaGH 和 cND 的粒徑量測結果 ....................................30 圖 5-12(a)5 nm cND 的質譜儀圖譜 ...........................................................................31 圖 5-12(b)5 nm cND-rEaGH 的質譜儀圖譜 ..............................................................32 圖 5-13(a)不同濃度的 cND 和 rEaGH 處理後對 A549 細胞的毒性測試 ...............33 圖 5-13(b)不同濃度的 cND 和 rEaGH 處理後對 CHO-K1 細胞的毒性測試 .........34 圖 5-14(a)不同濃度的 cND-rEaGH 處理後對 A549 細胞的毒性測試....................35 圖 5-14(b)經不同濃度的 cND-rEaGH 處理後對 CHO-K1 的毒性測試..................36 圖 5-15 利用奈米鑽石的螢光特性偵測奈米鑽石的位置 ........................................37 圖 5-16(a)5 nm 奈米鑽石經雷射轟炸後的影像........................................................38 圖 5-16(b)已爆炸及未爆炸的 5 nm 奈米鑽石經原子力顯微鏡的分析...................39 圖 5-17 A549 細胞分別經由不加任何藥劑、加入 rEaGH、cND 和 cND-rEaGH 的四種處理下，選擇是否經由雷射轟炸，再持續培養 24 小時後的細胞數目............40 vi.

(9) 圖 5-18 CHO-K1 細胞分別經由不加任何藥劑、加入 rEaGH、cND 和 cND-rEaGH 的四種處理下，選擇是否經由雷射轟炸，再持續培養 24 小時後的細胞數目....41 圖 5-19 以掃描式電子顯微鏡觀察經 cND-rEaGH 處理的肺腺癌細胞 A549，持續培養 24 小時後細胞型態................................................................................................42 圖 5-20 以掃描式電子顯微鏡觀察肺腺癌細胞 A549 經 cND-rEaGH 處理和雷射轟炸，培養 24 小時後的細胞型態................................................................................43. vii.

(10) 一、序論. 1-1. 奈米材料的介紹當某一粒子的在三個維度的尺寸都在 100 nm 以下，其內部電子在各方向的運動都受到侷限，就會有量子侷限效應(quantum confinement effect)產生 1。奈米粒子逐漸縮小粒徑時，位於奈米粒子表面的原子數和總原子數之比值則會急遽增加，又表面原子的熱穩定性及化學穩定性都較內部的原子差，所以當表面原子一遇見其他原子時就會很快的互相結合，使表面原子趨向穩定，這也導致奈米粒子無法單獨穩定的存在，而這種表面效應也造就了奈米粒子具有高度催化活性。奈米材料往往因為體積效應 2 而和塊材具有不同的性質，例如：由無數個原子及分子所構成的金屬塊材具有連續能階，但金屬奈米粒子則是由有限的原子所構成，其電子數目不足以形成連續的能帶，而是轉化形成更自分立的不連續能階，有如原子能階一般，就像是人造原子，這種藉由改變粒子大小而產生能階分明的現象就是所謂的體積效應。此外奈米粒子更因其粒徑小於紫外光、可見光和紅外光波長，所以對光的反射及散射能力大減，因此奈米粒子往往被視為是透明的材料 3,4。以下將簡述量子點和樹狀分子(demdrimer)這兩種奈米材料在生物或工業界上的應用： (1)量子點(Quantum dot)：量子點獨特的光譜特性使量子點有取代生物學所用的化學螢光染劑的趨勢 5。傳統的化學染劑其激發波峰(excitation peak)和放射波峰 (emission peak)常有部分的光譜重疊 6，所以化學染劑經由激發後所放射出的螢光訊號易受到激發光源的干擾，又螢光消失的速度極快，不同的化學染劑甚至須要不同波長的光源來激發，相較之下量子點具有許多化學螢光染劑所沒有的優點。不同粒徑大小的量子點可產生不同顏色的螢光，但它們都只需由單一波長的光源來做激發，其螢光的半衰期長又是另一項優點。以中心是由(CdSe) ZnS 所構成的 Qdot605 商品為例，Qdot605 經由激發光源照射 70 毫秒後，其螢光強度在兩小時之內僅衰減 30%2。故利用不同大小的量子點可同時追蹤細胞內的多種蛋白質，長時間的觀察蛋白質在細胞中的動態 7。由上述看來，量子點似乎優於傳統染劑，但我們必須記得量子點的核心多是具有毒性的無機半導體材料如硒化鎘 5,8 或硒化鉛 9 等所構成，為了防止量子點和生物分子直接接觸而造成細胞毒性，也為了減緩量子點的腐蝕速度，我們常在量子點的外殼包覆其他物質，如聚乙二醇(pol(ethylene glycol))等，甚至將量子點表面進行羧酸化的功能性修飾，並和生物巨分子結合，作為免疫分析法中的螢光探針 3 。此外量子點更可藉由參雜到其他基材的方式來獲得新的功能，例如：矽是具有間接能隙(indirect bandgap)的基材，沒有發光特性，若在其內部混入應變銻化鎵量子點(strained GaSb quantum dot)，在 11K 的低溫下以電流驅動此元件，就可發出近紅外光波段的光源，因此在量子點的協助下，以矽基材為主的發光二極體(LED) 1.

(11) 成功的被開發 4，而 LED 照明不會發熱，且能源效率又高，因此幾乎可以預見在未來 LED 產品將取代白熾燈泡、日光燈和鈉燈。 (2)樹狀分子(demdrimer) 樹狀分子是人工合成的奈米材料，因其屬於非生物性材料，所以需考慮細胞毒性、免疫原性(immunogenicity) 10 等問題。樹枝狀聚合物在合成的過程中，可以人工控制其體積、型態及末端所帶的官能機種類 11。所以當樹狀分子末端是帶正電的陽離子時，就可利用電性作用直接和帶負電的 DNA 分子結合，作為基因載體工具 11。例如：polyamidoamine(PAMAM)所構成的樹狀分子對限制酶酵素(restriction enzyme)具有抵抗性，可以保護核酸序列不被水解，相較於陽離子脂質體(cation liposome)等基因載體，具有更高的基因轉殖率 12。樹狀分子甚至可作為藥物釋放載體，而將厭水性的抗潰瘍藥物 5-氨基水楊酸(5-amino salicylic acid )包覆於其空腔中，再運送至細胞內進行藥物釋放 13。由以上對奈米材料的介紹，我們得知物體的特性會隨著尺寸大小而改變，無毒的塊體也許會在奈米粒子的形態下產生毒性並且更易進入人體14。雖然這並不代表奈米材料都具有毒性，但是每種新材料都是具有毒性的潛在，況且目前也沒有適用於回收廢棄的奈米材料的標準流程，更沒有任何相關的法令規章，因此選擇無毒性的奈米材料作為後續研發的基礎，對自然環境的永續經營是十分重要的。奈米鑽石的主要組成成分是碳原子，但雜有一定比例的的氮、氧、氫原子，故奈米鑽石屬於多晶奈米材料15。奈米鑽石是利用爆炸過程產生的高溫及高壓下，於短時間之內所形成16，故其晶格內部含有大量的缺陷存在。這些不純物質及晶格缺陷造就了奈米鑽石具有螢光的特性，就如同具有螢光特性量子點一樣，奈米鑽石也有作為生物探針(bio-probe)的可能性。此外更有學者直接利用高能量的質子光束照射奈米鑽石，增加晶格缺陷的數目，達到強化奈米鑽石發光的效能17。雖然量子點可在表層包覆無毒的介質材料，可達到跨入生醫領域的目的，但量子點畢竟是有毒物質，其終究具有潛在的危險性，因此本實驗將對奈米鑽石做應用性的開發，畢竟由多數碳原子所組成的奈米鑽石，可能具有高度的生物相容性，較適於生醫方面的應用。奈米鑽石除上述可經由一般的單光子激發產生螢光外，也可利用多光子激發產生螢光。奈米鑽石作為生物探針時，需一併考量細胞所能承受最大能量，因此其激發能量多有所侷限；當螢光是由多光子吸收效應所誘發時，此時的激發能量須高達108 W/cm2，且已有研究指出在奈米鑽石放出螢光的同時，其結構上會由原先的sp3轉變為sp2伴隨著一同發生18，而這樣的爆炸效應是否能用於後續的應用也將於本論文中加以探討。 1-2. 生物標靶性的開發許多奈米材料為了達到降低毒性及提高親水性等目的，多會在其表層包覆聚合物或生物分子，以便增加其應用性。例如：(1)厭水性的 C60 在水溶液中易聚集成團，但經由人類血清蛋白(human serum albumin)吸附於表面後，就可形成保護 2.

