【11】證書號數：I354705 【45】公告日： 中華民國 100 (2011) 年 12 月 21 日 【51】Int. Cl.： C12Q1/68 (2006.01) G01N33/569 (2006.01) 發明 全 6 頁 【54】名 稱：鑑定分解油品污染菌種之寡核苷酸序列及其生物晶片 【21】申請案號：094127299 【22】申請日： 中華民國 94 (2005) 年 08 月 11 日 【11】公開編號：200706656 【43】公開日期： 中華民國 96 (2007) 年 02 月 16 日 【72】發 明 人： 張長泉 (TW) ；唐中道 (TW) ；魏郁芳 (TW) ；朱俊育 (TW)
【71】申 請 人： 國立成功大學 NATIONAL CHENG KUNG
UNIVERSITY 臺南市東區大學路 1 號 【74】代 理 人： 郭雨嵐；林發立 【56】參考文獻： TW I252257 TW 200517496A [57]申請專利範圍 1. 一種用於鑑定分解油品污染菌種之寡核苷酸序列組合，其係包含：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：49 及 SEQ ID NO：50 之 寡核苷酸序列、或其互補股；其中 SEQ ID NO：7 及其互補股係用於鑑定洋蔥假單胞菌 (Burkholderia cepacia)，SEQ ID NO：8 及其互補股係用於鑑定叢毛單胞菌(Comamonas
testosteroni)，SEQ ID NO：13 及其互補股係用於鑑定德弗利亞菌(Delftia acidovorans)，
SEQ ID NO：17 及其互補股係用於鑑定哥敦氏菌(Gordonia nitida)，SEQ ID NO：20、 SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22 及其互補股係用於鑑定假單胞菌屬(Pseudomonas)， SEQ ID NO：45 及其互補股係用於鑑定羅爾斯頓氏菌(Ralstonia pickettii)，SEQ ID NO： 46 及其互補股係用於鑑定少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)，SEQ ID NO： 49、SEQ ID NO：50 及其互補股係用於鑑定不動桿菌屬(Acinetobacter)。
2. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：6 所示之序 列、或其互補股，用於進一步確認洋蔥假單胞菌(Burkholderia cepacia)之鑑定結果。 3. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：9、SEQ ID
NO：10、SEQ ID NO：11 或 SEQ ID NO：12 所示之序列、或其互補股，用於進一步確 認叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)之鑑定結果。
4. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15 或 SEQ ID NO：16 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認德弗利亞菌(Delftia
acidovorans)之鑑定結果。
5. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：18 或 SEQ ID NO：19 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認哥敦氏菌(Gordbnia nitida)之鑑定結 果。
7. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27 或 SEQ ID NO：28 所示之序列、或其互補股，用於進一步確 認前述假單胞菌屬之菌種為螢光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)。
8. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：29 所示之序 列、或其互補股，用於進一步確認前述假單胞菌屬之菌種為門多薩假單胞菌
(Pseudomonas mendocina)。
9. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34 或 SEQ ID NO：35 所示 之序列、或其互補股，用於進一步確認前述假單胞菌屬之菌種為惡臭假單胞菌
(Pseudomonas putida)。
10. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40 或 SEQ ID NO：41 所示 之序列、或其互補股，用於進一步確認前述假單胞菌屬之菌種為施氏假單胞菌
(Pseudomonas stutzeri)。
11. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43 或 SEQ ID NO：44 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認羅爾斯頓氏菌 (Ralstonia pickettii)之鑑定結果。
12. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：47 或 SEQ ID NO：48 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas
paucimobilis)之鑑定結果。
13. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52 或 SEQ ID NO：53 所示之序 列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬 之菌種為醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)。
14. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：54 所示之序 列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為鮑氏不動桿菌(Acinetobacter
baumannii)。
15. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56 或 SEQ ID NO：57 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬 之菌種為不動桿菌基因種 3(Acinetobacter genomic species 3)。
16. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59 或 SEQ ID NO：60 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬 之菌種為瓊氏不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)。
17. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：61 所示之序 列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為不動桿菌基因種 9
(Acinetobacter genomic species 9)。
18. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：62 或 SEQ ID NO：63 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為不動桿菌 基因種 13TU(Acinetobacter genomic species 13TU)。
19. 如申請專利範圍第 1 項之寡核苷酸序列組合，其進一步包含 SEQ ID NO：64 或 SEQ ID NO：65 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為不動桿菌 基因種 15TU(Acinetobacter genomic species 15TU)。
ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、 SEQ ID NO：49 及 SEQ ID NO：50 之寡核苷酸序列、或其互補股；其中 SEQ ID NO：7 及其互補股係用於鑑定洋蔥假單胞菌(Burkholderia cepacia)，SEQ ID NO：8 及其互補股 係用於鑑定叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)，SEQ ID NO：13 及其互補股係用於鑑 定德弗利亞菌(Delftia acidovorans)，SEQ ID NO：17 及其互補股係用於鑑定哥敦氏菌 (Gordonia nitida)，SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22 及其互補股係用 於鑑定假單胞菌屬(Pseudomonas)，SEQ ID NO：45 及其互補股係用於鑑定羅爾斯頓氏菌 (Ralstonia pickettii)，SEQ ID NO：46 及其互補股係用於鑑定少動鞘氨醇單胞菌
(Sphingomonas paucimobilis)，SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50 及其互補股 係用於鑑定 不動桿菌屬(Acinetobacter)。。
21. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：6 所示之序列、或其互 補股，用於進一步確認洋蔥假單胞菌(Burkholderia cepacia)之鑑定結果。
22. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、 SEQ ID NO：11 或 SEQ ID NO：12 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認叢毛單胞 菌(Comamonas testosteroni)之鑑定結果。
23. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15 或 SEQ ID NO：16 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認德弗利亞菌(Delftia
acidovorans)之鑑定結果。
24. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：18 或 SEQ ID NO：19 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認哥敦氏菌(Gordonia nitida)之鑑定結果。 25. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：23 或 SEQ ID NO：24
所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述假單胞菌屬之菌種為綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa)。
26. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、 SEQ ID NO：27 或 SEQ ID NO：28 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述假單 胞菌屬之菌種為螢光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)。
27. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：29 所示之序列、或其 互補股，用於進一步確認前述假單胞菌屬之菌種為門多薩假單胞菌(Pseudomonas
mendocina)。
28. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、 SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34 或 SEQ ID NO：35 所示之序列、或 其互補股，用於進一步確認前述假單胞菌屬之菌種為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。 29. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40 或 SEQ ID NO：41 所示之序列、或 其互補股，用於進一步確認前述假單胞菌屬之菌種為施氏假單胞菌(Pseudomonas
stutzeri)。
30. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43 或 SEQ ID NO：44 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認羅爾斯頓氏菌(Ralstonia
pickettii)之鑑定結果。
31. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：47 或 SEQ ID NO：48 所示之序列、或其互補股，用於進 一步確認少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas
32. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52 或 SEQ ID NO：53 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為醋 酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)。 33. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：54 所示之序列、或其 互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)。
34. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56 或 SEQ ID NO：57 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為不 動桿菌基因種 3(Acinetobacter genomic species 3)。
35. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59 或 SEQ ID NO：60 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為瓊 氏不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)。
36. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：61 所示之序列、或其 互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為不動桿菌基因種 9(Acinetobacter genomic species 9)。
37. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：62 或 SEQ ID NO：63 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為不動桿菌基因種 13TU(Acinetobacter genomic species 13TU)。
38. 如申請專利範圍第 20 項之生物晶片，其進一步包含 SEQ ID NO：64 或 SEQ ID NO：65 所示之序列、或其互補股，用於進一步確認前述不動桿菌屬之菌種為不動桿菌基因種 15TU(Acinetobacter genomic species 15TU)。
39. 一種鑑定分解油污細菌之方法，係包括下列步驟：(a)自待測菌株萃取 DNA；(b)利用適 當之引子對，增幅前述萃取 DNA 中 16S-23S 核糖體核酸基因間隔區之 DNA 序列；(c)將 前述步驟(b)之產物，與如申請專利範圍第 20 至 38 項中任一項所述之生物晶片進行雜交 反應；以及(d)藉由觀察步驟(b)之產物與前述晶片上何種探針具有正反應而鑑定該待測菌 株。 40. 如申請專利範圍第 39 項所述之方法，其中前述步驟(b)係可使用聚合酶連鎖反應進行增 幅。 41. 如申請專利範圍第 39 項所述之方法，其中前述步驟(b)之引子對，其正向引子為 SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3；反 向引子為 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4 所示之序列。 圖式簡單說明
第一圖係為寡核苷酸探針在晶片上之配置圖。