(12) 層，抑制由鹽類所引發的聚集現象 6；(2)用於治療腦部疾病的藥物常因血腦障壁而無法發揮其功效，因此即便是水溶性藥物，當其分子量大於 500Da 時，便無法到達腦部發揮其療效 19，然而以 Tween 80 包覆的奈米粒子打破了這個限制，因此在 Tween 80 的協助下，奈米粒子對腦部區域產生了標靶性，可將藥物專一的送達腦部 20。除了上述 Tween 80-奈米微粒具有主動式的生物標靶性外，我們還要介紹被動式的生物標靶性，阿黴素(doxorubicin)是治療惡性腫瘤常用的化療藥物，將阿黴素包覆在奈米脂質體中(liposome)並經由血流運送，經由長時間的觀察可發現奈米微粒因腫瘤細胞有較強的通透性和留存增強效應(enhanced permeability and retention effect)而於腫瘤組織處聚集，其後奈米粒子會因腫瘤組織的的低 pH 值環境及溶酶體對奈米脂質體的降解而持續的釋放藥物達到長效的治療結果。但無論是主動或被動都顯示了一個重要的概念，那就是生物標靶性的重要，現今的醫療已不只著重在殺死癌細胞而以，還包含了如何提升正常細胞的存活率、降低病患的不適感等等，因此如何在殺死癌細胞而不損傷正常細胞的平衡間取得一個最佳的支撐點，就仰賴學者及醫師對開發生物標靶特性投入更多的心力。本實驗也著重於生物標靶性的研發，但奈米鑽石不像奈米脂質體具有可儲藏藥物的空腔，因此我們將利用修飾奈米鑽石的表面來開發其生物靶向性。奈米鑽石具有梭基、羰基等表面官能基，其表面官能基可作為靶向性物質的附著點，而發展已久的生物鍵結技術(bioconjugate techniques)可作為我們對開發靶向性奈米鑽石的依據，例如：圖 1-1 的還原性烷化作用(reducetive alkylation)就是一種適用於奈米鑽石和具有靶向性的胺基物質間的化學反應，此靶向物會先和奈米鑽石經由烷化作用形成一由碳氮雙鍵所構成的不穩定中間體，但仍須經由還原作用後才能形成可長久穩定存在的碳氮單鍵複合體。因此藉由開發完善的生物鍵結技術，我們將可對奈米鑽石進行許多不同種類的靶向性修飾，在此則不一一詳加贅述。. 圖 1-1 還原性烷化作用的機制。 1-3. 多光子效應的介紹多光子激發指的一個分子同時吸收多個光子，由基態轉變為激發態的過程，而這些被吸收的光子頻率分別為 ν1、ν2、ν3……νn，此時經由多光子吸收效應而被激發的物質所吸收的能量等同於頻率為 ν1+ν2+ν3……+νn 的單光子所提供的能量，在單光子吸收效應中，分子經由逐次吸收單個光子來達到最終激發態，故在單光子吸收效應中，分子會停留在許多不同能階的階段性激發態；然而在多光子吸收過程中，分子會由基態直接躍升至最終激發態，不會有任何的階段性激發態存在，這就是多光子吸收效應和單光子吸收效應的最大差異。雙光子激發顧名思義是需要分子同時吸收兩個光子躍遷到激發態，但因需要 3.

(13) 兩個光子同時激發，故躍遷機率(transition rate)正比於入射光強度的平方 20，且因多光子吸收截面極低，因此需要在脈衝雷射的協助下才能達到極高的瞬間功率，以便產生有效的激發。雙光子共軛焦顯微鏡就是一實際利用雙光子對樣品做有效激發的應用，不同於一般共軛焦顯微鏡，雙光子激發的非線性光學效應只在聚焦處最為強烈，亦即雙光子激發只侷限在特定的一點；但傳統的共軛焦顯微鏡卻需要針孔設備提供空間濾波作用，才能達到光學切片能力，取得不同深度的斷面影像資訊 20。但雙光子共軛焦顯微鏡並非沒有缺陷的，雙光子共軛焦顯微鏡往往會對樣品造成傷害，因其所使用的超快雷射為了有效造成雙光子激發，需要數毫瓦的能量對樣品進行掃描，相較於單光子激發所需的數百微瓦能量，如此強的光源照射往往造成細胞的破壞，甚至死亡。因此使用多光子激發效應時需要考量生物細胞所能承受的最大能量，才能期許達到最佳的實驗結果。而奈米鑽石的多光子吸收效應也有相同的考量，雖然奈米鑽石經由多光子激發造成結構的劇烈改變，但其是否能應用於生醫領域仍是未知的，因此需要由我們進行更詳細的探討。 1-4. 奈米鑽石針對癌症標靶性的開發惡性腫瘤自民國七十一年至今，一直是國內十大死亡之首，其中又以肺癌排名國內癌症死因的第一名。肺癌依其臨床特性的差異可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer ; SCLS) 21 和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer; NSCLS) 21 兩大類，而非小細胞肺癌主要又分為肺腺癌(Lung adenocarcinoma)、鱗狀細胞癌 (Squamous cell carcinoma)和大細胞癌(Large cell carcinoma)三種 21，其中又以肺腺癌在台灣最為常見。在台灣罹患非小細胞癌的病患佔了 85％~88％；剩餘的 12％ ~ 15％才是小細胞癌。傳統的肺癌治療有手術切除、放射線治療和化學藥物治療等三種方式。外科手術切除僅適用於初期肺癌病患，達到盡量保存正常肺組織的目的；和外科手術同為局部性療法的放射性治療，適用於肺功能足夠但不能接受手術的病患，主要是去除腫瘤及鄰近組織和淋巴等癌細胞可能殘存之處；而化學藥物治療則是針對全身癌細胞可能散佈潛藏處，以注射藥物的方式達到消滅或縮小腫瘤，降低轉移或復發的機率。此外雷射治療、光動力療法(photodynamic therapy) 及標靶治療也都是可行方式，以下將對此三種療法進行簡介。 1-4-1 雷射治療用於治療肺癌的雷射包含了二氧化碳雷射(CO2 laser)、釹雅克雷射(Nd：YAG laser)、氬雷射(Argon laser)和氪雷射(Krypton laser) 22，其中以釹雅克雷射最為常用。釹雅克雷射提供肉眼不可見的 1064 nm 光束，配合著由特殊石英纖維所構成的軟式內視鏡，可輕易將雷射導到深層的組織。一般常用的能量為 10~40 瓦特(W)，隨著能量的不同，其穿透深度可由數毫米到數厘米。高能量的釹雅克雷射，會因其熱效應造成組織細胞的壞死(necrosis)，並形成焦痂(eschar)。使用高能雷射時最需注意血管的分布，因高能雷射具有破壞組織的能力，一旦傷害到大血管將造成大量出血，危及病患生命安全，低能量的釹雅克 4.

(14) 雷射，則會引發凝固效應(photocoagulation)。當低能量的釹雅克雷射照射細胞時，會造成細胞收縮(shrinkage)並減少流經此區域的血流量，故可用於去除腫瘤內的血管或用於止血 23。 1-4-2 光動力療法光動力療法主要由三大要素所構成，分別是光敏藥劑(photosensitizer)、特定波長的激發光和生物體內的氧分子，此三種成份皆對細胞不具任何威脅性，一旦結合起來卻具有毒殺癌細胞的能力(24)。其作用機制是進入人體並聚集於患部的光敏藥劑，在經由特定波長的光源照射後，光敏藥劑將由原本的基態轉變為激發態，這些激發態的感光劑將直接或間接的和氧分子進行交互作用，造成細胞的氧化壓力(oxidative stress)，引發特定的胺基酸分子和不飽和的脂質(unsaturated lipid)進行修飾或是導致DNA受損，一但這些損害未能經由修補機制而導正，就會造成細胞壞死(necrosis)或凋亡(apoptosis) 24，達到殺死不正常細胞的最終目的。第一代的光敏藥劑Photofrin，可用於治療氣道的表淺病變，甚至可用於治療肺癌、子宮頸癌和食道癌，但其缺點是患者在療程結束後，仍有少量光敏藥劑存在於皮膚，所以患者在治療後四至六星期必須避免照射陽光或強光，避免引發皮膚過敏25 ，而用於治療治療老年黃斑退化 (neovascular age-related macular degeneration)的光敏藥劑Visudyne是經由改良後的第二代光敏藥劑26，病患僅需在療程結束後的二十四小時後即可以恢復戶外活動。光動力療法成功與否的重要關鍵在於光敏藥劑能否被激發，因光的穿透深度僅達數公分深，相較於表層細胞，位於較深層的腫瘤細胞，所獲得的光劑量不足以有效的激發所有的光敏藥劑，而僅使深層腫瘤細胞獲得輕微的傷害，這些腫瘤細胞會經由血紅素氧化酵素-1(heme oxygenase-1)所主導的細胞保護機制而存活下來，並再次迅速的增生導致病症的復發24，因此光動力療法是一種化學性傷害機制，其成功與否取決於細胞中的活性氧含量。表 1-1 光敏藥劑所對應對的波長及使用特性 26 光敏藥劑. 商品名. 激發波長. 照射前所需時間. Porfimer sodium. Photofrin. 630 nm. 24-28 hr. Benzoporphyrin derivative ring A, BPD-MA, verteporfin. Visudyne. 690-692 nm. 1-2.5 hr. m-THPC,temeporfin. Foscan. 652 nm. 72-96 hr. 5-ALA. Levulan. 635 nm. 4-12 hr. Hexyl ester ALA. Hexvix. 635 nm. 4-12 hr. Tine ethyl etiopurpurin, SnET 2. Purlytin. 660-665 nm. 24 hr. Hypericin. Hypericin. 595 nm. 24 hr. 5.

(15) N-Aspartylchlorin e6. Npe6. 660-665 nm. 4 hr. 1-4-3 標靶治療標靶治療是直接阻斷參與腫瘤發展或生長所需的特定分子，因僅針對特定分子做攻擊，故對正常細胞的傷害極小 27。發展標靶治療，首先需區分並了解關於惡性和非惡性細胞不正常的生化反應及分子途徑，因非惡性細胞所引起的腫瘤多是經由細胞膜上的受體來控制訊息傳導的發生，誘發細胞增生、凋亡、血管新生、細胞貼附或是轉移等特性。舉例來說，許多腫瘤都伴隨著上皮生長受器(epidermal growth factor receptor)的過度表現，如乳癌、肺癌等，而上皮生長受器決定了實體腫瘤(solid tumor)的生長及存活與否 27，於是阻斷上皮生長因子所活化的訊息傳導過程，被視為標靶治療的重要目標。上皮生長受體分為是由細胞外(extracellular domain)、穿透細胞膜 (transmembrane domain)及細胞內(intracellular domain)的三大區域。細胞外的區域又細分為 4 個區塊，其中的第三區塊(domain III)是配體(ligand)的結合位置；細胞內的區域也依其功能性分為 3 個區塊，其中以參與訊息活化的酪胺酸激酶(tyrosine kinas domain)區段，最常被視為標靶治療的目標區域 27。. 圖 1-2 上皮生長激素受體的結構。以皮生長受器所開發出的標靶治療藥物，可區分為針對細胞外配體結合區段或細胞內酪胺酸激酶區段的單株抗體、配體及反義寡核甘酸(antisense oligonucleotide)等 27，表 1-2 為已用於治療肺癌的標靶治療藥物整理表。. 6.

(16) 表 1-2 針對上皮生長激素受體所開發出的標靶治療藥物及適用時間。藥物種類針對配體結合位置的單株抗體雙功能性的抗體. 針對酪胺酸激酶. 重組性疫苗. 名稱. 適用時間. IMC-C225. 第三期. ABX-EGF. 第二期. EMD-72000. 第二期. ThreaCIM-h-R3. 第二期. MDX-447. 第二期. ZD1839. 第三期. OSI-774. 第三期. CI-1033. 第二期. EKB-569. 第一期. PD-0183805. 第一期. PKI-166. 第一期. EGF-P64K. 第二期. IMC-C225、ABX-EGF、MDX447、scFv-14el-ETA-fusion toxin 是針對配體結合位置所發展出的抗體，前兩者的作用機制是直接結合到配體結合位置，使真正的配體無法結合的單株抗體；MDX447 則是一具有雙功能性的抗體，不但可佔據配體結合位置，更可作為被免疫作用細胞(immune effector cell)辨識的抗原決定區 (epitope)，許多的免疫作用細胞會聚積於此區塊並誘發免疫反應，達到殺死癌細胞的目的；而 scFv-14el-ETA-fusion toxin 則是融合黴菌內毒素 pseudomonas endotoxin A(ETA)的上皮生長受器抗體，其對正常型及突變型(EGFRvIII)的上皮生長受器有相同的結合能力，但相較於表現正常型上皮生長受器的細胞而言， scFv-14el-ETA-fusion toxin 對表現突變型的腫瘤細胞卻有高達 100 倍的毒殺能力 28,29 。針對酪胺酸激酶所開發出的標靶藥物則有 ZD1839(Iressa) 27、OSI-77427，兩者都是抗酪胺酸激酶的抗體，其原理是抑制 ATP 結合到酪胺酸激酶區域，抑制抗酪胺酸激酶的活性和自我磷酸化(autophosphorylation)的發生，達到阻斷後續訊息的傳導。針對配體所設計的標靶藥物 EGF-P64K30 則是由基因重組的人類上皮生長因子和具有高度免疫抗原特性的細菌蛋白質 P64K 所構成。除此之外，尚有針對配體及受體同時做治療的方法，其過程是利用反義寡核甘酸(antisense oligonucleotide) 阻止配體及上皮生長受器的基因進行轉錄過程，達到分別抑制配體和受器的蛋白質表現 27。為了達到使病人有最佳的術後結果，標靶治療是未來的醫療趨勢，故本實驗將針對肺癌開發出具有標的性的生物分子-奈米鑽石複合體，而此生物分子的選擇則取決於肺癌所喜好的生長激素，但我們需知道使用人類或相近物種如猪、牛、羊的生長激素往往會有所謂的高度異種活性，故如何挑選不具有活性或低活性的生長激素相似物(analog)作為奈米鑽石的結合分子也是一門重要的課題。本實驗最終將著重於奈米鑽石-蛋白質複合體的標的性、可偵測性、細胞毒性及能否做為消 7.

(17) 滅肺癌細胞這四大方面作探討。二、研究動機. 現今奈米科學正蓬勃的發展，而奈米材料之所以如此被重視主要是因其物化特性既不同於微觀的原子、分子，也不同於巨觀物體 31。奈米材料是指物質在立體空間中的尺寸至少有一維度是介於 1~100 nm 之間 31,32,33，奈米粒子則是指其粒徑介於 1~100 nm 之間的奈米微粒 33。奈米粒子和由相同元素所組成之塊材具有極為不同的特性，主要是因粒子的奈米尺寸造成極顯著的表面效應和體積效應，導致化學活性、吸附力大幅改變 34，因此奈米粒子在化學反應性 35、催化特性 31,36,37、熔點 38、相變溫度 39 各方面都有其特殊的性能，故在光學、電磁學、催化及熱力學等基本特性方面都需要進行進一步的探討與研究。以金為例，金的陰電性是2.4，是陰電性最高的化合物之一，亦即其反應性最低穩定性最高，因此極少與氟以外的高陰電性元素如硫或氧等直接反應，所以被認為是具有高抗氧化性、高抗腐蝕性且低活性的金屬塊材40。但金奈米粒子的發現打破了這個觀點，金奈米粒子可協助催化一氧化碳進行氧化性胺化作用(oxidative amination) 41、丙烯的環氧化作用42和不飽和化合物的氫化反應43,44 等，這證實了金奈米粒子具有化學活性，在工業界甚至取代了價格昂貴的白金觸媒，因此奈米材料具有和塊材極為不同的種種特性，這使得奈米材料擁有更廣泛的用途。細胞中的核酸、脂質和蛋白質等生物分子也都是奈米等級，若在奈米材料表面包覆一層生物分子則能結合這兩種奈米材料的特性，形成兼具反應性、光學活性與生物特性之新材料。這使得奈米材料可由工業應用跨足到醫學及生物科技領域，成為一項嶄新的研究，亦成為未來奈米科學發展之重要方向。然而要將奈米材料應用於生醫方面，首先就須考量此類材料的細胞毒性與生物穩定性，我們認為奈米鑽石可能具有高度的生物相容性。因奈米鑽石主要是由碳所構成，與生物系統相容，且其反應活性不高不易造成非預期之生理反應，此外由我們近年來的研究發現奈米鑽石具有螢光特性 45，因此可利用此一特性協助我們追蹤奈米鑽石在生物體中的位置，因奈米鑽石可能有上述之特性，本實驗中我們將利用奈米鑽石結合生物巨分子物質中的蛋白質，開發出具有生物標靶性的奈米鑽石-蛋白質複合體，並以癌症細胞為其應用標的，發展出一套可消滅癌細胞的奈米鑽石-蛋白質複合體系統。三、實驗架構. 3-1. 奈米鑽石的羧酸化及紅外線吸收光譜儀的檢測許多奈米材料都可以進行功能化的修飾 46,47，奈米鑽石(nano-diamond，ND) 8.

(18) 也不例外，但因奈米鑽石內部含有十分穩定 sp3 鍵結，所以我們採用強酸氧化法來氧化 48 奈米鑽石的表面使其功能化。但我們如何能得知氧化前後奈米鑽石表面是否具有任何的改變呢？紅外線光譜儀(Infrared Spectroscopy，IR)將可協助我們分析其中之變化。因分子或化合物的不同官能基對特定波長的紅外線具有吸收特性，故測量紅外光吸收光譜可用來觀察及測定分子的化學結構。因此我們能藉由比較奈米鑽石在氧化前後的紅外線吸收光譜之變化，就可得知強酸氧化對奈米鑽石造成的影響 48。紅外線光譜的作用原理是利用波長在 2.5 至 25 微米區間的紅外光照射待測物質，分子內之化學鍵將吸收紅外光的能量產生振動。不同化學鍵由於鍵能上之差異，所吸收之特定波長也有所區別。有機化合物通常在同一分子上存在有多種不同鍵結，且這些鍵結震動能亦會因其微觀環境之不同或變化而有所不同，因此同一分子可同時吸收不同波長之紅外光，藉由分析紅外光穿透樣品所得到之吸收圖譜，可獲得分子結構等重要訊息。雖然分子鍵的振動頻率可由式(1)所求得， λ=c/ν………………….(1) 其中λ為波長，.c 為光速，ν為振動頻率。這些頻率通常以波數(wavelength，cm-1) 表示，而不同之波數代表不同官能基之振動吸收能量與模式。但一般並不會對化合物所有的分子鍵能與振動態做繁瑣的計算與分析，反倒是歸納整理各類有機化合物之官能基在紅外光譜中所對應吸收峰位置，作為參考數據加以利用即可獲得相關之資訊，如前所述確切之吸收波長往往受到相鄰化學結構影響而會有偏移，但其幅度通常在合理範圍。因此比較奈米鑽石反應前後之 IR 光譜是否有 C=O(1670-1780 cm-1)或 COOH(2250-3100 cm-1)之吸收即可得知是否有氧化反應產生。下表即為有關不同官能基 IR 光譜之吸收表。表 3-1 常見的官能基在紅外線光譜所對應的特定吸收頻率。. 官能基 Alkane， C-H Alkene， =C-H Alkene， C=C Alkyne， ≡C-H Alkyne, -C≡CAlkyl halide, C-Cl Alkyl halide, C-Br Alkyl halide, C-I Alcohol，O-H Carboxylic，O-H. 吸收波峰 -1. (cm ) 2850-2960 3020-3100 1650-1670 3300 2100-2260 600-800 500-600 500 3400-3640 2250-3100. 9. 官能基. 吸收波峰(cm-1). Alcohol，C-O Aromatic，C-H Amine，N-H Amine，C-N Carbonyl，C=O Acid，C=O Ester，C=O Aldehyde，C=O Ketone，C=O Nitrile，C≡N. 1050-1150 3030 3310-3500 1030，1230 1670-1780 1650-1700 1740-1750 1720-1750 1720-1750 2210-2260.

(19) 3-2. 羧酸化奈米鑽石和蛋白質的鍵結程序為了產生具有生物標靶性的奈米鑽石，利用物理吸附或是化學結合方式將生物分子與奈米鑽石結合是不可或缺的步驟。雖然物理吸附也可得到奈米鑽石-生物分子複合體，且其反應方式也較為簡便，但利用物理吸附於奈米鑽石表面的生物分子往往也會因週遭環境的改變而改變其電性等物理特性，使生物分子脫附。故物理吸附雖可得到奈米鑽石-生物分子複合體的產物，但產物的穩定性卻無法準確的評估，且具有環境變異性的奈米鑽石-生物分子複合體不適用於高風險的醫學治療，因此化學結合是較為恰當的方式。生物分子是由碳、氫、氧、氮等多種元素構成，故在一般的生物分子上多具有氫氧基、硫醇基、羧酸基、羰基、胺基等各式各樣的官能基，可作為化學結合的選擇依據，又強酸氧化的奈米鑽也應具有特殊官能基，故化學結合將考量奈米鑽石和生物分子的官能基種類及數量，選擇出具有最高合成效率的化學反應作為開發具標靶性、穩定性的生物分子-奈米鑽石複合體的依據。動態光散射儀是一種濕式的量測方式，十分適用於均勻分布在水溶液中的生物分子 49,50，而生物分子-奈米鑽石複合體也可藉由此方式比較合成前後的粒徑大小，利用粒徑的變化作為生物分子-奈米鑽石複合體是否成功合成的指標。動態光散射儀的實驗原理是將雷射光導入含有懸浮粒子的溶液中，一但雷射光與懸浮粒子產生交互作用就會產生散射光。隨著時間的行進，懸浮粒子不停的在溶液中進行擴散移動，故散射出來的雷射光強度會隨著時間做改變，藉由觀察散射光隨著時間的起伏變化，並考量雷射的波長、溶液的黏滯係數、折射係數等多項變異性參數，再配合式(2)的愛因斯坦方程式即可計算出粒徑大小。 k T D0 = B …………………. (2) 3πη d h 其中 kB 為波茲曼常數，T 為凱式溫度，η 為溶液黏滯係數，dh 為水合直徑，Do 為待測物擴散係數。為了釐清生物分子-奈米鑽石複合體是藉由物理性吸附或是化學反應生成共價鍵的方式而互相結合，我們利用基質輔助雷射脫附游離時序飛行式質譜儀 (MALDI-TOF)做進一步的確認。. 3-3. 奈米鑽石和羧酸化奈米鑽石在生物特性的檢測雖然我們擁有 ND、cND，但卻不知道經強酸氧化後的奈米鑽石是否會造成其物理與化學特性的改變。於是我們將 cND 加入人類肺腺癌細胞 A549 中，一同進行培養，利用 MTS 試劑進行 cND 對細胞生理活性影響的分析。MTS 是 tetrazolium. [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium]的縮寫，其類似於傳統所用的 MTT，一樣可接收 NADH 或 NADPH 這些還原化合物所傳遞的電子，但 MTS 經電子還原後會產生水溶性的紅色產物 formazan，因此可直接藉由讀取 490 nm 的吸光值來判定細胞的數目 50。此外奈米鑽石加入細胞培養液後容易聚集成團，在顯微鏡下以黑色的聚合物 10.

(20) 呈現，因此使用共軛焦光學顯微鏡即可觀察。奈米鑽石尚可利用其螢光特性 7 來偵測其在生物體內所在位置；使用 488 nm 的光源作激發，收集 510-530 nm 的綠色螢光訊號可作為偵測奈米鑽石存在與否的依據。. 3-4 青石斑魚的重組生長激素(rEaGH)和重組基因魚類生長激素-羧酸化奈米鑽石複合體(cND-rEaGH complex)的生物特性檢測不同物種之同種基因多具有高度之結構與功能之相似性，生長激素就是一例。生長激素在哺乳類動物中經由活化生長激素受體(growth hormone receptor， GHR)，引發一連串的訊號傳導，包含了刺激胺基酸的運輸 51、蛋白質的合成 52 和 DNA/RNA 的製造 53 等；而魚類生長激素可誘發虹鱒的 IGF-1 生長激素進行蛋白質表現 54；鮭血液中的白血球也在生長激素的刺激下大量增生 55，因此魚類生長激素和人類生長激素具有許多功能性的相似之處。所以我們利用 MTS 檢測法評估 rEaGH 是否會造成人類細胞數量的改變，而 cND-rEaGH 複合體因同時含有 rEaGH 和 cND，雖然我們希望 rEaGH 的存在可使 cND-rEaGH 具有生物標靶性，但在我們尚不了解結合這兩個分子對個別奈米粒子是否會有任何特性上的改變，因此細胞毒性的測試將是其評估 cND-rEaGH 功能性的一項良好依據。 3-5 多光子吸收效應對奈米鑽石的影響奈米鑽石有吸收多光子效應而產生爆炸的特性 56，但我們不確定是否是所有的奈米鑽石都具有此多光子吸收特性，因此本實驗利用原子力顯微鏡掃描雷射轟炸前後的奈米鑽石，分析其型態上的改變，驗證本實驗室所用之奈米鑽石是否具有藉由同時吸收多個光子而產生爆炸效應。此外我們也評估 cND-rEaGH 在處理細胞時，能否藉由奈米鑽石的爆炸效應而對細胞造成局部傷害，因此我們將利用 MTS 評估細胞活性，這也間接的評估了具有標靶性的蛋白質-奈米鑽石複合體是否有作為醫學治療的潛力。四、實驗步驟. 4-1. 魚類和哺乳類動物生長激素的胺基酸序列與親緣關係與演化分析我們已知魚類和哺乳類動物的生長激素都可經由活化生長激素受體而誘發一連串的訊號傳導 57，故在功能上具有顯著的相似性，然而隨著演化時間的增加，不同物種間的歧異度會逐漸加深，因此比對魚類及哺乳類生長激素的胺基酸序列將使我們了解物種在演化過程中的序列保留度和其差異性 58。瞭解這些差異性可使我們對得知魚類和人類在親源演化上的歧異度。本實驗所比對的各種生長激素之胺基酸序列都由 NCBI 網站所取得。. 11.

(21) 4-2. 紅外線光譜了解強酸氧化奈米鑽石前後的差異性我們以 3:1 的比例混合的濃硫酸及硝酸，將奈米鑽石加入此強酸溶液中，於室溫氧化 24 小時後，再將奈米鑽石換到 0.1M NaOH 溶液中，以 90℃加熱 2 小時，最後換到 0.1M HCl 中再持續加熱 2 小時反應。氧化後的奈米鑽石以 12000 rpm 的轉速加以離心分離並加以收集，再經由多次的重複性水洗除去殘存的酸鹼溶液，最後乾燥保存。根據式(2)，我們預期強酸氧化後的奈米鑽石會有羰基(carbonyl group)和氫氧基(hydroxyl group)的產生。. ……………. (2) 紅外光譜測量是利用不同官能基對特定波長的紅外線吸收特性，故可用來觀察及測定分子的化學結構。本實驗中所採用的奈米鑽石材料和氧化方式都和 Tu, J.-S.在 2006 年所發表的論文相同 48，故 5 nm 及 100 nm 的奈米鑽石於氧化前後的紅外線光譜應如圖 4-1 所示，圖 4-1 是由取自於 Tu, J.-S.的論文。. 圖 4-1 5 nm 及 100 nm 的奈米鑽石在氧化前及氧化後的紅外線光譜。5 和 100 分別代表直徑為 5 nm 及 100 nm 的奈米鑽石，(1)未經強酸氧化的奈米鑽石，(2)經強酸氧化後的奈米鑽石。圖 4-1 是 5 nm 及 100 nm 的奈米鑽石在氧化前及氧化後的紅外線光譜。5(1)及 5(2)分別是經強酸氧化前及氧化後的 5 nm 奈米鑽石，100(1)及 100(2)則是強酸氧化 12.

(22) 前及氧化後的 100 nm 奈米鑽石。5(1)和 100(1)在 1635cm-1、1725cm-1 和 3435cm-1 都有吸收訊號，其分別是氫氧鍵(-OH)的吸收波、羰基(-C=O)和氫氧官能基鍵長的振動訊號，這代表奈米鑽石在氧化前就具有氫氧鍵及羰基的存在。5(2)和 100(2)顯示強酸氧化後的奈米鑽石，在 1635cm-1、1725cm-1 和 3435cm-1 的吸收訊號都大幅增加，亦即奈米鑽石在氧化後，氫氧鍵及羰基的數量有顯著的增加。奈米鑽石上的官能基是用於和蛋白質分子做化學共價鍵接合依據，而經由強酸氧化奈米鑽石是為了使奈米鑽石擁有更多的官能基，以便和更多的蛋白質進行接合。. 4-3 UV-vis 測定奈米鑽石的濃度許多生物分子都對特殊波長的光源具有吸收能力，例如：多數蛋白質在 280 nm 有吸收峰的存在，故我們常用其特殊吸收峰值估算蛋白質濃度，但本實驗所用的奈米鑽石不曾由任何報導指出其具有獨特的吸光特性，但這並不代表奈米鑽石不對光具有吸收性，因此我們利用 200 nm ~ 900 nm 的波段掃描經序列稀釋的 5 nm 奈米鑽石溶液，希望藉由全波段吸光數值的分析，觀察奈米鑽石是否在特定波段的光源下，其吸光數值和濃度具有相對應的關係。 4-4. 動態光散色儀測定奈米鑽石的粒徑均勻懸浮於溶液中的粒子都可經由動態光散射求得其粒子大小，而我們也須對市售買來的 5 nm 和 100 nm 的奈米鑽石進一步的確認其粒徑大小，確認產品的顆粒具有一致性並和確認其實際的直徑，避免後續的實驗數據是因奈米鑽石的大小不一致所造成。. 4-5 化學性結合產生蛋白質-羧酸化奈米鑽石複合體本實驗選用零鍵結長度的分子連結劑(cross-linker) 1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯胺鹽酸((1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)，EDC) 做為連結羧酸基(-COO-)和胺基(-NH3+)的工具，EDC首先須在酸性境中將帶有羧酸基的分子活化，形成活化的氧乙醯化異尿素酯(O-acylisourea reactive ester)中間產物，才能加入胺基分子，形成穩定存在的胜肽鍵(peptide bond) 59。使用EDC作為分子連結劑有許多的優點：(1)EDC是作用於兩個不同官能基間的分子連結劑，故具有特定的活化順序；(2) EDC僅協助兩個分子間進行鍵結，作用完後並不會有任何部分被併入產物中，也就是不會對產物進行任何不必要修飾，因此EDC將完全由產物中被移除。進行鍵結時需注意溶液中不能含有任何胺基，一般常用的三羥甲基氫基甲烷緩衝溶液(tris[hydroxymethyl]aminomethane buffer，Tris buffer)就含有胺基，會和我們所加入的胺基分子共同競爭羧酸基的鍵結反應，故應注意避免。在本實驗中是由 cND 提供羧酸基，蛋白質分子提供胺基，並在磷酸緩衝溶液中進行反應。實驗過程中，cND 一經 EDC 活化後，就會加入蛋白質分子進行後續的反應，而最終的反應產物是蛋白質-羧酸化的奈米鑽石的複合體。 13.

(23) 圖 4-2 1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯胺鹽酸使羧酸基分子和胺基分子進行共價性的胜肽鍵結合 59。. 4-6. 青石斑魚生長激素是人類生長激素的相似物. 人類屬於高等脊椎動物，而魚類卻是低等脊椎動物，但其生長激素有相似的功能。我們利用比對兩兩物種間的胺基酸序列，得知青石斑的生長激素和人類生長激素在演化上的歧異度最大，但在胺基酸序列上仍保有 32.4 %的一致性，青石斑魚和斑馬魚則保有 54 %的序列一致性，斑馬魚和人類則有 40 %的序列一致性，先前也證實了 106 pM 的人類生長激素仍可使斑馬魚的肝臟細胞有 10 %的增生效果 10 ，故使用斑馬魚生長激素刺激人類細胞仍有誘使人類細胞增生的可能性，因此我們選用親源演化距離更遠的青石斑魚生長激素作為功能性結合奈米鑽石的生物分子，使奈米鑽石具有標靶性但卻不因蛋白質的功能而引發生物細胞內部的高度訊號傳導，產生無法預期的副作用。. 4-7 量產青石斑魚的重組生長激素青石斑魚的蛋白質序號為 AAL36937，為本實驗是先前所單離出來的 60。我們利用此序列設計出新的重組蛋白質，並將重組基因送入大腸桿菌中，配合 IPTG 的誘導產生大量青石斑魚的重組生長激素(rEaGH)，其產量為每一公升的菌液經由 14 ~ 16 小時的長時間培養可產生約 250 mg 的內涵體(inclusion body)蛋白質，但此時的 rEaGH 蛋白質卻無法直接使用，因其錯誤摺的疊形式不具有任何生物功能性，為了使我們所培養出來的蛋白質具有正常的活性，首先必須想辦法使蛋白質重新摺疊，而摺疊的第一步就是對維持蛋白質一級結構的胜肽鍵(peptide bond)之外的所有鍵結加以破壞，並利用本實驗室發展成熟的蛋白質摺疊技術重新進行 rEaGH 內涵體的摺疊 60。. 4-8. 西方墨點法測定何種細胞適合作為 cND-rEaGH 的靶向性細胞首先我們已清楚得知 rEaGH 是人類生長激素的相似物，因此我們認為 14.

(24) cND-rEaGH 對具有生長因子受體的細胞會有靶向性。所以我們須找出何種細胞具有生長激素受體，前人研究已指出肝臟是主要的生長激素受體表現位置 61，而 CHO-K1 則不表現生長激素受體 62，在本實驗中我們尚對人類肺腺癌細胞 A549 進行檢測。以西方墨點法檢測生長激素受體的免疫染色過程中，一級抗體是兔子的抗人類生長激素受體的單株抗體，二級抗體則是帶有鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase，AP)的抗老鼠蛋白質的免疫球蛋白 G，此外尚利用來自於老鼠的抗人類肌動蛋白(actin)的單株抗體，作為偵測β-actin 在不同細胞樣本中的含量，β-actin 可視為不同樣本間的對照組(internal control)。. 4-9 cND-rEaGH 的接合效率評估已知 5 nm 奈米鑽石對 589 nm 的吸光數值和其濃度呈現一正向線性關係，我們假設單顆的 cND-rEaGH 接合後會使奈米鑽石的親水性上升及整體密度下降，所以單顆的奈米鑽石經由和 rEaGH 結合後可懸浮於溶液中，因此利用 12000 rpm 的轉速將懸浮的 cND-rEaGH 複合體和其它大顆粒的 rEaGH-(cND)n 複合體分離，利用位於上清液中的 cND-rEaGH 在 589 nm 的吸光數值評估 cND-rEaGH 的產率。 4-10 cND-rEaGH 的檢定 cND-rEaGH 雖然是經由化學接合步驟加以形成，但我們仍無法不經任何檢測就斷言其已成功形成，所以我們首先利用檢測較為快速的動態光散射儀測量蛋白質和 cND 的粒徑大小，並將經由化學接合步驟所得到的 cND-rEaGH 也一並測量其粒徑大小，藉由觀測粒徑大小的改變來確認 cND-rEaGH 是否成功形成。但是即便我們觀察到粒徑大小的改變，也不表示 cND-rEaGH 是經由共價鍵穩固的接合在一起，有可能是接合步驟所加入的藥劑造成 rEaGH 和 cND 以電性吸引力或是以疏水性聚合力聚合而成，故基質輔助雷射脫附游離時序飛行質譜儀(MALDI-TOF)檢測 cND-rEaGH 產物，將協助我們釐清這個疑點，並可得知每一個奈米鑽石與多少 rEaGH 做結合。 4-11 cND-rEaGH 的毒性測試當我們得到 cND-rEaGH 複合體後，但卻不了解此複合物是否可被生物體接受則需進一步分析，因此我們分別利用帶有生長激素受體的人類肺腺癌細胞 A549 和作為對照組的中國倉鼠卵巢癌細胞 CHO-K1 進行體外的細胞毒性測試。實驗中將以不同濃度的 cND-rEaGH 來處理細胞，處理時間為 24 小時，再繼續培養 24 小時才利用 MTS 試劑測定其細胞活性有無產生變異，實驗中也一併對 rEaGH 和 cND 進行細胞活性的測試。 4-12 奈米鑽石的特性無論奈米鑽石將來是否會被視為良好的生醫材料，其本身具有的光學特性都 15.

(25) 可協助奈米鑽石在各領域進行發展。奈米鑽石在 488 nm 光源的激發下，在 500 nm ~ 530 nm 的波段區間可偵測到螢光訊號，因此我們可結合共軛焦顯微鏡和 488 nm 的激發光源，同時觀察奈米鑽石在白光視野下的所在位置，並配合螢光顯微鏡再次確認此顆粒是否為奈米鑽石，同時配合共軛焦螢光顯微鏡可對不同深度的細胞切面進行觀測，我們可以得知奈米鑽石是否具有穿透細胞膜，進入細胞中的能力。此外奈米鑽石在多光子的吸收效應上也可產生非線性的螢光特性(12)，但在本實驗中我們著重於多光子吸收效應對奈米鑽石型態上的影響，奈米鑽石在經由吸收多光子而轉變為激發態時，會伴隨著 sp3 結構轉變為 sp2 12，而本實驗中以 532 nm 的雷射做為多光子的產生來源，藉由單位能量為 1x108 W/cm2 的雷射能量來促使奈米鑽石產生多光子吸收效應，後續我們將利用原子力顯微鏡掃描經由轟炸前後的奈米鑽石表面，藉以得知奈米鑽石在經由多光子激發後除了會有大量的 sp2 結構產生，是否也會伴隨著型態上劇烈的改變。. 4-13 cND-rEaGH 在癌症治療上的應用我們利用 rEaGH 使奈米鑽石成為具有標靶性的 cND-rEaGH 複合體後，證實了奈米鑽石可藉由多光子吸收效應產生型態上的劇烈爆炸，但奈米鑽石的爆炸是否可用於治療癌症卻是我們尚未探索的領域，於是我們選用具有生長激素受體的 A549 細胞作為 cND-rEaGH 標靶的細胞，更選用不具生長激素受體的 CHO-K1 細胞作為對照組，配合著雷射光對奈米鑽石的激發，探討 cND-rEaGH 是否能藉由奈米鑽石的爆炸效應對此兩種細胞產生截然不同的結果，我們期望可觀察到 A549 細胞可藉由 cND-rEaGH 中奈米鑽石的爆炸造成細胞上的傷害，因此我們將以存活的細胞數目來評估 cND-rEaGH 在雷射激發系統的配合下是否具有殺死癌細胞的能力。因生長激素受體是坐落在細胞膜上，所以推測 cND-rEaGH 結合後也只會出現在細胞的表面，而掃描式電子顯微鏡可協助我們觀察 cND-rEaGH 是否坐落於細胞表面；此外經 cND-rEaGH 處理且經雷射激轟炸後的 A549 細胞，也將藉由掃描式電子顯微鏡觀察其型態上是否有所改變。五、結果. 5-1. 魚類和哺乳類動物生長激素的胺基酸序列比對和其親源演化關係為了解魚類與哺乳類之歧異性，因此我們特別針對 14 個不同物種之生長激素加以比對，圖 5-2 是來自於不同物種間的生長激素之胺基酸序列比對，圖 5-3 則是利用生長激素在胺基酸序列上的保留性所畫出的親源演化樹，其中鱸形目 (Perciformes)包含了青石斑、真鯛、黃鰭鯛和吳郭魚，虹鱒、鮭和香魚則是鮭形目. (Salmoniformes)，鯉魚屬於鲤形目(Cypriniformes)，鰻魚是鰻鱺目(Anguilliformes)，而中國倉鼠、老鼠、大老鼠、牛(BoGH，bovine)和人類則是哺乳綱(Mammalia)， 16.

(26) 由親源演化樹的實際距離得知屬於同目或同綱的生物其生物歧異度較低，而魚類中以青石斑和人類的生長激素在蛋白質序列上的歧異度最大。. 5-2 奈米鑽石的濃度測定為了精準的分析奈米鑽石之濃度，我們採用 UV 吸收分析。圖 5-4 不同濃度的 5 nm 奈米鑽石在 200 ~ 900 nm 的吸收圖譜。在 2×10-1 mg/mL 的濃度下，奈米鑽石在 210 nm 有特殊吸收波，但隨著濃度的下降，此吸光波峰也逐漸的向左移動，所以無法利用此吸收波作為估算奈米鑽石濃度的依據。我們轉而觀察其他波段的吸光數值，計算其是否具有規律性，最後發現 589 nm 的吸光值和奈米鑽石的濃度 (1×10-1 ~ 1×10-3 mg/mL 的濃度區間)成一高度正向的線性關係。表 5-1 是 2×10-1 ~ 1×10-3 mg/mL 的奈米鑽石在 589 nm 的吸光數值，圖 5-5 則是 1×10-1 ~ 1×10-3 mg/mL 的奈米鑽石濃度在 589 nm 吸光值所呈現的線性關係，其回歸曲線公式為 Y = ( 3.45523 × X ) - 0.00217，X 為奈米鑽石的濃度，Y 為 589 nm 的吸光值。後續實驗將藉由 589 nm 的吸光數值來推算奈米鑽石的濃度。 5-3 確認市售奈米鑽石的粒徑大小為了確認市售奈米鑽石的實際粒徑大小，我們利用動態光散射儀進行量測。圖 5-6 為 5 nm 奈米鑽石的粒徑大小，5 nm 奈米鑽的實際粒俓為 4.57 ± 0.04 nm。 5-4 比對人類和青石斑魚的生長激素圖 5-7 為人類和青石斑魚的生長激素的胺基酸序列比對。上列為人類生長激素，下列為青石斑魚的生長激素，比對結果指出兩者間具有 32.4 %的序列相同和 50.2 %的序列相似性。所以青石斑魚的生長激素可視為人纇生長激素的相似物。 5-5. 青石斑魚重組生長激素的取得與表現為了大量表現 EaGH，我們由 NCBI 網站取得青石斑魚的基因序列，再加以修改並送到大腸桿菌中表現此重組蛋白質。圖 5-8(a)為青石斑魚生長激素 EaGH 的氨基酸序列，圖 5-8(b)、(c)分別為青石斑魚重組生長激素 rEaGH 的氨基酸序列和 DNA 序列。圖 5-9 為 rEaGH 在大腸桿菌的培養過程，收集每個階段的產物並藉由電泳來分析。當大腸桿菌開始成長時，細胞中就含有許多不同種類的可溶性蛋白質 (control)，一旦加入 IPTG 誘導 rEaGH 蛋白質表現時，細菌中的蛋白質比例將有所改變。收集大腸桿菌並經由細胞粉碎機的壓迫，所有的蛋白質可藉由離心分為可溶性及不可溶的兩大類蛋白質，不可溶的蛋白質是由 rEaGH 所組成，因 rEaGH 在大腸桿菌中被視為不具價值的物質，經由 IPTG 的誘導及長時間的培養，大量的 rEaGH 以錯誤的摺疊形式囤積在大腸桿菌中，因此在培養 14 小時的全懸浮液(total cell lysate)中有許多 rEaGH 的存在。圖中由左到右分別為 1：不經 IPTG 誘導，培養 14 小時的大腸桿菌全懸浮液(control)；2：經由 IPTG 誘導，培養 14 小時的大腸桿菌全懸浮液(IPTG toal cell lysate)；3：將經 IPTG 誘導的大腸桿菌全懸浮液的蛋 17.

(27) 白質經離心分離所得的上清液部分(supernatant)；4：將經 IPTG 誘導的大腸桿菌全懸浮液的蛋白質經離心分離所得的沉澱部分(inclusion body)和 M：標準分子量之蛋白質(marker)。在基因重組階段已知 rEaGH 的分子量為 22.3kDa，電泳圖中也顯示相同的結果。比較 1、2 的結果差異性得知加 IPTG 誘導後，rEaGH 才開始大量表現；綜合 3、4 的結果得知 rEaGH 以不可溶的錯誤摺疊方式囤積在細胞中。. 5-6 西方墨點法偵測細胞是否帶有生長激素受體為了偵測 A549 是否具有生長激素受體，所以我們以西方墨點法分析。圖 5-10 是 A549、CHO-K1 和 Hep G2 進行偵測生長激素受體的免疫呈色結果，由左至右分別為 A549、CHO-K1、Hep G2 和 marker，上圖是利用抗人類生長激素受體的多株抗體做為一抗，偵測人類生長激素受體是否存在；下圖是利用抗人類肌動蛋白 (actin)的單株抗體，偵測β-actin 作為樣本間的對照組(internal control)。由圖中可知生長激素受體存在於 A549 和 Hep G2，而 CHO-K1 不具有生長激素受體。因此後續實驗可用 A549 和 CHO-K1 做為實驗組及對照組，因為 cND-rEaGH 中的 rEaGH 是人類生長激素的相似物，所以會對帶有人纇生長激素受體的細胞產生靶向性，所以預期 A549 會認得 cND-rEaGH，但 CHO-K1 卻不會。 5-7 cND-rEaGH 的接合效率奈米鑽石因其高密度及低水合性質而無法溶於水中，但奈米鑽石一旦和 rEaGH 接合形成 cND-rEaGH 後，cND-rEaGH 可藉由 rEaGH 的存在而增加其水合能力，並藉由 rEaGH 來降低 cND-rEaGH 的整體密度，因此 cND-rEaGH 可在溶液中均勻分布。然而奈米鑽石在水溶液中極易自行聚合成團形成(cND)n，(cND)n 因其密度太高可經由離心方式進行移除，且(cND)n 即使和 rEaGH 做結合也會因其高密度而自溶液中沉澱，因此(cND)n-rEaGH 仍可經由離心步驟加以移除。在奈米鑽石和 rEaGH 的接合反應中，會有單顆 cND-rEaGH 和(cND)n-rEaGH 同時生成，然而 ND 是為了用於治療癌症，因此 ND 須能經由血液運送到患部，所以只有可溶於溶液中的 cND-rEaGH 才可做為真正的藥劑，因此 (cND)n-rEaGH 是無法做為人體用藥的，所以接合反應結束後，我們會利用離心的方式來移除 rEaGH-(cND)n，並藉由 ND 在 589nm 的吸光數值來估算上清液中的 cND-rEaGH 的含量，計算出 cND-rEaGH 的產率。表 5-2 是位於上清液中的奈米鑽石含量及反應開始時所加入的奈米鑽石含量，和反應結束後 cND-rEaGH 合成效率的評估。實驗中我們利用 200 μg、160 μg、 120 μg 和 80 μg 的奈米鑽石和等量的 rEaGH (320 μg)進行共價鍵接合反應，反應結束後藉由離心來取得位於上清液中的 cND-rEaGH，利用上清液中的懸浮奈米鑽石濃度來估算接合效率。舉例來說，初始濃度為 200 μg 的奈米鑽石結束接合反應後，只有鑽石含量為 5.46 μg 的 cND-rEaGH 位於上清液中，因此其接合效率為 5.46 ÷ 200 × 100 % = 2.75 %。 18.

(28) 鑽石濃度為 200 μg 的接合反應其效率只有 2.75 %，160 μg 的鑽石接合效率為 3.77 %，160 μg 的鑽石接合效率為 5 %，160 μg 的鑽石接合效率為 7.42 %。因此鑽石濃度越低，懸浮於上清液的 cND-rEaGH 就越多，這表示低濃度的鑽石溶液較易生成單顆 cND-rEaGH，而高濃度的鑽石溶液則易形成(cND)n-rEaGH。. 5-8 cND-rEaGH、rEaGH 和 cND 的粒徑大小藉由觀察化學結合前後是否會有粒徑大小的改變，來判定 cND-rEaGH 是否形成。圖 5-11 是 cND-rEaGH、rEaGH 和 cND 的粒徑量測結果。由左到右為 cND、 rEaGH 和 cND-rEaGH，其粒徑分別為 4.57 ± 0.04 nm、8.8 ± 0.06 nm、14.18 ± 0.04 nm。由於 cND-rEaGH 的粒徑明顯增加，所以證實了 cND-rEaGH 確實形成。 5-9 cND-rEaGH 的基質輔助雷射脫附游離飛行質譜儀檢測圖 5-12(a)是 5 nm cND 的質譜儀圖譜，圖 5-12(b)是 5 nm cND-rEaGH 的質譜儀圖譜。圖 5-12(b)中的峰值為[M+2H]2+=58173.1，由此結果得知 cND-rEaGH 確實是經由共價連結所形成的。圖(a)中顯示奈米鑽石的質量為 66474.56 x 1 = 66474.56 (Da)，而圖(b)中顯示 cND-rEaGH 的質量為 58173.1 x 2 = 116346.2 (Da)，因此接上奈米鑽石的 rEaGH 質量為 116346.2 - 66474.56 = 49871.64 (Da)，而先前估算過 rEaGH 的分子量約為 23.3 kDa，故 49871.64 ÷ 23300≒ 2，因此利用 cND 和 cND-rEaGH 間的質量差異可估算出每一顆 5 nm 的奈米鑽石帶有兩個 rEaGH 分子。 5-10 cND-rEaGH、cND 和 rEaGH 的細胞毒性檢測為了測試 cND-rEaGH 是否具有生物毒性，我們利用 MTS 檢測其毒性，且一併對 cND 和 rEaGH 進行檢測，一方面可得知其是否會影響細胞增生的活性，一方面可作為 cND-rEaGH 的對照組。圖 5-13(a)不同濃度的 cND 和 rEaGH 處理後對 A549 細胞的毒性測試；圖 5-13(b)是不同濃度的 cND 和 rEaGH 處理後對 CHO-K1 的毒性測試，實驗中將完全不經藥物處理的 A549 或 CHO-K1 的細胞數目視為 100 %。A549 在濃度為 0.24 μM ~ 2.48 μM 的奈米鑽石區間下，其存活率介於 98.36 % ~ 100.72 %之間，7.62 μM rEaGH 在 A549 的細胞存活率為 99.8 %，CHO-K1 在濃度為 0.24 μM ~ 2.48 μM 的奈米鑽石區間下，其存活率介於 101.5 % ~ 106.7 %之間，7.62 μM rEaGH 在 CHO-K1 的存活率為 101.53 %，由此可知 rEaGH 和 cND 並不會對 A549 和 CHO-K1 造成細胞數目上有顯著的改變。圖 5-14(a)是處理不同濃度的 cND-rEaGH 後對 A549 細胞的毒性測試；圖 5-14(b) 將 5-14(a)中的實驗樣本換為 CHO-K1 所進行的測試，實驗中仍以不經藥物處理的 A549 或 CHO-K1 的細胞數目視為 100 %。A549 在奈米鑽石濃度為 0.24μM ~ 2.48μM 的 cND-rEaGH 處理下，其存活率介於 100.68 % ~ 105.92 %之間，CHO-K1 相同濃度的 cND-rEaGH 處理下，其存活率介於 99.68 % ~ 105.86 %之間。所以 cND-rEaGH 可被視為無毒性的標靶性藥物。. 19.

(29) 5-11 奈米鑽石具有螢光特性圖 5-15 是利用 5 nm cND 處理 A549，加入濃度為 100 μg/mL 的奈米鑽石到 A549 細胞中持續作用 4 小時，再換入新的 RPMI 培養液，持續培養 24 小時，才開始進行細胞染色，此外更可利用奈米鑽石的螢光特性來偵測奈米鑽石的所在位置。細胞核部分是以 Hoexhst 33258 進行染色(藍色)，代表細胞骨架的β-actin 則以 Cys3 標定(紅色)，奈米鑽石則以 488 nm 的激發光激發，並收集 500 nm ~ 530 nm 的螢光訊號作定位(綠色)。由奈米鑽石的分布位置我們得知奈米鑽石具有穿透細胞的能力，其均勻分布在細胞質及細胞核中，因此奈米鑽石對細胞具有穿透力，所以奈米鑽石有做為攜帶藥物進行藥物運輸或是攜帶基因載體的能力。. 5-12. 多光子效應對 5 nm 奈米鑽石的型態影響我們利用 532 nm 雷射作為多光子的提供者，藉由原子力顯微鏡觀察雷射轟炸前及轟炸後的奈米鑽石其形態上的變異，我們先將 5 nm 的奈米鑽石灑在一蓋玻片上，並區域性的照射雷射，因此最後得到一同時含有未爆炸及已爆炸奈米鑽的玻片。圖 5-16(a)是利用原子力顯微鏡對此玻片進行面積為 3 μm2 的掃描所得到的影. 像，圖中高度的高低變化會以顏色深淺做表示。圖 5-16 (b)是在此 3 μm2 的區域中，再選定一直線進行橫切面的觀測。在此直線上我們選擇一個未爆炸及已爆炸的奈米鑽石進行數據上的分析，得知爆炸前的奈米鑽石，直徑為 11.71 nm；爆炸後的奈米鑽石直徑為 128.91 nm。然而奈米鑽石的初始直徑約為 5 nm，但此處的測量結果卻為 11.71 nm，此差距是因原子力顯微鏡的探針所致。如圖 5-1 所示，探針會因其形狀、直徑等因素，而使得其測量結果有所誤差，圖中藍色的探針因其形狀限制而無法對圓球型的奈米鑽石進行準確的觀測，圖中兩段以紅色箭頭標定的長度總合即為 11.71 nm 和 5 nm 間的差異。. 圖 5-1 原子力顯微鏡的探針掃描奈米鑽石時的示意圖。藍色為原子力顯微鏡的探針，黑色實線為探針的移動路徑，圓球為奈米鑽石，紅色箭號表示探針所造成的誤差區域。綜合以上數據我們得知奈米鑽石經由多光子激發後會產生形態上巨大的改變，這種改變被視為奈米鑽石的爆炸。物理性的爆炸機制對生物體而言是一種傷害，而奈米鑽石的爆炸機制是否有用於破壞細胞的潛能還待我們進行後續實驗來加以證實。 20.

(30) 5-13 cND-rEaGH 在癌細胞上的應用我們已知 rEaGH 使得 cND-rEaGH 可對帶有生長激素受體的細胞產生標的性，所以當 A549 細胞經 cND-rEaGH 處理後，可觀察到此複合物會和 A549 一同接合，此時我們利用 532 nm 雷射光元激發複合體中的奈米鑽石，以便了解奈米鑽石的爆炸能否造成細胞活性的改變，此外我們也利用不帶有生長素受體的 CHO-K1 細胞作為對照組進行相同的實驗。實驗中以不經藥劑處理也不經雷射處理的 A549 或 CHO-K1 細胞的細胞數目視為 100 %。圖 5-17 是 A549 細胞分別經由不加任何藥劑、加入 rEaGH、cND 和 cND-rEaGH 的四種處理下，選擇是否經由雷射轟炸，再持續培養 24 小時後的細胞存活率。圖 5-18 則是將實驗材料換成 CHO-K1，而其他實驗步驟完全相同。圖 5-17 中不加任何藥劑但經雷射轟炸的 A549 細胞活性為 88.98 ± 1.14 %；經 rEaGH 處理的細胞其雷射轟炸前後的活性分別為 100.58 ± 1.27 %和 90.41 ± 3.74 %；經 cND 處理的細胞其雷射轟炸前後的活性分別為 87.35 ± 2.64 % 和 69.75 ± 2.12 %；而 cND-rEaGH 處理的細胞其雷射轟炸前後的活性分別為 73.33 ± 6.23 %和 39.7 ± 3.85 %。因此我們得知此能量的雷射會造成 control 組的細胞有約 10 %的細胞死亡，而奈米鑽石先前已被證實可穿透細胞膜進入細胞質及細胞核，比較雷射轟炸前後會有約 17 %的細胞是經由奈米鑽石爆炸而死亡，故奈米鑽石的爆炸行為確實可用來破壞細胞，造成細胞死亡。在具有標定性的 cND-rEaGH 的處理下，比較雷射轟炸前後的細胞存活率，有約 33 %的細胞是經由雷射轟炸所死亡，因此我們得知具有標靶性的 cND-rEaGH 在雷射激發系統的配合下，會有最多的細胞因奈米鑽石爆炸而死亡。圖 18 中不加任何藥劑但經雷射轟炸的 CHO-K1 的存活率為 99.05 ± 5.73 %；經 rEaGH 處理的細胞其雷射轟炸前後的活性分別為 101.52 ± 4.55 %和 100.33 ± 5.98 %；經 cND 處理的細胞其雷射轟炸前後的活性分別為 102.67 ± 6.64 %和 97.54 ± 3.69 %；而 cND-rEaGH 處理的細胞其雷射轟炸前後的活性分別為 104.85 ± 6.23 %和 96.6 ± 3.85 %。因此 cND-rEaGH 無法辨識不具生長激素的 CHO-K1 細胞。 5-14. 經 cND-rEaGH 和雷射轟炸前後的細胞型態 A549 對 cND-rEaGH 經雷射轟炸後的影響最為顯著，故我們想觀察經. cND-rEaGH 處理的 A549 在雷射轟炸前後的細胞型態，本實驗會先將 A549 細胞進行固定、脫水及金屬包覆後，才利用掃描式電子顯微鏡觀察細胞型態。圖 5-19 是雷射轟炸前的 cND-rEaGH-A549 細胞，圖 5-20 是雷射轟炸後 cND-rEaGH-A549 細胞。因 cND-rEaGH 會藉由生長激素受體而附著於細胞膜表面，所以圖 5-19 中的箭號是位於細胞膜表面的 cND-rEaGH，其餘沒有和 cND-rEaGH 結合的細胞膜呈現光滑且豐潤的狀態，細胞大小約為 10 μm。圖 5-20 中，附著於細胞表面的 cND-rEaGH 會因奈米鑽石的爆炸而造成細胞膜上的微創型傷口，所以細胞表面會呈現凹凸不平整的狀態，這代表細胞嚴重喪失其完整架構而逐漸走向死亡。. 21.

(31) 22.

(32) 圖 5-2 魚類和哺乳類動物生長激素的胺基酸序列比對。圖中紅色、綠色、藍色和粉紅色分別為正電、負電、極性和非極性的胺基酸；灰色區域為訊號序列(signal peptide)；置底黑線表螺旋區域；框住的區域為生長激素對應生長激素受體的特定結合位置 1 (epitope)；粗體字為生長激素的特定結合位置 2。 23.